KR102501922B1 - 성장분화인자 15 효능제 화합물 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

성장분화인자 15 효능제 화합물 및 이를 사용하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102501922B1
KR102501922B1 KR1020207027912A KR20207027912A KR102501922B1 KR 102501922 B1 KR102501922 B1 KR 102501922B1 KR 1020207027912 A KR1020207027912 A KR 1020207027912A KR 20207027912 A KR20207027912 A KR 20207027912A KR 102501922 B1 KR102501922 B1 KR 102501922B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
val
pro
ser
leu
lys
Prior art date
Application number
KR1020207027912A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200128091A (ko
Inventor
말고르자타 도나타 곤치아르즈
빅터 에이치. 오붕구
리차드 토드 피커드
Original Assignee
일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일라이 릴리 앤드 캄파니 filed Critical 일라이 릴리 앤드 캄파니
Publication of KR20200128091A publication Critical patent/KR20200128091A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102501922B1 publication Critical patent/KR102501922B1/ko

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495Transforming growth factor [TGF]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04Anorexiants; Antiobesity agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06Antihyperlipidemics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475Growth factors; Growth regulators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/30Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

체중 감소를 유도하고, 당뇨병, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만을 치료하는 화합물이 본원에 제공된다. 또한, 이러한 화합물을 함유하는 제약 조성물 및 이러한 화합물 및 조성물의 치료 용도가 제공되며, 여기서, 이러한 화합물은 연장된 작용 시간 및 기타 유리한 특성을 갖는 GDF15 효능제로서 작용한다.

Description

성장분화인자 15 효능제 화합물 및 이를 사용하는 방법
본 개시내용은 생물학 및 의약에 관한 것으로, 보다 특히, 연장된 작용 시간 및 다른 유리한 특성을 갖는 성장분화인자 15(growth differentiation factor 15, GDF15) 효능제 화합물을 포함하는 화합물 및 조성물, 뿐만 아니라 체중 감소를 유도하고, 당뇨병, 이상지질혈증, 비알콜성 지방간염(NASH) 및/또는 비만을 치료하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
GDF15(MIC-1, NAG-1로도 알려짐)는 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta, TGFβ) 슈퍼패밀리에 속하는 시스테인(Cys, C) 노트(knot) 단백질이다. 이의 순환 농도는 암 악액질(cachexia) 및 대사와 같은 다양한 생물학적 기능과 관련되어 있다(문헌 [Emmerson et al. (2017) Nat. Med. 23:1215-1219] 참조). 성숙 인간 GDF15(서열식별번호 1)는 112 개의 아미노산 펩티드이다. 순환 GDF15는 성숙 단백질의 동종이량체(25 kDa)를 형성하는데, 이는 동종이량체 각각의 쇄 상의 서열식별번호 1의 77번 위치의 Cys 잔기(서열식별번호 2의 316번 위치에 상응함) 사이의 하나의 쇄간 이황화 결합으로 보고된 것을 통해 형성된다. GDF15의 생물학적 활성을 위해 동종이량체 형성이 요구된다고 알려져있다(국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/147742 참조).
보고된 성숙 GDF15 동종이량체의 많은 생물학적 기능 중, 에너지 항상성 조절은 이의 비만 및 제2형 당뇨병(T2D)에 대한 치료 가능성으로 인해 주목을 받고 있다. 성숙 GDF15 동종이량체의 활성과 에너지 항상성 사이의 관련성은 성숙 GDF15의 혈청 레벨의 증가가 진행성 전립선암을 갖는 개체에서 체중 감소와 상호 관련되어 있다는 관찰에 입각한 것이다(문헌 [Emmerson et al. (2017)]).
또한, 재조합 GDF15를 투여하거나, 또는 종양 이종이식(xenograft)에서의 이의 발현 및 분비를 통해 마우스에서 GDF15를 증가시키는 것은, GDF15가 음식 섭취를 감소시키고 에너지 소비를 증가시키는 이의 능력을 통해 체중 손실을 유도한다는 것을 보여준다. 또한, GDF15를 과다발현하는 트랜스제닉 마우스는 식이-유도된 비만에 대해 내성을 갖고, 개선된 글루코스 내성을 보인 반면, GDF15 녹아웃 마우스는 증가된 체중 및 지방량을 보였다. GDF15-유도된 체중 감소는 추가적으로 염증 반응을 감소시키고 설치류에서 수명을 증가시키는 것으로 나타났다.
신경교 세포-유래된 신경영양 인자(glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF) 수용체 알파-유사체(GFRAL)가 GDF15에 대한 리간드 결합 수용체로 확인되었다. GFRAL-결핍 마우스뿐만 아니라 항-GFRAL 중화 모노클로날 항체가 투여된 래트에서의 GDF15의 식욕억제 효과 상실은 GFRAL가 GDF15의 대사 효과를 주로 책임지고 있다는 것을 보여주었다(문헌 [Emmerson et al. (2017)]).
성숙 순환 인간 GDF15 동종이량체 효능제의 자연 반감기(t½)는 비교적 짧다(약 2 내지 3 시간). 그러나, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/017710은 일반적으로 결정가능 조각(Fc) 영역과의 접합을 포함하는 다양한 접합을 통해 GDF15 효능제의 t½을 연장시키는 것을 기술하고 있다.
체중 감소를 유도하고, T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만을 치료하기 위한 요법에 사용될 수 있는, 연장된 작용 시간을 갖는 생물학적으로 활성인 GDF15 화합물에 대한 요구가 존재한다. 치료적으로 바람직한 화합물은 GFRAL 수용체를 효능화시켜 유리한 특성을 제공할 것이다. 한 유리한 특성은 체중 감소를 유도하는 것일 것이다. 또 다른 유리한 특성은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 매주 1 회 투여로 혈류 중 화합물이 일정한 레벨을 유지하도록 치료 범위 내에서 연장된 시간 동안 생체내 안정성을 유지하는 것일 것이다. 추가적으로 바람직한 특성은 또한 면역원성의 감소를 포함한다. 또한, 바람직한 화합물은 유리한 물리적 및/또는 화학적 안정성 특성을 가질 것이다.
상기에 비추어, 본 개시내용은 연장된 t½ 및 다른 바람직한 특성을 갖는 생물학적으로 활성인 GDF15 유사체 화합물을 기술한다. 보다 구체적으로, 본원의 화합물은, GDF15 유사체 화합물의 아미노 (N)-말단에 강성 링커(rigid linker)를 통해 연결된 힌지리스(hingeless) 단량체성(GDF15 당 하나의 Fc 단위) 인간 IgG4 Fc를 갖는 재조합 융합 단백질로, 여기서 화합물은 각각의 단량체의 GDF15 부분 사이의 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 공유 연결된 동종이량체를 형성한다. 예시적인 화합물인 화합물 2는 2 개의 분자의 화합물 1(서열식별번호 2)의 동종이량체로, 놀랍게도 최대 약 117 시간의 연장된 t½을 나타내는데, 이는 연장된 효능을 제공할 수 있고, 화합물의 주 1 회 투여를 가능하게 할 수 있다. 본원의 화합물은 또한 향상된 물리적 안정성을 갖는다. 예를 들어, 화합물 2는 단백질 A 포획 풀에서 낮은 4.1 % 고분자량(HMW) 가용성 응집체를 갖는다. 화합물 2는 또한 향상된 화학적 안정성을 나타내는데, 예컨대 pH 6.0에서 시트레이트 중 40 ℃에서 4 주 저장 후 1 mg/ml에서 낮은 0.75 % 저분자량(LMW) 퍼센트 증가를 보인다.
한 실시양태에서, 서열식별번호 2를 포함하는 화합물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 각각 서열식별번호 2를 포함하는 2 개의 단량체를 포함하는 동종이량체를 포함하는 화합물이 제공되며, 여기서 2 개의 단량체는 제1 단량체의 Cys 잔기와 제2 단량체의 Cys 잔기 사이의 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 서열식별번호 2 또는 서열식별번호 2의 2 개의 단량체의 동종이량체를 갖는 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 유효량의 서열식별번호 2, 서열식별번호 2의 2 개의 단량체를 포함하는 동종이량체를 갖는 화합물, 또는 서열식별번호 2 또는 서열식별번호 2의 2 개의 단량체를 포함하는 동종이량체를 포함하는 제약 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 체중 감소를 유도하거나, 또는 T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 요법에 사용하기 위한, 서열식별번호 2, 또는 서열식별번호 2의 2 개의 단량체를 포함하는 동종이량체를 포함하는 화합물이 제공된다. 별법으로, 체중 감소를 유도하거나, 또는 T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만을 치료하는데 사용하기 위한, 서열식별번호 2, 또는 서열식별번호 2의 2 개의 단량체를 포함하는 동종이량체를 포함하는 화합물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 체중 감소를 유도하거나, 또는 T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 서열식별번호 2, 또는 서열식별번호 2의 2 개의 단량체를 포함하는 동종이량체를 포함하는 화합물에 대한 용도가 제공된다.
다른 실시양태에서, 서열식별번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에서 배양하고 화합물을 회수함으로써 제조되는 화합물이 제공된다. 추가적으로, 개체에게 유효량의 본원의 화합물 또는 본원의 조성물을 주 1 회 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 체중 감소를 유도하거나, 또는 T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만을 치료하기 위한 방법이 제공된다.
본원에서 사용된 "약"은 예를 들어 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 서열 동일성, 시간 프레임, 온도, 부피 등과 같은 값 또는 값들이 통계적으로 의미있는 범위 내에 있음을 의미한다. 이와 같은 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 전형적으로 20 % 이내, 보다 전형적으로 10 % 이내, 보다 더 전형적으로 5 % 이내의 단위 정도(order of magnitude) 범위 내에 있을 수 있다. "약"에 의해 포함되는 허용가능한 차이는 연구 대상의 특정 시스템에 따라 결정될 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.
본원에 사용된 "유효량"은 환자 또는 대상체에게 단일 또는 다중 용량 투여 시, 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는, 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간에 대한 생물학적 또는 의학적 반응 또는 원하는 치료 효과를 이끌어내는, 본원의 화합물 또는 본원의 화합물을 함유하는 제약 조성물의 양 또는 용량을 의미한다. 바람직하게는, 유효량의 본 발명의 화합물 또는 화합물을 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여 시 체중의 순 손실을 야기할 것이다. 용량은 보다 높은 초기 부하 용량(loading dose), 이어서 보다 낮은 용량을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "개체", "환자" 및 "대상체"는 상호교환가능하게 사용되며, 동물, 특히 인간을 의미한다. 인간인 경우, 개체는 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있어 본원의 화합물 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻게되는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 증상 및 이들 병태의 합병증을 퇴치 또는 완화시키기 위한 목적으로 GDF15의 투여가 권고되는 병태를 갖는 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 치료는 증상 또는 합병증 발병의 예방, 증상 또는 합병증의 완화, 또는 질환, 병태 또는 장애의 제거를 필요로 하는 개체에게 본원의 화합물 또는 화합물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특히, 치료는 이를 필요로 하는 개체에게 본원의 화합물 또는 화합물을 포함하는 조성물을 투여하여 체중의 순 손실을 야기하는 것을 포함한다. 치료되는 개체는 동물, 특히 인간일 수 있다.
본원에서의 제약 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 주사기, 임의로는 펜-유사 주사기 또는 기계적으로 구동되는 인젝터를 통한 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 또한, 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 제약 제품을 위한 통상적인 부형제를 사용하는 임의의 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia, PA, USA (2006)] 참조).
본원의 화합물 및 조성물은 체중 감소를 유도하고, 당뇨병, T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만과 관련된 병태를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 동시에, 개별적 또는 순차적 조합으로 사용될 수 있다. 청구된 화합물과 조합될 수 있는 추가의 치료제의 비제한적인 예는 인슐린 또는 인슐린 유사체; 바이구아니드; 술포닐우레아; 티아졸리딘디온; 디펩티딜 펩티다제-4("DPP-4") 억제제; 나트륨-의존성 글루코스 수송체(SGLT2) 억제제; 인크레틴 화합물, 예컨대 글루카곤-유사-펩티드-1(GLP-1) 또는 GLP-1 유사체, 위 억제 폴리펩티드(GIP) 또는 GIP 유사체, 옥신토모듈린(OXM) 또는 OXM 유사체; 또는 임의의 상기 작용제의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 화합물 및 추가의 치료제(들)는 동일한 전달 경로 및 장치, 예컨대 단일 환제, 캡슐, 정제 또는 주사가능한 제제를 통해 함께 투여될 수 있거나; 또는 별도의 전달 장치 또는 경로로 동시에 별도로 투여되거나; 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본원의 화합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질 또는 전구체 단백질 분자의 생산을 통해 제조될 수 있다. cDNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 화합물을 코딩하는 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 다양할 수 있다. DNA는 화합물 또는 그의 전구체를 생산하기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 대장균(Escherichia coli)의 K12 또는 B 균주, 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 또는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소("CHO") 세포일 수 있다.
적절한 숙주 세포는 본원의 화합물 또는 그의 전구체를 제조하기 위해 발현 벡터와 같은 발현 시스템으로 일시적 또는 안정적으로 형질감염 또는 형질전환된다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 부분으로서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하도록 선택 마커, 예를 들어 테트라사이클린, 네오마이신, 글루타민 합성효소 및 디히드로폴레이트 환원효소를 함유할 것이다.
본원의 화합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술, 뿐만 아니라 하기 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원의 화합물을 제조하기 위해, 기재된 각각의 단계에 대한 특정 생합성 또는 합성 단계가 사용되거나, 사용되지 않거나, 또는 상이한 방식으로 조합될 수 있다.
본원의 GDF15 유사체 화합물은 GFRAL 화합물로서 작용할 수 있고, CHOK1 세포 유도체를 사용하여 포유동물 세포 발현 시스템에서 생산된다. GDF15 단백질을 코딩하는 유전자를 글루타민 합성효소(GS)-함유 발현 플라스미드 골격(pEE 12.4-기재 플라스미드) 내로 서브클로닝하였다. 예시적인 Fc-GDF15 단백질인 화합물 1(서열식별번호 2)을 코딩하는 cDNA 서열(서열식별번호 16)을 조직 배양 배지 내로의 목적 생성물의 분비를 증진시키기 위해 신호 펩티드 서열인 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열식별번호 3)의 코딩 서열과 프레임 내 융합시켰다.
발현은 바이러스성 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 작동된다. CHOK1SV 세포를 전기천공법 및 적절한 양의 재조합 발현 플라스미드를 사용하여 안정하게 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 적절한 세포 밀도에서 현탁 배양액에서 유지하였다. 형질감염된 세포의 선택은 25 μM 메티오닌 술폭시민(MSX)-함유 무혈청 배지에서의 성장에 의해 달성되고, 약 35 ℃ 내지 37 ℃ 및 약 5 내지 7 %의 CO2에서 인큐베이션하였다. GDF15 단백질 또는 Fc-GDF15 융합 단백질은 CHO 세포로부터 배지 내로 분비된다. 단백질의 GDF15 부분은 서로 결합하여, 쇄간 이황화 결합을 통해 서로 연결된 2 개의 GDF15 단백질을 포함하는 동종이량체 또는 Fc-GDF15 융합 단백질 동종이량체를 생성한다. GDF15 또는 Fc-GDF15 동종이량체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이어서 음이온 교환 및 소수성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
수확된 배지로부터의 GDF15 단백질 동종이량체를 캅토 블루(Capto Blue) 수지(지이(GE)) 상에 포획하였다. 수확된 배지로부터의 Fc-GDF15 단백질 동종이량체를 맵 셀렉트(Mab Select) 단백질 A 수지(지이) 상에 포획하였다. 이어서, 수지를 러닝 완충액, 예컨대 포스페이트-완충 염수(PBS; pH 7.4) 또는 트리스를 함유하는 러닝 완충액으로 간단히 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하였다. 단백질을 낮은 pH 용액, 예컨대 10 mM 시트르산 pH 3으로 수지로부터 용리시켰다. GDF15 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 이는 잠재적인 바이러스를 불활성화시키기 위해 낮은 pH에서 유지될 수 있다. pH는 0.1 M 트리스 pH 8.0과 같은 염기를 첨가함으로써 중화될 수 있다. GDF15 단백질은 포로스 엑스큐(Poros XQ)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))와 같은 수지를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. GDF15 단백질은 15 컬럼 부피에 걸쳐 50 mM 트리스, pH 8.0에서 0에서부터 200 mM의 NaCl 구배를 사용하여 AEX 칼럼으로부터 용리된다.
Fc-GDF15 융합 단백질은 캅토 페닐 임프레스(Capto Phenyl ImpRes) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼(지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 충전 용액을 약 0.5 M 황산나트륨으로 조정함으로써 칼럼을 수행하고, 20 mM 트리스 pH 8 용액에서 0.5 M에서 0 M 황산나트륨으로 진행되는 10 칼럼 부피(CV) 구배를 사용하여 용리시켰다. HIC 후에, 단백질은 농축된 캅토 페닐 임프레스 풀을 슈퍼덱스(Superdex)200(지이 헬스케어) 상 PBS pH 7.4에서 등용매 용리로 로딩함으로써 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
정제된 GDF15 화합물을 바이러스 리텐션 필터, 예컨대 플라노바(Planova) 20N(아사히 카세이 메디칼(Asahi Kasei Medical))에 통과시킨 후, 재생 셀룰로스 막(밀리포어(Millipore)) 상에서 접선 유동 초여과(tangential flow ultrafiltration)를 사용하여 10 mM 시트레이트, 150 mM NaCl pH 7 내로 농축/투석여과할 수 있다.
가용성 인간 GFRAL 세포외 도메인(ECD)은 CHOK1 세포 유도체를 사용하여 포유동물 세포 발현 시스템에서 생산된다. 수확된 배지로부터의 폴리히스티딘-태그된 GFRAL ECD를 니켈-고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC) 상에 포획하였다. 이어서, 수지를 러닝 완충액, 예컨대 PBS pH 7.4, 또는 트리스를 함유하는 러닝 완충액(pH 8.0, 500 mM NaCl)으로 간단히 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하였다. 결합된 HIS-태그된 GFRAL ECD(서열식별번호 4)를 10 컬럼 부피에 걸쳐 PBS 또는 TRIS, pH 8.0, 500 mM NaCl에서 0에서 250 mM의 이미다졸을 사용하여 용리시켰다. HIS-태그된 GFRAL ECD는 농축된 IMAC 풀을 슈퍼덱스200(지이 헬스케어) 상 PBS pH 7.4에서 등용매 용리로 로딩함으로써 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
항체의 포유동물 발현은 글리코실화를 초래한다. 전형적으로, 글리코실화는 항체의 Fc 영역의 고도로 보존된 N-글리코실화 부위에서 일어난다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착된다. N-연결된 글리코실화를 위한 단 하나의 부위가 IgG 이뮤노글로불린의 전형적인 불변 영역에 존재한다. 그러나, 이러한 부위는 글리코실화를 방지하기 위해 변형될 수 있거나, 또는 추가적인 또는 다양한 글리코실화 구조를 위해 추가의 부위가 이에 더해질 수 있다. 또한, 글리코실화는 때때로 포유동물 세포에서 발현되는 분자의 다른 영역에서도 발견된다.
본원의 화합물은 이러한 방식으로 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 파악되는 유사한 방식으로 제조된다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 시험관내 수용체 친화도
인간 GDF15 동종이량체 및 예시적인 화합물 2의 인간 GFRAL 수용체에 대한 시험관내 결합 파라미터는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정된다. GFRAL의 ECD는 3 개의 Cys-풍부 도메인(D1, D2 및 D3)을 포함한다. 인간 GDF15(데스(des)-ARN 서열식별번호 1; 즉, N-말단에 Ala, Arg 및 Asp가 결여된 GDF15)의 동종이량체, 및 Fc-GDF15 화합물 1(서열식별번호 2)의 동종이량체인 화합물 2의 HIS-태그된 인간 GFRAL ECD(서열식별번호 4)에 대한 친화도는 SPR에 의해 측정될 수 있다. 반응속도는 표 1에 요약되어 있다.
인간 GDF15(데스-ARN 서열식별번호 1) 또는 화합물 2의 인간 GFRAL ECD에 대한 결합을 측정하기 위해, 비아코어(Biacore) T200 기기를 사용하여 인간 GDF15(데스-ARN 서열식별번호 1) 동종이량체 및 화합물 2의 GFRAL ECD에 대한 결합 반응 속도를 측정하였다. 측정은 25 ℃에서 수행되었다. 샘플을 HBS-EP+, pH 7.4(지이 헬스케어; 10 mM HEPES pH 7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05 % 계면활성제 P20)에 용해시켰다. 염소 항-토끼 GDF15 항체(R&D)를 아민 커플링 화학 반응을 이용하여 CM5 센서 칩의 유동 셀 상에 고정시켰다. GDF15 샘플을 러닝 완충액으로 희석함으로써 25 ㎍/ml로 제조하였다.
인간 GFRAL ECD 샘플을 러닝 완충액으로 희석함으로써 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 2.0 및 0(블랭크) nM의 최종 농도로 제조하였다. SPR 실험은 다음의 단계: (1) 별개의 유동 셀(Fc2, Fc3 및 Fc4) 상에서 GDF15 샘플을 포획하는 단계, (2) 100 ㎕/분으로 모든 유동 셀에 걸쳐 200 ㎕의 인간 GFRAL ECD를 주입하는 단계, (3) 600 초 동안 해리시키는 단계, (4) 20 ㎕/분으로 10 ㎕의 글리신, pH 1.5 주입(30 초)으로 칩 표면을 재생시키는 단계, 및 (5) 20 ㎕/분으로 10 ㎕의 HBS-EP+ 주입(30 초)으로 칩 표면을 평형화하는 단계를 포함한다. 인간 GFRAL ECD의 각 농도를 이중으로 주입하였다.
데이터를 표준 이중-참조(double-referencing)를 이용하여 처리하고, 결합 속도(kon, M-1s-1), 해리 속도(koff, s-1) 및 최대 반응(R max; 반응 단위(RU))을 결정하기 위해 비아코어 T200 평가 소프트웨어(Biacore T200 Evaluation Software)를 사용하여 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 평형 해리 상수(KD)는 KD = koff/kon (M)의 관계로부터 산출된다.
Figure 112020102830381-pct00001
결과는, 인간 GDF15 동종이량체(데스-ARN 서열식별번호 1을 포함하는 2 개의 화합물)가 인간 GFRAL ECD에 대해 7.2 nM의 친화도를 갖고, 화합물 2 동종이량체(서열식별번호 2를 포함하는 2 개의 화합물)가 인간 GFRAL ECD에 대해 8.3 nM의 친화도를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 2: 시험관내 기능적 활성
GDF15에 대한 수용체인 GFRAL는 GDNF 수용체 패밀리의 구성원으로, 단일 막횡단 도메인을 함유하나, 세포내 신호전달 도메인이 없다. GFRAL를 포함하는 GDNF 수용체 패밀리의 구성원은 공동-수용체 RET를 이용하여 신호를 전달한다. GDNF 수용체/RET 복합체의 자극은 ERK, AKT 및 STAT 인산화를 수반하는 신호 전달 네트워크를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.
성숙 인간 GDF15 변이체의 활성 및 상대적 효능을 평가하기 위해, HEK293 세포(ATCC)를 인간 GFRAL(NCBI 참조 서열 번호 NP_997293.2) 및 인간 RET51 (NCBI 참조 서열 번호 NP_066124.1)을 함유하는 CMV-유도된 포유동물 발현 벡터로 형질감염시키고, 게네티신 및 푸로마이신(라이프 테크놀로지스)의 존재 하에 3 주 동안 성장시켜, 두 단백질 모두를 안정적으로 발현하는 세포 풀을 생성하였다. 제조사의 지시에 따라 알파라이사 슈어파이어 울트라 포스포-ERK 1/2 검정 키트(AlphaLISA Surefire Ultra Phospho-ERK1/2 Assay Kit)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)), 및 엔비전 멀티레이블 마이크로플레이트 리더(EnVision Multilabel Microplate Reader) 모델 2102(퍼킨 엘머)를 사용하여 ERK1/2 인산화의 측정이 RET 활성화를 평가하기 위한 종점(endpoint)으로 선택되었다.
간략하게, 10 내지 20 계대 사이의 HEK293-hGFRAL/hRET 세포를 폴리-D-리신-코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰 당 20,000 개 세포로 시딩하고, 5 % CO2 / 95 % O2 대기 하에 37 ℃에서 3 일 동안 성장시켰다. 세포를 지시된 바와 같이 무혈청 배지에서 4 시간 동안 인큐베이션한 다음, 10 분 동안 처리하고 용해시켜, 분석될 때까지 동결시켰다. 세포 용해물을 1 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션함으로써 해동시키고, 오비탈 플레이트 진탕기 상에서 혼합하고, 백색 384-웰 플레이트로 옮겼다. 알파라이사의 "2-플레이트/1-인큐베이션" 방법은 검정 키트로 공급되는 어셉터 앤드 도너 믹스(Acceptor and Donor Mixes)를 용해물에 첨가하고, 엔비전 플레이트 리더 상에서 알파라이사 신호를 측정하기 전, 실온에서 8 시간 동안 암실에서 인큐베이션함으로써 활용된다.
분석에 사용된 세포의 각각의 플레이트는 분석 수행을 위한 참조 표준으로서 자연 인간 성숙 GDF15를 포함한다. 다중 플레이트로부터의 ERK1/2 인산화(pERK1/2) 데이터를 하기 식을 이용하여 Y-축 상의 초기 알파라이사 신호 데이터를 인간 GDF15 참조 표준에 대해 %최대값(Maxima)로 전환시킴으로써 단일 그래프로 모았다:
%최대값 = 100*(x-최소값)/(최대값-최소값),
여기서, 최소값(min)은 0이고 이는 자극이 없다는 것을 나타내며, 최대값(max)는 100이고 이는 화합물의 포화 용량에서 자극이 관찰됨을 나타내고, x는 임의의 주어진 처리이다. 각각의 화합물에 대한 EC50을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 7.00에서 4 파라미터 로지스틱 회귀를 갖는 가변 기울기 S자형 용량-반응 곡선을 사용하여 결정하였다. 표 2의 각각의 화합물에 대해 열거된 EC50을 각각의 화합물의 3 개의 독립적 분석에 대한 EC50의 기하 평균을 하기 식을 사용하여 생성함으로써 결정하였다.
기하 평균 =
Figure 112020102830381-pct00002
.
인간 GFRAL 및 인간 RET51 모두를 발현시키는 HEK293 세포를 사용하여 화합물 2의 효능을 평가하였다. 동종이량체로서의 자연 인간 성숙 GDF15(서열식별번호 1)를 각 플레이트의 셀 상에서 참조 표준으로서 사용하였다. 시험 물질을 3 개의 독립된 실험에서 4 중으로 수행하였다.
Figure 112020102830381-pct00003
실시예 3: 정상 래트 모델에서의 생체내 효능
비만은 당뇨병 및 인슐린 내성과 관련된 흔한 동반이환(co-morbidity)이다. GDF15는 음식 섭취를 억제하고, 체중 감소를 유도하며, 글루코스 항상성을 개선하는 것으로 보고되었다. 따라서, GDF15 화합물은 체중 감소를 유도하고, T2D, 이상지질혈증, NASH 및/또는 비만과 같은 병태에 대한 요법으로서 효과적일 수 있다. 화합물 2를 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 15 일의 기간 동안 매일 체중 및 음식 섭취를 측정하면서 투여하였다.
정상 수컷 스프라그-돌리 래트(인비고(Envigo); 14 주 된)가 기관에 도착함과 동시에 규칙적인 쵸우 식이(chow diet)(TD2014; 위스콘신주 매디슨 소재의 테클라드(Teklad, Madison, WI))를 유지하도록 하고, 이를 하기 연구에서 사용하였다. 음식(TD2014) 및 물에 자유롭게 접근가능하고 12-시간의 명/암 주기(0600에서 불이 켜지는)를 갖는 온도-제어된(24 ℃) 시설에서 동물들을 개별적으로 하우징하였다.
최소 1 주 동안의 시설에 대한 적응 기간 후, 래트를 그의 체중에 따라 무작위화하여 각각의 실험군의 동물이 유사한 체중을 갖도록 하였다. 체중은 332 내지 369 그램 범위였다.
모든 군은 5 마리의 래트를 함유하였다. 비히클 또는 비히클(PBS)에 용해된 화합물 2(용량 범위 0.01 내지 0.3 mg/kg)를 피하(SC) 주사(1 mL/kg)를 통해 15 일 동안 매 3 일마다 임의로 먹이를 준 정상 래트에게 투여하였다.
제1일, 제4일, 제7일, 제10일 및 제13일에 피하 주사를 수행하였다. 연구 기간 동안 일일 체중 및 음식 섭취에 대한 측정을 수행하였다. 다음과 같이 각각의 동물의 초기 체중으로부터 체중 퍼센트를 매일 계산하였다:
체중 퍼센트 = (일일 체중/초기 체중) X 100.
모든 데이터를 군 당 5 마리 동물의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 체중 감소 퍼센트 및 누적 음식 섭취에 대한 유효 용량 농도를 그래프패드 프리즘에서 비-선형 피팅 도구를 사용하여 측정하였다. ANOVA 반복 측정, 이어서 다중 비교를 위한 던넷(Dunnett) 방법을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. *-p < 0.05, **-p < 0.01, ***-p < 0.001, ****-p < 0.0001에서 유의한 차이가 확인되었다.
Figure 112020102830381-pct00004
정상 SD 수컷 래트에서 용량-의존적 방식으로 화합물 2를 사용한 만성 처리는, 비히클 처리된 동물과 비교할 때, 연구 완료 단계에서 음식 섭취의 통계적으로 유의한 감소 및 체중 퍼센트에서의 통계적으로 유의한 감소를 야기하였다. 누적 음식 섭취는 시험된 최고 용량에서 264.48에서 91.22로 감소하였고, 체중 감소는 감소 범위가 7 % 내지 26 %에 이르렀다. 데이터는 화합물 2가 정상 SD 래트에서 용량 의존적 방식으로 체중 및 음식 섭취를 감소시키는 데 통계적으로 유의한 효과가 있음을 나타내는 것으로 보인다.
실시예 4: 식이-유도 비만(Diet-Induced Obese, DIO) 마우스에서의 생체내 효능
체중 감소, 대사, 신체 조성 및 지방간에 대한 화합물 2의 효과를 조사하기 위해, 화합물 2를 C57/Bl6 DIO 마우스에 만성적으로 투여하였다.
24 내지 25 주 된 수컷 C57/Bl6 DIO 마우스(타코닉(Taconic))가 기관에 도착함과 동시에 칼로리 풍부 식이(TD95217; 위스콘신주 매디슨 소재의 테클라드)를 유지하도록 하고, 이를 하기 연구에서 사용하였다. 음식(TD95217) 및 물에 자유롭게 접근가능하고 12-시간의 명/암 주기(2200에 불이 켜지는)를 갖는 온도-제어된(24 ℃) 시설에서 동물들을 개별적으로 하우징하였다. 최소 2 주 동안의 시설에 대한 적응 기간 후, 마우스를 그의 체중에 따라 무작위화하여 각각의 실험군의 동물이 유사한 체중을 갖도록 하였다. 체중은 40 내지 50 그램 범위이다.
모든 군은 5 마리의 마우스를 함유하였다. 비히클 또는 화합물 2(0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 및 0.2 mg/kg)를 비히클 (PBS)에 용해시키고, 피하(SC) 주사 (10 mL/kg)를 통해 21 일 동안 매 3 일마다 암 주기 시작 30 내지 90 분 전에 임의로 먹이를 준 DIO 마우스에게 투여하였다. 제1일, 제4일, 제7일, 제10일, 제13일, 제16일, 제19일 및 제22일에 SC 주사를 수행하였다. 연구 동안 매일 체중 및 음식 섭취를 측정하였다.
체중의 절대 변화를 분자의 첫 번째 주사 전에 동일한 동물의 체중을 뺌으로써 계산하였다. 제17일에, 동물을 0600 및 1300에 단식시키고, 공복 혈당 및 인슐린을 측정하기 위해 혈액을 수집하였다. 혈당은 아큐첵®글루코미터((AccuChek®Glucometer)(인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈 당뇨병 케어, 인크.(Roche Diabetes Care, Inc.; Indianapolis, IN))를 통해 측정하였다. 인슐린을 엘라이사(ELISA)(메릴랜드주 록빌 소재의 엠에스디(MSD, Rockville, MD))를 통해 측정하였다. 인슐린 내성 지수는 하기 식에 의해 산출된다:
HOMA IR = 공복 혈장 인슐린(mIUl/L)*(공복 혈당(mmol/L)/22.5.
제24일에, 암 광주기(photoperiod) 전에 동물을 희생시키고, 간을 제거하여 냉동시켰다. 희생할 때 수집된 간의 균질물로부터 결정된 간 트리글리세리드, 및 혈장 분석물을 히타치 모듈러 피 임상 분석기(Hitachi Modular P Clinical Analyzer) 상에서 측정하였다.
Figure 112020102830381-pct00005
Figure 112020102830381-pct00006
Figure 112020102830381-pct00007
화합물 2는 수컷 DIO 마우스에서 체중 및 음식 섭취를 용량-의존적으로 감소시키고, 이는 화합물 2가 체중 감소를 유도하고 비만을 위한 요법에 사용될 수 있음을 시사한다(표 4). 화합물 2는 또한 혈청 글루코스를 감소시키는데, 이는 화합물 2가 당뇨병을 위한 요법에 사용될 수 있음을 시사한다(표 5). 화합물 2는 추가적으로 콜레스테롤을 감소시키는데, 이는 화합물 2가 이상지질혈증을 위한 요법에 사용될 수 있음을 시사한다(표 5). 화합물 2는 간 건강을 개선시키고(혈청 ALT의 감소에 의해 입증됨), 간 트리글리세리드를 감소시키는데, 이는 이것이 NASH의 요법에 사용될 수 있음을 시사한다(표 5). 제17일에 수행된 공복 혈당 및 인슐린 시험은 인슐린 민감도의 증가 및 인슐린 내성 지수의 감소를 입증하였고, 이는 당뇨병을 위한 요법에서의 화합물 2의 사용 가능성을 추가로 뒷받침한다(표 6).
실시예 5: 상이한 Fc-GDF15 구조체의 안정성
제약 생성물에서의 단백질 응집은 전체적인 생산 수율을 저하시키고, 개체에게 투여 시 면역 반응을 유발할 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 화합물을 단량체 상태로, 또는 이 경우에 있어서 공유 결합된 동종이량체로 유지하는 것이 바람직하다.
상이한 GDF15 융합 단백질이 응집 및/또는 분해되는 경향을 시험하기 위해, 다양한 Fc-GDF15 융합 단백질이 포유동물 CHO 세포에서 발현될 수 있다. Fc-GDF15 융합 단백질은 맵 셀렉트 단백질 A(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이(GE; Piscataway, NJ)) 상에 PBS(pH 7.4) 러닝 완충액으로 포획될 수 있고; 러닝 완충액으로 간단히 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거할 수 있으며; 20 mM 아세트산 및 5 mM 시트르산, pH 3으로 용리시킬 수 있다. Fc-GDF15 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 1 M 트리스 pH 8.0의 1/10 부피를 첨가함으로써 pH를 중화시켰다.
이어서, 단백질 A 포획 풀을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 분석하여, % 고분자량 응집체(HMW)를 결정하였고, 이는 얼마나 많은 응집이 일어났는지를 보여준다. SEC 분리 방법은 크기 30 cm x 0.78 cm의 5 μm 칼럼의 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) 3000SWXL 상에서 수행하였다. 이동상은 0.5 mL/분의 유속으로 PBSx1, 350 mM NaCl(pH 7.4)이다. 초기 저농도 샘플을 10 mcL 주입으로서 적용하고 214 nm의 흡광도 파장에서 모니터링하였다. % LMW 종은 화합물의 화학적 안정성, 또는 소분자량 분해 생성물을 나타낸다.
Figure 112020102830381-pct00008
탠덤 Fc-GDF15 융합 단백질 구조체(힌지 영역을 함유하는 항체의 2 개의 유사한 Fc 부분은 서로 말단-대-말단으로 부착되고, 이어서 이는 GDF15 분자에 부착되고, GDF15 부분이 자가-결합되어 이량체를 생성한다)인 화합물 3(2 개의 분자의 동종이량체로, 각각 서열식별번호 5를 포함함)은 화합물 2의 4.1 % HMW와 비교하여 60.8 % HMW를 갖는다. 이는 화합물 2가 탠덤 Fc-GDF15 융합 단백질 구조체보다 더 낮은 응집력 및 더 낮은 면역원성 응집체의 위험을 갖는, 보다 우수한 물리적 안정성을 갖는다는 것을 보여준다.
이종이량체 Fc-GDF15(서로 나란히 결합되는 항체의 2 개의 상이한 Fc 부분으로, 여기서 하나의 Fc 부분(사슬 B, 서열식별번호 17)은 GDF15 분자가 부착된 또 다른 Fc 부분(사슬 A, 서열식별번호 6)과 결합되고, 이어서 GDF15 부분이 자가-결합되어 동종이량체를 형성함)인 화합물 4(2 개의 분자의 동종이량체로, 각각의 분자는 서열식별번호 6 및 서열식별번호 17의 이종이량체를 포함함)는 단지 2.3 % LMW를 갖는 화합물 2와 비교하여 높은 49.1 % LMW 종을 갖는데, 이는 화합물 2가 더 나은 화학적 안정성 및 감소된 화학적 또는 단백질 분해성 절단 경향을 갖는다는 것을 시사한다. 화학적 안정성 및 분해 방지는 화합물이 장기간 동안 효능을 유지하는 것을 도와준다. 또한, 분해 감소는 분해 부산물이 제제 중의 활성 성분을 방해함으로써 추가적인 효능 문제를 일으키거나, 분해 부산물이 응집하여 면역원성 문제를 야기할 위험을 최소화한다.
실시예 6: 이중 대 단일 Fc 돌연변이의 안정성
2 개의 특이적 돌연변이를 갖는 본원의 화합물의 Fc 부분의 독특한 구조는, 높은 농도에서 예상외로 돌연변이 중 하나를 단독으로 갖는 Fc 구조체보다 더 우수한 안정성 및 더 높은 용해도를 나타낸다. IgG4-Fc에서 CH3/CH3 결합을 방해하고 단량체성 Fc 구조체를 생성하기 위해, 단일 돌연변이를 갖는 2 개의 Fc를 생성하였다. 제1 단일 돌연변이체는 화합물 7로, 전장 인간 IgG4 중쇄에서 405 번 위치에 페닐알라닌을 치환한 글루타민이 있으며, 이는 서열식별번호 2 내의 173 번 위치(서열식별번호 9에서의 175 번 위치)에 상응한다. 생성된 제2 단일 돌연변이체는 화합물 8로, 전장 인간 IgG4 중쇄에서 407 번 위치에 티로신을 치환한 글루탐산을 갖는 Fc인데, 이는 서열식별번호 2내의 175 번 위치(서열식별번호 10의 177 번 위치)에 상응한다. 이중 Fc 돌연변이체인 화합물 5(서열식별번호 7) 또한 생성되었고, 이는 화합물 7 및 8의 Fc 돌연변이를 모두 함유한다. 화합물 5는 추가의 2 개의 아미노산 AP가 화합물 5의 Fc 영역의 N-말단에 존재한다는 것을 제외하고는 화합물 2와 동일한 서열을 갖는다. 화합물 2, 5, 7 및 8은 단량체성 IgG4 Fc의 형성을 보장하기 위해 ESKYGPPCPPCP(서열식별번호 8)의 힌지 영역이 결여되어 있다.
본 실시예의 화합물을 포유동물 CHO 세포에서 발현시키고, 수확된 배지를 맵 셀렉트 단백질 A(지이) 상 PBS(pH 7.4) 러닝 완충액으로 포획하고; 러닝 완충액으로 간단히 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하고; 20 mM 아세트산 및 5 mM 시트르산, pH 3.0으로 용리시켰다. GDF15 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 1 M 트리스 pH 8.0의 1/10 부피를 첨가함으로써 pH를 중화시켰다.
이어서, 중화된 단백질 A 포획 풀을 10 MWCO를 갖는 아미콘 울트라 0.5 ml 원심분리 농축기(Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Concentrator) 내 10 mM 시트레이트 pH 5.0에서 완충 교환하였다. 그다음, 10 MWCO를 갖는 아미콘 울트라 0.5 ml 원심분리 농축기를 사용하여 최대 10 mg/ml 또는 그 이상으로 단일 및 이중 Fc-GDF15 돌연변이체를 농축하기 위해 시도하였다.
Figure 112020102830381-pct00009
결과는 단일 Fc 돌연변이체인 화합물 7 및 화합물 8의 동종이량체가 화합물 5의 동종이량체인 이중 Fc 돌연변이체에 비해 감소된 용해도를 갖는다는 것을 보여준다. 화합물 7의 동종이량체는 침전 및 물질 손실로 인해 10 mg/ml를 달성할 수 없었다. 화합물 8의 동종이량체는 화합물 7의 동종이량체와 비교하여 개선된 용해도를 나타내었으나; 농축 공정 동안 물질 손실로 인해 10 mg/ml를 달성할 수 없었다. Fc 내에 신규한 이중 돌연변이를 갖는 화합물 5의 동종이량체는, 9.8 mg/ml에서 용해도를 유지하였다. 단량체성 IgG4 Fc 단독 대조군은 최대 12 mg/ml까지 가용성이었다.
실시예 7: 가요성 또는 강성 링커에 대한 화학적 안정성의 비교
본원의 GDF15 화합물의 화학적 안정성을 시험하기 위해, 이러한 화합물을 4 ℃에서 다음과 같은 완충액: 10 mM 시트레이트, pH 6(C6), 10 mM 시트레이트, pH 7(C7), 10 mM 트리스, pH 7.0(T7), 10 mM 트리스, pH 8.0(T8) 또는 1 x PBS, pH 7.4(PBS)으로 하룻밤 동안 투석할 수 있다. Fc-GDF15 융합체의 장기간 안정성을 평가하기 위해, 각각의 완충액 중의 1.0 mg/mL 단백질 용액은 4 주 동안 4 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃에서 저장될 수 있고, % LMW는 분석용 SEC에 의해 결정된다.
SEC 분리 방법은 크기 30 cm x 0.78 cm의 5 μm 칼럼의 토소 바이오사이언스 3000SWXL 상에서 수행될 수 있다. 이동상은 0.5 mL/분 유속에서 PBS, 350 mM NaCl, pH 7.4일 수 있다. 초기 저농도 샘플을 10 mcL 주입으로서 적용하고 214 nm의 흡광도 파장에서 모니터링할 수 있다.
% LMW로 측정된 화학적 안정성의 변화를 0 시간 샘플에 대해 평가하였다. 기본적으로 상기 기재된 수행된 연구에 의해 결정된 바와 같이, GDF15 화합물에 대한 % LMW 증가는 표 9에 요약되어 있다.
시험된 화합물은 강성 G4-AP10-G4 링커를 갖는 화합물 1(서열식별번호 2)의 동종이량체인 화합물 2, 가요성 L5Q 링커(GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(서열식별번호 12))를 갖는 화합물 5(서열식별번호 7)의 동종이량체, 및 강성 G4S-AP10-G4S 링커를 갖는 화합물 6(서열식별번호 11)의 동종이량체이다.
Figure 112020102830381-pct00010
L5Q 링커는 25 ℃ 및 40 ℃에서의 저장 후에 AP10 링커 중 어느 하나보다 더 높은 % LMW를 갖는데, 이는 AP10(APAPAPAPAPAPAPAPAPAP; 서열식별번호 13) 강성 링커를 포함하는 단백질보다 L5Q 가요성 링커를 포함하는 GDF15 융합 단백질의 보다 높은 화학적 분해 경향을 나타낸다. 또한, G4S(GGGGS; 서열식별번호 14)를 포함하는 링커를 갖는 화합물 6의 동종이량체는 대부분의 조건에서 G4(GGGG; 서열식별번호 15)를 포함하는 링커를 갖는 화합물 2보다 더 높은 % LMW를 갖는데, 이는 G4-AP10-G4 링커를 갖는 화합물 2의 더 큰 화학적 안정성을 나타낸다.
강성(화합물 2 및 화합물 6) 및 가요성 링커(화합물 5)를 갖는 GDF15 화합물의 화학적 및 물리적 안정성은 10 mg/ml의 고농도에서 평가될 수 있다. 화합물을 먼저 다음과 같은 완충액: (a) 10 mM 시트레이트 pH 6.5; (b) 10 mM 시트레이트 pH 6.5, 150 mM NaCl; 및 (c) 10 mM 시트레이트 pH 6.5, 0.02 % 폴리소르베이트 80으로 4 ℃에서 O/N 투석할 수 있다. 150 mM NaCl 및 0.02 % 폴리소르베이트와 같은 부형제를 제제에 첨가하여, GDF15 융합체의 화학적 및 물리적 안정성에 대한 이의 효과를 시험하였다. 다음으로, 화합물은 10,000 MWCO, 15 ml 밀리포어 스핀 농축기(Millipore Spin Concentrator)를 사용하여 10 mg/ml로 농축시킬 수 있다. 농축 후, % HMW 및 % LMW는 농축 단백질(t = 0)을 사용하여 SEC에 의해 결정될 수 있다.
SEC 분리 방법은 크기 30 cm x 0.78 cm의 5 μm 칼럼의 토소 바이오사이언스 3000SWXL 상에서 수행될 수 있다. 이동상은 0.5 mL/분의 유속에서 PBS, 350 mM NaCl, pH 7.4이었다. 10 mg/ml 샘플을 이들 각각의 완충액에서 1 mg/ml로 희석한 다음, 10 mcL의 주입으로서 적용하고 214 nm의 흡광도 파장에서 모니터링하였다.
스트레스 조건 하에서 보다 장기간의 안정성을 평가하기 위해 10 mg/ml 제제를 4 주 동안 4 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃에서 인큐베이션할 수 있다. % LMW 및 % HMW는 SEC에 의해 제4주(t = 4w)에서 다시 결정될 수 있다. 화학적 안정성의 변화(% LMW)는 0 시간 샘플에 대해 평가될 수 있다.
Figure 112020102830381-pct00011
Figure 112020102830381-pct00012
표 10에 제시된 바와 같이, 가요성 링커를 함유하는 화합물 5의 동종이량체는 10 mg/ml에서 강성 링커를 갖는 화합물 6의 동종이량체보다 25 ℃ 및 40 ℃에서 더 높은 레벨의 % LMW를 나타내었고, 이는 이의 보다 낮은 화학적 안정성을 나타낸다.
표 11에 제시된 바와 같이, 가요성 링커를 함유하는 화합물 5의 동종이량체는 10 mg/ml에서 강성 링커를 갖는 화합물 6의 동종이량체보다 더 높은 레벨의 % HMW를 나타내었고, 이는 이의 더 낮은 물리적 안정성을 나타낸다. 낮은 화학적 및/또는 물리적 안정성은 침전 및 가능한 면역원성 문제를 야기할 수 있다.
실시예 8: GDF15 화합물의 약력학적 거동
화합물 2의 약력학적 거동을 원숭이에서 시험하였다. GDF15 화합물의 혈장 농도를 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 일라이 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN)에서 엘라이사 방법을 통해 측정하였다. 샌드위치 엘라이사는 1 또는 3 ㎍/mL로 코팅된 폴리클로날 염소 항-인간 GDF15(알앤디 시스템즈(R&D Systems)/AF957) 또는 모노클로날 마우스 항-인간/영장류 GDF15 항체(알앤디 시스템즈/MAB957)를 포획 시약으로서 사용하였다. 이어서, GDF15 화합물을 마우스 항-인간 IgG4 pFc-HRP 항체(서던 바이오테크(Southern Biotech)/9190-05) 또는 마우스 항-인간 IgG Fc-HRP 항체(서던 바이오테크/9200-05)로 검출하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 시스템(세라케어(SeraCare)/5120)을 사용하여 플레이트를 발색시키고, 효소 반응을 TMB 정지 용액(TMB Stop Solution)(KPL/50-85-04)으로 켄칭하였다.
수컷 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이에게 0.5 mL/kg의 부피로 PBS(pH 7.4) 중의 화합물 2의 단일 피하 용량(0.3 mg/kg)을 투여하였다. 약력학적 특징 규명을 위해, 투여 전, 및 투여 후 6, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408 및 504 시간 째에 각각의 동물로부터 혈액을 수집하였다.
Figure 112020102830381-pct00013
표 12의 데이터는 원숭이에서 t1/2가 117 시간에서 측정됨을 나타낸다. 이는 단량체성 Fc 분자로서는 예상외로 긴 t1/2이다. 또한, 원숭이에서의 약력학적 프로파일은 지속적인 기간 동안 안정한데, 이는 화합물 2의 약력학적 프로파일이 인간에서도 치료 범위 내에서 지속적인 기간 동안 명백히 안정하여 주 1 회 투여로 혈류 중의 약물이 일정한 레벨을 유지할 수 있음을 시사한다.
서열
하기 핵산 및/또는 아미노산 서열은 본 개시내용에서 언급되어 있으며, 참조로서 하기에 제공된다.
Figure 112020102830381-pct00014
Figure 112020102830381-pct00015
Figure 112020102830381-pct00016
Figure 112020102830381-pct00017
Figure 112020102830381-pct00018
Figure 112020102830381-pct00019
Figure 112020102830381-pct00020
Figure 112020102830381-pct00021
Figure 112020102830381-pct00022
Figure 112020102830381-pct00023
Figure 112020102830381-pct00024
Figure 112020102830381-pct00025
Figure 112020102830381-pct00026
Figure 112020102830381-pct00027
Figure 112020102830381-pct00028
Figure 112020102830381-pct00029
Figure 112020102830381-pct00030
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> GDF15 Agonists and Uses Thereof <130> X21678 <140> US 16/369,096 <141> 2019-03-29 <150> US 62/653,759 <151> 2018-04-06 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 2 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 100 105 110 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 115 120 125 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu Glu Ser 165 170 175 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro 210 215 220 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu 245 250 255 His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val 260 265 270 Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro 275 280 285 Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu 290 295 300 His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala 305 310 315 320 Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser 325 330 335 Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 340 345 350 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 4 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu Arg Asp Ala 1 5 10 15 Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met Glu Asp Ala Cys Asn Asp 20 25 30 Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Asn 35 40 45 Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe Lys Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu Leu Gly Lys 65 70 75 80 Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys Glu Asp Lys Phe Lys Trp 85 90 95 Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met Trp Ser Cys 100 105 110 Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys Asn Ala Gln 115 120 125 Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn Pro Cys Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln Asn Ile Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala Gln Ser Asp 165 170 175 Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys Thr Cys Ala 180 185 190 Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile Arg Ser Cys 195 200 205 Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe Gln Ser Lys 210 215 220 Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu Asn Cys Ile 225 230 235 240 Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser Asp Asp Cys 245 250 255 Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln Val Gln Cys 260 265 270 Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys Lys Ile Phe 275 280 285 Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro Thr Leu Ser 290 295 300 Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Ala Asn Lys His 305 310 315 320 His His His His His 325 <210> 5 <211> 616 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg Lys Ser Ser 260 265 270 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 275 280 285 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 290 295 300 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 305 310 315 320 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 325 330 335 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 340 345 350 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 355 360 365 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 370 375 380 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 385 390 395 400 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 405 410 415 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 420 425 430 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 435 440 445 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 450 455 460 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 465 470 475 480 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly 485 490 495 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro 500 505 510 Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu 515 520 525 Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln 530 535 540 Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn 545 550 555 560 Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr 565 570 575 Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu 580 585 590 Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu 595 600 605 Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 610 615 <210> 6 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Gly Thr His Cys 245 250 255 Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser 260 265 270 Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val 275 280 285 Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala 290 295 300 Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp 305 310 315 320 Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val 325 330 335 Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 355 360 <210> 7 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 165 170 175 Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gln Gly Gly Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys 245 250 255 Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp 260 265 270 Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala 275 280 285 Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr 290 295 300 Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val 305 310 315 320 Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly 325 330 335 Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys 340 345 350 Ile <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gln Gly Gly Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys 245 250 255 Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp 260 265 270 Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala 275 280 285 Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr 290 295 300 Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val 305 310 315 320 Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly 325 330 335 Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys 340 345 350 Ile <210> 10 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gln Gly Gly Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys 245 250 255 Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp 260 265 270 Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala 275 280 285 Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr 290 295 300 Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val 305 310 315 320 Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly 325 330 335 Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys 340 345 350 Ile <210> 11 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 165 170 175 Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala 210 215 220 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 225 230 235 240 Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg 245 250 255 Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp 260 265 270 Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile 275 280 285 Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile 290 295 300 Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys 305 310 315 320 Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp 325 330 335 Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys 340 345 350 His Cys Ile 355 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 20 25 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro 20 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 16 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 gaggccgccg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 60 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 120 gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 180 gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 240 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 300 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 360 ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 420 taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa agcaatgggc agccggagaa caactacaag 480 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttccagc tcgagagcag gctaaccgtg 540 gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 600 cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtggcggtgg tggagctcca 660 gccccagctc ctgctcctgc accagcacct gcccccgctc cagcacccgc acctggagga 720 gggggcggtg accactgtcc cctggggcct ggccggtgtt gcagactgca tacagtccgg 780 gcctccctgg aagacctggg ttgggcagat tgggtgctct cacctcgcga ggttcaggtg 840 accatgtgca ttggggcttg tccctcacaa tttcgcgcag ctaacatgca cgcccaaatc 900 aaaacctccc tgcaccggct taaaccggat actgttcctg ctccctgctg cgtgccagca 960 tcctacaacc ccatggtgct gatccagaag acggatacag gggtgtcact gcagacctat 1020 gatgacctcc tggccaaaga ttgccactgt atc 1053 <210> 17 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims (22)

  1. 서열식별번호 2를 포함하는 화합물.
  2. 서열식별번호 2로 이루어진 화합물.
  3. 화합물이 제1 화합물의 시스테인 잔기 및 제2 화합물의 시스테인 잔기 사이에 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되는 것인, 제1항 또는 제2항의 2 개의 화합물을 포함하는 동종이량체.
  4. 유효량의 제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 동종이량체를 포함하는, 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에서 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  5. 유효량의 제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 동종이량체를 포함하는, 비만의 치료를 필요로 하는 환자에서 비만을 치료하기 위한 제약 조성물.
  6. 유효량의 제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 동종이량체를 포함하는, NASH의 치료를 필요로 하는 환자에서 NASH를 치료하기 위한 제약 조성물.
  7. 유효량의 제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 동종이량체를 포함하는, 이상지질혈증의 치료를 필요로 하는 환자에서 이상지질혈증을 치료하기 위한 제약 조성물.
  8. 서열식별번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에서 배양하고, 화합물을 회수함으로써 제조되는 화합물.
  9. 유효량의 제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 동종이량체를 포함하는 제약 조성물로, 여기서 상기 제약 조성물은 체중 감소의 유도, 제2형 당뇨병, 비만, NASH 및/또는 이상지질혈증의 치료를 필요로 하는 환자에게 주 1 회 투여되는 것인, 상기 환자에서 체중 감소의 유도, 제2형 당뇨병, 비만, NASH 및/또는 이상지질혈증을 치료하기 위한 제약 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
KR1020207027912A 2018-04-06 2019-03-29 성장분화인자 15 효능제 화합물 및 이를 사용하는 방법 KR102501922B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862653759P 2018-04-06 2018-04-06
US62/653,759 2018-04-06
PCT/US2019/024756 WO2019195091A1 (en) 2018-04-06 2019-03-29 Growth differentiation factor 15 agonist compounds and methods of using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200128091A KR20200128091A (ko) 2020-11-11
KR102501922B1 true KR102501922B1 (ko) 2023-02-23

Family

ID=66630339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207027912A KR102501922B1 (ko) 2018-04-06 2019-03-29 성장분화인자 15 효능제 화합물 및 이를 사용하는 방법

Country Status (27)

Country Link
US (1) US11104711B2 (ko)
EP (1) EP3774860B1 (ko)
JP (1) JP7064618B2 (ko)
KR (1) KR102501922B1 (ko)
CN (1) CN112004821B (ko)
AR (1) AR115021A1 (ko)
AU (1) AU2019248535B2 (ko)
BR (1) BR112020017256A2 (ko)
CA (1) CA3096375C (ko)
CL (1) CL2020002564A1 (ko)
CO (1) CO2020012403A2 (ko)
CR (1) CR20200454A (ko)
DO (1) DOP2020000157A (ko)
EA (1) EA202092084A1 (ko)
EC (1) ECSP20062930A (ko)
ES (1) ES2937049T3 (ko)
IL (1) IL276980A (ko)
JO (1) JOP20200252B1 (ko)
MA (1) MA52228A (ko)
MX (1) MX2020010370A (ko)
PE (1) PE20212133A1 (ko)
PH (1) PH12020551656A1 (ko)
SG (1) SG11202009853VA (ko)
TW (1) TWI724392B (ko)
UA (1) UA127545C2 (ko)
WO (1) WO2019195091A1 (ko)
ZA (1) ZA202005385B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2694092B1 (en) 2011-04-08 2017-01-04 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)
PT3027642T (pt) 2013-07-31 2020-10-30 Amgen Inc Construtos do fator 15 de diferenciação de crescimento (gdf-15)
AU2019253462A1 (en) 2018-04-09 2020-11-26 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 fusion proteins
WO2021067655A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Amgen Inc. Use of gdf15 for treating cardiometabolic syndrome and other conditions
WO2021076620A1 (en) 2019-10-15 2021-04-22 Eli Lilly And Company Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines
KR20240049337A (ko) 2021-08-24 2024-04-16 선샤인 레이크 파르마 컴퍼니 리미티드 Gdf15 융합 단백질 및 이의 용도
WO2023154953A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160120999A1 (en) 2014-10-31 2016-05-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
WO2017109706A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novartis Ag Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US20090042780A1 (en) 2004-05-20 2009-02-12 Acceleron Pharma Inc Modified TGF-Beta Superfamily Polypeptides and Related Methods
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
EP2571510B1 (en) * 2010-05-21 2018-08-08 XL-protein GmbH Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses
US9732143B2 (en) * 2011-02-03 2017-08-15 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
BR112014018575A2 (pt) 2012-01-26 2017-07-04 Amgen Inc polipetídeos de fator de diferenciação de crescimento 15 (gdf-15)
EP2830646B1 (en) 2012-03-27 2018-03-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
CA2896076C (en) * 2012-12-21 2022-12-06 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-gdf15 antibodies
WO2014120619A2 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
CN105658664A (zh) 2013-07-31 2016-06-08 美国安进公司 含有Fc的多肽的稳定化
PT3027642T (pt) 2013-07-31 2020-10-30 Amgen Inc Construtos do fator 15 de diferenciação de crescimento (gdf-15)
WO2015198199A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Novartis Ag Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof.
JP6675333B2 (ja) 2014-06-23 2020-04-01 ノバルティス アーゲー 部位特異的タンパク質修飾
CN106459222A (zh) 2014-06-24 2017-02-22 诺和诺德股份有限公司 Mic‑1融合蛋白及其用途
CN106573966B (zh) 2014-07-30 2022-03-01 Ngm生物制药有限公司 用于治疗代谢异常的组合物和方法
CA2964808C (en) 2014-10-30 2023-06-27 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions using gdf15 polypeptides for increasing red blood cells
WO2016131893A1 (en) 2015-02-18 2016-08-25 Medimmune Limited Incretin fusion polypeptides
EP3277304B1 (en) 2015-04-02 2021-08-04 Janssen Biotech, Inc. Protoxin-ii variants and methods of use
WO2017121865A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 Novo Nordisk A/S Mic-1 receptor and uses thereof
BR112018076290A2 (pt) 2016-02-29 2019-11-12 Huawei Tech Co Ltd método de otimização de video, equipamento do usuário, dispositivo de rede e meio legível por computador
WO2017147742A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Eli Lilly And Company Gfral receptor therapies
JP2019513224A (ja) 2016-03-04 2019-05-23 エヌジーエム バイオファーマシューティカルス,インコー 体重を調節するための組成物及び方法
US10336812B2 (en) * 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160120999A1 (en) 2014-10-31 2016-05-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
WO2017109706A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novartis Ag Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)

Also Published As

Publication number Publication date
CN112004821A (zh) 2020-11-27
CR20200454A (es) 2020-11-18
MA52228A (fr) 2021-02-17
UA127545C2 (uk) 2023-10-04
AU2019248535A1 (en) 2020-09-10
KR20200128091A (ko) 2020-11-11
MX2020010370A (es) 2021-01-08
AU2019248535B2 (en) 2021-09-02
DOP2020000157A (es) 2020-09-15
ES2937049T3 (es) 2023-03-23
TW201946661A (zh) 2019-12-16
CO2020012403A2 (es) 2020-10-30
ZA202005385B (en) 2022-09-28
JP2021517584A (ja) 2021-07-26
PE20212133A1 (es) 2021-11-05
IL276980A (en) 2020-10-29
EP3774860B1 (en) 2022-12-28
CN112004821B (zh) 2024-01-02
EA202092084A1 (ru) 2021-01-27
CL2020002564A1 (es) 2021-01-29
WO2019195091A1 (en) 2019-10-10
US11104711B2 (en) 2021-08-31
JOP20200252A1 (ar) 2020-10-04
AR115021A1 (es) 2020-11-18
PH12020551656A1 (en) 2021-07-26
JP7064618B2 (ja) 2022-05-10
CA3096375C (en) 2023-09-12
EP3774860A1 (en) 2021-02-17
CA3096375A1 (en) 2019-10-10
ECSP20062930A (es) 2020-11-30
SG11202009853VA (en) 2020-11-27
JOP20200252B1 (ar) 2023-09-17
TWI724392B (zh) 2021-04-11
BR112020017256A2 (pt) 2020-12-22
US20190309033A1 (en) 2019-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102501922B1 (ko) 성장분화인자 15 효능제 화합물 및 이를 사용하는 방법
US9493530B2 (en) FGF21 mutants comprising a mutation at position 98, 171 and/or 180
EP3248610B1 (en) Fgf21 mutants and uses thereof
KR20090092336A (ko) 인슐린 감수성 및 지질 프로필을 개선하기 위한 장기 작용 glp-1 수용체 작용제의 용도
JP2022118184A (ja) コンジュゲートされたc1エステラーゼインヒビター及びその使用
US20180280474A1 (en) Treatment of bile acid disorders
EA042599B1 (ru) Соединения - агонисты фактора роста и дифференцировки 15 и способы их применения
AU2014202582A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof
KR20230137342A (ko) 반감기 연장 모이어티 및 그의 사용 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right