KR20050057593A - 고혈압 위험도 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정밀도 및 예지확률이 높은, 고혈압의 유전적 위험도를 진단하는 수단을 제공한다. 본 발명에서는 하기 공정을 포함하는 방법에 의해 고혈압의 위험도 진단을 수행한다: (i) 고혈압과의 관련성이 인정된 4종의 유전자 다형성으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정, (ii) 상기 공정에 의해서 얻어지는 다형성 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정, 및 (iii) 결정된 유전자형으로부터 고혈압의 유전적 위험도를 구하는 공정.

Description

고혈압 위험도 진단방법{METHOD OF PREDICTING GENETIC RISK FOR HYPERTENSION}

본 발명은 고혈압에 관련되는 유전자를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 고혈압에 관련된 복수 유전자의 다형성을 이용한 검출방법 및 상기 방법에 이용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 고혈압 발생 위험도를 예측하는데 이용될 수 있다.

고혈압은 개개인의 유전적 배경과 다양한 환경인자의 상호작용에 의해 발병되는 다인자성 질환이다(참조: Lifton RP, Gharavi AG, Geller DS. Molecular mechanisms of human hypertension. Cell. 2001; 104: 545-556). 고혈압은 관동맥질환, 뇌졸중, 만성신장질환의 주요한 위험인자이므로, 고혈압의 예방은 사회적·공중 위생학적으로 중요한 일이다. 고혈압을 예방하기 위한 하나의 방법은, 고혈압 감수성 유전자를 동정하는 것이다. 연쇄 해석(참조: Xu X, Rogus JJ, Terwedow HA, Yang J, Wang Z, Chen C, Niu T, Wang B, Xu H, Weiss S, Schork NJ, Fang Z. An extreme-sib-pair genome scan for genes regulating blood pressure. Am J Hum Genet. 1999; 64: 1694-1701. ; Krushkal J, Ferrell R, Mockrin SC, Turner ST, Sing CF, Boerwinkle E. Genome-wide linkage analysis of systolic blood pressure using highly discordant siblings. Circulation. 1999; 99: 1407-141. ; Rice T, Rankinen T, Province MA, Chagnon YC, Perusse L, Borecki IB, Bouchard C, Rao DC. Genome-wide linkage analysis of systolic and diastolic blood pressure: the Quebec Family Study. Circulation. 2000; 102: 1956-1963) 및 후보 유전자에 의한 관련 해석(참조: Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev YV, Lifton RP, Williams CS, Charru A, Hunt SC, Hopkins PN, Williams RR, Lalouel J-M, Corvol P. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell. 1992; 71: 169-180. ; Cusi D, Barlassina C, Azzani T, Casari G, Citterio L, Devoto M, Gloriso N, Lanzani C, Manunta P, Righetti M, Rivera R, Stella P, Troffa C, Zagato L, Bianchi G. Polymorphisms of a-adducin and salt sensitivity in patients with essential hypertension. Lancet. 1997; 349: 1353-1357. ; Siffert W, Rosskop D, Siffert G, Busch S, Moritz A, Erbel R, Sharma AM, Ritz E, Wichmann H-E, Jakobs KH, Horsthemke B. Association of a human G-protein b3 subunit variant with hypertension. Nat Genet. 1998; 18: 45-48. ; Bray MS, Krushkal J, Li L, Ferrell R, Kardia S, Sing CF, Turner ST, Boerwinkle E. Positional genomic analysis identifies the b2-adrenergic receptor gene as a susceptibility locus for hypertension. Circulation. 2000; 101: 2877-2882)에 의해, 고혈압과 관련되는 염색체상의 몇 개의 유전자 위치 및 후보 유전자군이 동정되었다. 지금까지의 게놈 역학적 연구에 의해 안지오텐시노겐(참조: Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev YV, Lifton RP, Williams CS, Charru A, Hunt SC, Hopkins PN, Williams RR, Lalouel J-M, Corvol P. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell. 1992; 71: 169-180), α-아듀신(ADDUCIN, 비특허 문헌6), G-단백질β3 서브 유닛(참조: Siffert W, Rosskop D, Siffert G, Busch S, Moritz A, Erbel R, Sharma AM, Ritz E, Wichmann H-E, Jakobs KH, Horsthemke B. Association of a human G-protein b3 subunit variant with hypertension. Nat Genet. 1998; 18: 45-48) 및 β2-아드레날린 수용체(참조: Bray MS, Krushkal J, Li L, Ferrell R, Kardia S, Sing CF, Turner ST, Boerwinkle E. Positional genomic analysis identifies the b2-adrenergic receptor gene as a susceptibility locus for hypertension. Circulation. 2000; 101: 2877-2882) 등의 유전자 다형성과 고혈압 이환과의 관련성이 보고되었지만, 고혈압 감수성 유전자는 아직 동정되지 않은 상태이다. 또한, 인종이 다를 경우 다른 게놈 다형성을 가지므로, 각각의 인종에 따른 다형성과 고혈압과의 관련성에 대한 데이터 베이스를 구축하는 것이 중요하다.

도 1은 실시예에서 스크리닝 관련 해석시 검토한 112종의 유전자 다형성을 나타낸 표이다.

도 2는 실시예에서 스크리닝 관련 해석시 검토한 112종의 유전자 다형성을 나타낸 표이다.

도 3은 실시예의 유전자형을 결정하기 위해 사용되는 프라이머(위로부터 순차적으로 서열번호 16, 17, 18, 14, 15, 11, 12, 13, 8, 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) 및 프로브(위로부터 순차적으로 서열번호 31, 32, 33, 34) 및 기타 조건을 나타낸 표이다. 도면에서, FITC은 플루오레세인 이소티오시아네이트를, TxR는 텍사스 레드를, Biotin은 비오틴을 각각 나타낸다.

도 4는 실시예의 관련 해석시 검토한 단일염기다형성을 나타낸 표이다.

도 5는 실시예의 관련 해석시 대상으로 삼은 1107건의 남성 사례 및 833 건의 여성 사례의 배경 데이터를 나타낸 표이다. 연령, 신체 질량 지수, 수축기 혈압, 확장기 혈압, 혈청 크레아티닌의 각 데이터는 평균 + 표준편차로 나타내었다. 표에서, *1는 P<0.0001을, *2는 P<0.001을, *3은 P<0.01을 각각 나타낸다.

도 6은 관련 해석의 대상으로 삼은 유전자 다형성과 다인자 로지스틱 회귀분석의 결과를 나타낸 표이다. 각 SNP에서 낮은 P 수치는 굵은 글씨로 나타내었다.

도 7은 고혈압과 관련 있는 유전자 다형성의 유전자형의 분포를 나타낸 도면이다.

도 8은 고혈압과 관련 있는 유전자 다형성의 다인자 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선택법을 실시한 결과를 나타내는 표이다.

도 9는 남성을 대상으로 4종의 조합 유전자 다형성을 이용한 고혈압의 유전적 위험도를 진단한 결과를 나타내는 표이다.

도 10은 여성을 대상으로 4종의 조합 유전자 다형성을 이용한 고혈압의 유전적 위험도를 진단한 결과를 나타내는 표이다.

도 11은 고혈압의 위험도 진단시 누적 오즈비와 단일염기다형성의 수의 관련성을 나타낸 그래프이다. (A)는 남성의, (B)은 여성의 관련성을 나타낸다. (A)에서 각 SNP은, SNP1: GPIa(1648A→ G)다형성, SNP2: CCR2(190G→ A)다형성, SNP3: ApoC-III(1100C→ T)다형성, SNP4: GPβ 3(825C→ T)다형성이다. (B)에서 각 SNP은, SNP1: TNFα(-850C→ T)다형성, SNP2: TNFα(-238G→ A)다형성, SNP3: IRS-1(3494G→ A)다형성, SNP4: GPIbα(1018C→ T)다형성이다.

발명의 개시

상기한 바와 같이, 지금까지 수많은 유전자 다형성과 고혈압과의 관련성이 연구되어 왔다. 그러나 많은 연구에서 일정한 관련성을 파악할 수는 없었다. 그 주된 이유는, 많은 연구에서 대상 집단의 크기가 충분하지 않으며, 인종간에 존재하는 유전자 다형성 및 환경인자 차이 때문이다. 또한, 고혈압과의 관련성이 인정되더라도, 대규모 집단에서의 해석에는 상대적 위험도(오즈비:odds ratio, OR)가 낮은 것이 일반적이다.

본 발명은 상기한 배경을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 높은 정밀도로 예측 확률이 높은 고혈압의 유전자적 위험도를 진단하는 수단을 제공하여, 고혈압의 1차 예방에 공헌하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위하여, 여러개의 공적(公的) 데이터 베이스를 이용하여 관동맥경화, 관동맥연축, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등과 관련 있는 것으로 추정되는 71개의 유전자를 선별하고, 유전자의 기능 변화와의 관련이 예상되는 군을 중심으로 112종의 다형성을 선택하였다. 이후, 상기 71개의 유전자의 112종의 다형성에 관해 심근경색과의 관련 해석을 445건의 심근경색 사례와 464건의 대조군 사례에 대하여 실시하여, 남성으로부터 19개, 여성으로부터 18개의 단일염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)이 심근경색 발생과 관련되어 있음을 발견하였고(참조: Yamada Y, Izawa H, Ichihara S, et al. Prediction of risk of myocardial infarction from polymorphisms in candidate genes. N Engl J Med. in press.), 이들 다형성 군에는 고혈압 후보 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다. 이에, 이들 SNP와 고혈압과의 관련성에 대하여 대규모 관련 해석을 수행하였다. 그 결과, 고혈압과 관련되는 SNP를 남성으로부터 4개, 여성으로부터 4개 동정하였다. 또한, 이들 다형성을 조합하여 해석하는 다형성 로지스틱(logistic) 회귀분석의 단계별 변수 선택법(stepwise forward selection method)에 의해, 남성의 경우 최대 오즈비(Odds ratio) 5.34, 여성의 경우 최대 오즈비 46.86를 나타냄을 확인하였으며, 이는 과거에 보고된 관련 해석의 중 최대의 오즈비에 해당되었다. 상기 결과로부터, 이들 SNP중에서 복수개의 SNP를 선택하고 각 SNP를 해석한 결과를 조합 및 이용함으로써 신뢰성과 예측 확률이 높은 고혈압의 위험도 진단을 실시할 수 있다는 사실을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하는 것으로, 하기의 구성을 제공한다.

[1] 하기 공정 (a)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:

(a) 핵산 시료로부터, 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정:

(1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성,

(2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성,

(3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성, 및

(4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성.

[2] 하기 공정(b)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:

(b) 핵산 시료로부터, 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 종 이상의 다형성을 해석하는 공정:

(5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성,

(6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성,

(7) 인슐린 수용체 기질 1(substrate 1) 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성, 및

(8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성.

[3] 하기 공정(i)∼(iii)을 포함하는 고혈압의 위험도 진단 방법:

(i) 핵산 시료로부터 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정;

(1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성,

(2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성,

(3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성, 및

(4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성,

(ii) 상기 공정으로부터 수득한 다형성 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및

(iii) 결정된 유전자형으로부터 고혈압의 유전적 위험도를 구하는 공정.

[4] 하기 공정 (iv)∼(vi)를 포함하는 고혈압의 위험도 진단 방법:

(iv) 핵산 시료로부터, 하기(5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정;

(5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성,

(6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성,

(7) 인슐린 수용체 기질 1(substrate 1) 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성, 및

(8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성.

(v)상기 공정에 의해서 얻어지는 다형성 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및

(vi) 결정된 유전자형으로부터 고혈압의 유전적 위험도를 구하는 공정.

[5] 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:

(1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

(4) G-단백질β3 서브유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.

[6] 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:

(5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(7) 인슐린 수용체 기질 1(substrate 1) 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

(8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.

[7] 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산이 불용성 지지체에 고정된 고정화 핵산:

(1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

(4) G-단백질β3 서브유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.

[8] 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산이 불용성 지지체에 고정된 고정화 핵산:

(5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

(7) 인슐린 수용체 기질 1(substrate 1) 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

(8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 제1 측면은 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법에 관한 것으로, 그 일 예는, 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 예는, 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 공정의 결과로부터 수득되는 다형성 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정함으로써 고혈압의 유전적 위험도를 구할 수 있다.

(1) 글리코프로테인 Ia(Glycoprotein Ia) 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성: 1648A→ G(이하, 「GPIa(1648A→ G)다형성」이라고도 함)

(2) 케모카인 수용체2(Chemokine receptor 2) 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성: 190G→ A(이하, 「CCR2(190G→ A)다형성」이라고도 함)

(3) 아포리포프로테인 C-III(Apolipoprotein C-III) 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성: 1100C→ T(이하, 「ApoC-III(1100C→ T)다형성」이라고도 함)

(4) G-단백질β3 서브 유닛(G-protein β3 subunit) 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성: 825C→ T(이하, 「GPβ 3(825C→ T)다형성」이라고도 함)

(5) 종양 괴사 인자α(Tumor necrosis factor-α) 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성: -850C→ T(이하, 「TNFα(-850C→ T)다형성」이라고도 함)

(6) 종양 괴사 인자α(Tumor necrosis factor-α) 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성: -238G→ A(이하, 「TNFα(-238G→ A)다형성」이라고도 함)

(7) 인슐린 수용체 기질 1(Insulin receptor substrate-1) 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성: 3494G→ A(이하, 「IRS-1(3494G→ A)다형성」이라고도 함)

(8) 글리코프로테인 Ibα(Glycoprotein Ibα) 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성: 1018C→ T(이하, 「GPIbα(1018C→ T)다형성」이라고도 함)

상기에 있어서, 1648A→ G 와 같은 표기는, 상기 염기번호 위치의 다형성이 화살표의 전 또는 후의 염기인 2개의 유전자형으로 이루어지는 것을 의미한다.

각 유전자에서의 염기번호는, 공공의 데이터 베이스인 GenBank(NCBI)에 등록되어 있는 공지된 서열을 기준으로 하여 나타낸다. 또한, 서열번호 1의 염기서열(Accession No.X 17033M 28249: Human mRNA for integrin alpha-2 subunit)에 있어, 1648번째의 염기는 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기에 해당된다. 동일하게 서열번호 2의 염기서열(Accession No.U95626: Homo sapiens ccr2b(ccr2), ccr2a(ccr2), ccr5(ccr5) and ccr6(ccr6) genes, complete cds, and lactoferrin(lactoferrin) gene, partial cds, complete sequence (단, 서열번호 2의 서열은 50,000번째까지의 서열))에 있어 46295번째의 염기는 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기에 해당되고, 서열번호 3의 염기서열(Accession No. X 01392: Human apolipoprotein CIII gene and apo AI-apo CIII intergenic)에 있어 1100번째의 염기는 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기에 해당되고, 서열번호 4의 염기서열(Accession No. M 31328: Human guanine nucleotide-binding protein beta-3 subunit mRNA, complete cds.)에 있어 831번째의 염기는 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기에 해당되고, 서열번호 5의 염기서열(Accession No. L11698: Homo sapiens tumor necrosis factor alpha gene, promoter region.)에 있어 203번째의 염기는 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기에 해당되고, 서열번호 5의 염기서열(Accession No. L 11698: Homo sapiens tumor necrosis factor alpha gene, promoter region.)에 있어 816번째의 염기는 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기에 해당되고, 서열번호 6의 염기서열(Accession No. S 85963: hIRS-1= rat insulin receptor substrate-1 homolog [human, cell line FOCUS, Genomic, 6152 nt].에 있어 3494번째의 염기는 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 염기번호 3494 위치의 염기에 해당되고, 서열번호 7의 염기서열(Accession No. J 02940: Human platelet glycoprotein Ib alpha chain mRNA, complete cds.)에 있어 524번째의 염기는 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기에 해당된다.

본 발명의 「다형성을 해석한다」는, 해석 대상의 유전자 다형성에 대해 핵산 시료가 어떠한 유전자형을 갖는지를 조사하는 것을 의미하여, 다형성이 존재하는 위치의 염기(염기서열)를 조사하는 의미이다. 전형적으로, GPIa(1648A→ G)다형성의 해석을 예로 들면, 핵산 시료에서의 글리코프로테인 Ia의 유전자형이 AA(1648 위치의 염기가 양 대립 유전자 모두 A인 상동 접합체), AG(1648 위치의 염기가 A인 대립 유전자와 G인 대립 유전자인 이종 접합체), 및 GG(1648 위치의 염기가 양 대립 유전자 모두 G인 상동 접합체) 중 어느 것인가를 조사하는 것을 의미한다.

상기 (1)∼(4)의 다형성은, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 일본 남성을 대상으로 한 해석으로, 고혈압의 유전적 위험도를 판정하는데 특히 유효하다고 인지된 다형성이다. 따라서 이들 다형성을 해석 대상으로 함으로써, 피험자로서 남성(특히 일본 남성)을 선택하였을 때, 보다 정밀도 및 예측률이 높은 진단이 가능하다.

동일하게 상기 (5)∼(8)의 다형성은, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 일본 여성을 대상으로 한 해석으로, 고혈압의 유전적 위험도를 판정하는데 특히 유효하다고 인지된 다형성이다. 따라서 이들 다형성을 해석 대상으로 함으로써, 피험자로서 여성(특히 일본 여성)을 선택하였을 때, 보다 정밀도 및 예측률이 높은 진단이 가능하다.

여기에서, 원칙적으로 해석하는 다형성의 수의 증가에 비례하여 핵산 시료의 유전자형이 보다 미세하게 분류되어, 이에 따라 고혈압의 유전적 위험도를 한층 예측률이 높게 진단할 수 있다. 이러한 견지로, 상기 (1)∼(4)의 다형성내에서 보다 많은 다형성을 해석하여 유전자형을 검출하는 것이 바람직하다. 따라서, (1)∼(4)의 모든 다형성을 해석하는 것이 가장 바람직하다. 3종 이하의 다형성을 조합하여 유전자형을 검출하는 경우, 후술하는 실시예에서 나타내는 오즈비가 높은 다형성을 우선적으로 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 3종의 다형성을 조합하여 이용하는 경우, 오즈비가 높은 순으로 3종, 즉 (2), (3), 및 (4)를 선택하는 것이 바람직하다. 동일하게 예를 들면 2종의 다형성을 조합하는 경우, (2) 및 (4)를 선택하는 것이 바람직하다.

(5)∼(8)의 다형성으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 경우도 동일하게, 이들 모든 다형성, 즉 4종의 다형성을 해석하는 것이 가장 바람직하다. 3종의 다형성을 조합하여 유전자형을 검출하는 경우, 후술하는 실시예에 나타내는 오즈비가 높은 다형성을 우선적으로 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 3종의 다형성을 조합하여 이용하는 것이면, (5), (7), 및 (8)을 선택하는 것이 바람직하다. 동일하게 예를 들면 2종의 다형성을 조합하여 이용하는 것이면 (5) 및 (7)을 선택하는 것이 바람직하다.

각 유전자의 다형성을 해석하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예컨대 대립 유전자 특이적 프라이머(및 프로브)를 이용하여 PCR 법에 의한 증폭, 및 증폭산물의 다형성을 형광 또는 발광에 의해서 해석하는 방법, PCR(polymerase chain reaction)법을 이용한 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism: 제한효소 분절 길이 다형성)법, PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism: 단일가닥 구조 다형성)법(Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989) 등), PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide: 특이 서열 올리고뉴클레오티드)법, PCR-SSO법과 도트 하이브리디제이션(dot hybridization)을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide: 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드) 하이브리디제이션법(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986) 등), 또는 TaqMan-PCR 법(Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143(1999), Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)), Invader 법(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol, 17, 292(1999)), 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(matrix)법(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7, 378(1997)), RCA(rolling cycle amplification)법(Lizardi PM et al., Nat Genet 19, 225(1998)), DNA 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 방법(Wang DG et al., Science 280, 1077(1998) 등), 프라이머 신장법, 서든 블롯 하이브리디제이션법, 도트 하이브리디제이션(Southern, E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)) 등의 공지 방법을 채택할 수 있다. 또한, 해석 대상의 다형성 부위를 직접 서열분석함으로써 해석할 수도 있다. 또한, 이들 방법을 임의로 조합하여 다형성을 해석할 수도 있다.

핵산 시료가 소량인 경우, 검출 감도 내지 정밀도의 면에서 PCR 법을 이용한 방법(예컨대 PCR-RFLP 법)에 의해 해석하는 것이 바람직하다. 또한, PCR 법 또는 PCR 법을 응용한 방법 등의 유전자 증폭법에 의해 핵산 시료를 미리 증폭(핵산 시료의 일부 영역의 증폭을 포함함)한 후, 상기 어느 하나의 해석방법을 적용할 수도 있다.

한편, 다수의 핵산 시료를 해석하는 경우에는, 대립 유전자 특이적 PCR법, 대립 유전자 특이적 하이브리디제이션법, TaqMan-PCR법, Invader법, 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(matrix)법, RCA(rolling cycle amplification)법, 또는 DNA 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 방법 등으로, 다수의 검체를 비교적 단시간에 해석할 수 있는 해석방법을 이용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 방법에서는, 각 방법에 따른 프라이머나 프로브 등의 핵산(본 발명에서 「다형성 해석용 핵산」이라고도 함)이 사용된다. 다형성 해석용 핵산의 예로서는, 해석 대상의 다형성을 포함하는 유전자에 있어, 상기 다형성 부위를 포함하는 일정 영역(부분 DNA 영역)에 상보적인 서열을 가지는 핵산을 들 수 있다. 또한, 해석 대상의 다형성을 포함하는 유전자에 있어, 상기 다형성 부위를 포함하는 일정 영역(부분 DNA 영역)에 상보적인 서열을 가지고, 상기 다형성 부분을 포함하는 DNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 핵산(프라이머)를 들 수 있다. 이러한 핵산으로는, 예를 들면 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 다형성을 해석 대상으로 하는 경우, 1648 위치의 염기가 A(아데닌)인 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 1648 위치의 염기가 G(guanine)인 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산이 이에 해당된다.

다형성 해석용 핵산의 구체적인 다른 예로는, 해석 대상의 다형성 부위가 어느 하나의 유전자형인 경우에 한하여, 상기 다형성 부위를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트를 들 수 있다. 보다 구체적으로, 해석 대상의 다형성 부위를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로는, 다형성 부위가 어느 하나의 유전자형인 안티센스 가닥의 상기 다형성 부위를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트를 예시할 수 있다. 이러한 핵산 세트로는, 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 다형성을 해석하는 경우 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, 1648 위치의 염기가 A(아데닌)인 글리코프로테인 Ia 유전자의 안티센스 가닥에서 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트, 또는 1648 위치의 염기가 G(guanine)인 글리코프로테인 유전자의 안티센스 가닥에서 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적인 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트가 이에 해당된다. 여기에서, 증폭되는 부분 DNA 영역의 길이는 그 검출에 알맞은 범위에서 적절하게 설정되며, 예컨대 50bp∼200bp, 바람직하게는 80bp∼150bp 이다. 보다 구체적으로는, GPIa(1648A→ G)다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다. 또한, 하기 서열의 밑줄은 다형성에 대응하는 부분을 나타낸다. 또한, 서열중의 N은 A, T, C, 및 G 중 어느 하나인 것을 의미한다.

센스 프라이머

GAGTCTACCTGTTTACTATCAANAA: 서열번호 8, 또는

GAGTCTACCTGTTTACTATCAANGA: 서열번호 9

안티센스 프라이머

ACCAGTACTAAAGCAAATTAAACT: 서열번호 10

동일하게, CCR2(190G→ A)다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

안티센스 프라이머

GCAGTTTATTAAGATGAGGNCG: 서열번호 11, 또는

TTGCAGTTTATTAAGATGAGGNTG: 서열번호 12

센스 프라이머

GGTGCTCCCTGTCATAAATTTGA: 서열번호 13

동일하게, ApoC-III(1100C→ T) 다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

센스 프라이머

CCTTCTCAGCTTCATGCAGG: 서열번호 14,

안티센스 프라이머

GTCTTGGTGGCGTGCTTCA: 서열번호 15

동일하게, GPβ 3(825C→ T) 다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

센스 프라이머

TCTGCGGCATCACGTNCG: 서열번호 16, 또는

TCTGCGGCATCACGTNTG: 서열번호 17

안티센스 프라이머

GAATAGTAGGCGGCCACTGA: 서열번호 18

동일하게, TNFα(-850C→ T) 다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

안티센스 프라이머

TCTACATGGCCCTGTCTTNGT: 서열번호 19, 또는

CTCTACATGGCCCTGTCTTNAT: 서열번호 20

센스 프라이머

CTCTACATGGCCCTGTCTTTAT: 서열번호 21

동일하게, TNFα(-238G→ A) 다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

안티센스 프라이머

CCCCATCCTCCCTGCTNCG: 서열번호 22, 또는

CCCCATCCTCCCTGCTNTG: 서열번호 23

센스 프라이머

AGTCAGTGGCCCAGAAGACC: 서열번호 24

동일하게, IRS-1(3494G→ A) 다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

센스 프라이머

GGGCCCTGCACCTCCNGG: 서열번호 25, 또는

GGGCCCTGCACCTCCNAG: 서열번호 26

안티센스 프라이머

GGGTAGGCCTGCAAATGCTA: 서열번호 27

동일하게, GPIbα(1018C→ T) 다형성 해석용 핵산 프라이머는 하기 서열을 가지는 것으로 예시될 수 있다.

센스 프라이머

CCCAGGGCTCCTGNCG: 서열번호 28, 또는

CCCCAGGGCTCCTGNTG: 서열번호 29

안티센스 프라이머

TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG: 서열번호 30

한편, 구체적인 프로브의 예로서 하기를 들 수 있다.

ApoC-III(1100C→ T)다형성 해석용 프로브로서,

CAGCTTCATGCAGGGCTACA: 서열번호 31, 또는

CAGCTTCATGCAGGGTTACA: 서열번호 32.

TNFα(-850C→ T)다형성 해석용 프로브로서,

ACATGGCCCTGTCTTNGTTAAG: 서열번호 33, 또는

ACATGGCCCTGTCTTNATTAAG: 서열번호 34.

IRS-1(3494G→ A)다형성 해석용 프로브로서,

CACCTCCNGGGGCTGCTAG: 서열번호 35, 또는

CACCTCCNAGGGCTGCTAG: 서열번호 36.

상기한 핵산 프라이머, 핵산 프로브는 단순한 일례이며, 핵산 프라이머는 목적한 증폭반응을 지장없이 수행할 수 있는 한도에서, 핵산 프로브는 목적한 하이브리디제이션 반응을 지장없이 수행할 수 있는 한도내에서 일부의 염기서열 변이가 있을 수도 있다. 상기 「일부의 변이」는, 염기의 일부가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 것을 의미한다. 변이에 해당되는 염기 수는, 예컨대 1∼7개, 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는, 1∼3개이다. 또한, 이러한 변이는 원칙적으로 다형성 부위에 대응하는 염기 이외의 부분에서 실시된다.

다형성 해석용 핵산(프로브, 프라이머)는, 해석방법에 따라서 적절한 DNA 단편 또는 RNA 단편이 이용된다. 다형성 해석용 핵산의 염기 길이는 각각의 기능이 발휘되는 길이이면 되고, 프라이머로서 이용되는 경우의 염기 길이는, 예컨대 10∼50 bp정도, 바람직하게는 15∼40 bp정도, 더욱 바람직하게는 15∼30bp 정도이다.

또한, 프라이머로 이용되는 경우에는 증폭대상에 특이적으로 하이브리디제이션하여, 목적한 DNA 단편을 증폭할 수 있는 한 주형이 되는 서열에 대하여 일부 미스매치(mismatch)가 있을 수도 있다. 프로브도 동일하게, 검출대상의 서열과 특이적인 하이브리디제이션을 수행할 수 있는 한, 검출대상의 서열에 대하여 다소의 미스매치가 있을 수도 있다. 미스매치의 정도는, 1∼수개, 바람직하게는 1∼5 개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다.

다형성 해석용 핵산(프라이머, 프로브)은 포스포디에스테르법 등의 공지된 방법에 의해서 합성할 수 있다. 또한, 다형성 해석용 핵산의 설계, 합성 등은 참고서적(예를들면, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)을 참고할 수 있다.

본 발명에서의 다형성 해석용 핵산은 미리 표지 물질로 표지해 둘 수 있다. 이러한 표지된 핵산을 이용함으로써, 예컨대 증폭산물의 표지량을 지표로 다형성을 해석할 수 있다. 또, 다형성을 구성하는 각 유전자형의 유전자에서 부분 DNA 영역을 각각 특이적으로 증폭하도록 설계된 두 가지의 프라이머를 서로 다른 표지 물질로 표지하여, 증폭산물로부터 검출되는 표지 물질 및 표지량에 의해서 핵산 시료의 유전자형을 판별할 수 있다. 이러한 표지된 프라이머를 이용한 검출 방법의 구체적인 예로는, 다형성을 구성하는 각 유전자형의 센스 가닥에 각각 특이적으로 하이브리디제이션하는 두 가지의 핵산 프라이머(대립 유전자 특이적 센스 프라이머)를 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isotiocyanate)와 텍사스 레드(TxRed)로 각각 표지하고, 이들 표지된 프라이머와 안티센스 가닥에 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머를 이용하여 다형성 부위를 포함하는 부분 DNA 영역을 증폭하여, 얻어진 증폭산물에서의 각 형광물질의 표지량을 측정함으로써 다형성을 검출하는 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 안티센스 프라이머는 예컨대 비오틴으로 표지하면, 비오틴과 아비딘과의 특이적인 결합을 이용하여 증폭산물을 분리할 수 있다.

다형성 해석용 핵산의 표지에 이용되는 표지 물질로는 ³²P 등의 방사성 동위원소, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 등의 형광물질이 예시될 수 있으며, 표지 방법으로는 알칼리포스파타아제 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용한 5'말단 표지법, T4 DNA 중합효소나 클레나우(Klenow) 단편을 이용한 3'말단 표지법, 닉(nick) 트랜슬레이션법, 랜덤 프라이머법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 9, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 등이 예시될 수 있다.

상기 다형성 해석용 핵산은 불용성 지지체에 고정된 상태에서 사용할 수도 있다. 고정에 사용되는 불용성 지지체는 칩 형, 비드 형 등으로 가공함으로써, 상기 고정된 핵산으로 다형성을 보다 간편하게 해석할 수 있다.

핵산 시료는, 피실험자의 혈액, 피부세포, 점막세포, 모발 등으로부터 공지된 추출 방법, 정제방법을 통하여 제조할 수 있다. 다형성 해석 대상의 유전자를 포함하는 경우, 임의 길이의 게놈 DNA를 핵산 시료로서 이용할 수 있다. 또, 반드시 해석 대상의 유전자 전부가, 하나의 핵산 상에 존재하는 핵산 시료를 이용할 필요는 없다. 즉, 본 발명의 핵산 시료로는, 해석 대상의 유전자의 전부가 하나의 핵산 상에 존재하고 있는 것이나, 해석 대상의 유전자가 2개 이상의 핵산 상에 분리되어 존재하고 있는 어느 것도 이용할 수 있다. 또한, 핵산 시료는 해석 대상의 유전자가 완전한 상태(즉, 유전자의 전장이 존재하는 상태)가 아니더라도, 최소한 해석되는 다형성 부위가 존재하고 있는 한, 단편적, 부분적인 상태라도 무방하다.

각 유전자 다형성의 해석은, 유전자 다형성마다, 또는, 복수 또는 전부를 동시에 수행한다. 전자의 경우로는 예를 들면, 피실험자로부터 얻은 핵산 시료를 해석 대상의 다형성의 수에 맞춰 나누어 주입하여, 각 다형성의 해석을 개별적으로 행한다. 후자의 경우로는 예를 들면, DNA 칩 또는 마이크로어레이에 의해서 행할 수 있다. 또한, 상기 동시라는 것은 해석과정의 모든 조작이 동시에 행하여지는 것만을 의미하는 것이 아니라, 일부의 조작(예를 들면 핵산 증폭 조작, 프로브의 하이브리디제이션, 또는 검출)이 동시에 행하여지는 경우도 포함한다.

해석 대상의 유전자의 전사산물인 mRNA를 이용하여 각 유전자의 다형성을 해석할 수도 있다. 예를 들면 피험자의 혈액, 뇨 등으로부터 해석 대상인 유전자의 mRNA를 추출, 정제한 후, 노던 블롯팅법(Molecular Cloning, Third Edition, 7.42, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), 도트 블롯팅법(Molecular Cloning, Third Edition, 7.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), RT-PCR 법(Molecular Cloning, Third Edition, 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), DNA 칩(DNA 어레이)를 이용한 방법 등을 실행함으로써, mRNA를 출발재료로 사용하여 다형성 해석을 수행할 수 있다.

또한, 상기의 다형성 중에서 아미노산의 변화를 수반하는 경우, 해석 대상의 유전자의 발현 산물을 이용하여 다형성 해석을 수행하는 것도 가능하다. 이 경우, 다형성 부위에 대응하는 아미노산을 포함하고 있는 한, 부분 단백질, 부분 펩타이드도 해석용 시료로서 이용할 수 있다.

이러한 유전자의 발현산물을 이용하고 해석하는 방법에는, 다형성 부위의 아미노산을 직접 분석하는 방법, 또는 입체구조의 변화를 이용하여 면역학적으로 분석하는 방법 등이 해당될 수 있다. 전자는, 주지의 아미노산 서열 분석법(에드만법을 이용한 방법)을 이용할 수 있다. 후자는, 다형성을 구성하는 어느 하나의 유전자형을 가지는 유전자의 발현산물에 특이적인 결합활성을 가지는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 이용한 ELISA 법(효소결합 면역 흡착 정량법), 방사 면역 측정법, 면역침강법, 면역확산법 등을 이용할 수 있다.

이상 설명한 본 발명의 검출 방법을 실행함으로써 얻어지는 다형성 정보는, 고혈압의 유전적 위험도 진단에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명은 상기의 검출 방법에 의해서 얻어지는 다형성 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정, 및 결정된 핵산 시료의 유전자형으로부터 유전적 위험도를 구하는 공정을 포함하는 고혈압의 위험도 진단 방법도 제공한다. 상기 유전자형의 결정은, 통상적으로 검출대상의 다형성에서 핵산 시료의 양 대립 유전자가 어느 유전자형을 각각 갖는지를 결정하는 것이다. GPIa(1648A→ G)다형성이 검출대상인 경우를 예로 들면, 통상적으로 핵산 시료에서의 GPIa의 유전자형이 AA(1648 위치의 염기가 양 대립 유전자 모두 A인 상동 접합체), AG(1648 위치의 염기가 A인 대립 유전자와 G인 대립유전자인 이종 접합체), 및 GG(1648 위치의 염기가 양 대립 유전자 모두가 G인 상동 접합체) 중 어느 것인가를 결정하는 것이다.

하기 실시예의 결과를 고려하여, 정밀도 및 예측률이 높도록 고혈압의 유전적 위험도를 진단 가능하게, 예를 들면 GPIa(1648A→ G)다형성은 핵산 시료의 유전자형이 GG일지, 그렇지 않으면 AA 또는 AG 중 어느 하나일지를 결정한다. 동일하게 CCR2(190G→ A)다형성은 AA일지, 그렇지 않으면 GG 또는 GA 중 어느 하나일지, ApoC-III(1100C→ T)다형성은 TT일지, 그렇지 않으면 CC 또는 CT 중 어느 하나일지, GPβ 3(825C→ T)다형성은 CT 또는 TT 중 어느 하나일지, 그렇지 않으면 CC일지, TNFα(-850C→ T)다형성은 TT일지, 그렇지 않으면 CC 또는 CT 중 어느 하나일지, TNFα(-238G→ A)다형성은 GA 또는 AA 중 어느 하나일지, 그렇지 않으면 GG일지, IRS-1(3494G→ A)다형성은 GA 또는 AA 중 어느 하나일지, 그렇지 않으면 GG일지, GPIbα(1018C→ T)다형성은 CT 또는 TT 중 어느 하나일지, 그렇지 않으면 CC 일지를 결정한다.

고혈압의 유전적 위험도를 진단함으로써, 장래에 고혈압으로 이환 가능성(발병 용이성), 즉 발병 위험도(발병 취약성)을 예측하고, 또한 유전자형이라는 객관적 지표에 따라 고혈압의 인정이나 병상의 파악을 행하는 것이 가능하게 된다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 진단 방법에 의해서 고혈압의 발병 위험도의 평가, 고혈압으로의 이환하고 있음을 인정, 또는 증상의 파악을 행할 수 있다. 그 중에서도 발병 위험도의 평가를 행할 수 있는 것은 임상적으로 큰 의의를 가진다. 발생 위험도를 사전에 아는 것은 고혈압의 1차 예방에 공헌하여, 적절한 예방조치를 강구하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 진단 방법에 의해서 얻어지는 정보는, 적절한 치료법의 선택이나, 예후 개선, 환자의 QOL(삶의 질)의 향상, 또는 발병 위험도의 경감 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 진단 방법을 실행함으로써, 고혈압의 발병 위험도 등을 모니터할 수 있다. 이러한 모니터의 결과, 어떤 외적인자(환경인자, 약제의 투여 등)와 발병 위험도 등의 증가와의 사이에 상관관계가 인지되면, 상기 외적인자를 위험인자로 인정하여, 상기 정보를 토대로 발병 위험도 등의 경감을 도모하는 것이 가능하라 생각된다.

본 발명에서 얻어지는 고혈압의 발병에 관련되는 유전정보는, 고혈압의 치료(예방적 처치를 포함함)에 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 진단 방법을 실시한 결과, 해석 대상의 고혈압의 발병 위험도를 높이는 유전자형인 경우에, 발현 위험도가 낮은 유전자형을 가지는 유전자를 생체내에 도입하여 발현시키면, 상기 유전자가 발현됨으로써 증상의 경감, 발병의 억제, 발병 위험도의 경감 등을 기대할 수 있다. 발병 위험도가 높은 유전자형을 가지는 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 가닥을 도입하고, 상기 mRNA의 발현을 억제하는 방법에 의해서도, 동일한 치료효과가 기대된다.

유전자 또는 안티센스 가닥의 도입은 예를 들면, 유전자 도입용 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 이용한 방법, 일렉트로포레이션(electroporation, Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)), 초음파 마이크로버블(Lawrie, A., et al. Gene Therapy 7, 2023-2027(2000)), lipofection(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1984)), 미세 주입(Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 366-370(1976)) 등의 방법에 의해 수행할 수 있다. 이들 방법을 이용하여 원하는 유전자 등을 생체에 직접적으로 도입(in vivo 법) 또는 간접적으로 도입(ex vivo 법)할 수 있다.

본 발명의 제 2 측면은, 상술한 본 발명의 검출 방법 또는 진단 방법에 사용되는 키트(유전자형 검출용 키트, 또는 고혈압진단용 키트)를 제공하는 것이다. 상기 키트는 상기 (1)∼(4)의 다형성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하기 위한 핵산(다형성 해석용 핵산)을 포함한다. 다른 양태로, 상기 (5)∼(8)의 다형성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하기 위한 핵산(다형성 해석용 핵산)을 포함하는 키트가 구성된다.

다형성 해석용 핵산은, 그것이 적용되는 해석방법(상술한 대립 유전자 특이적 핵산 등을 이용한 PCR 법을 이용하는 방법, PCR-RFLP법, PCR-SSCP, TaqMan-PCR법, Invader 법 등)에 있어, 해석 대상의 다형성 부분을 포함하는 DNA 영역 또는 그것에 대응하는 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 것(프라이머) 또는 특이적으로 검출할 수 있는 것(프로브)으로서 설계된다. 이하, 본 발명에서 제공되는 키트의 구체적인 예를 나타낸다.

하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산을 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(1) 1648 위치의 염기가 A 인 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 1648 위치의 염기가 G인 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산,

(2) 190 위치의 염기가 G 인 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 190 위치가 A 인 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산,

(3) 1100 위치의 염기가 C 인 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 1100 위치의 염기가 T 인 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 및

(4) 825 위치의 염기가 C 인 G-단백질 β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 825 위치의 염기가 T 인 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 -482 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산.

상기에서는, (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하나, (1)∼(4) 중 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 상기 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (2)∼(4)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산을 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(5) -850 위치의 염기가 C 인 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 -850 위치의 염기가 T 인 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산,

(6) -238 위치의 염기가 G 인 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또 는 -238 위치의 염기가 A 인 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산,

(7) 3494 위치의 염기가 G 인 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 3494 위치의 염기가 A 인 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 및

(8) 1018 위치의 염기가 C 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산, 또는 1018 위치의 염기가 T 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 서열을 가지는 핵산.

상기에서는, (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하나, (5)∼(8)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (5), (7), 및 (8)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산 세트를 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(1) 핵산 시료 중의 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기가 A 인 경우에만, 상기 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기가 G 인 경우에만, 상기 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트,

(2) 핵산 시료 중의 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기가 G 인 경우에만, 상기 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기가 A 인 경우에만, 상기 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트,

(3) 핵산 시료 중의 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기가 C 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기가 T 인 경우에만, 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 및

(4) 핵산 시료 중의 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기가 C 인 경우에만, 상기 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기가 T 인 경우에만, 상기 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트.

상기에서는, (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(4)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (2)∼(4)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산 세트를 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(5) 핵산 시료 중의 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기가 C 인 경우에만, 상기 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기가 T 인 경우에만, 상기 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트,

(6) 핵산 시료 중의 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기가 G 인 경우에만, 상기 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기가 A 인 경우에만, 상기 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트,

(7) 핵산 시료 중의 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기가 G 인 경우에만, 상기 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기가 A 인 경우에만, 상기 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 및

(8) 핵산 시료 중의 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기가 C 인 경우에만, 상기 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기가 T 인 경우에만, 상기 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트.

상기에서는, (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (5)∼(8)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (5), (7), 및 (8)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산 세트를 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, 1648 위치의 염기가 A 인 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머 및/또는 1648 위치의 염기가 G 인 글리코프로테인 Ia 유전자에 있어서 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, 글리코프로테인 Ia 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트,

(2) 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, 190 위치의 염기가 G 인 케모카인 수용체 2 유전자에 있어서 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머 및/또는 190 위치의 염기가 A 인 케모카인 수용체 2 유전자에 있어서 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머와, 케모카인 수용체 2 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트,

(3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 및

(4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, 825 위치의 염기가 C 인 G-단백질β3 서브 유닛 유전자에 있어서 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머 및/또는 825 위치의 염기가 T 인 G-단백질β3 서브 유닛 유전자에 있어서 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트.

상기에서는, (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(4)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (2)∼(4)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산 세트를 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(5) 종양 괴사 인자α 유전자의 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, -850 위치의 염기가 C 인 종양 괴사 인자α 유전자에 있어서 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머 및/또는 -850 위치의 염기가 T 인 종양 괴사 인자α 유전자에 있어서 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머와, 종양 괴사 인자α 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트,

(6) 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, -238 위치의 염기가 G 인 종양 괴사 인자α 유전자에 있어서 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머 및/또는 -238 위치의 염기가 A 인 종양 괴사 인자α 유전자에 있어서 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머와, 종양 괴사 인자α 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트,

(7) 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, 3494 위치의 염기가 G 인 인슐린 수용체 기질 1 유전자에 있어서 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머 및/또는 3494 위치의 염기가 A 인 인슐린 수용체 기질 1 유전자에 있어서 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트, 및

(8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트로서, 1018 위치의 염기가 C 인 글리코프로테인 Ibα 유전자에 있어서 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머 및/또는 1018 위치의 염기가 T 인 글리코프로테인 Ibα 유전자에 있어서 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 센스 프라이머와, 글리코프로테인 Ibα 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산 세트.

상기에서는, (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (5)∼(8)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (5), (7), 및 (8)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산 세트를 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(1) 1648 위치의 염기가 A 인 글리코프로테인 Ia 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 1648 위치의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표지물질로 표지된 제1 핵산과, 1648 위치의 염기가 G 인 글리코프로테인 Ia 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 1648 위치의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표지 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 글리코프로테인 Ia 유전자의 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 글리코프로테인 Ia 유전자의 1648 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3 핵산으로 이루어지는 핵산 세트,

(2) 190 위치의 염기가 G 인 케모카인 수용체 2 유전자의 센스 가닥에 있어서 190 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하여 또한 제1 표식 물질로 표지된 제1 핵산과, 190 위치의 염기가 A 인 케모카인 수용체 2 유전자의 센스 가닥에 있어서 190 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하여 또한 제2 표식 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 케모카인 수용체 2 유전자의 안티센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 케모카인 수용체 2 유전자의 190 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3 핵산으로 이루어지는 핵산 세트,

(3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 1100 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 제1 핵산 및 제2 핵산과, 1100 위치가 C 인 아포리포프로테인 C-III 유전자를 주형으로 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산을 이용하여 증폭되는 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표식 물질로 표지된 제3 핵산과, 및 1100 위치가 T 인 아포리포프로테인 C-III 유전자를 주형으로서 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산을 이용하여 증폭되는 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표식 물질로 표지된 제4 핵산으로 이루어지는 핵산 세트,

(4) 825 위치의 염기가 C 인 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 825 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표식 물질로 표지된 제1 핵산과, 825 위치의 염기가 T 인 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 825 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표식 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 825 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3 핵산으로 이루어지는 핵산 세트.

상기에서는, (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(4)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하여, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면(2)∼(4)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산 세트를 포함하여 이루어지는 유전자형 검출용 키트:

(5) -850 위치의 염기가 C 인 종양 괴사 인자α 유전자의 센스 가닥에 있어서 -850 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표식 물질로 표지된 제1 핵산과, -850 위치의 염기가 T 인 종양 괴사 인자α 유전자의 센스 가닥에 있어서-850 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표식 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 종양 괴사 인자α 유전자의 안티센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 종양 괴사 인자α 유전자의-850 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3 핵산으로 이루어지는 핵산 세트,

(6) -238 위치의 염기가 G 인 종양 괴사 인자α 유전자의 센스 가닥에 있어서 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표식 물질로 표지된 제1 핵산과, -238 위치의 염기가 A 인 종양 괴사 인자α 유전자의 센스 가닥에 있어서-238 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표식 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 종양 괴사 인자α 유전자의 안티센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 종양 괴사 인자α 유전자의 -238 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3핵산으로 이루어지는 핵산 세트,

(7) 3494 위치의 염기가 G 인 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표식 물질로 표지된 제1 핵산과, 3494 위치의 염기가 A 인 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표식 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 3494 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3핵산으로 이루어지는 핵산 세트, 및

(8) 1018 위치의 염기가 C 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제1 표식 물질로 표지된 제1 핵산과, 1018 위치의 염기가 T 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 안티센스 가닥에 있어서 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 제2 표식 물질로 표지된 제2 핵산과, 및 글리코프로테인 Ibα 유전자의 센스 가닥의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리디제이션하며 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산과 동시에 사용되어 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치의 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제3핵산으로 이루어지는 핵산 세트.

상기에서는, (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (5)∼(8)의 속에서 2종 이상을 임의로 선택하여 군으로 하여, 이러한 군으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면 (5), (7), 및 (8)로 이루어지는 군(후술하는 실시예에서 오즈비가 상위 3 위까지인 다형성을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2종 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.

상기 각 키트는, 키트의 사용 방법에 따라 1 또는 2 종 이상의 시약(버퍼, 반응용 시약, 검출용 시약 등) 등을 조합할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

<실시예 1> 유전자 다형성의 선택

PubMed[National Center for Biological Information(NCBI)], Online Mendelian inheritance in Men(NCBI), Single Nucleotide Polymorphism(NCBI) 등의 다수의 공적데이터 베이스를 이용하여, 지금까지의 보고된 유전자 중에서 혈관 생물학, 혈소판·백혈 구생물학, 응고선용계, 지질·당·기타 대사인자 등의 종합적측면으로 관동맥경화, 관동맥연축, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등과 관련성 있는 것으로 추정되는 71개의 유전자를 선별하였다. 또 이들 유전자에 존재하는 다형성 중에서 프로모터 영역이나 엑손에 존재하거나, 또는 스플라이싱 도너 부위나 억셉터-부위에 위치하여, 유전자 산물의 기능 변화와 관련이 예상되는 것을 중심으로 112종의 다형성을 선택하였다(도 1 및 도 2).

<실시예 2> 유전자 다형성의 결정

1994년 7월로부터 2001년 12월의 사이에 15개의 시설에 진찰(또는 입원)한 일본인 1940명(남성 1107명, 여성 833명)을 대상으로 하였다. 고혈압은 1067 사례(남성 574 사례, 여성 493 사례)이며, 수축기 혈압 ≥ 140mmHg 또는 확장기 혈압 ≥ 90mmHg, 또는 이들 모두에 해당하며, 강압약을 복용하고 있는 사례이다. 관동맥질환, 심장판질환, 선천성 심혈관질환, 또는 신장질환·내분비질환 등 2 차성 고혈압을 초래하는 질환을 가지는 사례는 제외하였다. 대조군은 정상혈압(수축기 혈압<140mmHg, 확장기 혈압<90mmHg)의 873 사례(남성 533 사례, 여성 340 사례)이며, 종래의 관동맥질환 위험인자, 즉 흡연(하루 10개 이상), 비만(body mass index > 26 kg/m²), 당뇨병(공복시 혈당 > 126mg/dL 또는 헤모글로빈 A1c > 6.5%, 또는 모두에 해당됨), 고지혈증(혈청 총 콜레스테롤 > 220mg/dL), 고요산혈증(남성은 혈청요산 > 7.7mg/dL, 여성은 혈청다산 > 5.5mg/dL)중 적어도 하나의 질환을 갖지만 관동맥질환을 갖지 않는 사례이다. 이들 대조군은 안정 상태에서 심전도가 정상이며, 운동부하시험에서도 심근의 허혈성 변화는 인지되지 않았다. 혈압은 미국심장협회의 지침에 따라서, 좌위로 측정하였다(Perloff D, Grim C, Flack J, Frohlich ED, Hill M, McDonald M, Morgenstern BZ. Human blood pressure determination by sphygmomanometry. Circulation. 1993; 88: 2640-2470.).

각각의 대상으로부터 정맥혈 7mL 을 50 mmol/L EDTA-2Na를 포함하는 튜브에 채혈하여, 게놈 DNA를 DNA 추출키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 이용하여 추출하였다. 단일염기다형성의 유전자형의 결정은, 형광·발광법에 의한 대립 유전자 특이적 프라이머·프로브 측정 시스템(토요보 진아날리시스, 쓰루가, 일본)에 의해 수행하였다(도 3). 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편은 5'말단에 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC) 또는 텍사스 레드(Texas red: TxR)로 표식한 두 가지의 대립 유전자 특이적 센스(또는 안티센스) 프라이머와, 5'말단을 비오틴으로 표식한 안티센스(또는 센스) 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 증폭하였다. 또한 다른 방법으로, 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편은 두 가지의 대립 유전자 특이적 센스(또는 안티센스) 프라이머와 5' 말단을 비오틴으로 표지한 안티센스(또는 센스) 프라이머를 이용하거나, 또는 센스 프라이머와 5' 말단을 비오틴으로 표식한 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 반응 용액(25 μL)은 20ng의 DNA, 5 pmol의 각 프라이머, 0.2 mmol/L의 각 데옥시뉴클레오시드-3-인산, 1 - 4 mmol/L의 염화마그네슘, 1U의 DNA 폴리머라아제(rTaq or KODplus; 토요보, 오오사까, 일본)을 포함하며, 각각의 DNA 폴리머라아제 완충액을 이용하였다. 증폭 과정은 초기변성이 95℃에서 5분, 35 내지 45 사이클로 변성이 95℃에서 30초, 어닐링이 55-67.5℃에서 30초, 신장이 72℃에서 30초, 그리고 최종신장이 72℃에서 2분으로 실시하였다.

형광법에 의한 유전자형의 결정으로, 증폭한 DNA는 96웰 플레이트의 각 웰에 두고 스트렙타비딘(Streptavidin)이 접합된 마그네틱 비드를 포함하는 용액상에서 실온으로 배양하였다. 상기 플레이트는 자기 스탠드 상에 두고, 각 웰로부터 상청액을 수득하고, 0.01M NaOH를 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰에 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더에 의해 FITC는 여기·형광파장이 485와 538nm, TxR는 여기·형광파장이 584와 612nm에서 형광을 측정하였다. 또한 발광법에 의한 유전자형의 결정으로, 증폭한 DNA는 0.3M NaOH로 변성시키고, 96웰 플레이트의 각 웰의 바닥면에 고정하고 싶은 임의의 대립 유전자 특이적 보족(補足) 프로브와 35-40%의 포름아미드를 포함하는 하이브리디제이션 완충액으로 37℃, 30분간 하이브리디제이션을 실시하였다. 웰을 충분히 세척한 후, 알칼리포스파타아제가 접합된 스트렙타비딘을 각 웰에 가하고, 37℃, 15분간 진탕 배양하였다. 웰을 다시 세척하고, 0.8 mM의 2-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸리움(모노소듐 염)(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium(monosodium salt)과 0.4 mM 5-브로모-4-트로로-3-인돌일 포스페이트 p-톨루이딘 염(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt)를 포함하는 용액을 첨가한 후 450nm 에서 흡광도를 측정하였다.

본 방법에 의한 유전자형 결정의 정밀도를 확인하기 위하여, 50명의 DNA 샘플을 무작위로 선택하고 PCR-제한효소 분절길이 다형성(PCR-RFLP)법 또는 PCR 산물의 직접 염기서열 결정법을 수행하였다. 모든 샘플에서 대립 유전자 특이적 프라이머·프로브 측정 시스템에 의해 결정된 유전자형은, PCR-RFLP 또는 DNA 염기서열 결정법에 의해서 결정된 것과 동일하였다.

하기 관련 해석에서의 통계해석은 다음과 같이 수행하였다. 임상 데이터는 고혈압 사례와 대조군간에 언페어드 스튜던트 T 검정법(unpaired Student's t test) 또는 만-휘트니 U 검정법(Mann-Whitney U test)을 이용하여 비교하였다. 정성 데이터는 카이 스퀘어 검정법(chi-square test)에서 검정하였다. 대립 유전자빈도는 유전자 계수법(gene counting method)에 의해 추정하고, 하디-웨인버그(Hardy-Weinberg) 평형으로부터 일탈여부를 카이-스퀘어 검정법(chi-square test)로 검정하였다. 본 발명자들은 위험인자를 보정한 다인자 로지스틱 회귀 분석하였다. 고혈압을 종속인자로 하여, 연령, 신체질량지수(body mass index: BMI), 흡연상황(0= 비흡연, 1= 흡연), 대사인자(0= 당뇨병·고콜레스테롤혈증·고요산혈증의 경력 없음, 1= 경력 있음), 각 다형성의 유전자형을 독립인자로 두었다. 각각의 유전자형은 우성(dominant, 열성(recessive), 부가(additive) 유전모델로 해석하고, P 값, 오즈비, 95% 신뢰구간을 산출하였다. 조합 유전자형 해석으로, 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선택법에 의해 각각의 유전자형에 대한 오즈비를 산출하였다.

<실시예 3> 고혈압에 관련되는 다형성의 선택, 및 고혈압 위험도 진단법의 개발

이전 보고에서 본 발명자들은 71개의 후보 유전자의 112종의 다형성과 심근경색과의 관련 해석을 남성 451 사례(심근경색 219 사례, 대조군 232 사례)와 여성 458 사례(심근경색 226 사례, 대조군 232 사례)에 대해 수행하였다(Yamada Y, Izawa H, Ichihara S, et al. Prediction of risk of myocardial infarction from polymorphisms in candate genes. N Engl J Med. in press.) 상기 연구에 의해, 남성 19개, 여성 18개의 단일염기다형성이 심근경색발현과 관련성 있음을 발견하였지만, 이들 다형성군에는 고혈압의 후보 유전자도 포함되어 있었다(참조: 도 1, 도 2, 도 4). 본 실시예에서는 이들 단일염기다형성과 고혈압과의 관련에 대해 1940 사례를 통하여 대규모 관련 해석을 수행하였다.

검토한 전체 대상 1940 사례(남성 1107 사례, 여성 833 사례)의 배경 데이터를 도 5에 나타낸다. 남성은, 연령, BMI, 고요산혈증의 빈도, 혈청 크레아티닌 농도 및 수축기·확장기 혈압이 대조군에 비하여 고혈압 사례에서 유의하게 높으며, 흡연 빈도는 대조군에 비하여 고혈압 사례에서 유의적으로 낮았다. 여성은, 연령, BMI, 고콜레스테롤혈증과 고요산혈증의 빈도 및 수축기·확장기 혈압이 대조군에 비하여 고혈압 사례에서 유의적으로 높게 나타났다.

남성의 19종의 다형성, 여성의 18 종의 다형성과 고혈압과의 관련 해석으로, 연령, BMI, 및 흡연, 당뇨병, 고콜레스테롤 혈증, 고요산혈증의 빈도를 보정한 다인자 로지스틱 회귀분석시, 남녀 각각 4종의 다형성은 고혈압 이환과 유의적 관련성을 나타내었다(우성 또는 열성 유전모델 중 어느 하나가 P<0.05)(도 6). 이들 다형성의 유전자형 분포를 도 7에 나타내었다.

본 발명자들은 다인자 로지스틱 회귀분석의 단계적 변수 선별법을 실시하였다(도 8). 상기 방법의 경우, 도 6에 나타낸 각각의 다형성의 고혈압과의 관련성에서, P 값(보다 낮은 P 값)에 따라 우성 또는 열성 유전모델을 채택하였다. 이들 유전자의 염색체상의 유전자 위치는 도 8에 나타내었다.

종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor)-α 유전자의 -850C→ T와, -238G→ A 다형성은, 연쇄불평형이 없었다[pairwise linkage disequilibrium coefficient, D'(D/Dmax), of -0.310, standardized linkage disequilibrium coefficient, r, of -0.020; P = 0.613, chi-square test]. 단계별 변수 선별법에 의해 산출한 조합 유전자형으로 의한 고혈압 이환의 오즈비는, 남성은 도 9과 도 11(A)에, 여성은 도 10과 도 11(B)에 나타낸다. 남성은 4종의 다형성의 조합 유전자형(GPIa(1648A→ G)다형성, CCR2(190G→ A)다형성, ApoC-III(1100C→ T)다형성, GPβ 3(825C→ T)다형성)에 의해, 최대 오즈비 5.34를 나타낸다(도 9, 도 11(A)). 여성은 4개의 다형성의 조합 유전자형(TNFα(-850C→ T)다형성, TNFα(-238G→ A)다형성, IRS-1(3494G→ A)다형성, GPIbα(1018C→ T)다형성)에 의해, 최대 오즈비 46.86를 나타낸다(도 10, 도 11(B)).

상기와 같이, 다인자 로지스틱 회귀분석에 의해 남성은 4종, 여성은 4종의 단일염기다형성이 고혈압과 관련되었음을 확인하였다. 즉, 본 발명자들은 남성은 19종, 여성은 18종의 단일염기다형성과 고혈압과의 관련성에 대하여, 1940 사례를 통한 대규모 관련 해석을 실시하여, 남녀 각각 고혈압 이환과 관련되는 다형성을 4종씩 동정하였다. 또한, 다인자 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선별법에 의해 남성은 최대 오즈비 5.34, 여성은 최대 오즈비 46.86를 나타내는 조합 유전자형을 이용한 고혈압의 유전자 위험도 진단법을 개발하였다.

혈압은, 혈관의 구조나 긴장성 및 체액의 양과 조성을 조절하는 다양한 생물시스템의 통합일 뿐만 아니라, 이들 시스템은 계속적으로 변화되는 생리적 필요성에 대한 적응에 의해서 조절된다(Lalouel J-M, Rohrwasser A. Development of genetic hypotheses in essential hypertension. J Hum Genet. 2001; 46: 299-306.). 본 발명자들은 혈관생물학, 혈소판·백혈구생물학, 선용계, 지질·당·기타 대사인자 등의 포괄적 시점에 따라 남성 19종, 여성 18종의 단일염기다형성과 고혈압과의 관련성을 검토하였다. 실제로, 고혈압과 관련된 유전자군은 그 병태에 있어서 다채로운 역할을 수행한다. 즉, 혈관생물학(G-단백질β3 서브 유닛), 혈관의 염증(종양 괴사 인자-α), 단구·림프구 생물학(케모카인 수용체 2), 혈소판기능(글루코프로테인 Ia 및 글루코프로테인 Ibα), 지질대사(아포리포프로테인 C-III), 인슐린·글루코스대사(인슐린 수용체 기질-1) 등이다. 본 발명자들이 개발한 유전자 위험도 진단 시스템은, 고혈압 이환의 최대 오즈비가 남성은 5.34, 여성은 46.86로 나타났으며, 특히 여성의 경우 지금까지의 보고된 대규모 관련 해석중 최대의 오즈비를 나타내었다. 고혈압과 관련된 8종의 다형성 중에서, 종양 괴사 인자α 유전자의 -850C→ T와, -238G→ A 다형성이 여성의 고혈압 위험도로는 최대의 오즈비를 나타내었다. 종양 괴사 인자α 유전자 위치는 프랑스계 캐나다인에서 비만에 따르는 고혈압과 관련된 것으로 보고되었다(Pausova Z, Deslauriers B, Gaudet D, Tremblay J, Kotchen TA, Larochelle P, Cowley AW, Hamet P. Role of tumor necrosis factor-α gene locus in obesity and obesity-associated hypertension in French Canadians. Hypertension. 2000; 36: 14-19). 또한 종양 괴사 인자α 유전자의 -308A→ G 다형성은 통계적 유의성은 없으나, 본태성 고혈압과 관련되는 경향이 인지되었다(Frossard PM, Gupta A, Pravica V, Perry C, Hutchinson IV, Lukic ML. A study of five human cytokine genes in human essential hypertension. Mol Immunol. 2002; 38: 969-976.). 캐나다 원주민에서의 혈청 종양 괴사 인자α 농도는 수축기 혈압과 인슐린 저항성에 관련있는 것으로 보고되었다(Zinman B, Hanley AJG, Harris SB, Kwan J, Fantus IG. Circulating tumor necrosis factor-α concentrations in a native Canadian population with high rates of type 2diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 272-278.). 또한 종양 괴사 인자α는 강력한 혈관 수축 물질인 엔도텔린-1(endothelin-1)의 생산을 촉진하고(Kahaleh MB, Fan PS. Effect of cytokines on the production of endothelin by endothelial cells. Clin Exp Rheumatol. 1997; 15: 163-167.), 혈청중의 두 물질의 농도와 비례 관계를 나타내는 것으로 비만 사례에서 확인되었다.(Winkler G, Lakatos P, Salamon F, Nagy Z, Speer G, Kovacs M, Harmos G, Dworak O, Cseh K. Elevated serum TNF-α level as a link between endothelial dysfunction and insulin resistance in normotensive obese patients. Diabetes Med. 1999; 16: 207-211). 상기 지견 및 본 발명자들의 상기 결과로부터, 종양 괴사 인자α 유전자는 고혈압 감수성 유전자 후보이다. 다른 6 종의 다형성 중에서, G-단백질 β3 서브 유닛 유전자의 825C→ T 다형성은 고혈압과 관련있는 것이 보고되어 있다(Siffert W, Rosskop D, Siffert G, Busch S, Moritz A, Erbel R, Sharma AM, Ritz E, Wichmann H-E, Jakobs KH, Horsthemke B. Association of a human G-protein β 3subunit variant with hypertension. Nat Genet. 1998; 18: 45-48.). 또한 아포리포프로테인 C-III 유전자 다형성은 혈압과 관련있는 것으로 보고되어 있다(Tas S, Abdella NA. Blood pressure, coronary artery disease, and glycaemic control in type 2diabetes mellitus: relation to apolipoprotein-CIII gene polymorphism. Lancet. 1994; 343: 1994-1995.). 케모카인 수용체 2 유전자와 인슐린 수용체 기질 1 유전자는 고혈압의 병태에 관여하는 것으로 보고되고 있다(Bush E, Maeda N, Kuziel WA, Dawson TC, Wilcox JN, DeLeon H, Taylor WR. CC chemokine receptor 2is required for macrophage infiltration and vascular hypertrophy in angiotensin II-induced hypertension. Hypertension. 2000; 36: 360-363., Abe H, Yamada N, Kamata K, Kuwaki T, Shimada M, Osuga J, Shionoiri F, Yahagi N, Kadowaki T, Tamemoto H, Ishibashi S, Yazaki Y, Makuuchi M. Hypertension, hypertriglyceridemia, and impaired endothelium-dependent vascular relaxation in mice lacking insulin receptor substrate-1.J Clin Invest. 1998; 101: 1784-1788.). 또한, 혈소판의 활성화는 본태성 고혈압의 병태에서 기능하는 것으로 보고되어 있다(Andrioli G, Ortolani R, Fontana L, Gaino S, Bellavite P, Lechi C, Minuz P, Manzato F, Tridente G, Lechi A. Study of platelet adhesion in patients with uncomplicated hypertension. J Hypertens. 1996; 14: 1215-1221., Dockrell ME, Walker BR, Noon JP, Watt GC, Williams BC, Webb DJ. Platelet aggregation in young men contrasting predisposition to high blood pressure. Am J Hypertens. 1999; 12: 115-119., Bereczki C, Tur S, Nemeth I, Sallai E, Torday C, Nagy E, Haszon I, Papp F. The roles of platelet function, thromboxane, blood lipids, and nitric oxide in hypertension of children and adolescents. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2000; 62: 293-297.). 글리코프로테인 Ia와 글리코프로테인 Ibα 유전자의 다형성은 관동맥질환과 관련되는 것이 보고되어 있지만(Kroll H, Gardemann A, Fechter A, Haberbosch W, Santoso S. The impact of the glycoprotein Ia collagen receptor subunit A 1648G gene polymorphism on coronary artery disease and acute myocardial infarction. Thromb Haemost. 2000; 83: 392-396., Murata M, Matsubara Y, Kawano K, et al. Coronary artery disease and polymorphisms in a receptor mediating shear stress-dependent platelet activation. Circulation. 1997; 96: 3281-6.), 이들 다형성과 고혈압과의 관련은 보고되어 있지 않다.

본 실시예로 검토한 몇 종의 다형성은, 근접하여 존재하는 고혈압 발생과 실제적으로 관련되는 유전자의 다형성과 연쇄불평형이 있을 가능성이 있다. 그러나, 저자들의 결과는, 글리코프로테인 Ia, 케모카인 수용체 2 유전자, 아포리포프로테인 C-III유전자, G-단백질β3 서브 유닛 유전자는 일본인 남성에 대하여, 종양 괴사 인자α유전자, 인슐린 수용체 기질 1 유전자, 글리코프로테인 Ibα 유전자는 일본인 여성에 대하여 고혈압 감수성 유전자라는 것을 나타내었다. 또한, 이들 유전자 다형성을 조합함으로써 유전자형이 고혈압의 유전적 위험도 진단에 유용함을 나타내었다. 본 발명자들의 유전자 진단법은 고혈압의 1차 예방뿐 아니라 고혈압이 원인으로 발생되는 심혈관질환, 뇌졸중, 신장질환 등의 예방에도 공헌할 수 있다고 생각된다.

본 발명은, 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다. 특허청구의 범위의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 안출할 수 있는 범위에서 여러 가지 변형 양태도 본 발명에 포함된다.

본 발명에 의해 고혈압에 관련되는 유전자 다형성이 해석되고 핵산 시료의 유전자형이 검출된다. 상기 유전자형의 검출에 의해서 얻어지는 다형성 정보를 이용함으로써, 정밀도 및 예측률이 높은 고혈압 위험도를 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명은 고혈압의 발생 위험도를 사전에 파악할 수 있는 유효한 수단으로 제공되며, 고혈압의 1차 예방은 물론 고혈압이 원인으로 생기는 심혈관질환, 뇌졸중, 신장질환 등을 예방하는데 공헌할 수 있는 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 의하여, 고혈압의 진단에 유용한 부가적 정보가 수집되어, 보다 적절한 치료를 가능케 하며 예후의 개선 등을 도모할 수 있다. 또한 본 발명은 고혈압의 발생 메커니즘을 해명하는 데에 있어서 유효한 정보를 제공하는 것으로부터, 고혈압의 예방법 확립에 이르기까지 매우 중요한 수단으로 제공된다.

<110> NAGOYA INDUSTRIAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTE GIFU INTERNATIONAL INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY YAMADA, Yoshiji YOKOTA, Mitsuhiro <120> Method for diagnosing a risk of hypertension <130> C0200701 <150> JP P2002-280034 <151> 2002-09-25 <160> 36 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5373 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaattcctgc aaacccagcg caactacggt cccccggtca gacccaggat ggggccagaa 60 cggacagggg ccgcgccgct gccgctgctg ctggtgttag cgctcagtca aggcatttta 120 aattgttgtt tggcctacaa tgttggtctc ccagaagcaa aaatattttc cggtccttca 180 agtgaacagt ttgggtatgc agtgcagcag tttataaatc caaaaggcaa ctggttactg 240 gttggttcac cctggagtgg ctttcctgag aaccgaatgg gagatgtgta taaatgtcct 300 gttgacctat ccactgccac atgtgaaaaa ctaaatttgc aaacttcaac aagcattcca 360 aatgttactg agatgaaaac caacatgagc ctcggcttga tcctcaccag gaacatggga 420 actggaggtt ttctcacatg tggtcctctg tgggcacagc aatgtgggaa tcagtattac 480 acaacgggtg tgtgttctga catcagtcct gattttcagc tctcagccag cttctcacct 540 gcaactcagc cctgcccttc cctcatagat gttgtggttg 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tactacggcc ctgaggaccc ccagcacaag ccagtcctct cctactactc 2880 attgccaaga tcctttaagc acacccagcg ccccggggag ccggaggagg gtgcccggca 2940 tcagcacctc cgcctttcca ctagctctgg tcgccttctc tatgctgcaa cagcagatga 3000 ttcttcctct tccaccagca gcgacagcct gggtggggga tactgcgggg ctaggctgga 3060 gcccagcctt ccacatcccc accatcaggt tctgcagccc catctgcctc gaaaggtgga 3120 cacagctgct cagaccaata gccgcctggc ccggcccacg aggctgtccc tgggggatcc 3180 caaggccagc accttacctc gggcccgaga gcagcagcag cagcagcagc ccttgctgca 3240 ccctccagag cccaagagcc cgggggaata tgtcaatatt gaatttggga gtgatcagtc 3300 tggctacttg tctggcccgg tggctttcca cagctcacct tctgtcaggt gtccatccca 3360 gctccagcca gctcccagag aggaagagac tggcactgag gagtacatga agatggacct 3420 ggggccgggc cggagggcag cctggcagga gagcactggg gtcgagatgg gcagactggg 3480 ccctgcacct cccggggctg ctagcatttg caggcctacc cgggcagtgc ccagcagccg 3540 gggtgactac atgaccatgc agatgagttg tccccgtcag agctacgtgg acacctcgcc 3600 agctgcccct gtaagctatg ctgacatgcg aacaggcatt gctgcagagg aggtgagcct 3660 gcccagggcc accatggctg ctgcctcctc atcctcagca gcctctgctt ccccgactgg 3720 gcctcaaggg gcagcagagc tggctgccca ctcgtccctg ctggggggcc cacaaggacc 3780 tgggggcatg agcgccttca cccgggtgaa cctcagtcct aaccgcaacc agagtgccaa 3840 agtgatccgt gcagacccac aagggtgccg gcggaggcat agctccgaga ctttctcctc 3900 aacacccagt gccacccggg tgggcaacac agtgcccttt ggagcggggg cagcagtagg 3960 gggcggtggc ggtagcagca gcagcagcga ggatgtgaaa cgccacagct ctgcttcctt 4020 tgagaatgtg tggctgaggc ctggggagct tgggggagcc cccaaggagc cagccaaact 4080 gtgtggggct gctgggggtt tggagaatgg tcttaactac atagacctgg atttggtcaa 4140 ggacttcaaa cagtgccctc aggagtgcac ccctgaaccg cagcctcccc cacccccacc 4200 ccctcatcaa cccctgggca gcggtgagag cagctccacc cgccgctcaa gtgaggattt 4260 aagcgcctat gccagcatca gtttccagaa gcagccagag gaccgtcagt agctcaactg 4320 gacatcacag caggtcgttt catggtgaca aagtcagaag acaaaactgc ttttaacctt 4380 gtccttgaat tctgttcttc gcctctgccc cttcctgttc tttcccactg cttcctcagg 4440 gagaatgcac ttacattctc agggcataca agatgctcac ccacactgac attggcagag 4500 agtcaaacaa acatgtagga gcagccacag gagggctttt tcgtttgagg aattcccaag 4560 tgaagtagtt actgcagtat ttttaaacat atatcctatg ccagttctgc gttttgtaga 4620 gttcctccgt aagaagcttg atttgtttgt tgaagttttc ttttcactat atatttaggt 4680 cagcccctgg aaggacagtt ctacaaaaaa tacccgttaa cacaggggct aaacccttcc 4740 ttatcttaaa ctatcttaat agtttctggg agcccttaag ggtgatctta tcaagttgtt 4800 ctctgtactt ttgttctgtg atttcataat actagggcaa cataaacagc agcgggaagc 4860 attgatttct attcatcctg ccctaaaaag atcaggagta agagcttttt agaaatatgt 4920 atttagagag aagtacctat ctattttgtg atctctcaag aaagtaatta tgggtgacgt 4980 tctccttttg ttcatgtacc aggatttgtg aaatattatt cacacaaccg acccaccatc 5040 ccacgggcct ggcctctctt gtacaggata tgcaggaaac tctgtatgtg tctgggaccc 5100 attattaaga gttatgggag ttcatcctag gatgtctgcc ttatagttat ctcttcttct 5160 tgcactgaga cattacagat atcatttggg ggctactata tatcttctgt aaaattactt 5220 ttatttgttg aagaagaatg catactaagt caggaacatg ccttaatttg ttttgttttg 5280 caattgagta gaagggctaa actgtatccc tccactttta gggttatttg cctgtgtgcc 5340 tttaagttca aaagtagaca ccacagtaaa tgctgaaagt tggctttagg tcttctgtgg 5400 ctaatgccgt attaaaaatg aaaaacattt gtggtagaaa ttagcctgcc cttcgttctg 5460 ttgatcctgt tttctggtgg tcataattgt gggtagaaga gagtacagtt tgcaaataat 5520 gtgatgagtt ggcaatgcag aagtttccag catttggaaa cactttactc tgacaaactg 5580 attatcttgt gaattttatc tatgctccac agaatgagct tttaaaagca ctgatttttc 5640 ttaatttgtg tccattcata agaaattaat ctgtgccctg gtttcctatt gacaggtatt 5700 tatttatcat gtgttcatag tcttcttaat tctgtttcca atatttgatc catataattc 5760 tctattttat aaagcaagaa aaaggtatat gaacactcaa atgaagattt tgggtgatat 5820 gttacaaaaa gcatttattt gatcagtatt tacttcaaca tttattttca tcattcacta 5880 gaagaaagat ttaattgtgt atatcaacat cagtagtaca aatcttgtta tatcaaatga 5940 tgtttttggg agttcagaat ccctcaacac tttaagcatt tgtattataa agtgcctcat 6000 tggtaaaata atgagaattt gaagaaaacc agcccagcag aactaaaatt ttggttttaa 6060 aggagataaa gagaataagt ttttcttact tgtcatctta atttgtttag gtttcttttt 6120 atagagtaga ataaatgatg tttgctctga ag 6152 <210> 7 <211> 2480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gacgctctgt gccttcggag gtctttctgc ctgcctgtcc tcatgcctct cctcctcttg 60 ctgctcctgc tgccaagccc cttacacccc caccccatct gtgaggtctc caaagtggcc 120 agccacctag aagtgaactg tgacaagagg aatctgacag cgctgcctcc agacctgccg 180 aaagacacaa ccatcctcca cctgagtgag aacctcctgt acaccttctc cctggcaacc 240 ctgatgcctt acactcgcct cactcagctg aacctagata ggtgcgagct caccaagctc 300 caggtcgatg ggacgctgcc agtgctgggg accctggatc tatcccacaa tcagctgcaa 360 agcctgccct tgctagggca gacactgcct gctctcaccg tcctggacgt ctccttcaac 420 cggctgacct cgctgcctct tggtgccctg cgtggtcttg gcgaactcca agagctctac 480 ctgaaaggca atgagctgaa gaccctgccc ccagggctcc tgacgcccac acccaagctg 540 gagaagctca gtctggctaa caacaacttg actgagctcc ccgctgggct cctgaatggg 600 ctggagaatc tcgacaccct tctcctccaa gagaactcgc tgtatacaat accaaagggc 660 ttttttgggt cccacctcct gccttttgct tttctccacg ggaacccctg gttatgcaac 720 tgtgagatcc tctattttcg tcgctggctg caggacaatg ctgaaaatgt ctacgtatgg 780 aagcaaggtg tggacgtcaa ggccatgacc tctaacgtgg ccagtgtgca gtgtgacaat 840 tcagacaagt ttcccgtcta caaataccca ggaaaggggt gccccaccct tggtgatgaa 900 ggtgacacag acctatatga ttactaccca gaagaggaca ctgagggcga taaggtgcgt 960 gccacaagga ctgtggtcaa gttccccacc aaagcccata caaccccctg gggtctattc 1020 tactcatggt ccactgcttc tctagacagc caaatgccct cctccttgca tccaacacaa 1080 gaatccacta aggagcagac cacattccca cctagatgga ccccaaattt cacacttcac 1140 atggaatcca tcacattctc caaaactcca aaatccacta ctgaaccaac cccaagcccg 1200 accacctcag agcccgtccc ggagcccgcc ccaaacatga ccaccctgga gcccactcca 1260 agcccgacca ccccagagcc cacctcagag cccgccccca gcccgaccac cccggagccc 1320 accccaatcc cgaccatcgc cacaagcccg accatcctgg tgtctgccac aagcctgatc 1380 actccaaaaa gcacattttt aactaccaca aaacccgtat cactcttaga atccaccaaa 1440 aaaaccatcc ctgaacttga tcagccacca aagctccgtg gggtgctcca agggcatttg 1500 gagagctcca gaaatgaccc ttttctccac cccgactttt gctgcctcct ccccctgggc 1560 ttctatgtct tgggtctctt ctggctgctc tttgcctctg tggtcctcat cctgctgctg 1620 agctgggttg ggcatgtgaa accacaggcc ctggactctg gccaaggtgc tgctctgacc 1680 acagccacac aaaccacaca cctggagctg cagaggggac ggcaagtgac agtgccccgg 1740 gcctggctgc tcttccttcg aggttcgctt cccactttcc gctccagcct cttcctgtgg 1800 gtacggccta atggccgtgt ggggcctcta gtggcaggaa ggaggccctc agctctgagt 1860 cagggtcgtg gtcaggacct gctgagcaca gtgagcatta ggtactctgg ccacagcctc 1920 tgagggtggg aggtttgggg accttgagag aagagcctgt gggctctcct attggaatct 1980 agttgggggt tggaggggta aggaacacag ggtgataggg gaggggtctt agttcctttt 2040 tctgtatcag aagccctgtc ttcacaacac aggcacacaa tttcagtccc agccaaagca 2100 gaaggggtaa tgacatggac ttggcggggg gacaagacaa agctcccgat gctgcatggg 2160 gcgctgccag atctcacggt gaaccatttt ggcagaatac agcatggttc ccacatgcat 2220 ttatgcacag aagaaaatct ggaaagtgat ttatcaggat gtgagcactc gttgtgtctg 2280 gatgttacaa atatgggtgg ttttattttc tttttccctg tttagcattt tctagttttc 2340 ttatcaggat gtgagcactc gttgtgtctg gatgttacaa atatgggtgg ttttattttc 2400 tttttccctg tttagcattt tctagttttc cactattatt gtatattatc tgtataataa 2460 aaaataattt tagggttggg 2480 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n stands for any base <400> 8 gagtctacct gtttactatc aanaa 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n stands for any base <400> 9 gagtctacct gtttactatc aanga 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 accagtacta aagcaaatta aact 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n stands for any base <400> 11 gcagtttatt aagatgaggn cg 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> n stands for any base <400> 12 ttgcagttta ttaagatgag gntg 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 13 ggtgctccct gtcataaatt tga 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 14 ccttctcagc ttcatgcagg 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 15 gtcttggtgg cgtgcttca 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n stands for any base <400> 16 tctgcggcat cacgtncg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n stands for any base <400> 17 tctgcggcat cacgtntg 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 18 gaatagtagg cggccactga 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n stands for any base <400> 19 tctacatggc cctgtcttng t 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n stands for any base <400> 20 ctctacatgg ccctgtcttn at 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 21 ctctacatgg ccctgtcttt at 22 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n stands for any base <400> 22 ccccatcctc cctgctncg 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n stands for any base <400> 23 ccccatcctc cctgctntg 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 24 agtcagtggc ccagaagacc 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n stands for any base <400> 25 gggccctgca cctccngg 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n stands for any base <400> 26 gggccctgca cctccnag 18 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 27 gggtaggcct gcaaatgcta 20 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n stands for any base <400> 28 cccagggctc ctgncg 16 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n stands for any base <400> 29 ccccagggct cctgntg 17 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 30 tgagcttctc cagcttgggt g 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 31 cagcttcatg cagggctaca 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 32 cagcttcatg cagggttaca 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n stands for any base <400> 33 acatggccct gtcttngtta ag 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n stands for any base <400> 34 acatggccct gtcttnatta ag 22 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n stands for any base <400> 35 cacctccngg ggctgctag 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n stands for any base <400> 36 cacctccnag ggctgctag 19

Claims (8)

1. 하기 공정(a)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:

   (a) 핵산 시료로부터, 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정,

   (1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성,

   (2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성,

   (3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성, 및

   (4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성.
2. 하기 공정(b)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:

   (b) 핵산 시료로부터, 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정,

   (5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성,

   (6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성,

   (7) 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성, 및

   (8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성.
3. 하기 공정 (i)∼(iii)을 포함하는 고혈압의 위험도 진단 방법:

   (i) 핵산 시료로부터, 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정;

   (1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성,

   (2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성,

   (3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성, 및

   (4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성,

   (ii) 상기 공정에 의해서 얻어지는 다형성 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및

   (iii) 결정된 유전자형으로부터 고혈압의 유전적 위험도를 구하는 공정.
4. 하기 공정(iv)∼(vi)을 포함하는 고혈압의 위험도 진단 방법,

   (iv) 핵산 시료에서의, 하기(5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 다형성을 해석하는 공정;

   (5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호-850 위치의 다형성,

   (6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호-238 위치의 다형성,

   (7) 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 염기번호3494 위치의 다형성, 및

   (8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호1018 위치의 다형성,

   (v) 상기 공정에 의해서 얻어지는 다형성정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및

   (vi) 결정된 유전자형으로부터 고혈압의 유전적 위험도를 구하는 공정.
5. 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:

   (1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

   (4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 염기번 호825 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.
6. 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:

   (5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (7) 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

   (8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.
7. 하기 (1)∼(4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산이 불용성 지지체에 고정된 고정화 핵산:

   (1) 글리코프로테인 Ia 유전자의 염기번호 1648 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (2) 케모카인 수용체 2 유전자의 염기번호 190 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (3) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 1100 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

   (4) G-단백질β3 서브 유닛 유전자의 염기번호 825 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.
8. 하기 (5)∼(8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 핵산이 불용성 지지체에 고정된 고정화 핵산:

   (5) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -850 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (6) 종양 괴사 인자α 유전자의 염기번호 -238 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산,

   (7) 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 염기번호 3494 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산, 및

   (8) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형성을 해석하기 위한 핵산.