TW201233685A - Anti-diabetic compounds - Google Patents

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TW201233685A TW100140134A TW100140134A TW201233685A TW 201233685 A TW201233685 A TW 201233685A TW 100140134 A TW100140134 A TW 100140134A TW 100140134 A TW100140134 A TW 100140134A TW 201233685 A TW201233685 A TW 201233685A
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Tetsuya Ishino
Moorthy Sitharamaiah Suriyanarayana Palanki
Bernard Norman Violand
Tapan Kanti Das
Tamara Shafer Hodge
Erin Kristen Parsons
Nancy Jane Levin
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Covx Technologies Ireland Ltd
Pfizer
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Description

201233685 六、發明說明： . 【發明所屬之技術領域】 本發明關於用於促進胰島素分泌和降低血糖量之新穎 « 化合物，以及製備和使用這些化合物之方法。 【先前技術】 第Π型糖尿病爲糖尿病中最普遍的形式。此種疾病係 因爲胰島素抗性及胰臟/3細胞衰竭，從而減少由葡萄糖刺 激之胰島素分泌所造成。纖維母細胞生長因子（FGF ) 21 (FGF族的成員之一）已被確定爲是一種代謝調節劑且優 先表現在肝臟和脂肪組織中，並透過細胞表面受體（其由 在諸如肝臓和脂肪組織之靶的細胞上的FGFR1 c和冷-Klotho所組成）發揮其生物活性（W00 1 3 6640 及 WO01 18 172)。該受體複合物被認爲引發細胞質傳信並透 過Ras/MAP激酶路徑上調GLUT1之表現。其提供持續之 葡萄糖及血脂控制，並提高胰島素敏感性及/9細胞功能， 但不會在臨床前設置中造成任何明顯的不良反應之能力已 使FGF21成爲有吸引力之第Π型糖尿病及相關之代謝失 調的治療劑。 現已有許多致力於以FGF21爲基礎的硏發療法。 W020060655 82 、 W020060287 1 4 、 W02006028595 及 W02005061712係關於FGF21之突變蛋白（包括個別胺基 酸取代）°W02006078463係針對使用FGF2治療心血管 疾病之方法。W02005072769係關於使用FGF21與噻唑啉 -5- 201233685 二酮之組合治療糖尿病之方法。WO 03 0 5 92 70係關於包含 投服 FGF2 1來降低危重患者之死亡率的方法。 W003 0 1 1 2 1 3係關於包含投服FGF21來治療糖尿病及肥胖 的方法。 然而，這些建議之療法中有許多均面臨FGF21在人 類活體內之半衰期爲1.5至2小時的問題。已有一些嘗試 企圖克服此缺點。W02005091944、W02006050247 及 WO2008 1 2 1 563中分別揭露經由離胺酸或半胱胺酸殘基、 葡糖基及非天然胺基酸殘基連接PEG之FGF21分子。 W0200 51 1 3 606描述FGF21分子使用聚甘胺酸連接子，經 由其C端重組融合至白蛋白及免疫球蛋白分子。 然而，發展蛋白結合物使其成爲有用、具成本效益之 藥物存在著許多重大且往往爲只能擇其一之挑戰：活體內 療效、活體內半衰期、活體外儲存之穩定性及製造之容易 性和效率（包括共軛結合之效率和特異性）間必須達到平 衡。一般而言，共軛結合過程中不會消除或顯著降低所討 論之蛋白質的所需生物作用是必要的。功能所需之蛋白 質-蛋白質交互作用可能需要多個蛋白質區作用協調，且 以附近出現之結合物擾亂這些蛋白質區中任一區時可能會 干擾活性部位或對三級結構造成足夠之改變而降低活性部 位之功能。除非該共軛結合作用係透過Ν’或C’端，否則 促進鍵聯之內部突變可能是需要的。這些突變對蛋白質之 結構和功能可具有不可預測之影響。因此，對於以FGF2 1 爲基礎之替代療法的需求仍持續存在。 201233685 本專利說明書中涉及之任何技藝不是且不應被視爲任 何形式之承認或暗示該參考之技藝形成通常知識之一部分 【發明內容】 本發明關於包含經由連接子共價連接抗體結合部位之 FGF21分子的組成物，其中該連接子係共價連接FGF21 內之連接殘基的側鏈。 該連接殘基可爲半胱胺酸或離胺酸。該連接殘基可能 位於選自如下群組之位置：根據S EQ ID NO: 1編號之胺基 酸殘基第 56 、 59 、 69 、 79 、 86 、 122 、 125 及 129 號。該 連接殘基可能位於選自如下群組之位置：根據SEQ ID ΝΟ:1編號之胺基酸殘基第56、59、86及122號。該連接 殘基可能位於選自如下群組之位置：根據SEQ ID NO: 1編 號之胺基酸殘基第79、125及129號。
於一些態樣中，本發明提供包含FGF2 1分子之組成 物，該FGF21分子係共價連接至少一個位於根據SEQ ID ΝΟ:1 編號之殘基 56、59、69、79、86、122、125 和 / 或 129號上之連接殘基的半衰期增加部分。於一些態樣中， 該FGF2 1分子係共價連接一個半衰期增加部分。於一些 態樣中，該連接殘基係選自79、125及129號殘基。該“ 半衰期增加部分”一詞係指當連接FGF2 1分子時可增加 FGF21分子之循環半衰期及/或抑制或降低FGF21分子 之腎清除率的任何分子。半衰期增加部分之實例包括PEG 201233685 、mPEG、含有磷醯膽鹼之聚合物、Fc結構區、Fab、Fab' 、F(ab’）2、Fv、ds Fv、scFv、VH、VL、微型雙功能抗體（ diabody )、小體（minibody)、抗體、催化性抗體（討 論於下文中）、蛋白質（諸如白蛋白）及其他本技藝已知 之大分子。 該連接殘基之側鏈可包含锍基。該連接殘基可爲半胱 胺酸。 該FGF21分子可包含SEQ ID NO: 3«該FGF21分子 可包含SEQ ID NO: 4。該FGF21分子可包含選自如下群 組之序列：SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO ： 12 及 SEQ ID NO : 13。 該連接殘基可位於根據SEQ ID NO: 1編號之位置 125處。該FGF21分子可包含選自如下群組之序列：SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO :6及SEQ ID NO : 7。於一些實施例中，該FGF21序列 爲 SEQ ID NO : 7。 該連接殘基可位於根據SEQ ID NO: 1編號之位置 129處。該 FGF21分子可包含選自如下群組之序列： SEQ ID NO ： 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO: 9及 SEQ ID NO: 10。於一些實施例中，該 FGF21 序列爲 SEQ ID NO: 10。 該連接殘基可位於根據SEQ ID NO : 1編號之位置79 201233685 處。該FGF21分子可包含選自如下群組之序列：SEQ ID NO : 3 ' SEQ ID NO ： 4 > SEQ ID NO ： 11 ' SEQ ID NO ： 12及SEQ ID NO: 13。於一些實施例中，該FGF21序列 爲 SEQ ID NO : 13。 於一些實施例中，該連接殘基可位於選自如下群組之 位置處：根據SEQ ID NO : 1編號之位置1、2、56、59、 69及122。於一些實施例中，該連接殘基可位於選自如下 群組之位置處：根據SEQ ID NO : 1編號之位置1、2、56 ' 59及122。該連接殘基可爲離胺酸。該FGF21分子可 包含SEQ ID NO: 17。該FGF21分子可包含選自如下群 組之序列：SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO : 20、SEQ ID NO : 21 及 SEQ ID NO : 23。 US2009098 1 30中揭露某些合適之連接子，其內容納 入此文中作爲參考資料。尤其是，US2009098 1 30中具體 及大致之關於描述連接子之一般公式、特殊連接子結構、 連接子之合成方法及X、Y和Z基團之不同成分的組合等 態樣包含在本文中。該連接子可爲直鏈型或支鏈型，並可 選擇性地包括一或多個碳環或雜環基。連接子長度可被視 爲直線原子之數目，其環形部分（諸如芳香環等等）係採 取圍繞該環之最短路線計算。於一些實施例中，該連接子 具有5-15個原子之線性延伸，於其他實施例中係具有15-30個原子，再於其他實施例中係具有3 0-5 0個原子，再 於其他實施例中係具有50-1 00個原子，而於其他實施例 中係具有1 00-200個原子。其他連接子之考量包括對所產 -9 - 201233685 生之化合物之物理或藥物動力學性質的影響，諸如對溶解 度、親脂性、親水性、疏水性、穩定性（較穩定或較不穩 定，以及計劃好之降解）、剛性、彈性、免疫原性及抗體 結合之調整作用、被納入微胞或脂質體之能力等等的影響 0 於本發明之一些態樣中，該化合物包含共價連接至連 接殘基之側鏈的連接子。該連接子可包含式：X-Y-Z ;其 中X爲包括任何選自C、H、N、〇、P、S、F、CM、Br* I之原子的生物相容連接鏈，並可能包含聚合物或嵌段共 聚物，且係共價連接其中該連接子爲線性之連接殘基，Y 爲可選擇地存在之包含至少一個環狀構造的識別基；且Z 爲連接部分，其包含連接至抗體之結合部位中之胺基酸側 鏈的共價鍵聯。 當存在時，Y可能具有下列可選擇地經取代之結構：
其中a、b、c、d及e各自獨立地爲碳或氮；f爲碳、 氮、氧或硫；Y係獨立地連接位於任何兩個具有足夠價數 之環位置處的X和Z;且a、b、c、d、e或f中不超過四 個同時爲氮，且較佳地，在環狀構造中之a、b、c、d及 e各爲碳。於一些態樣中，Y可能爲苯基。雖然不欲受限 於任何理論，咸信該Y基團可以協助將反應基置入抗體 結合部位中，從而使該Z基團能與反應性胺基酸側鏈反應 -10- 201233685 該連接子可經過設計從而使其包含能與大分子（諸如 抗體、蛋白質或其片段）形成共價或非共價鍵之反應基團 。該反應基團係經過選擇以與特殊結合部位中之反應殘基 一起使用。例如：藉由醛縮酶抗體修改之化學部分可爲酮 '二酮、/3內醯胺、活性酯鹵代酮、內酯、酐、馬來醯亞 胺、α -鹵代乙醯胺、環己二酮、環氧化物、醛、脒、胍 、亞胺、烯胺、磷酸化物、膦酸化物、環氧化物、氮丙啶 、硫代環氧化物、經屏蔽或保護之二酮（如縮酮）、內醯 胺、鹵代酮、醛等等。於本發明之實施例中係以連接子連 接本發明之肽，Ζ爲反應基團。 於一些實施例中，在與抗體之結合部位中之殘基側鏈 共軛結合前，ζ包含一或多個 c = o基團，該c = o基團經 過安排以形成氮雜環丁酮、二酮、醯基/9 -內醯胺、活性 酯、鹵代酮、環己二酮基團、醛、馬來醯亞胺、經活化之 烯烴、經活化之炔，或者，一般而言，包含容易發生親核 或親電子取代之脫離基的分子。其他基團可能包括內酯、 酐、α -鹵代乙醯胺、亞胺、醯肼或環氧化物。示範之可 與抗體結合部位中之反應性親核基團（如離胺酸或半胱胺 酸側鏈）共價鍵結之連接子親電子反應基團包括醯基/3-內醯胺、單純二酮、琥珀醯亞胺活性酯、馬來醯亞胺、具 連接子之鹵代乙醯胺、鹵代嗣、環己二酮、醛、脒、胍、 亞胺、烯胺、磷酸化物、膦酸化物、環氧化物、氮丙啶、 硫代環氧化物、經屏蔽或保護之二酮（例如縮酮）、內醯 胺、磺酸化物等等，經屏蔽之c = o基團，諸如亞胺、縮 -11 - 201233685 酮、縮醛以及任何其他已知之親電子基團。於某些實施例 中，該反應基團包括一或多個經安排以形成下列群組之 c = 0基團：醯基；S-內醯胺、單純二酮、琥珀醯亞胺活性 酯、馬來醯亞胺、具連接子之鹵代乙醯胺、鹵代酮、環己 二酮或醛。Z可能爲經取代之烷基、經取代之環烷基、經 取代之芳基、經取代之芳烷基、經取代之雜環基或經取代 之雜環烷基，其中至少一個取代基爲1,3-二酮部分、醯基 冷-內醯胺、活性酯、α -鹵代酮、醛、馬來醯亞胺、內酯 、酐、鹵代乙醯胺、胺、醯肼或環氧化物。Ζ基團可 能共價連接可增加本發明肽類之半衰期的大分子支架。若 存在時，Ζ基團可共價連接抗體之結合部位。 於一些態樣中，在共軛結合（例如與抗體之結合部位 結合）之前，Ζ具有下列構造：
其中q = 0-5°q可能爲1或2°q可能爲1。於其他 態樣中，q可能爲2。 於一些態樣中’在與抗體之結合部位共軛結合之後， Z具有下列構造：
其中q = 0-5，而抗體-N·爲結合抗體之結合部位中之 側鏈的共價鍵。q可能爲1或2。q可能爲1。於其他態樣 中，q可能爲2。 -12- 201233685 X可能爲包含三種組分之基團；Xp-Xs-Xy，其中 爲經特異改造以適合與FGF21蛋白質連接殘基之側鏈 合的基團，Xs爲X基團之間隔子區且Xy爲經改造以 合與Y基團結合之基團。於一些態樣中‘，Xy係選自醯 鍵、烯胺鍵或觚鍵。Xy可經過選擇以提供與Y基團相 (在兩個原子內）之氫分子。雖然不欲受限於學理，咸 Η原子可透過氫鍵交互作用協助Y基團辨認疏水袋 hydrophobic pocket )，尤其是在催化性抗體（諸 h38C2)結合槽裂（binding cleft)之疏水袋方面。因 ，例如，醯胺鍵可經定向從而使該NH基團直接與Y基 鍵結，提供NH基團之Η供氫鍵結。或者，該醯胺之C 基團可與Υ基團鍵結，使ΝΗ基團之Η與Υ基團至多 隔2個原子，但仍可供Η鍵結。於一些實施例中，Xy 存在。於一些實施例中，Xy基團具有下式：
卜V 0 於一些態樣中，XS係經過選擇從而使Xs不會提供 度反應的基團。Xs可經過選擇從而提供總長度爲2-15 原子之X基團。Xs可經過選擇從而使X基團之總長度 2至10個原子。Xs可經過選擇從而使X基團之總長度 4-8個原子。Xs可經過選擇從而使X基團之總長度爲5 原子。Xs可經過選擇從而使X基團之總長度爲6個原 。於一些態樣中，Xs可包含下列式之一：
Xp 組 適 胺 鄰 信 ( 如 此 團 =0 相 不 過 個 爲 爲 個 子 -13- 201233685
其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 且 m 存在或 不存在；η可能爲1、2、3、4、5或6;n可能爲1、2、3 或4，π可能爲1，π可能爲2，π可能爲3，π可能爲4。 於一些態樣中，Xs包含下列式之一：
Ο
(示範於L1及L2) (示範於L3及L7) (示範於L4) (示範於L5) (示範於L6) (示範於L8) 理想上，Xp係經過選擇從而使FGF21蛋白質之連接 殘基的特異定向性共價連接策略成爲可行。例如，當該連 接殘基包含親核基團時，Xp可能親電子基團，反之亦然 。例如，若該連接殘基側鏈包含胺基團，諸如K、Η、Y 、鳥胺酸、Dap或Dab，Xp可能爲COOH，或其他類似之 反應性親電子。若該連接殘基爲D或E，Xp可包含親核 基團，諸如胺基團。這些策略中之任一策略可允許Xp基 -14- 201233685 團與連接殘基間藉由形成醯胺鍵之策略來形成共價鍵。當 該連接基團爲胺基團時，Χρ可包含下式：
V 其中該連接殘基爲c、C之同系物或其他含毓基殘基 ，Χρ可能包含馬來醯亞胺基團（或類似），此基團允許 硫代馬來醯亞胺加成反應策略以使Χρ基團共價連接該連 接殘基。於一些態樣中，Χρ亦可能包含锍基，允許該連 接殘基與Χρ基團間形成二硫化物橋聯。於一些態樣中， Χρ可爲馬來醯亞胺：
其中該箭頭指明連接FGF2 1連接殘基之附著點，且 該平行線代表連接該連接子之Υ基團》其中該FGF21連 接殘基爲半胱胺酸殘基，或其他帶有側鏈之锍基，該共軛 結合之機制可能如下：
於一些態樣中，該Χρ基團包含經取代之馬來醯亞胺
-15- 201233685 於'些態樣中，在共軛結合之前及共軛結合之後’該 連接子之XY組分可選自下列： XY-1
XY-2
XY-4
組分 XY-1、XY-2、XY-3及 XY-4在共軛結合至 FGFH分子上之帶有锍基側鏈的實施例中特別有用。 於一些實施例中，該連接子可爲連接子-1 (L1)
L1 當L1與抗體共軛結合時，該抗體-L1複合物可包含 -16- 201233685 下式：
Ab-L1 當L1與FGF21分子共軛結合時，該L1-FGF21複合 物可包含下式：
L1-FGF21 當L1與抗體及FGF2 1分子共軛結合時，該抗體-L1-FGF21複合物可包含下式：
Ab-L1-FGF21 於一些實施例中，該連接子可爲連接子-2( L2)
L2 當L2與抗體共軛結合時，該抗體-L2複合物可包含
Ab-L2 當L2與FGF21分子共軛結合時，該L2-FGF21複合 物可包含下列式之一： -17- 201233685
L2-FGF21 L2-FGF21 當L2與抗體及FGF21分子共軛結合時，該抗體-L2-FGF21複合物可包含下列式之一：
於一些實施例中，該連接子可爲連接子-3 (L3)
L3 當L3與抗體共軛結合時，該抗體-L3複合物可包含
Ab-L3 當L3與FGF21分子共軛結合時，該L3-FGF21複合 物可包含下列式之一： -18- 201233685
L3-FGF21 當L3與抗體及FGF21分子共軛結合時，該抗體-L3-FGF21複合物可包含下式：
0 Ab-L3-FGF21 於一些實施例中，該連接子可爲連接子-4( L4)
當與抗體共軛結合時，該抗體-L4複合物可包含下式
當與FGF21分子共軛結合時，該L4-FGF21複合物可 包含下式： -19- 201233685
L4-FGF21 當L4與抗體及FGF21分子共軛結合時，該抗體-L4-FGF21複合物可包含下式：
於一些實施例中，該連接子可爲連接子-5 (L5) 〇
當L5與抗體共軛結合時，該抗體-L5複合物可包含 下式：
Ab-L5 當L5與FGF21分子共軛結合時，該L5-FGF21複合 物可包含下式： -20- 201233685
[NH-FGF211 L5-FGF21 當L5與抗體及FGF2 1分子共軛結合時，該抗體-L5-FGF21複合物可包含下式：
1或2
Ab-L5-FGF21 於一些態樣中，該連接子可爲連接子-6 ( L6 )
〇 〇 L6 當L6與抗體共軛結合時，該抗體_L6複合物可包含 下式：
1或2
Ab-L6 當L6與FGF21分子共軛結合時，該L6-FGF21複合 物可包含與L5-FGF21相同之構造式。類似地，當L6與 抗體及FGF21分子共軛結合時，該抗體_L6_FGF21複合物 可包含與Ab-L5-FGF21相同之構造式。 於一些實施例中’該連接子可爲連接子_7(L7)：
L7 -21 - 201233685 當與抗體共軛結合時，該抗體-L7複合物可包含下式
當與FGF21分子共軛結合時，該L7-FGF21複合物可 包含下式=
Ab-L7 當與抗體及FGF21分子共軛結合時，該抗體-L7-FGF21複合物可包含下式：
於一些實施例中，該連接子可爲連接子-8 (L8) Ο
當L8與抗體共軛結合時，該抗體-L8複合物可包含 下式：
當L8與FGF21分子共軛結合時，該L8-FGF21複合 物可包含下式： -22- 201233685
Η 人二^』S~FGF2lJ L8-FGF21 當L8與抗體及FGF21分子共軛結合時，該抗體-L8-FGF21複合物可包含下式：
Ο Ο S-FGF21 1或2
Ab-L8- FGF21 於一些實施例中，該Ab -連接子- FGF21結合物可具 有下式：
1或2 其中該抗體結合部位係共價連接該連接子，S-FGF21爲連 接FGF21分子上之含锍基側鏈的共價鍵聯，n=l、或2、 或 3' 或 4、5、6、7'8、9 或 10;n 可能爲 1、2、3、4 、5或6;n可能爲l;n可能爲2;n可能爲3;n可能爲 4’且m爲可選擇的。Μ可能不存在。μ可能存在。 於一些實施例中’該Ab-連接子-fGF2i結合物可具 有下式：
S-FGF21 1或2 其中該抗體結合部位係共價連接該連接子，S-FGF21爲連 201233685 接FGF21分子上之含毓基側鏈的共價鍵聯，n=l、或2、 或 3、或 4、5、6、7、8、9 或 10; η 可能爲 1、2、3'4 、5或6; η可能爲1; η可能爲2; η可能爲3; η可能爲 於一些實施例中，該組成物包含下式：
其中抗體係連接抗體之結合部位的共價鍵聯，S-FGF21爲 連接FGF2 1分子上之含锍基側鏈的共價鍵聯。於—些實 施例中，該FGF21分子包含SEQ ID NO: 10。於一些實 施例中，該FGF21分子包含SEQIDNO: 7。 於一些態樣中，本發明係針對如此處所描述之連接子 及連接子組分，尤其是，但不限於此處所描述之X基團 。於一些態樣中，本發明係針對包含抗體或其抗原結合部 分之組成物，該抗體或其抗原結合部分係以共價方式共軛 結合此處所描述之連接子或連接子基團。於一些態樣中， 該連接子或連接子基團可進一步直接或間接共軛結合肽或 蛋白質。很清楚地，該連接子及抗體連接子結合物之用途 不受限於與FGF21分子一起應用，且該抗體-連接子結合 物可爲與其他肽類、蛋白質及治療劑和靶向劑結合之結合 物。可理解的是’爲了這些目的，與此處所描述之描繪 S-FGF21及NH-FGF21的結構相同之結構可應用於其他蛋 白質、肽類及治療和靶向分子；被該蛋白質、肽或分子取 代之代表結構的FGF；21命名。 -24- 201233685 於一些態樣中’本發明提供具有下式之連接子：
其中11=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10;11可 能爲1、2、3、4、5或0;11可能爲1;11可能爲2:11可 能爲3; η可能爲4。Μ可能不存在。Μ可能存在。 於一些態樣中，本發明提供具有下式之連接子：
其中11 = 1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或1〇:11可 能爲1'2、3、4、5或ό:η可能爲l;n可能爲2;11可 能爲3; η可能爲4。Μ可能不存在。Μ可能存在。 於一些實施例中，本發明係針對包含選自如下群組之 連接子的組成物：LI、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8， 以及其他此處所描述之具有特殊及一般連接子式的連接子 。於一些態樣中’本發明係針對製造該連接子及其抗體_ 連接子’蛋白質-連接子或抗體-連接子-蛋白質結合物的 方法。 20小時 於一些實施例中，本發明關於包含經由連接子共價連 接抗體結合部位之FGF21分子的組成物，其中該連接子 係共價連接在FGF21中之連接殘基的側鏈，形成共範結 合之蛋白質-抗體複合物，從而使該經共軛結合之蛋白質_ 抗體複合物在小鼠模型中之皮下半衰期爲至少約 -25- 201233685 。於一些實施例中，該sc半衰期爲至少約25小時。於 一些實施例中，該SC半衰期爲至少約3〇小時。於一些 實施例中，該SC半衰期爲至少約33小時。於一些實施 例中，在大鼠模型中之SC半衰期爲至少約35小時。於 —些實施例中，在大鼠模型中之SC半衰期爲至少約36 小時。於一些實施例中，在靈長類動物模型中之SC半衰 期爲至少約40小時。於一些實施例中，在靈長類動物模 型中之SC半衰期爲至少約45小時。於一些實施例中， 本發明提供在小鼠模型中之IV半衰期爲至少約28小時之 經共軛結合的抗體-蛋白質複合物。於一些實施例中，本 發明提供在大鼠模型中之IV半衰期爲至少約5 5小時之經 共軛結合的抗體-蛋白質複合物。於一些實施例中，本發 明提供在大鼠模型中之IV半衰期爲至少約5 5小時之經共 軛結合的抗體-蛋白質複合物。於一些實施例中，本發明 提供在大鼠模型中之IV半衰期爲至少約60小時之經共軛 結合的抗體-蛋白質複合物。於一些實施例中，本發明提 供在靈長類動物模型中之IV半衰期爲至少約60小時之經 共軛結合的抗體-蛋白質複合物。於一些實施例中，本發 明提供在靈長類動物模型中之IV半衰期爲至少約65小時 之經共軛結合的抗體-蛋白質複合物。於一些實施例中， 本發明提供於投服單一劑量後在人體內之IV半衰期爲至 少約30小時之經共軛結合的抗體-蛋白質複合物。於一些 實施例中，本發明提供於投服單一劑量後在人體內之IV 半衰期爲至少約35小時之經共軛結合的抗體-蛋白質複合 -26- 201233685 物。 於一些實施例中，本發明關於包含經由連接子共價連 接抗體結合部位之FGF21分子的組成物，其中該連接子 係共價連接FGF2 1內之連接殘基的側鏈，形成共軛結合 之蛋白質-抗體複合物，從而使該經共軛結合之蛋白質_抗; 體複合物在小鼠模型中之皮下生物可利用率爲至少約50 %。於一些實施例中，該SC生物可利用率爲至少約55% 。於一些實施例中，該SC生物可利用率爲至少約65%。 於一些實施例中，在大鼠模型中之SC生物可利用率爲至 少約50%。於一些實施例中，在靈長類動物模型中之sc 生物可利用率爲至少約50%。於一些實施例中，在靈長 類動物模型中之SC生物可利用率爲至少約60%。於一些 實施例中，在靈長類動物模型中之SC生物可利用率爲至 少約6 5 %。 於一些實施例中，本發明關於包含經由連接子共價連 接抗體結合部位之FGF21分子的組成物，其中該連接子 係共價連接FGF21內之連接殘基的側鏈，形成共軛結合 之蛋白質-抗體複合物，從而使該經共軛結合之蛋白質-抗 體複合物在小鼠模型中之皮下生物可利用率爲至少約50 %。於一些實施例中，該SC生物可利用率爲至少約55% 。於一些實施例中，該SC生物可利用率爲至少約65%。 於一些實施例中，本發明關於包含經由連接子共價連 接抗體結合部位之FGF21分子的組成物，其中該連接子 係共價連接FGF21內之連接殘基的側鏈，形成共軛結合 -27- 201233685 之蛋白質-抗體複合物，從而使該經共軛結合之蛋白質-抗 體複合物在Glutl Taqman分析中之EC5Q效力低於約5nM 。於一些實施例中，在Glutl Taqman分析中之EC5〇效力 低於約4nM。於一些實施例中，在Glutl Taqman分析中 之EC5〇效力低於約3nM。 於一些實施例中，該經共軛結合之蛋白質-抗體複合 物結合二或多種有利優勢，諸如SC半衰期、IV半衰期、 葡萄糖攝取、效力、生物可利用率、易於製造、共軛結合 效率、活體內之穩定性、活體外之穩定性、對水解之抗性 及抗體、連接子與蛋白質之間的相容性。 抗體 US2006205 670之內容納爲此文之參考-尤其是段落 [0153] - [0233 ]，其描述抗體、其有用之片段和變異體 及修改、結合部位和CDRs、抗體製備方法、表現、人化 、胺基酸修改、糖基化、ADCC、CDC、增加之抗體的血 清半衰期、表現載體、哺乳動物宿主系統及折疊，以及其 他抗體技術之要素。 此處所使用之"結合部位”（亦稱爲抗體結合部位） 係指與適當抗原（或結構上類似之蛋白質）之決定簇結合 (或可結合）之免疫球蛋白之區或Ig結構區。此一詞通 常包括涉及抗原結合之CDR及相鄰之框構殘基。 此處所使用之“醛縮酶抗體”係指含有結合部位部分 之抗體，該結合部位部份當不受防礙（例如經由共軛結合 -28- 201233685 )時，其催化脂族酮供給者及醛接受者之間 應。醛縮酶抗體可經由以免疫原將免疫反應 生成，再進一步藉由在抗體之結合部位具有 反應性ε胺基團）來表徵，該免疫原包含與 之具下式之1,3-二酮半抗原： 的醛醇加成反 動物免疫化來 離胺酸（帶有 載體蛋白耦合 ΟΗ Ο 0
且該醛縮酶抗體進一步藉由該抗體之結 有反應性ε胺基團之離胺酸表徵。該醛縮酶 一步藉由1，3-二酮半抗原與該催化性抗體之 基團間形成複合物而使其催化活性被1,3-二 來說明。 如前述，於某些實施例中，某些可與本 結合使用之抗體在抗體結合部位中可能需要 鏈。反應性側鏈可能天然存在或可能經由突 體中。該抗體結合部位之反應殘基可能與抗 當該殘基係由存在於該最先被鑑定用於製造 胞中的核酸編碼時。或者，該胺基酸殘基' DNΑ發生突變，從而編碼該特定殘基來產生 WO 0 1 /22922 )。該反應性殘基可爲非天然 ，例如：使用如本文所討論之獨特密碼子、 基-tRN A，藉由生物合成倂入法產生。於另 該胺基酸殘基或其反應性官能基（如：親核 )可能連接抗體結合部位之胺基酸殘基。因 用之“透過抗體結合部位中之胺基酸殘基” -29- 合部位中之帶 抗體之特性進 離胺酸的ε胺 酮半抗原抑制 發明之化合物 一個反應性側 變而被置於抗 體聯合，諸如 抗體之淋巴細 可經由特意使 (如 殘基，其係由 tRNA及胺醯 一種方法中， 性胺基或毓基 此，此處所使 產生之與抗體 201233685 的共價鍵聯意指該鍵聯可直接連接抗體結合部位中之胺基 酸殘基或透過連接抗體結合部位之胺基酸殘基的側鏈之化 學部分連接。於一些實施例中，該胺基酸爲半胱胺酸且該 側鏈之反應基團爲锍基。於其他實施例中，該胺基酸殘基 爲離胺酸且該側鏈之反應性基團爲ε -胺基團。於一些實 施例中，該胺基酸爲根據 Kabat編號之重鏈上的Lys93» 於一些實施例中，該胺基酸爲HC h38C2(SEQ ID NO: 26 )上之 Lys-99。 催化性抗體爲具有包含一或多個反應性胺基酸側鏈之 合適結合部位的抗體來源之一。這類抗體包括醛縮酶抗體 、召內醯胺酶抗體、酯酶抗體及醯胺酶抗體。 一種實施例包含醛縮酶抗體（諸如小鼠單株抗體mAb 33F12及mAb 38C2)，以及這類抗體之適當嵌合及人化 變體（如：h38C2，SEQ ID NO ： 25 及 26)。老鼠 mAb 38C2(及h38C2)具有接近但在HCDR3外之反應性離胺 酸且爲藉由反應性免疫化及機械上模擬天然醛縮酶所產生 之新催化性抗體類別的原型。見C. F. Barbas et al.， Science 278:2085-2092 ( 1 997)。其他可能使用之醛縮酶催 化性抗體包括由下列群組產生之抗體：融合瘤85A2， ATCC編號爲PTA_1015;融合瘤85C7，ATCC編號爲 PTA-1014;融合瘤 92F9，ATCC 編號爲 PTA- 1017;融合 瘤 93F3，ATCC 編號爲 PTA-8 23 ;融合瘤 84G3，ATCC 編 號爲 PTA-824;融合瘤 84G11，ATCC 編號爲 PTA-1018; 融合瘤84H9，ATCC編號爲PTA-1019;融合瘤85H6， -30- 201233685 ATCC編號爲PTA-825;融合瘤90G8，ATCC編號爲PTA-1016。透過反應性離胺酸，這些抗體利用天然醛縮酶之烯 胺機制催化醛醇及逆醛醇反應。醛縮酶抗體及產生醛縮酶 抗體之方法揭露於美國專利案編號 6,2 1 0,9 3 8、6,3 68,8 3 9 、6,326，176、6,589,766、5,985,626 及 5,733,75 (其係以 引用方式倂入本案）中。 本發明之化合物亦可能經由連接本發明之化合物與反 應性半胱胺酸來形成，諸如那些在硫酯酶及酯酶催化性抗 體之結合部位中發現者。合適之硫酯酶催化性抗體描述於 K. D. Janda et al·， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 9 1:2532-2536 (1 994)中。合適之酯酶抗體描述於 P.
Wirsching et al.，Science 2 7 0:1 775- 1 782 ( 1 995)中 ° 含有 反應性胺基酸之抗體可藉由本技藝所周知之方式製備，包 括使抗體結合部位殘基突變以編碼該反應性胺基酸或以含 有反應性基團之連接子在抗體結合部位中化學衍生出胺基 酸側鏈。
該抗體可爲人化抗體。當本發明之化合物共價連接抗 體之結合部位且這類抗體爲人化抗體時，這類抗體被人化 時保留對Z基團之高連接親和力是重要的。考量之人化的 小鼠醛縮酶抗體形式有多種。於一種實施例中係使用具有 人類恆定區CK及CY11之人化醛縮酶催化性抗體 h38c2 IgGl 或 h38c2 Fab。C. Rader et al., J. Mol. Bio. 332:889-899 (2003)中揭露可用於製造h38c2 Fab及h38c2 IgGl的 基因序列及載體。使用人類種系VK基因DP K-9及人類JK -31 - 201233685 基因JK4作爲用於將m38c2之/c輕鏈可變區人化的框構 ，並使用人類種系基因DP-47及人JH基因JH4作爲用於 將m3 8 c2之重鏈可變區人化的框構。第1圖說明m3 8c2、 h38c2及人類種系細胞中之可變輕鏈和重鏈之間的序列比 對。h3 8c2可採用IgGl、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，包 括其任何同種異型。於本發明化合物之某些實施例中，其 中該抗體爲具有Glm(f)同種異型之h38c2 IgGl，Z結 合在重鏈之位置99上之離胺酸殘基的側鏈。另一種實施 例採用包含h38c2 (SEQ ID NO: 27及28)之可變區（VL 及VH)及來自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4之恆定區的嵌 合抗體。該抗體可爲全長抗體、Fab、Fab1、F(ab')2、Fv 、ds Fv、sc Fv、VH、VL、微型雙功能抗體或包含來自 h38c2之Vl及VH結構區的小體。該抗體可爲包含來自 h38c2之VH及結構區及選自如下群組之恆定區的抗體 :IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4。該抗體可爲 h38C2 IgGl ( SEQ ID NO: 25及26)。該抗體可爲包含來自人IgG、 IgA、IgM、IgD或IgE抗體之恆定區的小鼠醛縮酿抗體的 人化變體。於另一實施例中，該抗體爲包含來自小鼠醛縮 酶抗體之VL及VH區及來自人IgG、IgA、IgM、IgD或 IgE抗體之恆定區的嵌合抗體。於一些實施例中，該抗體 包含來自m38C2(SEQ ID NO: 29及30)之VL及VH結 構區。於進一步之實施例中，該抗體爲包含來自天然.或固 有之人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗體的多肽序列之小 鼠醛縮酶抗體的全長人類變體。 -32- 201233685 亦考量各種形式之人化的醛縮酶抗體片段。一種實施 例係使用h38c2 F(ab')2。h38c2 F(ab')2可經由蛋白質水解 h38c2 IgGl來產生。另一種實施例係使用包含來自h38c2 之 及 VH結構區（其可選擇地藉由插入之連接子 (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 31)連接）的 h38c2 sc Fv» 可 以產製人抗體以替代人化。例如，現在已可能生產基因轉 殖動物（如小鼠），當被免疫化（或者，在催化性抗體之 情況中爲反應性免疫）時其有能力在缺乏內源性免疫球蛋 白產製之情況下製造人類抗體之完整集合庫。 或者，可使用噬菌體展示技術在活體外使用來自未免 疫化捐贈者之免疫球蛋白可變（V)區基因集合庫來產製 人抗體及抗體片段。如上述，亦可藉由活體外激活之B細 胞來產生人抗體，例如美國專利案編號5,567,6 1 0及 5,229,275 。 修改此處所描述之抗體的胺基酸序列被列入考量。例 如：理想的是改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特 性。抗體之胺基酸序列變異體係經由將合適之核苷酸變化 引入抗體核酸或藉由胜狀合成來製備。這類修改包括，例 如：從抗體之胺基酸序列刪除、插入殘基及/或取代殘基 。製造任何刪除、插入及取代之組合以取得最終構造，只 要該最終構造擁有所需之特性。該胺基酸變化亦可能改變 抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化部位之數量或位置。 本發明之抗體或抗體部分可從另一個分子（例如另一 個肽或蛋白質）衍生或連接至另一個分子。一般而言，該 -33- 201233685 抗體或其部分係經衍生從而使該連接子共價結合抗體結合 部位之能力不受衍生作用或標示之影響。因此，本發明之 抗體和抗體部分欲包括此處所描述之完整和修改形式的抗 體。例如：本發明之抗體或抗體部分可功能上連接（藉由 化學偶聯、基因融合、非共價結合或以其他方式）一或多 個其他可以調介該抗體或抗體部分與另一分子（諸如鏈黴 抗生物素（streptavidin )蛋白核心區或聚組胺酸標籤） 聯結的分子實體（諸如另一抗體，如：雙特異性抗體或微 型雙功能抗體、偵測劑、細胞毒性劑、藥劑及/或蛋白質 或肽）* 於其他實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部位可 爲融合抗體或與另一多肽連接之抗體。於一些態樣中，僅 有抗體之可變區與多肽連接。於一些態樣中，該抗體係以 不會干預該結合部位之結合能力的方式與肽共價結合。 多肽可爲一種治療劑，諸如靶向劑，肽、蛋白質促效 劑、蛋白質拮抗劑、代謝調節劑、激素、毒素、生長因子 或其他調節蛋白，或可爲一種診斷劑，諸如可輕易地目測 檢驗之酶（諸如辣根過氧化物酶）。此外，可創造其中兩 個（或多個）單鏈抗體彼此連接之融合抗體。若欲在單一 多肽鏈上創造二價或多價抗體，或若欲創造雙特異性抗體 則此亦有所助益》 一種類型之衍生抗體係經由將二或多種抗體（爲相同 類型或不同類型，例如：創造雙特異性抗體）交聯來產生 °合適之交聯劑包括那些爲異型雙功能，具有兩個藉由合 -34- 201233685 適之間隔子分開之不同反應性基團的交聯劑（例如間-馬 來醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯）或同型雙功能交 聯劑（例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯）。 另一種類型之衍生抗體爲經標記之抗體。可能用來衍 生本發明之抗體或抗體部分的有用偵測劑包括螢光化合物 ，包括螢光素、螢光素異硫氰酸酯、玫瑰紅（rhodamine )、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素 '鑭系螢光粉等等。 亦可以有用於偵測之酶標示抗體，諸如辣根過氧化物酶、 半乳糖苷酶，螢光素酶，鹼性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等等 。當抗體係以可偵測之酶標示時則係經由添加額外試劑使 該酶予用來產生可被識別之反應產物來偵測抗體。例如： 當存在辣根過氧化物酶作用劑時，添加過氧化氫及二胺基 聯苯胺可產生能被偵測到之有色反應產物。亦可以生物素 標記抗體，並透過間接測量抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素 蛋白結合來進行偵測。可以磁性劑（諸如釓）來標記抗體 。亦可能以可被第二報導子（例如：白胺酸拉鍊對序列、 用於第二抗體之結合部位、金屬結合區、抗原決定部位標 籤）辨識之預定多肽抗原決定部位標記抗體。於一些實施 例中，標記係藉由具有各種長度之間隔子連接，以減少潛 在之空間阻礙。 亦可以化學基團（諸如聚乙二醇（PEG )、甲基或乙 基、或碳水化合物基團）衍生抗體。這些基團可用於改良 該抗體之生物學特性，如：增加血清半衰期或增加組織結 合。 -35- 201233685 醫藥組成物 本發明之另一態樣係提供包含本發明之組成物及/或 化合物的醫藥組成物。包含本發明之組成物的作用劑可經 配製並經由全身性投服。用於配製及投服之技術可在 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1 990, Mack Publishing Co.，Easton, PA 中找到。 在用於注射方面，本發明之組成物可配製在水溶液、 乳液或懸浮液、或非水性溶液、懸浮液、乳液、分散液或 適合重建成無菌注射液或分散液之無菌粉末或凍乾粉末中 。合適之水性和非水性稀釋劑、溶劑及載劑之實例包括水 、乙醇、多元醇（諸如丙二醇、聚乙二醇、甘油等等）、 彼等之合適的混合物及油類。流動性可經由，例如使用塗 層（諸如卵磷脂）、在分散液之情況下經由維持所需的粒 度及使用表面活性劑來保持或改善。 本發明之組成物可配製在包含生理上相容之緩衝劑（ 諸如檸檬酸鹽、醋酸鹽、組胺酸或磷酸鹽）的水溶液中。 如有需要，這類調製劑亦可包含各種張力調節劑、助溶劑 及/或穩定劑（如：鹽類，諸如氯化鈉、糖類，諸如蔗糖 、甘露醇及海藻糖、蛋白質，諸如白蛋白、胺基酸，諸如 甘胺酸及組胺酸、表面活性劑，諸如聚山梨酸酯（吐溫（ Tween))或共溶劑，諸如乙醇、聚乙二醇及丙二醇）。 本發明之組成物亦可包含佐劑，諸如潤濕劑、乳化劑及懸 浮劑、分散劑和保存劑。本發明之組成物亦可能包含懸浮 -36- 201233685 劑，諸如瓊脂、偏氫氧化鋁、膨潤土、 、微晶型纖維素、聚氧乙烯山梨醇和山 蓍膠，或彼等之混合物。 本發明之組成物亦可能包含各種抗 如對苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸 包含等張劑，例如糖、氯化鈉等等。本 之長期吸收可能受使用能延遲吸收之作 脂酸鋁及明膠）影響。 本發明之組成物可包含用於改質、 成物之pH値、滲透壓、黏度、澄清度 氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋出速 配製物質。合適用之配製物質包括，但 諸如甘胺酸、麩醯胺、天門冬醯胺、精 抗菌劑、抗氧化劑（諸如L-甲硫胺酸 鈉或亞硫酸氫鈉）、緩衝劑（諸如醋酸 鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、 酸）、膨脹劑（諸如甘露醇或甘胺酸） 二胺四醋酸（EDTA) > DPTA)、錯合 聚乙烯吡咯啶酮、；S-環糊精或羥丙基 充劑、單醣、雙醣及其他碳水化合物（ 糖或糊精）、蛋白質（諸如血清白蛋白 白）、著色劑、調味及稀釋劑、乳化劑 諸如聚乙烯吡咯啶酮）、低分子量多肽 諸如鈉）、防腐劑（諸如苯扎氯銨、苯 乙氧基化異硬脂醇 梨醇酐酯，以及黃 菌及抗真菌劑，例 等等。亦可能需要 發明之注射組成物 用劑（例如：單硬 維持或保存例如組 、顏色、等張性、 度、吸附或滲透的 不限於：胺基酸（ 胺酸或離胺酸）、 抗壞血酸、亞硫酸 鈉、乳酸鹽、硼酸 磷酸鹽或其他有機 、螯合劑（諸如乙 劑（諸如咖啡因、 -/3 -環糊精）、塡 諸如葡萄糖、甘露 、明膠或免疫球蛋 、親水性聚合物（ 、成鹽抗衡離子（ 甲酸、水楊酸、硫 -37- 201233685 柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯'對羥基苯甲酸丙酯、 氯己陡（chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫）、溶劑（ 諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇）、糖醇（諸如甘露醇或山 梨醇）、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑（諸如普朗尼克（ pluronics) ; PEG;山梨醇酐酯；聚山梨酸酯，諸如聚山 梨酸酯20或聚山梨酸酯80; triton ;胺丁三醇：卵磷脂 :膽固醇或泰洛沙泊（tyloxapal ))、穩定性加強劑（諸 如蔗糖或山梨醇）、張力加強劑（諸如鹼金屬鹵化物-較 佳爲氯化鈉或鉀-或甘露醇、山梨醇）、輸送載體、稀釋 劑、賦形劑及/或製藥佐劑。 該配製組分可以能被投服部位接受之濃度存在。可使 用緩衝劑將該組成物維持在生理pH値或略低之pH値， 通常係在約5至約8之pH値範圍內。 於一些態樣中，本發明之醫藥組成物可能製備成其中 本發明之化合物係經過配製以控制或持續釋出該化合物。 實例包括透明質酸之類、高分子凝膠，小珠、顆粒，可注 射之微球，脂質體，薄膜，微膠囊，持續釋出之基質及植 入式藥物輸送裝置。 於一些態樣中，本發明之醫藥組成物係提供於單或多 腔預塡式注射器中。 於一些態樣中，本發明提供包含至少一種本發明之化 合物或組成物與至少一種適合用於醫藥組成物中之額外成 分的套組。於一些態樣中，本發明提供包含至少一種本發 明之化合物或組成物與至少一種用於輸送該組成物給患者 -38- 201233685 的套組。 本發明之組成物可經由將FGF21分子與連接子共價 連接並將連接子與多價抗體之結合部位共軛結合來合成。 例如：可將FGF2 1-連接子結合物（其中該連接子包含二 酮或AZD( /3-內醯胺）反應部分）與0.5當量之醛縮酶 抗體（諸如h38C2 IgGl ) —起培育以製造本發明之組成 物。 使用方法 在人類治療用途方面，人、人化、或人嵌合抗體、或 其抗原結合部分爲本發明化合物或組成物之抗體部分的較 佳抗體形式。 本發明之一種態樣爲用於治療糖尿病或糖尿病相關病 況的方法，其包含投予罹患糖尿病或糖尿病相關病況之個 體治療上有效量之本發明的組成物。 本發明之另一態樣爲用於增加個體內胰島素分泌之方 法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥 學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於降低個體中之血糖量之·方法 ，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學 衍生物。 本發明之另一態樣爲用於治療個體肥胖之方法，其包 含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學衍生物 -39- 201233685 本發明之另一態樣爲用於控制或減輕個體之體重量的 方法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其 藥學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於治療個體之血脂異常的方法 ’其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學 衍生物。 本發明之另一態樣爲用於治療個體之高血壓的方法， 其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學衍 生物。 本發明之另一態樣爲用於治療個體之肝脂肪變性（ hepatosteaotosis)的方法，其包含投予個體治療上有效量 之本發明組成物或其藥學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於治療個體之心血管疾病的方 法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥 學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於降低個體之升糖素量的方法 *其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學 衍生物。 本發明之另一態樣爲用於降低個體之三酸甘油酯量的 方法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其 藥學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於增加個體之非酯化游離脂肪 酸量的方法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成 物或其藥學衍生物。 -40- 201233685 本發明之另一態樣爲用於降低個體中低密度膽固醇量 的方法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或 其藥學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於降低個體中C-反應蛋白量 的方法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或 其藥學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於降低個體中果糖胺量的方法 ’其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學 衍生物。 本發明之另一態樣爲用於控制個體中血糖控制的方法 ，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學 衍生物。 本發明之另一態樣係用於增加個體中脂素（adipsin) 量的方法，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物 或其藥學衍生物。 本發明之另一態樣爲用於增加個體中HDL量的方法 ，其包含投予個體治療上有效量之本發明組成物或其藥學 衍生物》 於一些態樣中，本發明提供用於治療下列疾病之方法 :糖尿病相關病況、肥胖、血脂異常、高血壓、肝脂肪變 性或心血管疾病；或控制或減輕體重量；或控制血糖控制 :或增加胰島素分泌、或非酯化游離脂肪酸、HDL或脂 素之量；或降低血糖、升糖素、三酸甘油酯、果糖胺、低 密度.膽固醇、或C-反應蛋白的量；其包含投予個體治療 -41 - 201233685 上有效量之本發明化合物或醫藥組成物。 於一些態樣中，本發明提供本發明組成物或醫藥組成 物於製備用於治療下列疾病之藥物的用途：糖尿病相關病 況、肥胖、血脂異常、高血壓、肝脂肪變性、或心血管疾 病；或控制或減輕體重量；或控制血糖控制；或增加胰島 素分泌、HDL、或非酯化游離脂肪酸之量或脂素；或降低 血糖、升糖素、三酸甘油酯、果糖胺、低密度膽固醇、或 C·反應蛋白的量。 此處所使用之“治療有效劑量” 一詞意指硏究人員、 醫生或其他臨床醫療人員尋求之可在組織系統、動物或人 體中引出生物或藥物反應（其包括減輕正在接受治療之疾 病或障礙的症狀）的本發明化合物、組成物或醫藥組成物 的量。 投服方法和劑量 本發明組成物之投服途徑可能包括腸胃道外輸送，包 括肌肉內、SC或髓內注射，以及鞘內、直接室內、靜脈 內及腹腔內輸送。於一些實施例中，投服係經由靜脈內途 徑。本發明之組成物可經由直接注射調製劑或藉由輸液基 質（諸如生理鹽水、D5W、乳酸林格氏液或其他常用之輸 液介質）輸注本發明組成物之調製劑的混合物而透過任何 腸胃道外途徑投服。 於治療患有糖尿病或與糖尿病相關之病況（於一些態 樣中爲一或多種下列病況：糖尿病、肥胖、血脂異常、高 -42- 201233685 血壓、肝脂肪變性、心血管疾病、高血糖、低胰島素量或 本文所討論之任何病況、或與本文所討論之症狀相關的病 況）之哺乳類動物（包括人類）時係投予治療上有效量之 本發明的組成物或藥學上可接受之衍生物。例如：本發明 之組成物可以約0.1毫克/公斤體重至約15毫克/公斤體重 之每日IV輸液形式投服。因此，一些實施例係提供約〇.5 毫克/公斤體重之劑量。其他實施例提供約0.75毫克/公斤 體重之劑量。其他實施例提供約1.0毫克/公斤體重之劑 量。其他實施例提供約2.5毫克/公斤體重之劑量。其他 實施例提供約5毫克/公斤體重之劑量。其他實施例提供 約10·0毫克/公斤體重之劑量。其他實施例提供約15.0毫 克/公斤體重之劑量。本發明之組成物或藥學上可接受之 衍生物的劑量應以約每天一次至每週 2次，或者約每週 一次至每月一次之間隔投服。於一些實施例中投服之劑量 爲使根據本發明的本發明組成物或其藥學上可接受之衍生 物的峰値血漿濃度達到約0.002毫克/毫升至30毫克/毫升 。此可經由無菌注射在適當之調製劑中的投服成分之溶液 來達成（可使用化學技藝中之技術熟習人士已知的任何合 適調製劑溶液）。理想之血液濃度可經由連續輸注根據本 發明的本發明組成物來維持（此可藉由經驗證之分析方法 測量血漿量來確定）。 一種用於將本發明之組成物投予個人之方法包含投予 個人FGF21-連接子結合物並允許其在活體內與適當抗體 之結合部位形成共價化合物。在活體內形成之本發明組成 -43- 201233685 物的抗體部分可在投服FGF21-連接子結合物之前、同時 或之後投予個人。或者，或另外，抗體可在以適當之免疫 原接種後存在於個人之循環中。例如，可經由以受質之反 應性中間體（其與載體蛋白共軛結合）進行免疫接種來產 生催化性抗體。尤其是，醛縮酶催化性抗體可經由投服與 二酮部分連接之鱟血藍蛋白來產生。 因此，該組成物可隨著時間的推移以單一劑量、兩個 或多個劑量（其可能或可能不包含相同量之所需分子）之 形式投服，或經由植入裝置或導管連續輸注。適當劑量之 進一步修飾爲本技藝之一般技術人士的例行工作且係在其 定期執行的任務範圍內。適當之劑量可透過使用合適之劑 量-反應數據確定。 該醫藥組成物之投服途徑與已知的方法相同，例如： 口服、透過SC、IV、腹腔內、腦內（腦實質內）、腦室 內，肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射 ;經由持續釋放系統；或經由植入設備。當需要時，可經 由一次大量注射（bolus injection)或持續輸注，或藉由 植入設備來投服該組成物。 或者，或另外，可經由植入膜、海綿或其他已吸收或 封裝所需分子之適當材料來局部投服該組成物。當使用植 入裝置時，可將該裝置植入任何合適之組織或器官，該所 需分子可經由輸液、定時釋出之一次大量投服或連續投服 來輸送。 -44- 201233685 組合療法 於本發明之另一態樣中，本發明之組成物可與其他用 於治療糖尿病或與糖尿病相關之病況、或增加胰島素分泌 、或降低血糖量、或用於治療此處所討論之任何病況的治 療劑組合。於一種實施例中，可將本發明之組成物與胰島 素（諸如，例如合成的人胰島素，包括速效、短效、中速 或長效胰島素）組合投服。於其他實施例中，可將本發明 之組成物與屬於α -葡萄糖苷酶抑制劑、磺醯脲、格列萘 (meglitinide )、雙胍類或噻唑啶二酮（TZD )族的化合 物組合投服。亦可將本發明之組成物與下列者組合投服： 代謝調節蛋白質或肽類，諸如葡萄糖激酶（GK)、葡萄 糖激酶調節蛋白（GKRP )、解耦合蛋白2及3 ( UCP2及 UCP3)、升糖素、類升糖素胜肽1及2(Glpl及Glp2) 、唾液素（exendin)(諸如唾液素-4)、抑胃肽（GIP) 、Glp2過氧化酶體增殖激活受體α ( PPAR α )、瘦素受 體（OB-Rb ) 、DPP-IV抑制劑、磺醯脲或其他腸促胰島 素肽類。本技藝之一般技術人士會知道多種目前用於治療 糖尿病或與糖尿病相關之病況的作用劑。 爲了評估本發明組成物或其藥學上可接受之衍生物與 其他用於治療下列病況之治療藥物組合時之潛在療效，可 使用本技藝已知之方法測試這些組合：糖尿病或與糖尿病 相關之病況、增加胰島素分泌、或降低血糖量。例如，可 使用活體外經葡萄糖刺激之胰島素分泌分析來測量本發明 組成物與另一治療劑之組合於增加胰島素分泌之能力。於 -45- 201233685 這類分析中係以不同濃度之葡萄糖治療胰臟β細胞一段設 定的時間並使用本技藝已知之方法（諸如放射免疫法）測 量胰島素量。亦可在活體內測量本發明組成物與其他治療 劑對胰島素分泌的影響，此係經由直接投予個體作用劑並 在不同時點測量體液樣本中之胰島素量來進行。用於投予 個體已知之治療劑以用於組合療法中的方法爲臨床醫療服 務提供者所周知。 欲投服之本發明組成物的有效劑量可透過本技藝所周 知之用於測定諸如生物半衰期、生體可用率及毒性之這類 參數的程序確定。欲與本發明組成物或其藥學上可接受之 衍生物組合使用之治療劑的有效量係根據熟習本技藝之人 士所知之建議劑量。在測試這些給藥量與本發明組成物或 其藥學上可接受之衍生物組合時之有效性後，這些建議或 已知之量較佳爲所引用之給藥量再降低10%至50%。需 注意，主治醫生將知道如何及何時將因爲毒性、骨髓、肝 或腎功能障礙、或不良的藥物-藥物交互作用而治療終止 、中斷或調整療法以降低給藥量。若臨床反應不適（排除 毒性），則主治醫生亦將知道調整治療劑至較高之量β 治療有效劑量係指足以改善症狀或延長患者生存之化 合物量。本發明組成物在活體外之有效濃度可經由測量 EC5〇測定。這類作用劑在活體內之毒性和療效可藉由在 細胞培養或實驗動物中之標準製藥程序測定，如：用於測 定LD5q(使50%族群致命之劑量）及ED5G(對50%族群 爲治療有效之劑量）。介於毒性及治療效果之間的劑量比 -46- 201233685 爲治療指數且可以ld5G/ed5()比表示。顯示出大治 之化合物爲較佳者。從這些細胞培養分析及動物硏 之數據可用於配製用於人類之劑量範圍。這類化合 藥量宜在一循環濃度之範圍內，包括具有很少或不 之ED5Q。該給藥量可根據所使用之劑型及投服途 此範圍內變化。對任何化合物而言，該治療有效劑 細胞培養分析進行初步估計。劑量可在動物模式中 取得包括IC 5Q (即，在細胞培養中測得之與未經治 照組相比較時，可達到半最大抑制受感染細胞製造 測試化合物濃度）之循環血漿濃度範圍。這類資訊 更準確地測定人體中之有用劑量。血漿中的量可， 由高效液相色層分析（HP LC )測得。 於那些其中將本發明組成物與與其他治療劑組 之實施例中，可藉由Chou和Talalay ( T. C. Chou Talalay, Adv. Enzyme Regul. 2 2:27-55 ( 1 984))之 物分析法，採用下列公式計算該作用劑之組合效果 CI = -~l + Dl +-0^1^— (Dx\ (Dx)2 (Dx)t(Dx)2 其中c/爲組合指數，（Dx) 1爲產生X百分比效果所 獨的藥物1劑量，爲與£>2組合時產生相同之X 效果所需之藥物1的劑量。（^及（1>)2之數値係 從藥物2推衍出。α値係使用中位數效果公式從劑 曲線圖測定： fu yDm) 其中/α爲被劑量D影響之分數，/w爲未受影響之 -47- 療指數 究取得 物之給 具毒性 徑而在 量可從 配製以 療之對 RT的 可用於 例如藉 合投服 and P. 多種藥 需之單 百分比 以類似 量效應 分數， 201233685 Z)w爲50%效果所需之劑量且w爲劑量效應曲線之斜率β 對於相互排斥之藥物（即，類似之作用模式）方面，兩種 單獨之藥物及其混合物在中位數效果圖中爲平行線。互相 不排斥之藥物（即，作用模式獨立）在中位數效果圖中將 爲平行線，但混合物中將產生凹面向上曲線。若該作用劑 互相排斥，則α爲0，若該作用劑互相不排斥，則α爲1 。所取得之假設互相不排斥的數値將總是略高於相互排斥 的藥物。C7値<1表示協同效應，數値> 1表示拮抗效應 ，數値等於1表示加成效應。組合之藥物效果亦可使用來 自Biosoft之CalcuSyn套裝軟體（英國劍橋）計算。 根據本發明之化合物可爲溶劑化的，尤其是水合的。 水合作用可在製造化合物或包含該化合物之組成物時發生 ，或者，水合作用可因爲該化合物之吸濕性質而隨時間發 生。本發明之化合物可爲經凍乾的。 本發明亦提供本發明化合物之立體異構物、互變異構 物、溶劑化物、前藥及其藥學上可接受之鹽。本發明亦提 供根據本文所揭露之任何序列的化合物》 -48- 201233685 序列 SEQ ID 描沿 序列 NO： 1 FGF21 型 xPIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE xl= H 存在 SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL (Η/Δ), xl46= EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPAXPEPP L/P. GILAPQPPDV GSSDPLSMVG PSQGRSPSYAS 2 FGF21AH: HI 不純 (ΔΗ1), P146. 3 FGF21 Cys 突型 l:xl= Η/Δ, X79 = D/C, xl25 = H/C, xl29 = A/C, xl46= P/L 4 FGF21 Cys突鼓型 2 xl= Η/Δ, Xl25 = C/H, xl29 - A/C, xl46 * L/P 5 FGF21 H125CM: Xl = Η/Δ, H125C, xl46 = L/P 6 FGF21AH-H125C-L146: ΔΗ1 H125C L146 7 FGF21AH-H125C： △HI H125C P146 8 FGF21 A129C 型： Xl = Η/Δ, A129C, xl46 - L/P 9 FGF21AH-A129C-L146: ΔΗ1, A129C, L146 10 FGF21AH-A129C: △HI, A129C, P146 11 FGF21 D79C 型： xl = Η/Δ, D79C, xl46 = P/L 12 FGF2UH-D79C: ΔΗ1, D79C, P146 13 FGF21AH-D79C-L146: ΔΗ1, D79c, L146 14 FGF21AH-L86C： ΔΗ1, L86C, P146 15 FGF21AH-T40C: ΔΗ1, T40C, P146 16 FGF21AH-H1C: H1C, P146 17 FGF21 Lys突链型： χ1=Η/Δ, x56, x59, xl22= K/R, R69, xl46=L/P 18 FGF21AH-K56: AH1-K56-K59R-K69R-K122R-P146 19 FGF21AH-K59: △H1-K56R-K69R-K122R-P146 20 FGF21AH-K69: AH1-K56R-K59R-KX22R-P146 21 FGF21AH-K122: AH1-K56-K59R-K69R-P146 22 FGF21AH-Knull-P2: AH1-K56R-K59R-K69R-K122R-P146 23 FGF21AH-Knull-H1K △H1-H1K-K56R-K59R-K69R-K122R-P146 24 FGF2UH-Knull-S181K: AH1-K56R-K59R-K69R-K122R- P146-S181K 25 h38C2 ELQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLL HTYGSPYLNH YLQKPGOSPK LLIYKVSNRP 隨 SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAV YFCSQ6THLP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 26 h38C2 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYWMSWVRQS PEKGLEWVSE IR1RSDNYAT mm HYAESVKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTGIYYCKT YFYSFSYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWrVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 27 VL h38C2 28 VH h38C2 29 VL m38C2 30 VH m38C2 31 (Gly4 Ser)3 32 FGF21 28 aa N·獅導序列 33 FGF21 209越序列， P174 (P146)同等型 -49- 201233685 SEQ ID NO: 1顯示出181-殘基表現蛋白質，其中 Η1爲任意的且殘基146可爲L或P。經測試之用於共軛結 合之殘基位置下方劃線且爲黑體。全部使用用於SEQ ID NO : 1之編號。 亦顯示一種人化38C2 IgGl實施例之輕及重鏈的胺基 酸序列（分別爲SEQ ID NO : 25及26 )。可變區（VC及 VH )下方劃線且互補決定區（CDR )爲黑體。離胺酸99 (其側鏈與本文所描述之連接子共價結合）鄰接HC CDR3。 【實施方式】 藉由下列實例說明本發明之多功能性，這些實例說明 本發明之典型實施例，而非以任何方式限制所主張之專利 範圍或說明書內容。 實例1鑑定FGF-21上之最佳繫鏈部位 進行硏究以鑑定經由連接子將FGF21與催化性抗體 結合部位共軛結合之最佳部位。兩種共軛結合策略在考慮 之內：透過表面離胺酸側鏈共軛結合，及透過表面半胱胺 酸側鏈共軛結合。一般而言，球蛋白在其表面上不具有未 配對之半胱胺酸殘基，因此，在蛋白質表面中納入單一半 胱胺酸可用於建造用於特定共軛結合之單—位點。然而， 具半胱胺酸之表面殘基的突變往往造成諸如分子間二聚體 化、天然二硫鍵配對錯誤及干擾受體結合之問題。由於這 -50- 201233685 些原因’蛋白質共軛結合最常透過離胺酸殘基而受到影響 FGF21受體及其活化機制之同源模擬 FGF21結合 FGFRlc及FGFR4二者，但該受體複合 物僅能透過FGFRlc激活。雖然 FGFRlb與FGFRlc具有 87%同一性（FGFRlb與FGFRlc相一致，除了 mb/c選擇 式剪接區之外），FGF21僅特異辨識FGFRlc。此處， FGF21-FGFR1C複合結構之同源模擬係使用 FGFR2-FGFRlc晶體結構作爲模板來進行。使用MOE軟體進行同 源模擬及結構分析。受體激活需要另一細胞表面受體， PKlotho。ySKlotho具有兩個與人類細胞質β-葡萄糖苷酶 非常相似（~35 %相同）之結構區。人類冷Klotho結構係 使用人類細胞質沒-葡萄糖苷酶作爲模型，且該FGF21-FGFRlc之模擬結構中的結構比對一致。此模擬之複合物 結構提供最佳離胺酸共軛結合部位及納入FGF2 1之最佳 半胱胺酸殘基（其不應干擾FGF21與FGFRlc之間及 FGF2 1與/3 Klotho之間的結合界面）的合理準則。 使用下列標準來選擇共軛結合部位：（1 )結構中之 殘基應盡可能接觸溶劑；（2 )殘基應遠離二硫鍵；（3 ) 殘基應遠離受體及/3 -Klotho結合表面。 與溶劑之接觸可根據可接觸之表面積（ASA)評估。 使用 CCP4 軟體（The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". ( 1 994) Acta Cryst. D50，76 0-76 3 )及內 -51 - 201233685 部自用程式（in-house program)從FGF21之模擬結 算ASA。簡單地說，CCP4中之程式在其日誌檔案中 每一殘基之平方埃値。爲了計算 ASA ( fASA )部 fraction of ASA)，使用內部自用程式將每一殘基的 標準化。表1顯示殘基之ASA及fASA。其側鏈中經 受到遮蔽之殘基的表面不包括在內。第1欄爲胺基酸 ，第2欄爲殘基數，第3欄爲ASA (爲平方埃），第 爲暴露部分》fASA値界定溶劑對指定多肽中之胺基 基的可接近性。接近零之fASA値指出預測該殘基無 近溶劑，暗示連接子較無法接近而與其共軛結合。使 對最低fASA値，0.3，表面積値> 1.00暗示此爲特別 之候選共軛結合部位。 根據ASA分析，K122(表面積爲164_4)及K59 面積爲117.2)被認爲是最有希望之共軛結合的候選 。爲了比較，亦在Κ69 (表面積爲91 ).及KM (表面 73)進行共軛結合》 構計 計算 分（ ASA 預測 名稱 4欄 酸殘 法接 用絕 可能 (表 部位 積爲 -52- 201233685 胺基酸 殘基數 表面積 暴露部分 胺基酸 殘基數 表面槙 暴露部分 GLY 14 105.2 1.25387 PHE 88 123 0.55083 GLN 15 158.5 0.83774 ASP 89 50.7 0.32626 VAL 16 81.5 0.50216 PRO 90 107.5 0.7424 ARG 17 91,6 0.36743 GLU 91 121.5 0.64904 ARG 19 78.6 0.31528 ARG 96 92.6 0.37144 ALA 26 93.9 0.8067 LEU 98 114 0.57576 GLN 27 126.5 0.66861 LEU 99 113.2 0.57172 GLN 28 169.4 0.89535 GLU 101 182.1 0.97276 THR 29 64.2 0.43349 ASP 102 94.6 0.60875 GLU 30 103.9 0.55502 GLY 103 56.1 0.66865 6LU 37 117.1 0.62553 GLN 108 72.6 0.38372 ASP 38 90.5 0.58237 GLU 110 132.4 0.70727 THR 40 49.8 0.33626 ALA 111 62.7 0.53866 GLY 43 38.1 0.45411 GLY 113 56.8 0.677 ALA 45 93.6 0.80412 LYS 122 164.4 0.79229 ASP 46 95 0.61133 PRO 124 67.4 0.46547 PRO 49 82.4 0.56906 HIS 125 168.4 0.84836 GLN 54 66.8 0.35307 ARG 126 131.4 0.52708 LYS 56 73 0.35181 PRO 128 91.3 0.63053 ALA 57 46.6 0.40034 ALA 129 78.8 0.67698 LEU 58 82.7 0.41768 ARG 131 225.5 0.90453 LYS 59 117,2 0.56482 GLY 132 65.8 0.78427 PRO 60 153.8 1.06215 PRO 133 84.9 0.58633 GLY 61 27.9 0.33254 ARG 135 106.2 0.42599 VAL 68 58.8 0.36229 GLY 141 30.4 0.36234 LYS 69 91 0.43855 LEU 142 69.1 0.34899 SER 71 69 0.54893 PRO 143 71.4 0.49309 ARG 77 129.4 0.51905 ALA 145 86.4 0.74227 PRO 78 98.9 0.68301 LEU 146 123.3 0.62273 ASP 79 109.8 0.70656 PRO 147 131.1 0.90539 TYR 83 84.4 0.35418 GLU 148 67.3 0.35951 LEU 86 119.4 0.60303 PRO 149 170 1.17403 HIS 87 104.8 0.52796 表1 FGF21之表面殘基的比較 -53- 201233685 實例2產生 FGF21蛋白質及突變體 從 ATCC 購買 FGF21 cDNA。使用 pcDNA3.1 ( Invitrogen® )及pET21b ( EMD )分別建構哺乳動物及細 菌表現載體。在 FGF21 突變變種方面，使用 QuikChange®定向致突變試劑套組（Stratagene®)將突變 引入表現載體中。藉由DN A定序驗證所需之突變的存在 〇 在哺乳動物表現方面，使用293轉染（fectin )試劑 (Invitrogen® )以 FGF21之哺乳動物表現載體轉染 HEK293F細胞（Invitrogen® )並使其生長在不含血清之 培養基上。將經調整之無菌過濾培養基對緩衝液 A( 20mM Tris-HCl，pH 7.5)進行透析，並裝載至以緩衝液 A預先平衡之HiTrap Q管柱（GE healthcare®)上。以從 緩衝液 A 至緩衝液 B(20mM Tris-HCl，pH 7.5 及 100mM NaCl )之線性梯度洗提FGF 21蛋白質。將匯集之分液濃 縮，並與磷酸鹽緩衝液（PBS，pH 7.4 )裝載至Sephadex 300上。將由此產生之蛋白質溶液濃縮並儲存在低於-80 °C。藉由SDS-PAGE及RP-HPLC確認純度。 爲了從大腸桿菌產製FGF21AH，將細菌表現載體轉 形入宿主株 BL21-(DE3) -RIL( Stratagene®)中。令轉 形之細胞在37°C下生長在1升LB培養基上，經由加入 ImM異丙基沒-D-硫代吡喃半乳糖苷來起始表現。4小時 後，收成細胞並將其冷凍在-20 °C中。將冷凍之細胞糊懸 浮在裂解緩衝液（50 mM Tris，10mM EDTA，pH 7.5)中 -54- 201233685 ，並通過微射流機4次。在17,000 X g，4t：下離心30分 鐘後，將含有沈澱小九之包涵體（IB )再懸浮於50 mM Tris，pH 7.5中。將經清洗之IB漿離心（30分鐘， 17,000 X g . 4°C )。將IB沈澱小九儲存在-80°C。以7 Μ 尿素、5 mM DTT及50 mM雙三羥基甲胺基丙烷（bis-tris propane) ，pH 10.5溶解冷凍之IB沈澱小九，濃度爲1 至10毫克/毫升FGF21，並攪拌 1小時以溶解並減少蛋 白質。然後，將溶解之IB在5 OmM雙三羥基甲胺基丙烷 (pH値8.0)中稀釋10倍。最終蛋白質濃度爲0.1至1 毫克/毫升。將溶液攪拌〜2天並對 4升之20mM Tris-HCl ，ρΗ7·5進行透析。將蛋白質溶液在14000 X g離心 30 分鐘。將上清液裝載至HiTrap Q HP ( GE Healthcare® ) 上，以緩衝液A平衡之（見上文）。以緩衝液A清洗未 結合之細菌蛋白，並以緩衝液B之線性梯度洗提FGF21 蛋白質。然後，將FGF21分液裝載到預先以PBS緩衝液 平衡之HiTrap螯合HP管柱（GE Healthcare® )上。以從 PBS至PBS緩衝液加100 mM咪唑（pH値調整爲7.4)之 線性梯度洗提FGF21蛋白質。收集分液並濃縮之（可高 達 50毫克/毫升），將蛋白質溶液施放在以 PBS ( Gibco®，pH7.4 )平衡之尺寸排阻管柱（Hiload 26/60， superdex 3 00 )上。藉由0.22微米過濾器將純化之蛋白質 消毒，並保存於- 80t。來自8升培養基之FGF21AH的典 型產量爲600~700毫克。典型純度爲> 95%。典型之內毒 素量爲〜1EU//毫克。以類似於FGF21AH之方式製造並純 -55- 201233685 化FGF21之半胱胺酸及離胺酸-至-精胺酸突變種。純化蛋 白質之典型產量爲350~400毫克。使用埃爾曼 （Ellman )試劑確認游離半胱胺酸。 實例3連接子1之合成方法
連接子1之合成方法：在氮氣下於約35 °C將一整分 鈀碳（例如約1.0克，約0.47毫莫耳）加入在甲醇（例 如約2〇0毫升）中之13A (例如約5克，約20.1毫莫耳 )的懸浮液中，再將氫氯酸（例如約2.5毫升，約30.2 毫莫耳）一滴滴地加入其中。將氫氣緩慢地吹入約3 5 °C 之溶液中並將該溶液在此溫度下攪拌約2小時。將固體通 過矽藻土墊過濾並收集之。將濾液在降低之壓力下濃縮並 將固體在真空中乾燥以產生爲氫氯酸鹽形式之13B。將化 合物13B與二氯甲烷（例如約200毫升）及飽和碳酸氫鈉 溶液（例如約2 5 0毫升）混合，並將二氯甲烷層分開。以 飽和氯化鈉（例如約250毫升）清洗二氯甲烷層，並將其 以硫酸鈉乾燥。過濾有機層，將其在降低之壓力下濃縮並 -56- 201233685 使用快速層析法（Si〇2，約60%之在己烷中的醋酸乙酯 )純化之以產生約68%產量（例如約2.94克）之13C。 將約〇°C之在二氯甲烷（例如約200毫升）中之13C (例 如約4.65克，約21.3毫摩耳）、13D (例如約7_00克， 約21.3毫莫耳）和N-(3-二甲基胺丙基）-N·-乙基碳二 醯亞胺氫氯酸鹽（例如約3 · 3克，約2 1 .3毫莫耳），以 及N，N-二異丙基乙胺（例如約2.75克，約21.3毫莫耳） 之溶液在氮氣下攪拌5分鐘，並在室溫下攪拌約4小時。 以稀釋之碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液清洗有機層，在 真空下濃縮之，並使用快速層析法（Si02，乙腈）純化之 以產生連接子1 (例如約8 · 2 5克，產量約7 3 % )。 實例4連接子2之合成方法
-57- 201233685
將在DMF (例如約10毫升）中之檸康酸酐，14 (例 如約2_0毫克，約16.7毫莫耳）、々-丙胺酸，17(例如 約1.5克，約16_7毫莫耳）的溶液在室溫下攪拌約5小 時。然後，將反應液冷卻至約0°C並加入包含二異丙基碳 二醯亞胺（例如約2.6毫升，約16.7毫莫耳）之11〇81'( 例如約1.9克，約16.7毫莫耳）之DMF(例如約1〇毫升 )溶液，。加入二異丙基乙胺（例如約5當量，約83.5毫 莫耳）並將該反應混合物暖至室溫，再攪拌約16小時。 將反應物倒入水中，以1 N HC1酸化，再以醋酸乙酯（例 如約3x約30毫升）萃取之。以水（例如約2χ約30毫升 )及鹽水（例如約3 0毫升）清洗有機層，然後以硫酸鈉 乾燥之。在真空下去除溶劑，並藉由管柱色層分析法純化 該粗混合物。匯集所需之分液，並在降低之壓力下濃縮之 以產生1 7 A。 在室溫下，將化合物17A (例如約0.5克，約2.09毫 莫耳）在二氯甲烷中之約15%三氟醋酸中攪拌約2小時 ，並在降低之壓力下濃縮至乾燥。將游離酸18加入在四 氫呋喃（例如約20毫升）中之N-羥基琥珀醯亞胺（例如 約0.25 g，約2.09毫莫耳），再加入二異丙基碳二醯亞 -58- 201233685 胺（例如約0.33毫升，約2.09毫莫耳），並在室溫下 拌約4小時。將二異丙基脲過濾掉。將濾液蒸發至乾燥 將石油醚（例如約30毫升）加入殘質中，硏磨、搖動 ，輕輕倒出石油醚層。再以石油醚重複一次此程序並將 物18在真空中乾燥。 將胺-聚乙二醇2-第三丁酯，19(例如約0.5克 2.09毫莫耳）加入活化之18的THF溶液中，再加入過 之DIPEA (例如約3當量）。將溶液在室溫下攪拌至少 小時，並藉由HP LC-MS純化之，收集3 43及3 99之質 。匯集包含所需產物之分液並凍乾之以收集20。將殘 溶解在二氯甲烷中之約15%三氟醋酸及數滴水中，並 室溫下攪拌約2小時。將反應物濃縮至約1毫升並以水 理之使產物沉澱。使用HPLC-MS將該粗物質純化以產 21 ( M + 343 )。 將在DMF (例如約2毫升）中之酸21 (例如約60 克，約0.18毫莫耳）、HBTU(例如約137毫克，約0. 毫莫耳）及苯胺氫氯酸鹽22 (例如約45毫克，約0.18 莫耳）、二異丙基乙胺（例如約0.14毫升，約0.90毫 耳）的溶液在室溫下攪拌約30分鐘並在HP LC-MS上純 之。匯集所需之分液並濃縮之以收集L2 (例如約1 6毫 ，約0.03毫莫耳）。 實例5連接子3之合成方法 攪 〇 後 產 量 1 里 質 在 處 生 毫 36 毫 莫 化 克 -59- 201233685
將在DMF (例如約10毫升）中之檸康酸酐，14 (例 如約0.5克，約16.4毫莫耳）、胺-聚乙二醇2-第三丁酯 23(例如約1.0克，約4.2毫莫耳）的溶液在室溫下攪拌 約2小時。加入二異丙基碳二醯亞胺（例如約0.8毫升， 約5.2毫莫耳）及HOBT(例如約0.7克，約6.1毫莫耳 )並將反應物在約8 0°C加熱約2小時。令反應物冷卻至 室溫一整夜，過濾出尿素。將濾液倒入水中並以DCM萃 取之。以鹽水清洗有機層並濃縮成油。將該粗產物溶解在 乙腈中之約50% 6N HC1中以將該酸去保護。將該產物溶 解在DMF中，過濾並使用HPLC-MS純化之以收集24 ( 例如約208毫克，約0.7毫莫耳）。 將過量之HBTU和DIEA (例如各約超過 3當量）加 入在DMF中之馬來醯亞胺，24 (例如約0.16克，約0.6 毫莫耳）及苯胺氫氯酸鹽 22 (例如約150毫克，約0.6 毫莫耳）的溶液。經由約2次注射在HPLC-MS上來純化 該粗製物質。匯集包含該最純物質之所需分液並凍乾之， 以收集L3 (例如約17.3毫克，約36.7毫莫耳）。 實例6連接子4之合成方法 -60- 201233685
F F
OH 13 〜0^V〇>!< 〇 * 3) NMIWTHF,r,t.,2 小時 4) 50% TFA/DCM. r.t, 30 分鐘
在氮氣（N2)下，將在二甲基甲醯胺（例如約5毫升 )中之檸康酸酐（14，例如約510毫克，約4.55毫莫耳 )及反式-4 -胺甲基環己烷羧酸（13，例如約716毫克， 約4.5 5毫莫耳）的溶液在室溫下攪拌約6小時。將反應 溶液冷卻至約〇°C，加入DIPEA (例如約198毫升，約 11.4毫莫耳），再加入在dmF(例如約3毫升）中之五 氟苯基三氟醋酸酯（例如約1.96毫升，約11.4毫莫耳） 。將反應混合物暖至室溫，再在氮氣下攪拌約1 6小時。 過濾出固體’將濾液倒入約30毫升水中，以二氯甲垸（ 例如約2x約30毫升）萃取之並將二氯甲烷層以硫酸鈉乾 燥。在真空下除去溶劑並藉由管柱色層分析法將粗混合物 純化以產生約5 50毫克之五氟苯基酯中間體（15，例如約 29%產量）。 將N -甲基嗎福林（例如約290微升，約2.64毫莫耳 )加入在四氫呋喃（THF，例如約5毫升）中之五氟苯基 酯中間體（15，例如約550毫克，1.32毫莫耳）及3-[2. -61 - 201233685 (2-胺基-乙氧基）-乙氧基]丙酸第三丁醋（例如約295毫 克，約1.32毫莫耳）之溶液中並在室溫下攪拌約2小時 。在真空下去除溶劑’將殘質溶解於DMF中並藉由製備 性高效液相色層分析法純化之。以在二氯甲烷（例如約4 毫升）中之約50%三氟醋酸處理取得之第三丁酯中間體 約30分鐘。在真空下去除溶劑並藉由製備性高效液相色 層分析法純化該殘質以產生約300毫克爲白色固體之酸中 間體 16 (例如約 55% 產量：MS : 41 1.2 ( M + H+))。 將在DMF (例如約1毫升）中之上述酸中間體（16 ，例如約33毫克，約0.08毫莫耳）、1-[3·(4-胺基-苯 基）-丙醯基]-氮雜環丁 -2-酮（例如約18毫克，約0.08 毫莫耳）、ΗΟΒΤ(例如約25毫克，約0.16毫莫耳）和 HBTU(例如約61毫克，約0.16毫莫耳），以及Ν-甲基 嗎福林（例如約44微升，約0.4毫莫耳）的溶液在室溫 下攪拌約2小時。藉由製備性高效液相色層分析法純化該 粗混合物以產生爲無色油質之L4(例如約22毫克，45% 產量；MS: 611.4( MH+ ))。 實例7連接子5之合成方法
在約〇°C，將二異丙基碳二醯亞胺（例如約3.11毫升 ，約19.86毫莫耳，約2.95當量）加入在乾燥四氫呋喃 (例如約500毫升）中之連接子6(例如約6.63克，約 201233685 20.69毫莫耳，約3.07當量）及N-羥基琥珀醯亞胺（例 如約2.29克，約19.86毫莫耳，約2.95當量）的溶液中 。將混合物在約0 °C下攪拌約1小時，然後在室溫下攪拌 —整夜。在真空下去除溶劑並以石油醚（例如約2x約20 0 毫升）清洗殘質，將粉末在真空下乾燥約2小時，再用於 接下去之步驟中。 實例8連接子6之合成方法
實例9連接子7之合成方法 -63- 201233685
將在二甲基甲.醯胺（例如約25毫升）中之I (例如 約438毫克，約4.47毫莫耳）和Π (例如約1.04克，約 4.47毫莫耳）之溶液在氮氣下攪拌約2.5小時。使用冰浴 將反應物冷卻至約〇°C。加入1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（例 如約647毫克，約5.62毫莫耳），及N- ( 3-二甲胺丙基 )-Ν'-乙基碳二醯亞胺氫氯酸鹽（例如約1.71克，約8.92 毫莫耳）並在約室溫攪拌一整夜。以二氯甲烷稀釋有機層 ，以清水洗淨，在降低之壓力下濃縮並使用快速層析法（ Si02，約75%之在己烷中的醋酸乙酯至約5%之在二氯甲 烷中之甲醇）純化，以產生1Π (例如約767毫克）。將在 二氯甲烷（例如約15毫升）及三氟醋酸（例如約1.16毫 升）中之瓜（例如約573毫克，約1.83毫莫耳）的溶液 在約室溫下攪拌約9.5小時。將該物質在降低之壓力下濃 縮’在真空泵上乾燥一整夜以產生IV。將粗IV溶解在二氯 甲烷（例如約1 5毫升）及二甲基甲醯胺（約2滴）中並 -64 - 201233685 與草醯氯（例如約465毫克，約3.66毫莫耳）一起攪拌 約2小時。在減壓下除去溶劑並將該油在真空下乾燥 1 小時。將該油溶解在二氯甲烷（例如約15毫升）中並將 其在氮氣下與13B(例如約464毫克，約1.83毫莫耳） 及二異丙基乙胺（例如約2.9毫升，約16.5毫莫耳）一 起攪拌約30分鐘。以飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶 液清洗有機層，在降低之壓力下濃縮並使用快速層析法（ Si02，約85%之在己烷中的醋酸乙酯至約100%之醋酸乙 酯）純化以產生連接子 7 (例如約3 2 3毫克，約39% ) 實例10連接子8之合成方法
將在二氯甲烷中之V (例如約980毫克，1.91毫莫耳 )、13C(例如約484毫克，1.91毫莫耳）、二異丙基乙 胺（例如約2毫升，約1 1 .5毫莫耳）之溶液在約室溫下 攪拌約6小時。另外加入約1當量之13C (例如約484毫 克’約1.91毫莫耳）及約3當量之二異丙基乙胺（例如 約1毫升，約5.73毫莫耳）並在約室溫下攪拌一整夜。 以飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液清洗反應混合物， -65- 201233685 乾燥（硫酸鈉）、過濾後在降低之壓力下濃縮並使用快速 層析法（約100%醋酸乙酯至約5%之在醋酸乙酯中之甲 醇至約10%之在醋酸乙酯中之甲醇）純化以產生連接子 8 (例如約285毫克，約24% )。 實例11蛋白質與連接子之共軛結合 以1:10之莫耳比將FGF21突變蛋白與相關連接子在 室溫下反應2小時。然後，使用PD-10柱及交換成20mM Tris-HCl，20 mM NaCl，pH 7.0之緩衝液將所有與連接子 連接之FGF21蛋白純化。 實例12蛋白質-連接子複合物與抗體共軛結合 以6:1之莫耳比將所有與連接子連接之FGF21蛋白與 h38C2 IgGl ( SEQ ID NO ： 25 及 26 ) ( 20mM Tris-HCl， 20 mM NaCl，pH 7.0)在室溫下融合一整夜。藉由 SEC 純化蛋白質-連接子-抗體複合物。藉由LCMS分析確認共 軛結合效率。 實例.13蛋白質產製分析 在大腸桿菌中表現所有FGF2 1蛋白。在包涵體中找 到經細菌表現之FGF2 1蛋白。將細胞裂解並移除上清液 後，將小九溶解在4°C，7 Μ尿素、50 mM雙三羥基甲基 甲胺基丙烷（Bis-Tris-propane) ，pH 10_5中。將溶解之 包涵體在50 mM雙三羥基甲基甲胺基丙烷、10 mM氧化 -66 - 201233685 之麩胱甘肽，PH9.0中稀釋並攪拌2小時，再在4°C下對 20 mM Tris-HCl，pH 7.5 透析一整夜。藉由 HiTrap Q 柱 純化可溶部分。藉由SDS-P AGE分析決定蛋白質之特點。 離胺酸突變體之表現量爲10-50毫克/升。 實例 14 Glutl Taqman 分析 藉由qPCR法使用已分化之3T3-L1脂肪細胞來測量 Glutl mRNA表現。在第10-14天以化合物處理經血清飢 餓一整夜之分化的3T3-L1脂肪細胞6小時。從這些細胞 萃取總RNA，使用Quantitect探針RT-PCR試劑套組並在 Taqman探針機（Applied Biosystems公司®)中運行定量 即時PCR反應以測量Glutl及GAPDH mRNA表現。藉由 Glutl mRNA量中之倍數變化（藉由來自各樣本之GAPDH mRNA量正常化）測量化合物之生物活性。從分析中之劑 量反應曲線取得爲化合物藥效測量値之EC5G値。 實例1S葡萄糖攝入分析 在無血清存在時以化合物處理分化之3T3-L1脂肪細 胞24小時。然後，將細胞與14C-2-脫氧葡萄糖培育1小 時並在Wallac 1450 MicroBeta(Trilux)儀器中定量攝入 細胞之葡萄糖。攝取之葡萄糖係以每分鐘計數（CPM )表 示。從分析中之劑量反應曲線取得爲化合物藥效測量値之 EC50 値。 -67- 201233685 實例16老鼠藥物動力學 經由IV或SC投服後，在小鼠中檢查FGF21抗體結 合物之PK。將抗體結合物注射入年輕的成年雄性瑞士韋 伯斯特（Swiss-Webster)小鼠（20-25克），並在給藥後 5分鐘至120小時之時點取得血液樣本。使用ELISA測定 血清中之抗體結合物濃度（該ELISA係透過結合在96孔 板上之單株抗-hFGF21抗體來捕捉抗體結合物之FGF21部 分）。透過抗- hFC單株抗體偵測結合在板上之FGF21抗 體結合物，並使用在包含血清之分析緩衝液中稀釋之PK 劑量溶液的標準曲線測定濃度。取得S C血清濃度剖面之 曲線下面積（AUC )除以IV血清濃度剖面之AUC的比例 以計算SC生物可利用率。 實例17老鼠效力 在兩種小鼠肥胖胰島素抗性模型-ob/ob小鼠及由高脂 肪飲食誘導之肥胖小鼠中評估FGF2 1抗體結合物之效力 。在這兩種模型方面，將雄性小鼠（在ob/ob方面係使用 6-8週齡，在DIO方面係使用12-14週齡，高脂肪飮食係 從6週齡開始）每2-4隻安置在一個籠內並經由皮下注射 投服FGF21抗體結合物。每天早上測量體重。藉由口服 葡萄糖耐量試驗評估葡萄糖耐量。簡單地說，在測試當天 上午讓小鼠禁食4-5小時。取得基線血液樣本並使用可攜 式血糖儀測定血糖量。在基線樣本之後，經由管餵投服葡 萄糖，之後，在15至120分鐘抽取血液樣本。在基線至 -68- 201233685 120分鐘之時點的AUC計算糖耐量。 實例 18 K56 Ab-L5-FGF21AH-K56 活性 依上述產生 FGF21AH-K56-K59R-K69R-K122R ( SEQ IDNO: 18)並純化之。在GlutlTaqman分析中發現 FGF2 1AH-K56-K59R-K69R-K122R 有效（EC50 = 0.9nM; n = 2)。攝入之葡萄糖顯示出爲 5.5nM。FGF21AH-K56-K59R-K69R-K122R與L5在K56結合並依描述與h38C2 共軛結合以形成 Ab-L5-FGF21AH-K56。在 Glutl Taqman 分析中 Ab-L5-FGF21AH-K56 保留效力（E C 5 〇 = 1 · 9 η Μ ; η = 1 )，並顯示出IV半衰期爲17小時，SC半衰期爲13小 時。生物可利用率爲66%。 實例 19 K59 Ab-L5-FGF21AH-K59 活性 依上述產生 FGF21AH-K56R-K59-K69R-K122R ( SEQ ID NO: 19)並純化之。在Glutl Taqman分析中發現 FGF21AH-K56R-K59-K69R-K122R 有效(ECs〇 = 〇.6nM ； n = 1 )。攝入之葡萄糖爲 0.9nM ° FGF21 ΔΗ-Κ56ΙΙ-Κ59-Κ69ΙΙ-K122R與L5在Κ5 9組合並與h38C2共軛結合形成Ab-L5-FGF2 1 ΔΗ-Κ59。在 Glutl Taqman 分析中 Ab-L5-FGF2 1 ΔΗ-K56保留活體外效力（EC5〇 = 6.5nM ; 2 )，並顯示出 IV半衰期爲13小時。 實例 20 K69 Ab-L5-FGF21AH-K69 活性 -69- 201233685 依上述產生 FGF2 1 AH-K56R-K59R-K69-K1 22R ( SEQ ID NO : 20 )並純化之。在 Glutl Taqman分析（ EC5〇=1.3nM; n= 1)及葡萄糖攝入分析（EC5〇 = 5.2nM)中 發現 FGF21ΔΗ-Κ56ΙΙ-Κ59ΙΙ-Κ69-Κ122R 是有效的。 FGF21AH-K56R-K59R-K69-K122R 與 L5 在 Κ69 組合並與 h38C2 共軛結合以形成 Ab-L5-FGF21AH-K69。 實例 21 K122 Ab-L5-FGF21AH-K122 活性 依上述產生 FGF21AH-K56-K59R-K69R-K122 ( SEQ ID NO: 21) 並純化之。在 Glutl Taqman 分析 （ EC5〇 = 2.6nM; n= 2)及葡萄糖攝入分析（EC5〇=1.7nM)中 發現 FGF21ΔΗ-Κ56-Κ59ΙΙ-Κ69ΙΙ-Κ122 是有效的。 FGF2 1AH-K56-K59R-K69R-K122 與 L5 在 K122 組合並與 h38C2 共軛結合以形成 Ab-L5-FGF2 1 AH-K1 22。Ab-L5-FGF21AH-K122保留活體外效力（在Glutl Taqman分析中 ，EC5〇=1.6nM ; n = 2)，並顯示出IV半衰期爲16小時， SC半衰期爲14小時。生物可利用率爲40%。 實例 22 K-null-P2 Ab-L5-FGF21AH-Knull-P2 活性 依上述產生 FGF21AH-Knull-P2 ( SEQ ID NO : 22) 並純化之。在 Glutl Taqman 分析（EC5G=1.2nM ; n= 2) 中發現 FGF2 1 ΔΗ-Κηυ11-Ρ2 是有效的。F G F 2 1 △ Η - K n u 11 - Ρ 2 與L5在Ρ2之Ν'端組合並與h38C2共軛結合以形成Ab-L5-FGF21AH-Knull-P2。Ab-L5-FGF21AH-Knull-P2 顯示出 -70- 201233685 活體外效力降低（在Glutl Taqman分析中，EC5〇=16.6nM ；n=l )，並顯示出IV半衰期爲17小時。 實例 23 Knull-HIK Ab-L5-FGF21AH-Knull-H1K 活性 依上述產生 FGF21AH-Knull-H1K(SEQ ID NO: 23) 並純化之。在 Glutl Taqman 分析（EC5〇 = 6.4nM; n= 2) 中發現 FGF2 1 ΔΗ-Knull-H 1 K 是有效的。F G F 2 1 Δ Η - Knu 11-Η1Κ與L5在Η1Κ組合並與h38C2共軛結合以形成Ab-L5-FGF21AH-Knull-H1K。FGF21AH-Knull-H1K 保留活體 外效力（在 GlutI Taqman 分析中，EC5〇 = 4.3nM; n = 2) * 並顯示出IV半衰期爲16小時，SC半衰期爲1 1小時且 S C生物可利用率爲5 1 %。 實例 24 K-eu11-S181K A b - L 5 - F G F 2 1 Δ Η - Kn u 11 - S 1 8 1 K 活 性 依上述產生 FGF21AH-Knull-S181K ( SEQ ID NO : 24 )並純化之。在 Glutl Taqman 分析（EC5〇 = 7.5nM; n= 2 )中發現 FGF21AH-Knull-S181K 是有效的。FGF21AH-Knull-S181K與L5在S181K組合並與h38C2共軛結合以 形成 Ab-L5-FGF2 1 ΔΗ-Knull-Sl 8 1 K 。 Ab-L5-FGF21AH-Knull-S181K顯示出失去活體外效力（在Glutl Taqman分 析中，EC5〇 = >500nM; n = 2 )。 實例25離胺酸突變體之活性的結果摘要 -71 - 201233685 所有離胺酸突變蛋白質在Glutl Ta<lman分析中均具 活性。在Taqman分析中’當共軛結合時’大多數結合物 (K56、K59、K122、Knull-Hl K)保留活性，其 EC5〇 値 類似於固有FGF21蛋白。在Taqman分析中，Knull-P2結 合物顯示出起始效力降低，且KnuU-S18 1K結合物顯示出 失去活性。 實例26利用半胱胺酸馬來醯亞胺共轭結合作用鑑定 FGF21上之最佳繫鏈部位 引入半胱胺酸取代突變作爲連接殘基的挑戰之一爲該 半胱胺酸殘基可能會發現自己與其他殘基接觸，和/或形 成鹽橋或氫鍵。雖然使用建模結構預測原子層級的距離可 能很難，根據位於 FGFRlc及/3 Klotho結合位點遠端的 潛力選出許多殘基：Hisl、Thr40、Asp79、Leu86、 Hisl25及Alal29。所有六個殘基在結構組成（轉彎及環 )、可接近之表面積（ASA)及四周形狀（凸和凹）方面 均彼此不同’且全部均以與FGFRlc交互作用之蛋白質的 對側爲模型（見表 2)。尤其是，由於與Hisl、Asp79、 Leu86及Hisl 25相關之高ASA値，這些部位被鑑定爲具 有潛在吸引力之共輒結合部位。 -72- 201233685 殘基 構造 形狀 %ASA ASA 冷Klotho部位 Hisl 混亂 N/A N/A Thr40 冷-股 凹 34 49.8 較不遠 Asp79 /3 -轉角 凸 71 109.8 遠 Leu86 /3 -股 凸 60 119.4 較不遠 Hisl25 混亂 凸 85 169.4 遠 Alai 29 混亂 凹 68 78.8 遠 表2 用於半胱胺酸取代之候選殘基的比較
實例 27 H1C FGF21AH-H1C 製造及表現 FGF21AH-H1C ( SEQ ID NO : 16)。然而 ，FGF21AH-H1C突變體缺乏Ν’半胱胺酸基團，因此，終 止硏究這種突變體。
實例 28 T40C FGF21A H-T40C 製造 FGF21AH-T40C ( SEQ ID NO: 15)時出現重大 挑戰。在位置40處之蘇胺酸的半胱胺酸突變在再折疊後 在RP-HPLC中造成多種FGF21AH-T40C物種。採取進一 步之嘗試，經由改變蛋白質之濃度及pH値，加入及不加 入麩胱甘肽來改良再折疊過程。藉由RP-HP LC監測再折 疊過程。加入麩胱甘肽造成T4 0C之有效再折疊；然而， 麩胱甘肽被發現連接至FGF21上（最可能透過在位置40 處之引入的半晄胺酸連接）。麩胱甘肽加合物顯示出與野 生型FGF2 1AH相同之生物活性，表示位置40不涉及由 FGF21造成之受體活化。 -73- 201233685 實例 29 D79C Ab-Ll-FGF21AH-D79C 活性 依上述產生 FGF21AH-D79C(SEQ ID NO: 12)並純 化之。在 Glutl Taqman 分析（EC5〇 = 2.1nM; n = 4)中發現 FGF21AH-D79C 是有效的。FGF21AH-D79C 與 L1 在 D79C 組合並與h38C2共軛結合以形成Ab-Ll-FGF21AH-D79C。 Ab-Ll-FGF21 ΔΗ-ϋ79(：保留活體外效力(ECs〇 = 3.7nM -在 Glutl Taqman分析中；n = 3)，並顯示出IV半衰期爲17 及19小時（n = 2 ) ，SC半衰期爲20及20小時（n = 2 )且 生物可利用率爲55%及70(n = 2)。 實例30 FGF21AH-D79C之穩定性分析 依上述在大腸桿菌中製造FGF21AH-D79C突變蛋白並 純化之。從1升培養表現FGF21AH-D79C。取得150毫克 包涵體並取得85毫克純化之蛋白，代表60%產量。爲了 測試 FGF21AH-D79C 及 FGF21AH ( SEQ ID NO: 2)之穩 定性，將剛解凍之樣本保持在4°C超過七天，並在第〇、3 及7天藉由RP-HPLC、SEC-HPLC、埃爾曼分析及SDS-PAGE檢査其完整性。結果發現 FGF21AH-D79C在中性 pH 7.4是穩定的：即使在 4 °C培育 7天後僅少量 FGF21AH-D79C顯示出被氧化及二聚體化，而超過一半之 FGF21AH-D79C在較低之pH 6.0下，在4°C培育3天後被 氧化。PBS ( ρΗ7·4 )及 20mM Tris-HCl、50 mM NaCl ( PH7.5)對FGF21AH-D79C之穩定性的影響沒有顯著差異 • 74- 201233685
爲什麼FGF21AH-D79C之游離半胱胺酸在PH 7.4下 較在pH 6.0下更加穩定並不清楚。WT FGF21之計算出的 等電點（pi)爲 5.43(e.e·，FGF2 卜 H1-P146) ; FGF21AH 之 pi 爲 5.27 ;且 FGF21AH-D79C 之 pi 爲 5.47。 FGF21AH-D79C之溶解度在pH6.0下可能降低。在數個冷 凍/解凍週期下檢查FGF21AH-D79C之穩定性。將蛋白重 複冷凍（-80°C )及解凍（4°C ) 9 次。在 RP-HPLC、SEC 及埃爾曼分析中，在週期1和週期9之間無一樣品顯示出 任何差異。總之，FGF21AH-D79C顯現出在4°C下比在-80 °C下明顯較不穩定。
實例 31 L86C FGF21AH-L86C 依上述產生 FGF21AH-L86C(SEQ ID NO: 14)並純 化之。雖然大多數疏水性殘基埋藏在蛋白質核心中，一些 殘基暴露於可能會導致蛋白質不溶之溶劑中。Leu86爲疏 水性殘基並在FGF21之模建結構中顯現出接觸溶劑。據 推測，L86C突變可能提供溶解度利益。 L86C突變導致無效之再折疊及低蛋白產量。加入麩 胱甘肽造成L8 6C有效再折疊；然而，結果發現有超過一 個之麩胱甘肽連接在FGF2 1分子上（最有可能透過引入 之C86以及天然半胱胺酸殘基連接）。該麩胱甘肽加合物 顯示出生物活性約降低10倍，因此終止硏究FGF21AH-L86C ° -75- 201233685 實例 32 H125C Ab-Ll-FGF21AH-H125C 活性 依上述產生 FGF21AH-H125C(SEQ ID NO: 7)並純 化之。在 Glutl Taqman 分析（EC5〇=1.24nM; n= 3)中發 現 FGF21AH-H125C 是有效的。FGF21AH-H125C 與 L1 組 合並在H125C與h38C2共軛結合以形成Ab-Ll-FGF21AH-H125C。當共軛結合時，Ab-Ll-FGF21AH-H125C保留活體 外效力（在 Glutl Taqman 分析中，EC5〇 = 3.2nM; n = 4) ’ 並顯示出IV半衰期爲37小時，SC半衰期爲32小時且 SC生物可利用率爲67%。 實例 33 A129C Ab-Ll-FGF21AH-A129C 活性 依上述產生 FGF21AH-A129C ( SEQ ID NO: 10)並純 化之。在 Glutl Taqman 分析（EC5〇=1.4nM; n = 6)中發現 FGF21AH-A129C 是有效的。FGF21AH-A129C 在 A129C 與 L1組合並與 h38C2共軛結合以形成 Ab-Ll-FGF21AH-A129C。Ab-Ll-FGF21AH-A129C 保留活體外效力（在 Glutl Taqman 分析中，EC5〇 = 2.7nM; n = 7)，並顯示出 IV 半衰期爲33小時，SC半衰期爲37小時且SC生物可利用 率爲 69% (在小鼠中）°Ab-Ll-FGF21AH-A129C在大鼠 中顯示出IV半衰期爲60小時，SC半衰期爲39小時且 SC生物可利用率爲52%。Ab-Ll-FGF21AH-A129C在猴子 中顯示出IV半衰期爲65小時’ SC半衰期爲48小時且 SC生物可利用率爲68%。 -76- 201233685 實例34內毒素純度之提昇 藉由大腸桿菌發酵培養來產製FGF21AH-H125C和 FGF21AH-A129C蛋白。爲了降低內毒素量，在第一個q 步驟後使用額外之Q步驟，以使內毒素量從10 EU/毫升 降至>0.1 EU/毫升。依下述修改純化方案。自1升培養基 取得約10克之IB並以40毫升之7M尿素、5mM DTT、 50mM BTP (雙三羥基甲基丙烷）pHjo.5 0〜2小時）溶 解之。藉由RP-HPLC監測FGF21蛋白減少。經由在400 毫升之50mM ΒΤΡ，pH 8·0 ( 24 ~36小時）中稀釋將溶解 之蛋白再折疊。藉由RP-HPLC監測FGF21之固有二硫鍵 的氧化反應。一旦再折疊幾乎完成，將溶液對4升之 20mM Tris-HCl，pH 7.5 透析兩次》經由在 20,000 X g 離 心60分鐘使未溶解之蛋白質沉澱出。將上清液裝塡在 Hitrap Q FF 上，並以 〇〜200mM NaCl 梯度（20CV，20mM Tris-HCl，O.OlmM TCEP，pH 7.5)洗提 FGF21 蛋白。將 收集之分液裝塡在Hitrap Ni-NTA FF上並以0〜lOOmM咪 唑梯度（10 CV，O.OlmM TCEP，PBS，pH 7.4)有效地移 除殘餘之DNA。將所需分液對4升之20mM Tris-HCl， O.OlmM TCEP，pH 7.5透析兩次並裝塡在Hitrap Q HP柱 上，以 0 〜lOOmM NaCl 梯度（20CV，20mM Tris-HCl，pH 7.5 )洗提。收集純化之蛋白質分液，以0.22mm過濾器消 毒，並保存於-80t。 自1升培養基取得之典型產量爲約350至約400毫克 。典型之純化的蛋白質產量爲約22 0至約280毫克。此種 -77- 201233685 純化技術產生純度> 95 %之蛋白質，而典型之內毒素量爲 約1EU/毫克》使用發酵器取代搖瓶以改善產量約4至約5 倍》 實例35選擇連接子 咸知，下列L1之馬來醯亞胺環可能容易被打開，產 物接著隨著時間的推移而降解（Woodnutt，G; IBC Conference “Beyond Antibodies/Protein Engineering Design”，San Diego, 2 1-23rd September 2009 )。 如計劃1所示，馬來醯亞胺連接子（諸如L1 )可與 锍基反應以形成具有馬來醯亞胺部分的毓基加合物。此將 毓基加至馬來醯亞胺的加成反應被稱爲邁克爾（Michael )反應。接著，含胺基團（諸如抗體h38C2)可依計劃 1 中所示與AZD (沒-內醯胺）反應來產生6。所產生之硫 基-琥珀醯亞胺加合物是穩定的。然而，該琥珀醯亞胺環 可隨著時間的推移緩慢地水解分裂，產生7和/或8。医| 此，具有對水解分裂作用具提高之穩定性，同時保留其發 生邁克爾反應的能力的馬來醯亞胺環是有吸引力的。 -78- 201233685
計劃1 實例36馬來醯亞胺改質 因此，檢查L1中之馬來醯亞胺環的穩定性，預料經 由修改馬來醯亞胺環可產生更穩定之連接子。爲了減緩由 水造成之馬來醯亞胺環可能的水解分裂，採取三種不同的 方法（L2-L4 )修改該環並提高穩定性。 -79- 201233685
首先，設想附著於該環之小烷基可能減緩琥珀醯亞胺 環的水解分裂。製備在琥珀醯亞胺環上具有甲基之連接子 2。爲了令環發生水解分裂，水分子加在羰基上並形成過 渡態之四面體中間體。甲基之存在將會在空間上及電子上 限制四面體中間體形成，並大幅減緩水解速率。 第二種修改係聚焦在馬來醯亞胺環之羰基附近的丙醯 胺羰基上。羰基一般會吸引水。在靠近馬來醯亞胺環處具 有羰基有助於吸引水並促進攻擊馬來醯亞胺環的羰基。經 由移除丙醯胺羰基可減緩水解性開環反應。此修改可在 L3中見到。 第三種修改係在如L4中所見到之丙醯胺基中引入環 己基亞甲基。該環己基環之大體積疏水性質會在電子及空 間上干擾四面體中間體形成，該四面體中間體係經由開環 水解分裂所必須之在環之羰基上加入水來形成。預料，這 將減緩水解分裂。 -80- 201233685 穩定性硏究 在穩定性硏究方面，從連接子L1-L4移除1 - ( 3- ( 4-胺苯基）丙醯基）-氮雜環丁 -2酮部分。製備4種測試化 合物（3 0-3 3) ’其中該馬來醯亞胺與麩胱甘肽（一種具 三個胺基酸之肽）共轭結合》 實例37化合物30之合成方法 將在二甲亞颯（5毫升）中之3-(2-(2-(3-(2,5-二合氧基-2,5 -二氫-1H -吡咯-1-基）丙醯胺基）-乙氧基） 乙氧基）丙酸（164毫克，0.5毫莫耳）及還原之麩胱甘 肽丨1〗々毫克’爲0.5毫莫耳）的溶液在室溫下攪拌17小 時。將醋酸乙酯（25毫升）加入反應混合物中並濾出固 體。以額外之25毫升醋酸乙酯清洗固體，乾燥之，以產 生252毫克之化合物30。
實例38化合物31之合成方法 -81 - 201233685 將在二甲亞碾（1_2毫升）中之3-(2-(2-(3-(3-甲基-2,5-二合氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基）丙醯胺基）-乙氧基）乙氧基）丙酸（37毫克，0.12毫莫耳）及還原 之麩胱甘肽（42毫克，0.12毫莫耳）的溶液在室溫下攪 拌22小時。將在乙醚中之50%醋酸乙酯（10毫升）加入 反應混合物中並濾出固體。以額外之25毫升醋酸乙酯清 洗固體，乾燥之，以產生67毫克之化合物31。
實例39化合物32之合成方法 將在二甲亞颯（2毫升）中之3-(2-(2-(3-甲基-2,5-二合氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基）乙氧基）乙氧基） 丙酸（50毫克，0.2毫莫耳）及還原之麩胱甘肽（61毫克 ，0.2毫莫耳）的溶液在室溫下攪拌25小時。將在乙醚中 之65%醋酸乙酯（30毫升）加入反應混合物中並濾出固 體。以額外之25毫升醋酸乙酯清洗固體，乾燥之，以產 -82- 201233685
實例40化合物33之合成方法 將在二甲基亞碾（1.2毫升）中之3-(2-^ / f 、2 - ( 4-（ (3-甲基-2,5-二合氧基-2,5-二氫-111-吡咯-1_基、 )中基） 環己烷羧醯胺基）乙氧基）乙氧基）丙酸（50黎古 Λ 1 考克，0.1 2 毫莫耳）及還原之麩胱甘肽（37毫克，0.12毫# & 笔莫耳）的 溶液在室溫下攪拌22小時。將在乙醚中之5〇%醋酸乙醋 (1 〇毫升）加入反應混合物中並濾出固體。以額外之25 毫升醋酸乙酯清洗固體，乾燥之，以產生75毫克之化合 物33。 -83- 201233685
實例41化合物30-33之穩定性硏究
L4 —► 33
在LC-MS上監測化合物30、31、32及33形成開環 產物以及麩胱甘肽裂解。檢查這些新類似物在40 t，pH -84- 201233685 =6.5 緩衝液、40 °C ’ pH = 7.5 緩衝液及 4 °C，pH = 7.5 緩 衝液中於兩週之期間內之穩定性（表3 A -C )。 將化合物30、31、32及33溶解在室溫之緩衝液中。 將樣本在40 °C下培育並在設定之期間分析緩衝溶液。在 界定之期間，將1〇微升之緩衝溶液注入用於分析之安捷 倫 （Agilent)高效液相色層分析和質譜儀。使用UV光 譜儀在210和254 nm處監測來自分析柱之洗提液，亦使 用質譜儀監測。使用質譜儀監測水解副產物並根據特定質 量之總離子流計算水解百分比。 從表3A-3C中之顯示％水解的LC-MS數據明確得知 :與L 1 ( 3 0 )中之馬來醯亞胺環相比較，經改質之L2、 L3和L4 ( 3 1 - 33 )的馬來醯亞胺環在40°C，pH = 6.5下 之穩定性高出5-10倍，在40°C，pH = 7.5緩衝液中之穩 定性高出4-15倍，而在40°C，pH = 7.5緩衝液中之穩定 性則高達20倍。麩胱甘肽共軛結合之結果（包括表3A、 3B及3C中之數據）的討論見於IBC Conference “Beyond Antibodies/Protein Engineering Design”，San Diego，21-23rd September 2009 φ 0 化合 物# 0 小時 % 1 小時 % 5 小時 % 24 小時 % 48 小時 % 72 小時 % 96 小時 % 120 小時 % 168 小時 % 192 小時 % Ll 30 0.0 0.4 0,6 4.9 11.6 14.8 18.3 17.0 25.0 25.9 L2 31 0.1 0.1 0.3 0.8 1.8 2.6 3.0 3.1 5.0 5.1 L3 32 0.0 0.1 0.3 0.9 1.7 2.4 2.8 4.2 4.6 4.9 L4 33 0.1 0.1 0.1 0.3 0.4 0.6 0.6 0.3 1.1 1.1 表3A 在40°C，pH値=6.5之穩定性硏究（lOmM His、130 mM Gly、130mM Sue緩衝液）* -85- 201233685 化合 0 1 5 24 48 72 96 120 144 168 264 336 物# 小時 小時 小時 小時 獨 小時 獨 小時 小時 /J俯 小時 小時 % % % % % % % % % % % % L1 30 0.1 0.3 2.0 10. 15. 29. 0 0 0 L2 31 0.1 0.2 0.6 3.2 4.6 7.1 8.2 9.4 12. 12. 13. 15. 6 2 1 0 L3 32 0.1 0.1 0.1 1.0 1.1 2.2 2.8 3.3 3.3 3.9 4.4 5.0 L4 33 0.1 0.2 0.3 0.6 1.8 2.8 3.0 4.3 4.1 4.7 6.5 8.8 表3B 在· pH値=7.5之穩定性硏究（i〇〇mM His，200 mM Gly、200mM Sue )。 化合 物# 0 小時 % 1 小時 % 5 小時 % 24 小時 % 48 小時 % 72 小時 % 96 小時 % 120 小時 % 144 小時 % 168 小時 % 264 小時 % 336 小時 % L1 30 0.1 0.1 0.1 0.7 2.0 2.2 4.4 5.5 6.9 7.5 8.7 12. 2 L2 31 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.4 0.3 0.6 0.7 L3 32 0.1 0.1 0.0 0.2 0.3 0.3 0.4 0.6 0.6 0.7 1.1 1.3 L4 33 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.3 0.3 0.2 0.5 0.6 表3C 在4TC，pH値=7.5之穩定性硏究（l〇〇mM His * 200 mM Gly，200mM Sue ). 實例42與FGF21共軛結合之連接子L1-L4的穩定性 進行下列實驗以調查該四種連接子在與FGF21共軛 結合後於2週之內的化學穩定性：將各連接子與FGF21 共軛結合，放置在+41儲存條件下，移出部分並在特定時 點藉由冷凍淬火，並藉由LCMS分析監測連接子之穩定性 〇 將該來自凍乾之貯存物質之四種連接子溶解在DMSO 。在以1:1之連接子：蛋白質比例加入連接子貯存物質前 先以O.lmM TCEP將FGF21AH-A129C蛋白部分還原30 分鐘；在共軛反應物中之FGF21AH-A129C蛋白的濃度爲 5毫克/毫升.令 L1與蛋白質反應30分鐘；令L2、L3 和L4反應2小時。透過尺寸排阻樹脂去除過量之連接子 -86- 201233685 以將共範結合反應淬火。將共範結合之FGF21AH-A129C 蛋白放置在+4°C以穩定儲存。在t = 0(穩定儲存之前） 及t =第1、3、8和14天移出部分。藉由LC-MS分析進 行連接子穩定性之分析以測定該未共軛結合之蛋白質、蛋 白質+連接子結合物及該共軛結合之蛋白質+連接子經過一 次及兩次水解時的相對量。 連接子水解爲此實驗分析之關鍵變量》經由觀察接下 去在FGF2 1-連接子複合物中加入水來監測水解。加入一 個H20，+ ( 1 ) H20，似乎表示存在於所有4種連接子上 之活性AZD基團的水解作用。加入第二個H20分子，+ ( 2 ) H20，爲連接子中之水解作用（如化學不穩定性）之 強烈指示。由於存有馬來醯亞胺官能基，L 1特別容易受 影響。 下列表4中之實驗結果證明L1之+ ( 2 ) H20增幅最 大。在t = 0時，L1-L4各自之+ (2) H2〇測量値係介於 6 - 8 %之總測量蛋白質。在2週之間監測這些樣本’在L1 中觀察到之+( 2 ) H20增加至18%’而其餘之各連接子 L2-L4的數値係固定在6-8%。此數據暗示與L2-L4相比 較，L1相對不穩定。 -87- 201233685 連奸 時間 (小時） 0 連軒 1 連接子 +(1) H2〇 + (2> H2〇 L1 0 13 49 30 8 L1 24 14 41 34 11 L1 72 14 40 35 11 L1 168 10 33 40 18 L1 336 12 28 41 18 L2 0 22 45 27 6 L2 24 23 43 26 8 L2 72 24 37 32 8 L2 168 24 40 29 7 L2 336 26 38 28 8 L3 0 19 45 30 6 L3 24 18 47 27 8 L3 72 19 43 30 8 L3 168 19 43 29 8 L3 336 20 43 29 8 L4 0 20 46 28 6 L4 24 20 46 27 7 L4 72 21 42 30 7 L4 168 21 41 32 6 L4 336 22 41 31 6 表4與FGF21共輾結合之L1_L4的水解分析
實例43 與L1-L4共軛結合之Ab-FGF21AH-A129C L2-L4先前顯示出在各種條件下與麩胱甘肽（見表 3A-C)及FGF2 1 (見表4)共軛結合時較L1穩定。將改 質之馬來醯亞胺連接子L2-L4與FGF21AH-A129C融合（ 共輕結合效率顯不於表5中），並在Glutl Taqman分析 中顯示出活性（表5):將EC5()値對FGF21AH之相對數 値正常化。 -88 - 201233685 連接子 [化合物] FGF21-連接子 共軛結合 FGF21-連接子-Ab 共軛結合 相對於FGF21AH之Glutl TaqmanfS^ ECs〇(nM) L1 30 95% 95% 1.68 L2 31 67% 95% 1.00 L3 32 87% 89% 0.35 L4 33 90% 94% 2.71 表5 L1-L4之共軛結合效率 然而，不管上述內容，Ab-L2-FGF21AH-A129C、Ab-L3-FGF2 1AH-A129C ' Ab - L 4 - F G F 2 1 Δ Η - A1 2 9 C 在活體內各 自較Ab-Ll-FGF21AH-A129C不穩定。此可從IV給藥後循 環中之維持量較低，S C給藥後循環中之峰値和維持量較 低顯明得知（第2A-C圖，表6)。令人驚訝的是，這些 結果與那些以緩衝系統中與小肽融合之連接子進行之穩定 性硏究的結果背道而馳。 化合物 Τ1/2 (小時） AUC (小時*微克升） SC生物可利用度（％) IV SC IV SC Ab-Ll-FGF21AH-A129C 33 33 491 511 ~100 Ab-L2-FGF21AH-A129C 37 23 314 165 53 Ab-L3-FGF21AH-A129C 32 13 254 129 51 Ab-L4-F6F21AH-A129C 22 14 219 106 48 表6在IV及SC投服3毫克/公斤後小鼠與Ll，L2，L4及L4共ί 扼結合之FGF21的ΡΚ參數 在小鼠血清中之另一硏究中證明這些結果。使用各個 LI、L2、L3 和 L4 將 FGF21AH-A129C 與 h38C2 共軛結合 。在冷凍前，將各個樣本在小鼠血清中稀釋成0.3毫克/ 毫升並在37t下培育，接著再藉由2DLC/MS進行分析。 與參考標準相比較，5分鐘後偵測到149 %之 Ab-Ll-FGF21AH-A129C，34 小時後爲 66%，72 小時後爲 81%， 且在1 20小時後偵測不到。相反地，在所有樣本中均偵測 -89- 201233685 不到 Ab-L2-FGF2 1 AH-A129C ' Ab - L 3 - F G F 2 1 A Η - A12 9 C、 Ab-L4-FGF21AH-A129C。
實例44在大鼠中硏究與LI & L2共軛結合之 Ab-FGF21AH-A129C 在雄性Spraque Dawley大鼠中測定兩種不同變化形 式之Ab-FGF21AH-A129C (其差異在於該將FGF21蛋白與 抗體支架共軛結合之連接子）的單劑量藥物動力學（PK )。經由 IV 或 SC 給予大鼠 Ab-Ll-FGF21AH-A129C (馬 來醯亞胺連接子）或 Ab-L2-FGF21AH-A129C (甲基馬來 醯亞胺連接子）之劑量（3毫克/公斤），並在給藥後之5 分鐘至14天的期間抽取血液樣本。經由ELISA法測定血 清 Ab-FGF21AH-A129C量，其中係經由特異於FGF21之 單株抗體捕捉該FGF21結合物並藉由抗人Fc偵測。所得 之PK數據證明與Ab-L2-FGF21AH-A129C結合物（T丨/2 : IV = 52小時，SC=33小時；SC 生物可利用率=36%)相 比較，該Ab-Ll-FGF2 1AH-A129C結合物具有較優越之PK 特性（T, /2 : IV = 6 0小時，S C = 3 8小時；S C生物可利 用率=52%)(第3A圖及表7)。這些結果並不被預期 可用於提供在緩衝系統中以這些與小肽融合之連接子進行 之穩定性硏究的結果。 -90- 201233685 化雜 Tl/2 (小時） AUC (小時*微贼升） sc生物可利用度（％) IV SC IV SC Ab-Ll-FGF21AH-A129C 60 38 1382 717 52 Ab-L2-FGF21AH-A129C 52 33 419 152 36 表7在IV及SC投予3¾克/公斤劑量後具有L1和L2之FGF21結合物的大鼠PK參數（第3A面） 實例 4S 具有 L1 及 L2 之 Ab-FGF21AH-A129C 對 Glutl RNA的影響 在第8天將3T3-L1脂肪細胞接種在24孔組織培養板 (Falcon®，目錄 # 3 53 047 )中，並在 37°C，5%C02 下’ 培養在DMEM完全培養基（l〇%FBS，2mM L-麩醯胺’ 1 %P/S)中。以含有〇.2%BSA，不含血清之DMEM培養基 饑餓這些細胞（第12天）一整夜並以在含有0.2%BSA’ 但不含血清之 DMEM培養基中的 Ab-Ll-FGF21AH-A129C 及Ab-L2-FGF21AH-Al29C在37°C處理6小時。吸出培養 基，然後根據製造商的說明，使用RNeasy迷你試劑套組 從細胞萃取RNA。使用 Spectramax®Plus分光光度計在 A260nm 測量 RNA。 化合物 GlutlRNA 表現 EC5〇(nM} FGF21AH 3.39 FGF21AH-A129C 16.03 Ab-Ll-FGF21AH-A129C 1.72 Ab-L2-FGF21AH-A129C 9.33
表8 T^qman定量性即時PCR 以 FGF2 1 ΔΗ、FGF21AH-A129C、Ab - L 1 - F G F 2 1 Δ Η -A129C 及 Ab-L2-FGF21AH-A129C 刺激 3T3-L1 脂肪細胞而 產生劑量依賴性G/wi/誘導。Ab-Ll-FGF21AH-A129C顯示 -91 - 201233685 出較 Ab-L2-FGF21AH-A129C 有效（表 8)。 實例46連接子長度之硏究 將 Ab-Ll-FGF2 1 AH-D79C ' Ab-L7-FGF2 1 ΔΗ-D79C 及 Ab-L8-FGF21AH-D79C針對彼此進行測試以評估連接子長 度之容限。在以細胞爲基礎之實驗中全部均顯示出類似之 PK (第3B圖及表9)和可相比擬之效力（數據未顯示） 化合物 IVTl/2 (小時） IVAUC (小時*微克/毫升） Ab-Ll-FGF21AH-D79C 19 176 Ab-L7-FGF21AH-D79C 27 183 Ab-L8-FGF21AH-D79C 15 248 表9.經由IV投服3毫克/公斤後具Ll、L7及L8連接子之FGF21結合物的老鼠PK參數 (第3B圖） 實例47殘基位置及連接子選擇之摘要 採用锍基-馬來醯亞胺共軛結合策略測試可能之共軛 結合部位的 H1C、T40C、D79C、L86C、H125C 及 A129C 。其中，H1C、T40C及L86C顯示出具有表現及再折疊之 問題。由於 D7 9C、H125C及A12 9C均顯示出可接受之蛋 白質產製量，對其進行進一步探索並證明未經共軛結合之 突變蛋白仍有效力。Ab-FGF21AH-D79C、Ab-FGF21AH-H125C 及 Ab-FGF21AH-A129C 顯示出與 FGF21AH 類似之 生物活性，暗示在這些位置結合抗體不會干擾受體結合》 D79C、H125C及A129C具有與FGF21AH類似之穩定性及 生物活性。 -92- 201233685 所有測試之離胺酸突變抗體結合物均顯示出較Η 1 2 5 C 及A129C抗體結合物差之老鼠PK，其IV半衰期爲13-17 小時（表1 〇 )。 發酵之蛋 白質産贷 mWfr) 賴糖 攝入 ECs〇 (nM) Glutl Taqman 雜合之 蛋白質 EC5〇(nM) Glutl Taqman 結合物 ECso(nM) IVT1/2 (小時） SCT1/2 (賴） %SC BioAv GTT* (對照組之 %AUC) FGF21AH** 12(12) 2.3 p) N/A 0.4 0.5 96 67 K56 10-50 5.5 0-9(2) 1.9(1) 17 13 66 100 K59 10-50 0.9 0.6(1) 6.5 p) 13 ND N/A 100 K69 10-50 5.2 1-3(1) ND ND ND ND ND K122 10-50 1.7 2.6 W 1.6⑵ 16 14 40 100 Knull-P2 10-50 ND 1.2(2) 16.6(1) 17 ND N/A 100 Knull-HIK 10-50 ND 6.4(2) 4.3 (2) 16 11 51 99 Knull-S181K 10-50 ND 7.5(2) >500 (2) ND ND ND ND D79C 9.9 2-1(4) 3.7 (3) 17,19 20,17 55,70 54 L86C 62 ND ND ND ND NO ND H125C 0.65 1.2(3) 3.2⑷ 37 32 67 48,66 A129C 5.7 1.4(6) 2.7 28,33 37,33 69,100 64, 67, 72 表10 FGF21上之共軛結合部位的摘要· *給予單一3毫克/公斤之SC劑量後3天（除了D79C爲10毫克/公斤· FGF21dH爲1毫克/ 公斤Qd以外）·**蛋白質：ND:未測定 雖然 AU129並未高度暴露於溶劑中，且較D79或 H125爲少，令人驚訝地，FGF21AH-A129C爲最穩定的突 變體之一且爲測試之用於抗體結合的最佳位置。這令人意 想不到，因爲該突變爲非保留性。雖然不欲受限於學理， 在A12 9C共軛結合之獨特的適用性有幾個可能的原因。首 先，AU129及Hisl25均位於FGF21模建結構中有彈性之 環區中。這些區通常爲其他肝素結合 FGF成員之肝素結 合部位。由於FGF19、FGF21及FGF23不會與肝素相互 作用，維持此區之序列保真度可能不是其生物學功能之關 鍵。該位置之彈性可能有益於抗體-共軛結合，以避免干 擾受體結合。第二；Alal29被帶正電之駐在者，即 93 - 201233685
Hisl25、 Argl26及Argl31、及Argl35包圍。由於強電荷 之排斥力，此正電區可能避免FGF21AHA-129C之 SS-二 聚體化。第三；這些帶電的駐在者可能有利於穩定馬來醯 亞胺連接子L1，當其不存在時可能會在馬來醯亞胺開環 後產生羧酸化物。因此，當採用馬來醯亞胺鍵聯策略來共 軛結合FGF21時，在A129之特定殘基位置連接顯示出特 別有利6 在小鼠模型中，Ab-Ll-FGF21AH-A129C 及 Ab-Ll-FGF21AH-H125C均顯示出至少30小時之高IV半衰期及 SC半衰期以及良好之生物可利用率。此兩種結合物在 Glutl Taqman分析中證明效力低於4nM。一般而言，與 Ab-Ll -FGF2 1 AH-H125C 相比較，Ab-Ll -FGF2 1 AH-A129C 顯示出半衰期及效力略爲提昇。在 Ab-Ll-FGF21AH-A129C中使用L1亦顯示超越較活體外試驗中建議者之令 人驚訝的活體內優勢，且與那些測試者相比較，其似乎爲 整體最有利的連接子。 與數種替代者相比較，Ab-Ll-FGF21AH-A129C組分 (抗體、連接子、連接殘基位置、連接殘基、蛋白質）之 特定組合似乎提供最佳之半衰期、生物可利用率、效力、 活性、容易產製且對水解具抗性。 實例48化合物之效力 測試以化合物 Ab-FGF21 ΔΗ-Κ56 及 Ab-FGF21AH-Knull-HIK治療之 〇b/ob小鼠的葡萄糖耐量。與 Ab- -94- 201233685 FGF2 1 ΔΗ-Η 1 25 C (第 4A 及 4B 圖）及 Ab-FGF2 1 ΔΗ-A129C (第5A及5B圖）相比較，兩種化合物較差。相反 地，Ab-FGF21AH-D79C 及 Ab-FGF21AH-H125C 顯示出改 善葡萄糖耐量並減少體重增加（第4A、4B、6A、6B、6C 、6D圖及表1 1 )。 治療 平均葡荀糖AUC (%載劑對照組） 賊劑 100 FGF21AH1·公斤 QD 61 Ab-FGF21AH-D79C,第0&3天 53 Ab-FGF21AH-D79C,第3天 53 Ab-FGF21AH-D79C,第5天 87 Ab-FGF21AH-D79C,第6天 67 Ϊ3瘦對照組(載劑） 41 较11在第6天，於ob/ob小鼠中進行OGTT期間經由SC注射10毫克/公斤之Ab-FGF21AH-D79C 後•於指出之時間的葡萄糖AUC (見第6C及6D圖） 由ob/ob小鼠中之白色脂肪組織（WAT )中的Ucpl 表現增加及逆轉脂肪肝證明由於能源消耗增加，Ab-FGF21AH-A129C被發現可改善葡萄糖耐量並減少體重增 加（第6E、6F、6G、6H圖及表12)。在（/c/7/表現方面 ，將從活體內效力硏究中收集之冷凍內臟WAT樣本均化 β從組織勻漿中萃取總RNA，使用Quantitect探針 RT-PCR 試劑套組並在 Taqman 機器（Applied Biosystems)中 運行定量性即時PCR反應來測量Glutl和GAPDH mRNA 表現。藉由Glutl mRNA量（藉由來自各樣本之GAPDH mRNA量正常化）的倍數變化決定治療效果。由WAT中 之C/cp/表現增加暗示由於能源消耗增加’ Ab-FGF21AH-A129C造成體重減輕、降低DIO小鼠中之血清三酸甘油酯 -95- 201233685 及脂肪酸量並減少肝臟重量（第7A、7B、7C、7D、7E圖 及表13 )。在ob/ob小鼠中亦觀察到肝臟重量減輕（第 7F圖及表Μ )。在〇b/ob小鼠中之進一步試驗證明在硬 脂醯-輔酶A去飽和酶- l(SCDl)、單醯基甘油〇-醯基轉 移酶（M0GAT2)及叉頭盒（forkhead box ) A2 ( FoxA2 )中之RNA量降低（第7G、7H、71圖及表15)。 治療 在0GTH!間 zmmAvc 3¾¾/公斤 在WAT中之 UCP1 mRNA 表現 10娜公斤 在肝臟中之三酸 甘油酯含 10 /公斤 從第-1天開始 之歴重變化 10職公斤 載劑 100 1.0 35.7 6.2 FGF21AH 1毫克/公斤QD 67 2.6 37.0 4.7 Ab-FGF21AH-A129C,第〇天 80 2.4 22.2 4.2 Ab-FGF21AH-A129C,第1天 68 2.6 22.1 3.8 Ab-FGF21AH-A129C,第2天 68 2.1 22.2 3.8 Ab-FGF21AH-A129C,第3天 57 2.5 27.7 4.0 精瘦對照組(載劑） 57 0.2 9.3 1.1 表12第6天在ob/ob小鼠中單次SCii射Ab-FGF21 ΔΗ·Α129<：後之結果：見第6E，6F、6G、6H圖· 治療 在 0GTT 期間之 葡萄糖 AUC 從第-1天開始 之體重變化 在WAT中之 UCPlmRNA 表現 血淸脂質之平均値 TG (¾¾/分奄升〉 NEFA (mM) 100 -0.2 1.00 133 0.61 FGF21AH 1 奄 公斤 QD 75 -1.6 1.38 92 0.40 Ab-FGF21AH-A129C, d 0&7 83 -2.4 4.02 69 0.36 食物餵食對麵(載瑚 78 +1.2 0.42 104 0.52 治療 肝臓重量(克） 載劑 2.3 FGF21AH 1奄克/公斤QD 1.8 Ab-FGF21AH-A129C,第 0天 1.4 Ab-FGF21AH-A129C,第 1天 1.4 Ab-FGF21AH-A129C,第2天 1.4 Ab-FGF21AH.A129C,第3 天 1.5 精瘦對照組(載剤） 0.8 5814 -96 - 201233685 治療 SCD1 M0GAT2 FoxA2 載劑 1.01 1.05 1.00 FGF21AH 1毫克/公斤QD 0.95 0.37 1.23 Ab-FGF21AH-A129C,第 0天 0.83 0.38 1.14 Ab-FGF21AH-A129C,第3天 0.61 0.31 1.81 表15在ob/ob小鼠中於指定時間單次SC注射10毫克/公斤之Ab^FGF21AH-A129C後第6天從收集之肝臟組織樣本進行之 dPCRm得之mRNA表現的平均倍數變化（第7G，7H、71圖）· 實例49在ob/ob模型中之Ab-Ll-FGF21AH-A129C的血 漿藥物量 在投予10毫克/公斤及3毫克/公斤之劑量後的第3、 4、5及 6天檢査 ob/ob小鼠中之劑量相關的 Ab-Ll-FGF2 1 AH-A129C 血清量》觀察到之 Ab · L 1 - F G F 2 1 △ Η-A129C血清量維持良好（第7J及7Κ圖）。這些結果與健 康動物中之藥物動力學一致。 實例50 Ab-ILl-FGF21AH-A129C在活體內對胰島素敏感性 之影響
在有知覺、未受約束之ob/ob小鼠中進行硏究，以測 定在高胰島素正常血糖鉗夾技術（hyperinsulinemic euglycemic clamp)期間 Ab-Ll-FGF21AH-A129C 在活體內 對全身胰島素敏感性（以葡萄糖輸注速率來衡量）及肝葡 萄糖產製的影響。以每週兩次之頻率經由SC投服10毫 克/公斤劑量之 Ab-Ll-FGF21AH-A129C (在30mM醋酸鹽 緩衝液中，pH 4.8 )共一週。每次注射之給藥量爲2毫升 /公斤。在硏究之第2及5天注射Ab-Ll-FGF21AH-A129C -97- 201233685 。在硏究之第2及5天以每週兩次之頻率投服載劑（在 30mM醋酸鹽緩衝液中’ PH 4.8)，每次注射之給藥量爲 2毫升/公斤。在手術前不久以2毫克/公斤SC之酮洛酚（ ket pro fen)及1〇〇毫克/公斤SC之氨苄青黴素治療小鼠。 根據動物第1天之空腹血糖及體重將其隨機分配（n= 8/ 組）。 在硏究第1、4、7及8天記錄體重。令人意外地， Ab-Ll_FGF21AH-A129C在這項硏究中並未表現出對體重 的影響（數據未顯示）。在第1天（4-小時空腹）及第8 天（16-小時空腹）以Accu-Chek手持式血糖儀（羅氏） 測定空腹血糖。Ab-Ll-FGF21AH-A129C在這項硏究中對 空腹血糖之量沒有影響（數據未顯示）。 在硏究第7天，令小鼠在第8天之鉗夾程序前禁食 16小時。在第8天將導管外置並爲動物連接輸液管。在 鉗夾程序開始前90分鐘（-90分鐘），將6/iCi之[3-3H] 葡萄糖大九藥注射入頸靜脈，再以0.1// Ci/分鐘之固定輸 液速度輸液，直到鉗夾程序結束。在-10分鐘和0分鐘採 血以測定基礎HCG。在時間 0分鐘時開始變量輸注葡萄 糖（50%葡萄糖）及固定輸注胰島素20mU/公斤/分鐘。 每10分鐘從尾靜脈測量血糖並根據每隻動物之血糖量調 整葡萄糖輸注速率直到達到穩定的狀態。在1 70分鐘及 180分鐘之時點，收集血液以在鉗夾條件下測定肝葡萄糖 產量（HGP)。在鉗夾程序期間，動物未被約束且有知覺 -98- 201233685 採用下列公式計算肝葡萄糖產量（HGP): HPG = Ra-冷葡糖輸注速率，其中，
Ra= _葡萄糖輪注速率(dpm/分鐘)_=毫5£/公斤/分鐘 血液比活(dpm/^3g)x重量(公斤） 出現速率（Ra)(其如同穩定狀態=消失速率（Rd)) 與以載劑治療之動物相比較，Ab-Ll-FGF21AH-A129C 不影響ob/ob小鼠之體重或空腹血糖。所有動物均成功鉗 夾，並在鉗夾之最後30分鐘達到100-110毫克/分公升之 正常血糖量以及固定的葡萄糖輸注速率。在以載劑及Ab-L1-FGF21AH-A129C治療之組別中均達到正常血糖（1〇〇 毫克/分公升-110毫克/分公升血糖）。在整個高胰島素正 糖鉗夾技術期間均測量血糖量（第8A圖）。在實驗最後 30分鐘（鉗夾期間），以載劑及Ab-Ll-FGF21AH-A129C 治療之動物之間並無統計上之差異。與載劑相比較，Ab-L1-FGF21AH-A129C顯著增加葡萄糖輸注速率（GIR)( 第8B圖）。Ab-Ll-FGF21 AH-A129C未改變基礎肝葡萄糖 產量（HGP )，但在鉗夾條件下（高胰島素）顯著抑制 HGP (第 8C 圖）。 總之，在這項硏究中，與以載劑治療之動物相比較， Ab-Ll-FGF21AH-A129C顯著增加葡萄糖輸注速率（其爲 全身胰島素敏感性之測量値）並抑制肝葡萄糖產量，但不 會對體重或空腹血糖量有影響。 實例SI Ab-Ll-FGF21AH-A129C在食蟹獼猴中之作用 -99- 201233685 這項硏究之目的係評估當經由每週兩次皮下注射投予 肥胖胰島素抗性（糖尿病前期）食蟹獼猴Ab-Ll-FGF21AH-A129C時，其對血漿血糖及血脂指標，以及葡 萄糖耐量和炎症生物標記之影響。這項硏究亦經過設計以 確定與每天投予 FGF21AH 劑量相比較時，Ab-Ll-FGF21AH-A129C在猴子中之藥效動力學（PD)效果的持 續時間。 本硏究中包含 22隻成年食蟹獼猴（Mflcaca )。根據性別、體重及在給藥開始前2週採集 之基線血漿樣本中所測得之基礎血糖和血脂指數將猴子（ 13隻雄性，1 1隻雌性）分爲四組治療組，每組6隻。將 動物保持在高脂肪的飮食。先投予動物藥物4週，再接著 4週之洗出期。依下述投予動物劑量：每週兩次經由皮下 投予在 25mM Tris，125mMNaCl 於 pH 爲 7.0 中之八1)-[1-FGF2 1AH-A12 9C，劑量分別爲1.5毫克/公斤（A組；4隻 雄性（m) ，1隻雌性（f))及0.15毫克/公斤（B組： 3m，3f)，每週兩次經由皮下投服載劑（25mM Tris及 125mM NaCl 最終 pH 爲 7.0) (C 組；3m，3f)及每日 —次（QD ) 0.3 毫克 /公斤之 FGF21AH ( D 組；3m，2f) ο 在給藥和沖洗期間每週採集血液樣本，但在沖洗之第 3週未收集樣本。經過一夜飢餓（16-18小時）後，經由 肌肉內注射（ΙΜ)爲猴子注射氯胺酮10-15毫克/公斤使 其鎭靜。記錄體重並經由經皮股靜脈穿刺將血液（5毫升 -100- 201233685 )收集到經乙二胺四醋酸（EDT A )處理之真空採血管中 ，該採血管以〜1.8個胰蛋白酶抑制劑單位（TIU )抑肽酶 (Aprotinin)(西格瑪，0.6 TIU/毫升全血）預先處理選 。將採血管立即放在冰上。經由離心製備血漿，將所產生 之血漿部分分裝並冷凍在-80 °C。 在給藥期之第1、14及28天進行血漿藥物量抽樣。 使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA )測定血漿 Ab-Ll-FGF21AH-A129C量。使用老鼠抗獨特型h 3 8 C 2捕捉入1>-L1-FGF21AH-A129C並以針對FGF21之N-和C-端的生物 素化老鼠抗FGF21單株抗體的混合物偵測。該C-端偵測 抗體對FGF21之最後4-5個胺基酸具特異性，而N-端偵 測抗體係針對FGF2 1之前1 1 -1 2個胺基酸產生。雙偵測試 劑分析之最低需要稀釋爲在3%BSA的磷酸鹽緩衝液中稀 釋20倍。校準範圍爲0.03-10微克/毫升，而定量範圍爲 0.03-4微克/毫升。 以相同的方式處理每個藥效終點之數據。將每一隻猴 子的基線値從各時點減除以產生對應於從基線開始之變化 的數値》將各治療組中每個時點從基線値開始之變化加以 平均並計算該平均値之標準差（SEM )。以從基線値開始 之平均變化±標準差報告在硏究時程中各治療組之結果。 在以 0.15毫克/公斤及 1.5毫克/公斤 Ab-Ll-FGF21AH-A129C治療之動物方面，使用從基線値開始之變化及學生 T檢定（未配對樣本，不相等之方差）評估在各時點時相 對於載劑之統計意義。由於經FGF21AH治療之動物沒有 -101 - 201233685 載劑對照組，使用原始數據，而非使用從基線値開始之變 化來評估統計意義。在這種情況下，相對於基線進行學生 T檢定（兩側，配對樣本）。 實例S2Ab-Ll-FGF21AH-A129C血漿藥物量 血漿藥物量顯示於表16中。可衡量之藥物量出現在 第一個劑量後4小時及接下去之所有測試時點。 天 劑量 笼克/公斤: 根據時間(小時>之平均(SD) AB-L1-FGF21AH-A129C血漿濃度 Predose 1 4 24 1 0.15 BLQ NC 61.6(52.5) 60.1(25.0) 1.5 BLQ NC 221(186) 335(181) 14 0.15 31.7(20.8) 18.6(10.5) 27.1(10.3) 27.6(14.3) 1.5 66.4(38.5) 249(188) 312(225) 300(228) 28 0.15 - - - 39.1(51.4) 1.5 - - - 73.7(84.8) 表16 Ab-Ll-FGF21 Δ H-A129C血漿藥物量· BLQ 定量限値（8毫微克/毫升）， NC =未計算，n<3 ,-老可用於測試之樣本 實例S3體重 以AB-L1-FGF21AH-A129C劑量治療2週後之二組及 以FGF2 1對照蛋白質治療1週後之組別中的體重均顯著 減輕（第9A圖）。在所有組別中，於洗出期間體重減輕 仍受壓抑，雖然在AB-L1-FGF21AH-A129C二組中於4週 洗出期前已不明顯。以FGF2 1AH治療之動物表現出體重 減輕高於以AB-L1-FGF21AH-A129C治療之動物。在這些 動物中並不直接測量食品的攝入量，但保健人員並未在任 何治療組之任何動物中觀察到食慾不振。 -102- 201233685 實例54空腹血糖 採用 Ace Alera臨床化學分析 Wassermann®，考德威爾，NJ)，根據 酶比色法測量血糖。於任何治療組中之 時間均無顯著改變（第9B圖），此赛 FGF2 1AH-A129C長期治療不會引起低血 實例5S空腹血漿胰島素 採用來自Mercodia® (瑞典烏普薩 套組，根據製造商之指示測定血漿胰島 療組中之空腹血漿胰島素在經過的時間 9C 圖）。 實例56空腹血漿果糖胺 採用Ace Alera臨床化學分析儀 Diagnostics® (德國 Mannheim)之試劑 指示藉由酶比色法測量血漿果糖胺。以 1.5 毫克 / 公斤 AB-L1-FGF21AH-A129C 4及3週後，以及以FGF21對照蛋白質 3週後血漿果糖胺量顯著降低（第9D 續至洗出期，尤其是在1.5毫克/公斤 A129C治療組中，但在以FGF21AH治 過之各時點間則不一致。血漿果糖胺量 著降低，表示血糖控制改善。 i及試劑（阿爾法 製造商的指示藉由 空腹血糖在經過的 i示長期以 AB-L1 - 糖。 立）之ELISA試劑 素濃度。於任何治 均無顯著改變（第 ，利用來自 Roche 套組根據製造商的 〇·15毫克/公斤和 治療之組別在治療 治療之動物在治療 圖）。此顯著性持 AB-L1-FGF2 1 ΔΗ- 療之動物方面，經 隨著時間的推移顯 -103- 201233685 實例57空腹血漿升糖素 使用來自Millipore®之人類（與非人類靈長類動物的 交叉反應）內分泌免疫分析試劑套組在BioPlex®儀器（ Luminex xMAP技術）上根據製造商之指示測量血漿升糖 素。在整個硏究過程中，所有3個治療組中之升糖素量降 低，且在一些時點處升糖素量下降達到有意義，但下降之 顯著性在治療組間或AB-L1-FGF21AH-A129C劑量組間並 不一致（第9E圖）。 實例58靜脈內葡萄糖耐量試驗（IVGTT) 在三個時點，在每一隻動物中進行靜脈內葡萄糖耐量 試驗（IVGTTs ):基線（即，開始給藥前兩週），給藥 4週後第二次試驗，給藥後沖洗期4週後最後一次試驗。 在那些時點，爲猴子注射鎭靜劑並依上述採集空腹血液樣 本。在約30秒內將50%右旋糖（500毫克/公斤；1毫升/ 公斤）注入周邊靜脈（頭靜脈或隱靜脈），再沖洗生理鹽 水。接著，在給予右旋糖後5、10、20、30和60分鐘將 血液樣本收集入以EDT A處理之真空採血管中（2毫升） 〇 在IVGTT之各時點測量葡萄糖及胰島素。計算糖耐 量試驗期間（0-60分鐘）之葡萄糖及胰島素曲線下面積 。以梯形法則，採用時間0 ( t = Ο分鐘）數値作爲基線 値’從葡萄糖及胰島素偏移曲線計算葡萄糖和胰島素之 -104- 201233685 AAUC。在以 0·15毫克/公斤和 1.5毫克/公斤 AB-L1-FGF21AH-A129C治療之組別方面，以Dunnetts事後檢定 ，藉由 ANOVA評估相對於載劑之統計學意義。以 Dunnetts事後檢定，藉由重複測量ANOVA來評估 FGF21AH組中在經過之IVGTT時點處相對於基線之統計 學意義》 葡萄糖及胰島素之平均AAUCiSEM計算値分別顯示 於第9F及9G圖中。任何治療組之任何計算參數中並無 顯著變化。 實例59血漿總膽固醇（TPC ) 在Ace A1 era分析儀上使用酶法測量TPC量。在所有 治療組中，治療1週後TPC顯著減少（第9H圖）。以 〇-15毫克/公斤 AB-L1-FGF21AH-A129C治療之動物中其 TPC量在整個給藥及洗出階段中保持下降，然而以1.5毫 克/公斤及FGF21AH治療之組別中其TPC量在洗出階段中 朝基線反彈。 實例60三酸甘油酯（TG) 在Ace Alera分析儀上使用酶法測量TG量。在以1.5 毫克/公斤AB-L1-FGF2 1AH-A129C治療之組別及 FGF21AH治療之動物中在整個給藥期間TG顯著減少（第 9i圖）。以FGF2 1AH治療之組別中TG量在洗出階段持 續下降，而以1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21AH-A129C治療 -105- 201233685 之組別中TG量在洗出階段則有朝向基線之趨勢。 實例61非酯化之游離脂肪酸（FFA) 在羅氏（Roche) Cobas®C3 1 1臨床化學分析儀上，採 用來自和光® ( WaKo )(和光診斷，Richmond，維吉尼 亞州）之議定計劃及試劑，根據製造商的指示使用酶法測 量非酯化之游離脂肪酸（FFA )。在以0· 15毫克/公斤及 1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21AH-A129C治療之組別中 FFA 量沒有顯著變化（第9J圖）。在以FGF21 △ Η治療之動 物中，FF Α量在治療前2週顯著增加，然後在洗出階段第 1週前回到基線量。 實例62高密度脂蛋白膽固醇（HDL) 在Ace Alera分析儀上使用酶法測量HDL量。在任何 治療組中HDL膽固醇在整個治療期間並無顯著的變化》 實例63低密度脂蛋白膽固醇（LDL)
在Ace Alera分析儀上使用酶法測量LDL量。在以 0.15 毫克 / 公斤及 1.5 毫克 / 公斤 AB-L1-FGF21AH-A129C 治療之組別中，LDL膽固醇分別從治療2週及治療1週開 始明顯下降至洗出階段第2週（第9K圖）。在以FGF21 △ H治療之動物中’ LDL膽固醇量僅在治療1週後被觀 察到顯著下降。此治療組中之任何其他時點並未見到任何 顯著性。 -106- 201233685 實例64總酮體（ΤΟΤΚ) 在羅氏（Roche) Cob as® C3 11臨床化學分析儀上，採 用來自和光®之議定計劃及試劑，使用酶法測量ΤΟΤΚ。 在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21AH-A129C治療之動物中總酮量並無顯著變化（第9L圖）。 在以FGF21AH治療之動物中，TOTK量在治療前3週後 顯著增加，而在整個洗出階段中TOTK量有朝向基線之趨 勢。 實例6S脂聯素 使用Mercodia®ELISA試劑套組測量脂聯素量。血漿 脂聯素量顯示於第9M圖中。有三隻動物（載劑、1.5毫 克/公斤AB-L1-FGF21AH-A129C及FGF21AH治療組中各 1隻）被從分析中排除，因爲其脂聯素量低於分析之偵測 下限。雖然以FGF21AH治療之動物中脂聯素量有向上之 趨勢，但在任何治療組中未見到脂聯素量有顯著變化。 實例66 C-反應蛋白（CRP) 採用來自 ALPCO Diagnostics® (新罕布什爾州， Salem)之ELISA試劑套組，根據製造商的指示測量c-反 應蛋白（CRP)。在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤 AB-L1-FGF21AH-A129C治療之組別中，在4週之治療期 內，除了第2週之外，血獎 CRP量顯著下降（第9N圖 -107- 201233685 )。在沖洗階段該量趨向回復至基線。在以F G F 2 1 △ Η治 療之動物中血漿CRP量亦下降，但僅在沖洗階段第1週 達到顯著意義。 實例67瘦素 採用 Luminex®技術（Millipore® 目錄編號 HMH-34K )，根據製造商之指示使用議定計劃及試劑來測量瘦素。 在以FGF2 1AH治療之動物中血漿瘦素量下降（第9〇圖） ，但這種下降在任何時點均未達到顯著意義。在以八8-L1-FGF2 1AH-A129C治療之組別中瘦素量沒有變化。 實例68脂素 採用R & D系統® (明尼蘇達州，明尼亞波利市）人 補體因子D Quantikine試劑套組（目錄編號DFD00)， 根據製造商的說明來測量脂素量。在治療之前3週，所有 經治療之動物中的血漿脂素量顯著增加（第9Q圖）。在 沖洗階段該量趨向回復至基線。 實例69來自猴子硏究的結論 AB-L1-FGF21AH-A129C可在輕至中度胰島素抗性食 蟹獼猴中有效減輕體重、改善脂質指標（TPC、TG和 LDL)並降低炎性生物標記（CRP) 。AB-L1-FGF21AH-A129C或FGF21AH對空腹血糖量沒有明顯效果且未發展 出低血糖。藉由IVGTT評估得知對胰島素敏感性沒有影 -108- 201233685 響。雖然意外，這樣的結果，加上對血糖量沒有影響，可 能是由於與正常健康之獼猴相比時，在這些獼猴中之葡萄 糖及胰島素的基線量僅略微升高。此暗示這些動物只顯示 輕度之胰島素抗性。基線量的小變化，加上猴子與猴子之 間的自然變異以及每組中少量的動物數目可能使觀察到血 糖指數的統計上顯著變化較爲困難。在以 AB-L1_ FGF2 1AH-A129C治療之動物中，治療期結束時果糖胺量 降低確實指出這些動物中之血糖控制改善。每週兩次投予 AB-L1-FGF21AH-A129C劑量（尤其是1 · 5毫克/公斤劑量 )時可產生與每天投予對照組FGF21蛋白劑量相當之有 利影響。 實例70 AB-1L1-FGF21AH-A129C之首次人體硏究 在患有第 2型糖尿病之受試者中進行人1)-1^1-FGF21AH-A129C (h38C2-(SEQ ID NO :10-L1)2)之隨機化 、安慰劑對照、平行上升單一 IV劑量硏究。受試者接受 爲IV大九藥（0.5毫克及1.5毫克）或IV滴液（5、15、 50、100、200毫克）形式之安慰劑或 Ab-Ll-FGF21AH-A129C，在各活性治療劑量組中有10位受試者接受評估， 在安慰劑組中有1 4位接受評估。迄今爲止，已有七組劑 量高達200毫克劑量量之群組接受評估，由於高達200毫 克之單一 IV劑量被發現通常爲安全且被良好耐受，因而 未鑑定最大耐受劑量（MTD )。此處提出所觀察到之安全 性/耐受性、藥物動力學及藥效學數據的初步總結。 -109- 201233685 在投予單一劑量後，與安慰劑相比較，7個點之平均 血漿血糖變化形廓及空腹血糖量之間並未觀察到差異，雖 然二者均顯示出降低》在總膽固醇、LDL膽固醇、空腹胰 島素、空腹升糖素或空腹石-羥基丁酸酯中未觀察到劑量 相關之趨勢》與安慰劑相比較，在硏究之頂端兩個劑量量 (100和200毫克IV)中觀察到HDL膽固醇增加。在空 腹三酸甘油酯方面觀察到劑量依賴性下降。 在單次靜脈內投予健康志願者 Ab-Ll-FGF21AH-A129C後分別估計FGF21之完整C-端及完整N-端的藥物 動力學。與該二者之接觸似乎隨劑量增加而按比例增加。 對數濃度對時間曲線的終端階段分別與C-端之7至9小 時的平均終端半衰期及N-端之3 0-3 6小時的平均終端半 衰期平行。
在33位受試者中無嚴重不良事件（SAE)之報告， 共有60件不良事件（AE )之報告。在這些不良事件中， 有54件報告係來自28位接受Ab-Ll-FGF21AH-A129C之 受試者中。大多數之AE被認爲在強度上是輕微的，除了 在投予15毫克 Ab-Ll-FGF21AH-A129C劑量或安慰劑後 3 2.5小時開始之噁心事件被評級爲中度不良事件以外（該 中度不良事件歷時165小時，其並不需要醫療干預且被認 爲與硏究藥物治療有關）。亦報告一起被評級爲中度之腹 瀉事件，其係在投予50毫克Ab-Ll-FGF21AH-A129C劑量 或安慰劑後 2小時開始，歷時〗5 6小時，不需要醫療干 預且被認爲與硏究藥物治療有關。腹瀉爲最常報告之AE -110- 201233685 (12位受試者中有14起），其中九（9)起被認爲與治 療有關。其他腹瀉事件被認爲與供給之自來水改變加氯治 療有關，該自來水係在參與臨床硏究之單位的住院禁閉期 間提供給一個群組之受試者。在第7群組（200毫克劑量 組或安慰劑）中報告之9起胃腸不良事件中有5起之胃腸 道症狀（腹脹、腹痛、腹瀉、消化不良、胃腸脹氣、胃酸 過多、噁心及嘔吐）顯示出出現的頻率似乎隨劑量增加而 增加。沒有任何參與硏究之受試者因爲AE而撤回。 在硏究之全部劑量中未觀察到IGF-1値、實驗室試驗 、生命徵象或12導聯心電圖中具有劑量相關的趨勢。在 200毫克治療組中，收縮壓（SBP )之平均値在數値上有 較其他治療組（包括安慰劑）高之趨勢，增加最多的爲在 第1天給藥後0.5小時從基線增加11.2mM汞柱，並持續 至第15天增加7. OmM汞柱。在200毫克治療組中觀察到 之從基線間始的平均變化係在該組平均基線的一個標準偏 差內。再者，在200毫克治療組中，個別受試者中之入!)-L 1 - F G F 2 1 △ Η - A12 9 C暴露與S B P增加之間沒有相關性。此 外，增加之SBP持續至第15天，直到硏究藥物沖洗後。 所有這些觀察暗示所觀察到之平均値增加係在治療組變異 之內且可能與此有關》 實例71劑量攝生法 在投予第2型糖尿病患者單一劑量之 Ab-Ll-FGF21AH-A129C後三酸甘油酯降低之濃度-反應關係係使 -111 - 201233685 用一個緩慢的藥理學起始及終止ΡΚ/PD模型來解說。劑 量之預測係基於使用該PK/PD模型測出之IC5Q和來自 FIH (人體首次）三酸甘油酯數據之緩慢藥理動力學’以 及從ob/ob小鼠OGTT數據得到之模型推衍的最大藥理作 用。預計每週投予10毫克h38C2-(SEQ ID NO: l〇-Ll)2之 劑量或每週投予兩次5毫克Ab-Ll-FGF21AH-A129C之劑 量共4週以在8% HbAlC之患者中達到降低〜2 5%之空腹 血糖。 因此，本發明提供一種劑量攝生法，其包含以約5毫 克之本發明化合物（尤其是 Ab-Ll-FGF21AH-A129C)之 劑量治療患者。於一些態樣中，係一週二次（每週兩次） 投服約5毫克之本發明化合物（尤其是Ab-Ll-FGF21AH-A129C )。於一些態樣中，係投服約5毫克之本發明化合 物（尤其是 Ab-Ll-FGF21AH-A129C)至少四週。於一些 態樣中，係每二週投服一次約5毫克之本發明化合物（尤 其是 Ab-Ll-FGF21AH-A129C)至少四週。 因此，本發明提供一種劑量攝生法，其包含以約10 毫克之本發明化合物（尤其是Ab-Ll-FGF21AH-A129C) 劑量治療患者。於一些態樣中，係每週一次投服約1 〇毫 克之本發明化合物（尤其是Ab-Ll-FGF21AH-A129C) ^ 於一些態樣中’係投服約毫克之本發明化合物（尤其 是 Ab-Ll-FGF21AH-A129C)至少四週。於一些態樣中， 係每週投服一次約10毫克之本發明化合物（尤其是Ab-L 1 -FGF2 1 ΔΗ-A129C )至少四週。 -112- 201233685 於一些態樣中，該患者患有第2型糖尿病。於一些態 樣中，該患者爲具有升高之血紅蛋白 A1C的糖尿病患者 。於一些態樣中，該劑量攝生法係用於降低三酸甘油酯量 。於一些態樣中，該劑量攝生法係用於提高高密度脂蛋白 。於一些態樣中，該劑量攝生法係用於降低血糖。於一些 態樣中，該劑量攝生法係用於降低至少約25 %之血糖》 於一些態樣中，該劑量攝生法係用於治療第2型糖尿病。 實例 72 Ab-Ll-FGF21AH-H125C & A b - L 1 - F G F 2 1 Δ Η -A129C之穩定性 藉由UF-DF (採用截斷30000分子量之滲濾及超濾作 用）製備八1)-1^1邛0?2 1厶11-11125〇&八15(1138〇2-(FGF2 1 ΔΗ-Η 1 25C-L1 )2 )及 Ab-L 1-FGF2 1 ΔΗ-A129C ( h38C2-(FGF21AH-A129C-Ll)2)之各種調製劑，然後進行 無菌過濾。將調製劑置於一範圍之壓力條件下（見表17 )。然後，使用外觀分析、UV (紫外線吸光度）、SDS-P AGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳）、尺寸排 阻色層分析法（SEC )及iCE (成像毛細管電泳法）分析 樣本。藉由生物物理技術（諸如差示掃描量熱法（DSC ) 及分析性超速離心）分析一些樣本。在不同時點分析樣本 (表1 7 )以評估穩定性趨勢》爲了測定聚山梨酸酯8 0之 任何有益的影響，選擇製備之具有或不具有聚山梨酸酯 80之調製劑接受攪動壓力（在3 00rpm迴轉振盪4小時） 。此外，若結合物可以高濃度溶解於水性緩衝溶劑中，一 -113- 201233685 些調製劑亦使用較高之濃度來進行評價，並評估在高濃度 下之穩定性。 配製劑 蛋白質 窀克俺升 爛 開始 4小時 300rpm 4週 Sec 4遇 25»C 2週 4〇ec 2遇 50»C A "HnSC-HisS" (20mM 組胺酸，pH 6> 7-10 C PF PF PF PF PF B "H125C-NaAc4”（20mM 醋齡ft , pK4| 7-10 C nc PF nc C nc C "H12SC-NaP8M (20mM 说酸鈉，pH 8》 7-10 C nc PF nc c nc D wH12SC-His6-SO"(20mM 組胺酸，ρΗ6ϊ 40-50 C nc PF nc c nc E "H125C-His6-PS8tn2〇mM his, 0.2¾克/¾升聚山梨酸酯 80, pH 6} 7-10 C C nc nc nc nc F "A129C-His6· U〇mM 組胺酸，pH 6J 7-10 C PF PF PF PF PF G "A129C-NaAc4w (20mM 醋酸纳，pH 4) 7-10 C nc C nc C nc H WA129C -NaP8M2〇mM 磷酸鈉，pH 8} 7-10 C nc C nc c nc 1 •A129C -His6-S(T (20mM 繼酸，pH 6J 40-50 C nc PF nc c nc J “AUSC-Hise-PSSCTpOmM his, 0.2¾ 克/¾ 升聚山梨酸酯 80, pH 6J 7-10 C C nc nc nc nc 表17八1)丄1-?0?21^11-11125£：(八七）及八15丄1不01;21么卜八129(：(厂1)之調製劑· PF :形成粒子：C :透明；nc :沒有進行。 外觀分析
在不同溫度下儲存時形成顆粒：在20mM組胺酸，pH 6調製劑中之兩種候選物（調製劑A和F)顯示出在51 下儲存4週，或在25 °C下儲存4週，或在40°C下儲存2 週，或在50°C下儲存2週時會形成顆粒。這些數據暗示
20mM 組胺酸，pH 6 調製劑導致 Ab-Ll-FGF21AH-H125C 及Ab-Ll-FGF21AH-A129C不穩定。當承受在40°C下2週 之壓力時，相對於具相同蛋白質濃度之組胺酸，pH 6調 製劑，醋酸鹽，pH 4及磷酸鹽，pH8之調製劑顯示出未 形成微粒。然而，當與具較低蛋白質濃度（7-10毫克/毫 升）之相同調製劑（組胺酸，pH 6 )相比較時，高蛋白質 濃度（40-50毫克/毫升）顯示出減緩顆粒形成。在5°C下 儲存 4 週後比較 Ab-Ll-FGF21AH-H125C 及 Ab-Ll- -114- 201233685 FGF2 1AH-A129C之外觀數據時，在2種調製劑（醋酸鹽 ，pH 4 及磷酸鹽，pH 8)中，Ab-Ll-FGF21AH-A129C 顯 示出較優越之對抗顆粒調製劑的性能。 如從表17中所見，當比較具有及不具有聚山梨酸酯 80之調製劑時’聚山梨酸酯8 0'的存在有助於在兩種候選 物中防止誘導形成顆粒之攪動壓力。攪動壓力通常用於預 測對抗涉及空氣-水界面以及機械壓力之不同操作步驟的 穩定性。 隨著時間的推移未觀察到紫外線之顯著變化指出即使 表1 7中所列之一些調製劑中被觀察到形成微粒，蛋白質 之淨濃度不會隨著時間的推移受到顯著影響。 形成高分子量物種（HMWS) 使用SEC來測量表1 7中列出之各種調製劑形成 HMWS (結果顯示於表18中）。SEC能夠可靠地分離 HMWS 且爲 Ab-L 卜 FGF21 ΔΗ-Η1 25C 及 Ab-Ll-FGF21AH-A129C之重要穩定性指示分析。SEC分析中之HMWS被定 義爲在攜帶2個FGF21單位（即，h38C2-(FGF2 1 ΔΗ-Η 1 25C-L1 )2 R h 3 8 C 2 - (F GF 2 1 △ Η - A12 9 C - L 1) 2 ) 的結合物前洗提出之物種。二種候選物之在2 OmM組胺酸 ，pH 6中的調製劑顯示出高初始以及時間倚賴性之 HMWS形成作用。有趣的是，二種候選物之一些調製劑（ 醋酸鹽，pH 4 ;磷酸鹽，pH 8及在組胺酸，pH 6中之高 濃度調製劑）在高溫下（40°C )下趨向顯示出聚集物在第 -115- 201233685 一週初步分解。蛋白調製劑隨著時間的推移有非線性聚集 的趨勢係在文獻中得知。與在2 OmM組胺酸，pH 6中之 調製劑相比較，在20mM醋酸鈉，pH4中之調製劑顯示出 HMWS較少。因此，在形成HMWS方面，在20mM醋酸 鈉，pH4中之調製劑提供較在20mM組胺酸，pH 6中之調 製劑更優越的穩定性。SDS-P AGE分析與這些結果一致。 最後，當比較兩種候選物在醋酸鹽，pH4之調製劑中 形成HMWS的傾向時，Ab-Ll-FGF21AH-A129C顯示出性 能優於 Ab-Ll-FGF21AH-H125C ( ^ 18)。 貯存溫度 5°C 25eC 40eC 時點 (週） 開始 2週 4週 8週 1週 2週 4週 1週 2週 4週 H125C-His6 25.1 25.9 27.1 21.8 22.8 23.3 22.0 14.5 20.2 25.1 H125C-NaAc4 11.7 8.5 9.6 4.6 4.5 6.3 H125C*NaP8 21.0 20.2 21.7 15.0 12.0 10.1 H125C-His6-50 33.2 36.4 33.9 20.9 A129C-His6 27.3 23.3 25.0 24.3 18.6 20.3 18.9 14.0 2B.2 13.0 A129C-NaAc4 3.6 3.2 3.5 2.9 3.6 5.0 A129C-NaP8 17.8 17.0 17.8 11.9 14.9 30.8 A129C*His6-50 28.2 35.3 29.6 23.5 表18藉由SEC測量之ΑΙ>1·1·Κ5Ρ21ΔΗ-Η125(：及Ab-Ll-FGF21AH-A129C%HMWS (高分子S物種）之穩定性數據· SEC條件包括：Waters Biosuite UHR 250 4微米，4.6x300奄米SECft，流動相：200mM磷酸鈉lOOmMft化鈉緩 面液（pH 7.0)，分析柱溫度：周圍溫度•流速：0.13升汾鐘（等強度），偵測：在214nm之紫外線吸收•運 行時間：50分鐘 電荷異質性 蛋白質具有由轉譯後改質（諸如脫醯胺及斷裂成片斷 )造成之電荷異質性。影像式毛細管等電聚焦法（iCE ) 根據其在pH梯度中之電荷差異（pi値）分離蛋白質物種 。表19中顯示使用iCE監控在各種 Ab-Ll-FGF21AH-H125C及Ab-Ll-FGF21AH-A129C調製劑中之電荷異質性 -116- 201233685 。iCE之運行條件包括：含有2M尿素及Pharmalyte 3-1 Ο 之約1毫克/毫升蛋白質。與在2 OmM醋酸鈉，pH 4中之 調製劑相比較，二種候選物在20mM組胺酸，pH 6以及 2OmM磷酸鈉，pH 8中之調製劑顯示出較高之形成酸性物 種的趨勢。因此，在20mM醋酸鈉，pH 4中之調製劑提 供卓越的穩定性。此外，與在相同調製劑中之 Ab-Ll· FGF21AH-H125C 相比較，Ab - L 1 - F G F 2 1 Δ Η - A1 2 9 C 顯示出 在2 OmM醋酸鈉，pH 4中形成較少之酸性物種的傾向， 因而在電荷異質性方面表現出較優越之穩定性。 貯存謎 5eC 25eC 40eC 時間點 (週） 開始 2週 4週 1週 2週 4週 1週 2週 H125C-His6 60.0 62.8 64.9 60.3 71.9 74.2 75.1 82.9 H12SC -NaAc4 62.4 61.7 60.7 53.3 H125C-NaP8 77.4 92.3 95.3 96.2 H125C-His6-50 61.9 78.5 A129C-His6 58.4 62.7 62.5 64.2 73.0 75.2 75.7 81.9 A129C-NaAc4 49.3 52.7 48.8 45.2 A129C >NaP8 68.3 87.5 89.0 97.4 A129C -His6-50 62.5 53.9 表 19 藉由Ab-Ll-FGF21 ΔΗ·Η125(：及Ab^Ll-FGF21 ΔΗ-Α129(：之iCE 電荷異質性數據測量之％酸性物種 差示掃描量熱法（DSC) 採用DSC，藉由測量由溫度引起之解折疊轉變中點（ Tm )來硏究兩種候選物之熱穩定性。h38C2之主要解折 疊轉變的Tm値爲73.5 °C。該結合物顯示出較高之主要解 折疊轉變的Tm，暗示具較高之對抗解折疊的熱穩定性（ Ab-Ll-FGF21 AH-H125C ( h3 8 C 2 - (F G F2 1 ΔΗ-Η 1 2 5 C - L 1 )2 ) -117- 201233685 及 Ab-Ll-FGF2 1 AH-A129C ( h 3 8 C 2 - (F G F 2 1 Δ Η - A12 9 C - L 1) 2 二者之Tm爲79°C )。 亦使用內在蛋白色胺酸螢光，藉由測量由溫度引起之 解折疊轉變中點（Tm-FL )來硏究兩種候選物之熱穩定性 。此分析半定量性地監控由高溫引起解折疊時的三級結構 變化。h38C2 、 Ab-Ll -FGF21AH-A129C 及 Ab-Ll- FGF21AH-H125C之主要解折疊轉變的Tm-FL値分別爲約 74.1°C、77.7t及79.7°C。與藉由DSC測量之Tm値一致 ，該兩種候選物顯示出較h38C2之Tm-FL略高的類似 Tm-FL，此暗示該結合物之熱動力學穩定性較單獨之 h38C2爲高。 分析性超速離心分析 使用此分析正交定性測量選定之測試調製劑中之 HMWS的量。HMWS在20mM組胺酸，pH 6調製劑中之 量顯示出與 SEC中所見者類似。Ab-Ll-FGF21AH-A129C 在20mM醋酸鈉，pH 4中之HMWS量較低，與在SEC分 析中所見之趨勢爲定性上相一致。分析性超速離心數據提 供正交驗證，指出該20mM醋酸鈉，pH 4調製劑具有較 2〇mM組胺酸，pH 6調製劑優越之穩定性（表20)。 配製劑 %HMWS Ab-Ll-FGF21AH-H12SC 在 20mM 組胺酸，pH 6 中 25.2 Ab-Ll-FGF21AH-A129C 在 20mM 組胺酸，pH 6 中 24.3 Ab-Ll-FGF21AH-A129C在 20mM 醋酸鈉，pH 4 中 5.2 表20藉由AWJ-FGF21 ΔΗ-Η125(：及AWJ-FGF21 ΔΗ-Α129(：之分析性超速離心所測得之HMWS數據 -118- 201233685 比較數種此實例中所討論之穩定性指標的數據’ Ab-L1-FGF21AH-A129C之整體穩定性變化形廓似乎優於Ab-L1-FGF21AH-H125C。亦明顯地’與較高之PH値（如PH 値6-8 )相比較，降低調製劑之PH値（如醋酸鹽’ pH 4 )可提供較佳之穩定性。 實例73 Ab-Ll-FGF21AH-A丨29C之pH緩衝液的篩選 硏究 Ab-L hFGF21AH-A129C(h38C2-(FGF21AH-A12 9C-L1 )2 )在各種水性緩衝液中之穩定性以
尋找合適之穩定介質爲目標。連接子-1不穩定，以及蛋 白組分（即h38C2和FG21)之任何水解分解產生低分子 量的物種（LMWS )。此外，若結合物在測試之調製劑中 聚集則可形成高分子量物種。經由將緩衝液交換入所需之 調製劑中，使目標蛋白的濃度在5-8毫克/毫升的範圍內 來製備調製劑。使用0.2微米過濾器過濾調製劑，包裝在 玻璃小瓶中並儲存在所需之溫度下。在指定之時點分析樣 本。 藉由SEC測量HMWS及LMWS 在溫度壓力（40°C )下觀察緩衝液和pH値之顯著影 響2週。數據呈現在表21中。在最初之時點可見到在較 高pH之調製劑中HMWS有增加之趨勢。組胺酸調製劑爲 顯現出高％HMWS的物種之一。在4.5至5之pH値範圍 內的醋酸鈉、乳酸鈉、蘋果酸鈉及檸檬酸鈉調製劑顯示出 -119- 201233685 在起始點的聚集相對少。在40°C儲存數週後，在pH 6.5 和7之調製劑中，％HMWS確實降低。乳酸鈉，pH4.5調 製劑顯示出在％ HMWS方面相當優越之性能。 LMWS之趨勢與HMWS之趨勢不同。除檸檬酸鈉， pH 5調製劑外，所有調製劑在起始時點均顯示出一致之 % LMWS値。在40°C儲存2週後，一些低pH調製劑顯示 出％ LMWS顯著增加，據推測這是由於發酵。然而，很 明顯地，緩衝液物種之作用在對抗形成LMWS之穩定作 用上亦發揮效果。％ LMWS之pH依賴趨勢暗示進一步精 製調製劑可以進一步改善穩定性。 ID 調製劑 %HMWS 起始點 %HMWS 在401C下 2週後 %LMWS 起始點 %LMWS 在40*C下 2週後 A 20mM 醋酸鈉，pH 4.5 8.9 13.7 26.8 38.1 6 20mM醋酸鈉，pHS 9.4 22.6 26.1 33.8 C 2〇mM 醋酸鈉，pH 5_S 12.1 29.2 26.1 33.2 0 20mM 組酸胺，pHS_5 16.9 26.0 25.3 29.7 E 20mM組酸胺，pH6 23.0 28.2 24.6 29.7 F 20mM 組酸胺，pH6.S 18.0 14.8 25.5 38.6 G 20mM 乳酸鈉，pH 4_5 8.9 11.3 26.7 55.2 H 13mM蘋果酸鈉，pH4.5 9.2 20.8 27.6 52.7 I 13mM蘋果酸鈉，pH5 9.9 34.3 27.6 28.3 J lOmM檸檬酸鈉，pH 5 7.8 24.3 36.5 47.5 K lOmM檸檬酸鈉，ρΗ6·5 21.5 15.9 26.0 37.8 L 13mM琥珀酸鈉，pH 6 16.8 13,3 26.2 42.1 N 10m Μ 磷酸鈉，pH 6. S 22.2 12.9 25.3 45.3 P lOmM 磷酸鈉，100mM NaCI, pH 6.5 19.3 15.4 25.7 40,0 Q lOmM磷酸鈉，pH7 16.4 13.1 27.1 43.9 R 7mM醋酸鈉，7mM組胺酸， 4mM頻果酸鈉，pH 5 9.9 22.6 27.0 33.7 S 5mM檸檬酸鈉，SmM 磷酸鈉，pH6.S 22.1 12.1 25.9 44.7 表21 Ab*Ll-FGF21 Δ H-A129C之調製劑的SEC數據 -120- 201233685 實例74 Ab-Ll-FGF21AH-A129C對抗攪動之穩定性 經由緩衝液交換及添加賦形劑使目標蛋白質濃度在 9-11毫克/毫升的範圍內來製備調製劑。使用0.2微米過 濾器過濾製備之調製劑並包裝在玻璃小瓶中。使用速度爲 3 OOrpm之迴轉式振盪器施放攪動。在指出之時點分析樣 本。表22中之結果證實聚山梨酸酯80之存在有助於防止 由攪動引起之不穩定。 調製劑 開始時 之爛 攪動24小時後 之爛 攪動24小時後》/〇 HMWS中之變化 30mM乳酸鈉，90毫克/¾升 海藻糖二水合物，pH 4.8 透明 獄液體及沈澱 1.4 30mM乳酸鈉，90毫克/毫升 海藻糖二水合物,0.5毫克/毫升 聚山梨酸酯80, pH 4.8 透明 透明帶有一點顆粒 0.1 表22 調製劑對抗攪動壓力之穩定性數據 實例75 Ab-Ll-FGF21AH-A129C之凍乾調製劑 雖然液態調製劑可與本發明之化合物一起使用，凍乾 調製劑可提供更長久之穩定性。實例72證實本發明化合 物在醋酸鈉中最穩定之令人吃驚的結果。然而，醋酸鈉會 昇華，因此很難納入凍乾之緩衝液中。因此，有需要硏發 用於本發明化合物之替代緩衝液以在凍乾調製劑中提供最 佳之長期穩定性。 經由緩衝液交換及添加賦形劑使目標蛋白質濃度約爲 10毫克/毫升來製備調製劑，但調製劑J和K之目標蛋白 -121 - 201233685 質濃度爲約20毫克/毫升。使用0.2微米過濾器過濾製備 之調製劑並包裝在玻璃小瓶中。爲了製備凍乾之調製劑’ 將小瓶凍乾、塞住並加蓋。在指定之時點拉出樣本並藉由 各種分析方法測定（包括SEC及iCE )。亦評估該液態調 製劑2週以評估穩定性。 評估凍乾調製劑儲存在升高之溫度下的性能。表23 顯示出在指定之時點的SEC和iCE數據。凍乾調製劑表 現出眾，即使在較高之溫度壓力下比較時。在凍乾調製劑 中，乳酸鹽及醋酸鹽調製劑的表現相對較好。然而，已知 當凍乾造成pH値移動時醋酸鹽會發生昇華。醋酸調製劑 在凍乾時確實顯示出增加〇·3-〇.5個pH單位。因此’歸 結出該凍乾之乳酸調製劑（調製劑C)適合用於取得適當 之穩定性，並提供足夠的保護防止形成微粒、HMWS、 LMWS及酸性物種。當與實例73中呈現之調製劑比較時 ，顯然地，調製劑C (包含乳酸鹽、海藻糖二水合物、 PS20、EDTA、L_Met)協助預防連接子之不穩定性和蛋白 質剪切（此兩者造成LMWS形成），以及聚集（形成微 粒及HMWS)。實例72和73顯示出僅包含乳酸鹽之 h38C2-(FGF21AH-A129C-Ll)2之調製劑雖然優於其他緩衝 液（諸如組胺酸），但可能不會提供足夠之穩定性以利長 期使用。乳酸鹽與各種類型之穩定劑（諸如作爲冷凍保護 劑及凍乾保護劑的糖或多元醇（如海藻糖、蔗糖、甘露醇 )、用於攪動穩定性之表面活性劑（如聚山梨酸酯8 0、 聚山梨酸醋20、泊洛沙姆（poloxamer))和蜜合劑（如 -122- 201233685 EDTA、DTPA)以及抗氧化劑（如L-蛋胺酸）的組合可提 供穩定性之協同增強作用。表23中，與僅含緩衝液之相 對應的調製劑相比較，乳酸鹽被蘋果酸鹽 '琥珀酸鹽或醋 酸鹽之一取代的組合調製劑可提供較優越的穩定性。因此 ，該組合物明顯增強Ab-Ll-FGF21AH-A129C之穩定性。 實例76 Ab-Ll-FGF21AH-A129C之凍乾調製劑 經由緩衝液交換及添加賦形劑使調製劑間之目標蛋白 質濃度有所不同來製備調製劑。使用0.2微米過濾器過濾 製備之調製劑並包裝在玻璃小瓶中。爲了製備凍乾之調製 劑，將小瓶凍乾、塞住並加蓋。在指定之時點藉由各種分 析方法（包括SEC及iCE)分析樣本。此外，亦評估該液 態調製劑2週以評估液態調製劑之穩定性趨勢。在凍乾後 測試該凍乾調製劑之含水量且均低於 0.5%。 將該凍乾調製劑儲存在不同的溫度壓力下，表24顯 示出在指定之時點的SEC、iCE及降低之CGE (毛細管凝 膠電泳）數據。CGE產生蛋白質片段之半定量估計値。與 其液體對應部分相較下，凍乾調製劑顯示出較佳之穩定性 。乳酸（乳酸鈉）凍乾製劑在穩定賦形劑之存在下（在冷 凍保護劑/凍乾保護劑之存在下）顯示出良好之穩定性。 因此，可歸結出該凍乾之乳酸調製劑適合測試長期之儲存 穩定性。在乳酸調製劑中’需要平衡調製劑之PH値以防 止因爲連接子之不穩定性及蛋白質剪切而過度破碎。例如 :與其它調製劑相比較，液體狀態之調製劑F ’ p Η 4.5產 -123- 201233685 生大量碎片。最後，當比較調製劑B及L時，穩定劑（ 即，EDTA和L-蛋胺酸）被發現可提供實質之利益使破碎 減至最少，尤其是提供給液體調製劑此利益。其他金屬螯 合劑（如：EDTA、DTPA )及抗氧化劑（如：L·蛋胺酸、 純抗壞血酸）之組合預計對取得穩定性有利。 亦測試選定之調製劑的相對生物活性以探究在表24 之數據中見到之物理和化學降解間是否有關聯性。藉由間 接 FGF-R//3 -Klotho HEKL-2 93 細胞結合 ELIS A 測量生物 活性，並以參考物質之相對％表示。生物活性數據呈現於 表2 5中。從數據來看，似乎物理與化學降解間有關聯性 ，且該藉由分析方法分析出之顯示明顯降解的調製劑（表 24)亦顯示出生物活性明顯降低。這些數據對調製劑A 之組分所提供之穩定性及功能完整性提供進一步的信心。 調製劑 在5*C 2週後 拉物活性 在251C 2週後 之生物活性 在40TC 2週後 之生物活性 液91/ 凍乾 A 105 - - 凍乾 B - 107 64 液體 D - 97 61 液體 F * 98 49 液體 表25表24列出之選定的Abil-FGF21 △ H-A129C之凍乾和液思調製劑的生物活性（相對％ )數據 因此，於一些態樣中，本發明提供包含約〇. 1至約 200毫克/毫升之FGF21-結合物及約1至15 0mM之乳酸或 醋酸鈉，pH値爲約4至約5.5 :以及至少下列一者之調製 劑： (i) 約10至約150毫克/毫升之冷凍保護劑； (ii) 約0.001至約1.0毫克/毫升之螯合劑； -124- 201233685 (iii) 約0.01至約10毫克/毫升之抗氧化劑； (iv) 約0.02-2.0毫克/毫升之表面活性劑。 於一些態樣中’本發明之調製劑包含二或多項之（i )至（iv)。於一些態樣中，本發明之調製劑包含三或多 項之（i )至（iv )。於一些態樣中’本發明之調製劑包 含（i ) 、（ ii ) 、（ iii )及（iv )。 於一些態樣中’本發明提供凍乾調製劑，其包含： (i)約〇_1至約200毫克/毫升之FGF21-結合物 (Π )約1至150mM之乳酸，pH値約4至約5.5 ; 及 (iii )約10至約15〇毫克/毫升之冷凍保護劑； (iv )約0.02-2.0毫克/毫升之表面活性劑。 於一些態樣中，該凍乾調製劑可進一步包含約〇.〇〇 i 至約〗.〇毫克/毫升之螯合劑。該螯合劑可爲EDTA或 DTPA’且存在量可爲約0.02至約〇.5毫克/毫升。該螯合 劑之存在量可爲約0.05毫克/毫升。 於一些態樣中，該凍乾調製劑可進一步包含約0.01 至約1 〇毫克/毫升之抗氧化劑。於一些態樣中，該抗氧化 劑可爲L-蛋胺酸。該抗氧化劑之存在量可爲約〇.02至約 5毫克/毫升。該抗氧化劑之存在量可爲約〇.〇5至約0.2 毫克/毫升。該抗氧化劑之存在量可爲約0.1毫克/毫升。 於一些態樣中’該FGF21-結合物爲一種如此處描述 之本發明化合物。於一些態樣中，該F G F 2 1 -結合物爲 Ab-L 1-FGF2 1 ΔΗ-Η 1 2 5C 或 Ab-L 1-FGF2 1 ΔΗ-A129C。於一 -125- 201233685 些態樣中，該FGF21-結合物爲特殊物種h38C2i (SEQ ID NO :l〇-Ll)2。於一些態樣中，該FGF21-結合物 之存在量爲約5毫克/毫升至約200毫克/毫升。於一些態 樣中’該FGF21_結合物之存在量爲約5毫克/毫升至約 100毫克/毫升。該FGF21-結合物之存在量爲約5毫克/毫 升至約50毫克/毫升。該FGF21-結合物之存在量爲約1〇 毫克/毫升。 於一些態樣中，該乳酸之存在量爲約1至約10 0mΜ 。於一些態樣中，該乳酸之存在量爲約1 OmM至約5 0mm 。於一些態樣中，該乳酸之存在量爲約30mM。該pH値 可爲約4.3至5.3。該pH値可爲約4.8 ±0.5。該pH値可 爲約4.8 。 於一些態樣中，該冷凍保護劑係選自如下群組：海藻 糖二水合物 '蔗糖及甘露醇。該冷凍保護劑可爲海藻糖二 水合物。該冷凍保護劑之存在量可爲約50至約120毫克/ 毫升。該冷凍保護劑之存在量可爲約90毫克/毫升。 於一些態樣中，該表面活性劑係選自如下群組：聚山 梨酸酯80、聚山梨酸酯20及波洛沙姆。該表面活性劑可 爲聚山梨酸酯20»於一些態樣中，該表面活性劑之存在 量爲約0.05至約1.0毫克/毫升。於一些態樣中，該表面 活性劑之存在量爲約0· 1至0.5毫克/毫升。於一些態樣中 ’該表面活性劑之存在量爲約0.2毫克/毫升。 於一些態樣中，本發明包含適合用於凍乾之調製劑， 其包含下列： -126- 201233685 (i) 約 10 毫克 / 毫升之 h38C2-(FGF21AH-A129C-Ll)2 » (ii) 約 30mM 乳酸，pH 4·8± 0·5 ; (iii )約90毫克/毫升之脫水海藻糖 (iv) 約0.05毫克/毫升之乙二胺四醋酸二鈉二水合 物； (v) 約0.1毫克/毫升之L-蛋胺酸；及 (vi) 約0.2毫克/毫升之聚山梨酸酯20。 除非另有說明，在具體實例中當使用“ Ab-Ll-FGF21AH-A129C” 一詞時，其係指 h 3 8 C 2 抗體（S E Q ID NO: 25及26)，該抗體之各臂透過SEQ ID NO: 26之 K99共價連接至連接子_1(L1)，且各 L1分子共價結合 SEQ ID NO: 10 中之 Cys129 的巯基（根據 SEQ ID NO: 1 之編號）。該化合物亦可被描述爲Ab- (FGF2 1 AH-A129C-L1 )2、h 3 8 C 2 (F G F 2 1 △ Η - A12 9 C - L 1) 2 及 h38C2(SEQ ID NO:10-L1)2。顯然地，對該抗體之序列、 特殊連接子及FGF21分子進行些微修改是可能的。 因此，本發明已被廣泛揭露並參考上述代表性實施例 說明。熟習本技術之人士將可察知可對本發明做各項修改 ，而不悖離其精神及範圍。此處列舉之所有出版物、專利 申請案及核發之專利納入做爲參考，其程度如同各個別出 版物、專利申請案及核發之專利係專門且個別指明其全部 內容被納入參考。當與本揭露內容中之定義矛盾時則排除 納入參考之內容中所包含的定義。 -127- 201233685 可感知，爲了清楚起見而描述在分開實施例中之本發 明某些特性亦可組合提供於單一實施例中。相反地，爲了 簡明起見而描述在單一實施例中的本發明之各種特性亦可 分開提供或以任何合適的子組合提供》 此文中關於本發明之一種實施例所討論之任何限制係 經具體考量可能適用於本發明之任何其他實施例。此外， 本發明之任何組成物可用於本發明之任何方法中，且本發 明之任何方法可用於製造或採用本發明之任何組成物。尤 其是，可理解的是，申請專利範圍中所描述之本發明的任 何態樣（單獨或與一或多項額外之專利主張及/或描述之 態樣組合）可與申請專利範圍和/或說明中另外提出之本 發明的其他態樣組合。 除非明確表示僅指該替代項，或替代項彼此具排他性 ，申請專利範圍中所使用之“或”一詞係指“和/或”， 雖然該揭露內容係支持僅指該替代項及“和/或”之定義 0 除非另外明確描示，本專利說明書中所使用之“一（ a) ”或“一（an) ”可能意指一或多個。在此處之申請 專利範圍中，當與“包含”一詞一起使用時，“ 一（a ) ”或“ 一（an ) ”等字可能意指一或超過—個。此處所使 用之“另一”可能意指至少有第二項或更多項。 此文中’當參考本發明使用 包含（comprises) /包 含（comprising ) ”等字及“具有（having )/包括（ i n c U d i n g ) ”等字時係用於具體指明所陳述之特性、整體 -128- 201233685 、步驟或組分之存在，但不排除存有或加入一或多種其他 特性、整體、步驟、組分或其群組。 -129- 201233685 在401C下 4遇後之 酸物種 34.3 40.2 32.0 34.7 34.0 38.2 33.1 34.4 34.5 32.8 35.9 31.9 36.2 膽種 (液龅 31.1 31.8 31.8 32.3 32.1 31.3 31.9 31.5 I 32.9 32.4 32.0 32.2 31.4 %HMWS 在40TC下 4週後 魄乾） 卜 σ> 卜 对· (Ο in 卜· 卜 1〇 σ> (Ο CO l〇 卜 cd 00 — CO in oq — σ> %HMWS 在25*C下 9迓後 mm 卜 CO ρ — 卜 co σ> C0 — ο ιη 5 l〇 ο ιό in — (Ο %HMWS 在25r下 2週後 (液勸 CM 25.2 oq 16.8 15.7 23.5 16.7 17.8 15.6 13.1 16.7 CO r*^ 19.2 %HMWS 起始 (液S) CM ιή σ> in c>J ΙΛ CO 00 卜i CO CO 卜 σ> σι ΙΟ σ) 卜 cd CO 寸 CO L-Met 奄克/¾升 ιΗ Ο tH d rH d T-* d 0.05 0.05 tH Ο rH d 0.05 o fH d «Η 〇 ιΗ Ο EDTA 毫克/¾升 0.05 0.05 0.05 0.05 0.025 0.025 0.05 1 0.05 0.025 0.05 0.05 0.05 0.05 表面活性劑 0.5毫躺升 PS20 0.5毫克/¾升 PS20 0.S毫贼升 PS20 0_5毫克/毫升 PS20 0.2S毫克/毫升 PS20 0.25毫舰升 PS20 0.25¾克/毫升 PS20 0·4毫躺升 波洛沙姆1 88 0_25毫躺升 PS20 0.5毫克/毫升 PS20 0.5毫獅升 PS20 0.5毫克/毫升 PS20 0.5毫规升 PS20 雔 1 Ιι 〇 @ σ» 女爷 逆II KSP® 〇艇 σν <n m ιι 普1 σ» 1 畑1想 〇擗 σ> S ιι 裔费 畑i 容娣 ttf I 避 1 Si {〇 棚i 〇 XS σ> ° β f g ύί 1 硗s w w 〇 « σ> 1 〇 Β σι fn 〇 B 1 i| 〇避 σ> ΙΓ» ΙΛ 00 00 00 00 00 00 00 令· 00 00 ΙΛ 緩衝劑 30 mM醋酸鹽 20 mM I 舰酸鹽 30 mM乳酸鹽 30 mM馬來酸鹽 30 mM馬來酸鹽 20 mM 號拍酸鹽 i i ΰ η % il 30 mM馬來酸鹽 m 枨S Σ E ε 〇 30 mM醋酸鹽 20 mM 墟拍酸鹽 30 mM醋酸鹽 20 mM _腿 〇 < CO ο 〇 UJ X - J 20 毫克/¾升 Κ 20 毫躺升 j Έ 瘛 it 騮豳^¥^«^o63T--v-HVI.c\Ju.od-n-qvs« -130- 201233685 I在401C下 :2週後之 %Fiag 1 S 々· rH IN r>i Γ0 «-i 0_8d 12.4 ΓΜ fN ο r>i <N (N IN 10.9 起始之 %Frag rsi 卜 fv rH 0 01 卜 rH 卜 Ο ΓΝ Ρ». rA 〇 (N 卜 r-i 在40X：下 4週後之 %酸物S 40.4 1 40.4 40.3 1 o 39.5 39.3 40.3 1 起始時之 罐物種 38Λ 38.2 38.5 39.1 38.9 39.1 38.6 38.5 40.4 40.2 39.7 在401下 4遇後之 96HMWS CM ΙΛ in • rH uS <S uS ΓΜ VO tH ΙΛ 在251下 8週後之 %HMW ΙΛ uS 卜 00 σ> uS m σΐ m uS 卜 00 ΓΟ ΙΛ ① ui r- ΙΛ fN in u c 在40TC下 2週後之 %HMWS 呀 ι/ί 14.1 VO ΙΛ VO 々 uS 13.5 〇> i/i ΙΛ uS 呀 li) ΓΜ t/i 13.5 起始之 ；%HMWS 1/) uS L〇 ι/i 00 uS 00 uS in uS ΙΛ ΙΛ 灯 uS 00 uS PO uS i/i ο CT 〇 o* 〇 σ o o o o ΞΤ σ 賦形劑 逵s ίπ · Μ 趙 i 1 .坦 e < 1 nil § d d ί^1 - m 鬆 d <n . 兮趙 M 乂埋 i^S >t； ϊ®ρ S R 1111 cn d d fii f S 1? - L蜃 iis 1» UJ _ S§dW Is «S3 J» UJ ^ 未炒ft «/> i_ σι d d i3i 1。： rf j 海;ί i 嫌i S 3 ]g LU till i® gW| S d o tSP - ΙΛ 髟 d <π 、 爷 趣 11 . m 細 Ρ二。 pli S d d )3? <Π II § o 铤S ϋ £ 囊囊 <n 11 辟〇 m § m £ 囊裏 O ^ σι o 1 II 海 m S m 2 dr i% o ^ cn o I 爷 II S o m S m s dr朱 1¾ w® § d i II is m s dr朱 囊溪 w·» § 5 00 c〇 t/i in m <S\ < 00 守· 〇o 00 00 '«t 00 々· 緩衝劑 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 15 mM 乳酸 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 30 mM 乳酸 | 30 mM 乳酸 蛋白質 25度 玆躺升 o a o o o 〇 ο S o o o 〇 < C〇 u Q UJ u. ο X —** 蘊暫0^豳^马^顴鉍騮豳®^:齪ii^o6CNl.v-Hvl.3ll.9LL-n-qv 寸Z 谳 □ 131 - 201233685 【圖式簡單說明】 第1圖.m38c2、h38c2及人類種系之可變區的胺基酸 序列比對。框構區（FR )及CDR係根據Kabat等人的定 義。星號標記區分m38c2與h38c2或h38c2與人類種系之 間的差異。 第2A、2B和2C圖·以與連接子-1 ( L_1 )共軛結合 之Ab-FGF21AH-A129C所進行之單劑量小鼠藥物動力學硏 究與以L-2、L-3或L-4所進行之硏究的比較。經由IV或 SC投予年輕成年雄性瑞士韋伯斯特（Swiss-Webster)小 鼠3毫克/公斤之劑量。在所有案例中，在半衰期（L- 1結 合物之SC及IV半衰期~33小時，L-2、L-3或L-4結合物 之SC半衰期爲13-23小時，IV半衰期爲22-37小時）及 /或SC生體可利用率方面（L-1結合物爲~l〇〇%，L-2、 L-3或L-4結合物爲約48-53%)，具L-1之結合物有較 佳之性能。 第3A圖.以與L-1共軛結合之Ab-FGF21AH-A129C 所進行之單劑量大鼠藥物動力學硏究與以L-2所進行之硏 究的比較。經由IV或SC投予成年雄性Sprague Dawley 大鼠3毫克/公斤之劑量。在兩種投服途徑中，在半衰期 (L-1結合物之SC半衰期爲〜39小時且IV半衰期爲〜60 小時，L-2結合物之SC半衰期爲〜33小時且IV半衰期爲 〜52小時）及SC生體可利用率方面（L-1結合物爲~52% ’ L-2結合物爲36% )具L-1之結合物相較於L2有較佳 之性肯巨 β 第 3Β 圖· Ab-Ll-FGF21 △ H-D79C、 Ab-L7- -132- 201233685 FGF21AH-D79C R Ab - L 8 - F G F 2 1 Δ H - D 7 9 C ^ PK 的比較。 第4A及4B圖·在投予單一 SC劑量之ob/ob小鼠中 進行口服葡萄糖耐量試驗（0GTT )期間之葡萄糖曲線下 面積（AUC )(平均葡萄糖AUC ( %載劑對照組）在中括 號中）：載劑[100]、FGF21AH ( 1毫克/公斤[74])、 FGF21AH ( 0.6毫克/公斤[1 0 3 ])(爲了清楚起見未顯示 於第 4B 圖）、Ab-FGF21AH-H125C ( 3 毫克 / 公斤[66]及 1毫克/公斤[87])(與L1共軛結合）、
Ab-FGF21AH-K59 ( 3毫克/公斤[1 〇 5 ])(與L 5共軛結合 )、Ab-FGF21AH-Knull-H1K ( 3 毫克/公斤[100])(與 L5 共軛結合）' 精瘦對照組[56]。藉由單向ANOVA分析， 相對於 PBS，·Ρ <0.05，“P <0.01。 第5Α和5Β圖.在投予單一SC劑量之ob/ob小鼠中 進行0GTT期間之累積體重（A)及肝臓重量（B)變化 (平均體重（克）在中括號中，平均肝臟重量（克）在大 括號中）：載劑[2_6] {2.4}、FGF21AH(1毫克/公斤 [2.5] {2.2}) 、FGF21AH(0.6 毫克 / 公斤[3.2] {2.4})、
Ab-FGF21AH-A129C(3 毫克 / 公斤[1.7] {2.0})(與 L1 共 軛結合）、八1)-?0?21八11-反59(3毫克/公斤[2.7] {2.4}) (與 L5 共軛結合）、Ab-FGF21AH-Knull-H1K ( 3 毫克 /公 斤[2_6] {2.4})(與L5共軛結合）、精瘦對照組[0.6] {1.0}。藉由雙向ANOVA(A)及單向 ANOVA(B)分析 ，相對於 PBS，*P <0.05，“P <0.01。 第6A圖.在投予單一劑量之ob/ob小鼠中之累積體 -133- 201233685 重變化（平均體重（克）在中括號中）：載劑Π.7]、 FGF21AH [1.9] ' FGF21 Δ H-D79C ( 2 毫克 / 公斤[2.1])、 Ab-FGF21AH-D79C(10 毫克 / 公斤[1.4])、 Ab-FGF21AH-H125C(10 毫克 / 公斤[0.8])及 Ab-FGF21AH-A129C ( 10 毫克 / 公斤[0.9])、精瘦載劑 [0.6]。d0:第0天。所有Ab結合物均使用L1。藉由雙向 AN OVA 分析，相對於 PBS，“P <0.01。 第 6B圖.在投予單一劑量之 ob/ob小鼠中進行 OGTT期間之葡萄糖AUC (平均葡萄糖AUC%在中括號中 ):載齊 lj[100] ， FGF2 1 ΔΗ [63]， A b - F G F 2 1 Δ Η - D 7 9 C ( 2 毫克/公斤[86])，？〇[21么11-〇79(：(10毫克/毫升[54])， Ab-FGF21AH-H125C(10 毫克 / 毫升[51])及 Ab-FGF21AH-A129C ( 10毫克/公斤[54])，精瘦對照組 [48]。所有Ab結合物均使用L1。藉由單向AN OVA分析 ，相對於載劑，〃P <0.01。 第 6C 圖·在投予 FGF21AH 及 Ab-FGF21AH-D79C 劑 量（10毫克/公斤）之ob/ob小鼠中進行OGTT期間的葡 萄糖AUC。Ab-FGF21AH-D79C係與連接子-1共軛結合。 相對於載劑，〃P <0.01。 第6D圖·在第6天投服FGF21AH及Ab-FGF21AH-D79C劑量（1〇毫克/公斤）之ob/ob小鼠中於進行OGTT 期間之葡萄糖AUC。Ab-FGF2lAH-D79C係與連接子-1共 轭結合。相對於 ob/ob-PBS，·*Ρ <0.01。 第6Ε圖·在第Ο、〗、]或3天投服單一 -134- 201233685
Ab-FGF21AH-A129C齊!1量（3毫克/公斤）之〇b/ob小鼠中 於d6進行OGTT期間之葡萄糖AUC。Ab-FGF21AH-A129C 係與L1共軛結合。藉由單向ANOVA分析，相對於PBS ，*P <0.05，…P <0.001。 圖6F.單一劑量之Ab-FGF21AH-A129C(10毫克/公 斤）增加〇b/ob小鼠之白色脂肪組織中之Ucpl表現。Ab-FGF2 1 ΔΗ-Α129(：係與L1共軛結合。 第6G圖.單一劑量之Ab-FGF21AH-A129C ( 10毫克/ 公斤）降低 〇b/ob小鼠中之肝臟三酸甘油酯。Ab-FGF21AH-A129C係與L1共軛結合。藉由單向ΑΝ Ο V A分 析，相對於載劑，·Ρ <0.05，<0.001。 第6H圖·在第0、1、2或3天投服單一劑量之八1>-FGF21AH-A129C ( 10毫克/公斤）的〇b/ob小鼠中之累積 體重變化。Ab-FGF21AH-A129C係與L1共軛結合。 第7A圖.重複投服Ab-FGF21AH-A129C之劑量（第 0及7天，10毫克/公斤）提高DIO小鼠中之葡萄糖耐量 。0GTT 係在第 1〇 天進行 ^ Ab-FGF21AH-A129C 係與 L1 共軛結合。藉由單向 ANOVA分析，相對於載劑， <0.05，”P <0.01，…p <0.001。 第7B圖·在第 0及7天投服二個 Ab-FGF21AH-A129C ( 10毫克/公斤）劑量的DIO小鼠中之累積體重變 化。Ab-FGF21AH-A129C係與L1共軛結合。藉由雙向 ANOVA分析，相對於載劑，*P <0.〇5 〇 第7C圖.重複投服Ab-FGF21 △ H-A129C劑量（10 -135- 201233685 毫克/公斤）增加DIO小鼠之白色脂肪組織中之Ucpl表現 。藉由單向ANOVA分析，相對於載劑，〃P<0.01。 第7D圖.Ab-FGF21AH-A129C降低DIO小鼠中之血 清三酸甘油酯（10毫克/公斤）。第7E圖. Ab-FGF2lAH-A129C降低DIO小鼠中之血清非酯化脂肪酸 (10毫克/公斤）。第7F圖.Ab-FGF21AH-A129C肝重量 。Ab-FGF21AH-A129C係與 L1 共軛結合。藉由單向 ANOVA分析，相對於載劑（A、B )、相對於PBS ( C ) ，*P <0.05，*·Ρ <0.01，…p <0.001 〇 第 7G、7Η、7i 圖· Ab-FGF21AH-A129C 對 ob/ob 小鼠 中肝臓基因表現的影響。（7G) SCD1:硬脂醯-Co A脫 氫酶1，（7H)MOGAT2:單醯基甘油醯基轉移酶2(7i )FoxA2:叉頭轉錄因子 A2。Ab-FGF21AH-A129C 係與 L1共軛結合。藉由單向AN OVA分析，相對於載劑，·_P <0.01 〇 第7J、7K圖·投予〇b/〇b小鼠10毫克/公斤之Ab-L1-FGF21AH-A129C 劑量（7J)及 3 毫克 / 公斤之 Ab-Ll-FGF2 1AH-A129C劑量（7K)後之劑量相關血清量。 第8A圖.在高胰島素正常血糖鉗夾全部期間之血糖 量。第8B圖.在高胰島素正常血糖鉗夾全部期間之葡萄 糖輸注速率。第8C圖·在基期及鉗夾條件下之肝葡萄糖 產製（··· =p <0.0001 )。 第 9A-E 及 9H-9P 圖·數値代表 Ab-Ll-FGF21AH-A129 C ’ 1·5毫克/公斤及FGF21AH (對照組蛋白質）（ -136- 201233685 n= 5) 、Ab-Ll-FGF21AH-A129C，0.15 毫克 / 公斤及載劑 組（n = 6 )之平均値土SEM » 在以 Ab-Ll-FGF21AH-A129C 治療之組別中，計算在各個時點相對於載劑之顯著性。顯 著性値爲 a= p<0.05，b = p <0.01，c = p<0.005 且 d = p<0.001。Y軸顯示從基期開始之變化。 第9A圖· Ab-Ll-FGF2 1AH-A129C對體重的影響。 第9B圖· Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血糖的影響 〇 第9C圖· Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿胰島素 的影響。 第9D圖· Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿果糖胺 的影響。 第9E圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿升糖素 的影響。 第9F圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對靜脈內葡萄糖耐 量試驗（IVGTT ) ΔΑυ(：葡萄糖的影響。數値代表平均 △ AUC土SEM。以Dunnetts事後檢定，藉由單向方差分析 (ANOVA)評估以 Ab-Ll-FGF2 1AH-A129C 0.1 5 毫克/公 斤及1 .5毫克/公斤治療之組別相對於載劑之統計顯著性 。以Dunnetts事後檢定，藉由重複測量ANOVA來評估 FGF2 1 △ Η對照蛋白質組中經過之IVGTT時點處相對於基 期之統計學顯著性。 第 9G 圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C 對 IVGTTAAUC 胰 島素的影響。數値代表平均AAUC±SEM。以Dunnetts事 -137- 201233685 後檢定，藉由單向方差分析（ANOVA )評估以Ab-Ll-FGF21AH-A129C 0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤治療之組 別相對於載劑之統計顯著性。以Dunnetts事後檢定，藉 由重複測量ANOVA來評估FGF2 1AH對照蛋白質組中經 過之IVGTT時點處相對於基期之統計學顯著性。 第9H圖· Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿總膽固 醇的影響。 第9i圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿三酸甘 油酯的影響。 第9J圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿游離脂 肪酸的影響。 第9K圖· Ab-Ll_FGF21AH-A129C對空腹血漿低密度 脂蛋白膽固醇的影響。 第9L圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿總酮體 的影響。 第9M圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿脂聯素 (adiponectin )的影響。 第9N圖.Ab-Ll-FGF21z\H-A129C對空腹血漿C-反應 蛋白的影響。 第9〇圖· Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿瘦素的 影響。 第9P圖.Ab-Ll-FGF21AH-A129C對空腹血漿脂素的 影響。 -138- 201233685 序列表 <110> CovX Technologies Ireland Limited Pfizer Inc <120>抗糖尿病化合物 <130> PC71671 <150> US61/410,715 <151> 2010-11-05 <160> 33 <170> Patentln version 3.5 > > > > o 1 3 · 1 X 1 · · 2 22 2
<220> <221> MISC.FEATURE <222> (1)..(1) <223〉X = H或不存在 <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222> (146)..(146)
<223> X = L 或 P <400> 1
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin 50 55 60
He Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 201233685 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210〉 2 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400〉 2
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 320 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210〉 3 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 <220〉 <221> MISC.FEATURE <222> (1).. (1) <223> X = H或不存在 <220>
<221〉 MISC一FEATURE 201233685 <222〉 （79)..(79)
<223> X = D 或 C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(125)
<223> X = H 或 C <220> <22】> MISC一FEATURE <222> (129T..(129)
<223> X = A 或 C <220> <221> MISC.FEATURE <222> (146)..(146)
<223〉 X = P 或 L <400> 3
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Xaa Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro Xaa Arg Asp Pro 115 120 125
Xaa Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 4 <211> 181 <212〉 PRT <213>現代人 <220〉 201233685 <221> MISC.FEATURE <222> (1).. (1) <223> X = Η或不存在 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (1251..(125) <223> X = C 或 Η <220> <221> MISC FEATURE <222> (129)..(129)
<223> X = A 或 C <220> <221> MISC.FEATURE <222> (1467..(146)
<223> X = L 或 P <400> 4
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro Xaa Arg Asp Pro 115 120 125
Xaa Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 5 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 201233685 <220> <221〉 MISC一FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = Η或不存在 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (146)..(146)
<223> X = L 或 P <400> 5
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu He Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65' 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro Cys Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 365 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210〉 6 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400〉 6
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 a 201233685
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro Cys Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Leu Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 7 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 7
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 201233685
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro Cys Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 8 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 <220〉 <221> MISC.FEATURE <222〉 （ 1).. (1) <223> X = H或不存在 <220> <221> misc.feature <222> (146)..(146) <223> Xaa可爲任何天然胺基酸 <400> 8
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Cys Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 201233685 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210〉 9 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400〉 9
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Cys 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Leu Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 20 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 10
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15 201233685
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu He Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Cys 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 11 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 <220> <221> MISC.FEATORE <222> (1) ·. (1) <223> X = H或不存在 <220> <221> MISC_FEATTJRE <222> (146)..(146)
<223> X = P 或 L <400> 11
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45 201233685
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Cys Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 12 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 12
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Cys Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 • 10 - 201233685
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 13 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 13
Pro He Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Cys Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Leu Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180
<210〉 14 <211> 180 <212> PRT -11 - 201233685 <213>現代人 <400〉 14
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Cys His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 15 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 15
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Cys Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60 -12 · 201233685
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 16 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 <400> 16
Cys Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 -13 - 201233685
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 17 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 <220〉 <221> MISC.FEATURH <222> (1).. (1) <223> X = H或不存在 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (56)..(56)
<223> X = I(或 R <220> <221> MISC.FEATURE <222> (59)..(59)
<223> X = K 或 R <220>
<221> MISC.FEATURE <222> (1221..(122)
<223> X = K 或 R <220> <221> MISC.FEATURE <222> (1461..(146)
<223> X = L 或 P <400> 17
Xaa Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Xaa Ala Leu Xaa Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Xaa Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 -14 - 201233685
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210〉 18 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 18
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Arg Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 19 <211> 180 -15 - 201233685 <212> PRT <213>現代人 <400> 19
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Arg Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210〉 20 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 20
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 1- 5 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60 16 - 201233685
Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 21 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 21
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 -17 - 201233685
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 22 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 22
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 23 <211> 181 <212> PRT <213>現代人 <400> 23 -18 - 201233685
Lys Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val 15 10 15
Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His 20 25 30
Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val lie Gin 50 55 60 lie Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His 100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val 145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 24 <211> 180 <212> PRT <213>現代人 <400> 24
Pro lie Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg 15 10 15
Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu 20 25 30
Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro 35 40 45
Glu Ser Leu Leu Gin Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val lie Gin lie 50 55 60
Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 -19 - 201233685
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly 100 105 110
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140
Pro Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro 165 170 175
Ser Tyr Ala Lys 180 <210> 25 <211> 219 <212> PRT <213>現代人 <400> 25
Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Thr 20 25 30
Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gin Gly 85 90 95
Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 • 20 · 201233685
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <2I0> 26 <211> 448 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 26
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Glu lie Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95
Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 -21 - 201233685
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg 245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 丁yr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213>現代人 <400> 27
Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Thr 20 25 30 • 22 - 201233685
Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gin Gly 85 90 95
Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 28 <211> 118 <212> PRT <213>現代人 <400〉28
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Glu lie Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95
Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr loo 105 no
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213>小鼠 <400> 29
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Arg Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Thr 20 25 30
Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser -23 - 201233685 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Gly 85 90 95
Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 30 <211> 118 <212> PRT <213〉小鼠 <400> 30
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Thr Met Lys Leu Ser Cys Glu lie Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Glu lie Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95
Tyr Cys Lys Tyr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210〉 31 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>胺基酸連接子 <400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 32 <211> 28 <212> PRT -24 - 201233685 <213>現代人 <400> 32
Met Asn Ser Asn Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 15 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala 20 25 <210〉 33 <211〉 209 <212> PRT <213>現代人 <400〉 33
Met Asn Ser Asn Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 15 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro lie Pro 20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr 35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu lie Arg 50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie Leu Gly Val 85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175
Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205
Ser -25 -

Claims (1)

  1. 201233685 七、申請專利範圍： 1. 一種組成物，其包含經由連接子共價連接抗體之 結合部位或彼之抗原結合部分的FGF21分子。 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該連接子 係透過根據 SEQ ID NO: 1編號之胺基酸位置79' 125或 129處的連接殘基側鏈共價連接FGF21分子。 3. 如申請專利範圍第2項之組成物，其中殘基129 爲半胱胺酸且該連接子係共價連接半胱胺酸1 29的锍基。 4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該連接子 包含式X-Y-Z ;其中X爲包括任何選自C、H、N、0、p 、S、F、Cl、Br或I之原子的生物相容連接鏈，並可能包 含聚合物或嵌段共聚物，且係共價連接其中該連接子爲線 性之連接殘基，Y爲可選擇地存在之包含至少一個環狀構 造的識別基；且Z爲連接部分，其包含連接至抗體之結合 部位中之胺基酸側鏈的共價鍵聯。 5. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中γ具有可 選擇地經取代之構造：
    其中a、b、c、d及e各自獨地爲碳或氮；f爲碳、 氮、氧或硫。 6. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中γ爲苯基 〇 7. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中當共價連 接抗體時Z具有下式 201233685
    ，且q = 1或2 β 8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中q = 2。 9. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中X爲包含 三種組分之基團：Xp-Xs-Xy，其中Xp爲經特異改造成可 與FGF2 1蛋白質之連接殘基的側鏈組合的基團，Xs爲X 基團的間隔子區，且Xy爲經改造成可與Y基團結合的基 團。 10. 如申請專利範圍第9項之組成物，其中Xy係選 自醯胺鍵、烯胺鍵或觚鍵。 11. 如申請專利範圍第1 0項之組成物’其中xy具有 下式： l_Vx 〇 〇 12.如申請專利範圍第9項之組成物，其中Xp包含 下式：
    13.如申請專利範圍第9項之組成物，其中Xs係選 自如下群組： 201233685
    其中 η = 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 且 m 存在或 不存在。 14.如申請專利範圍第9項之組成物，其中XS包含 下式=
    15.如申請專利範圍第1 4項之組成物，其包含下式
    其中該抗體爲連接抗體之結合部位的共價鍵聯，S-FGF21 爲連接該連接殘基之含巯基側鏈的共價鍵聯，n= 1或2、 3、4、5、6、7、8、9或10;且m存在或不存在。 16.如申請專利範圍第13項之組成物，其包含下式
    其中該抗體係共價連接其結合部位，S-FGF21爲連接該連 接殘基之含锍基側鏈的共價鍵聯，且1或2、3、4、5 、6、7、8、9 或 10° ' 3 - 201233685 1 7 ·如申請專利範圍第1 5項之組成物，其中η = 1、 2、3 或 4。 18 ‘ 專利範圍第17項之組成物，其包含下式
    其中該抗體係連接其結合部位且S-FGF21係連接該連接 殘基之含疏基側鏈。 1 9·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該連接子 係共價結合根據Kab at編號之該抗體重鏈的離胺酸93之 ε -胺基團》 20. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該抗體爲 全長抗體、Fab、Fab，、F(ab，）2、Fv、ds Fv、sc Fv、VH、 VL、微型雙功能抗體、包含來自h38c2或m38C2之VH及 VL結構區的小體或包含來自h38c2或m38C2之乂„及VL 結構區的全長抗體及選自如下群組之恆定區：UG1、IgG2 、IgG3 及 IgG4 且可爲 h38C2 IgGl。 21. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該抗體爲 醛縮酶抗體。 2 2 .如申請專利範圍第21項之組成物’其中該醛縮 酶抗體包含含有SEQ ID N0 : 27之VL區° 2 3.如申請專利範圍第22項之組成物’其中該醛縮 酶抗體包含含有SEQ ID N0 : 28之VH區。 2 4 .如申請專利範圍第2 3項之組成物’其中該醒縮 201233685 酶抗體包含含有SEQ ID NO: 25之輕鏈。 25·如申請專利範圍第24項之組成物，其中該醛縮 酶抗體包含含有SEQ ID NO: 26之重鏈。 26. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該FGF21 分子包含選自如下群組之序列：SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO 7、 SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14' SEQ ID NO ： 15 及 SEQ ID NO : 16。 27. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該FGF21 分子包含序列SEQ ID NO : 3。 2 8 ·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該FGF2 1 分子包含序列SEQ ID NO: 10。 29.如申請專利範圍第28項之組成物，其包含下式
    其中該抗體爲h38C2之結合部位並包含SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO : 26，且 S-FGF21 爲 SEQ ID NO: 1〇 之 Cysl29的含毓基側鏈。 30.如申請專利範圍第1項之組成物’其包含下式
    其中該抗體爲h38C2之結合部位並包含SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO : 26，且 S-FGF21 爲 SEQ ID NO : η 之 201233685 Cys 125的含锍基側鏈。 3 1.如申請專利範圍第1項之組成物，其包含下式
    其中該抗體爲h38C2之結合部位並包含SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO : 26，且 S-FGF21 爲 SEQ ID NO: 12 之 Cys79的含毓基側鏈。 32.—種包含FGF21分子的組成物，該FGF21分子 係共價連接位於根據SEQ ID NO: 1編號之第79、125或 129號殘基的連接殘基處之半衰期增加部分。 33 · —種組成物，其係選自如下群組：SEQ ID NO :3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、S EQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7、SEQ ID NO : 8 ' SEQ ID NO ： 9 ' SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO ： 11、SEQ ID NO : 12 及 SEQ ID NO ：13 = 34.—種組成物，其包含經由連接子共價連接抗體結 合部位的FGF21分子，其中該連接子係共價連接FGF21 內之連接殘基的側鏈形成共軛結合之蛋白質-抗體複合物 ，從而使該共軛結合之蛋白質-抗體複合物具有至少一種 下列特徵= (a )在小鼠模型中S C半衰期爲至少約3 0小時，及 (b)在Glutl Taqman分析中效力少於約4nM，且特 徵在於該共軛結合之蛋白質-抗體複合物具有下式： 201233685
    其中該抗體爲h38C2之結合部位並包含SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO : 26，且 S-FGF21 爲 SEQ ID NO : 7 之 Cysl25或SEQIDNO: 10之Cysl29的含锍基側鏈。 35. —種組成物，其包含經由連接子共價連接抗體結 合部位的FGF21分子，其中該連接子係共價連接FGF21 內之連接殘基的側鏈形成共軛結合之蛋白質-抗體複合物 ，從而使該共軛結合之蛋白質-抗體複合物具有至少一種 下列特徵： (a)在小鼠模型中SC注射後之血漿T1/2爲至少約 3 3小時， (b )在大鼠模型中SC注射後之血漿Τ1/2爲至少約 3 5小時， (c) 在靈長類動物模型中SC注射後之血漿Τ|/2爲至 少約4 5小時， (d) 在Glutl Taqman分析中效力少於約3ηΜ,且特 徵在於該共軛結合之蛋白質-抗體複合物具有下式：
    其中該抗體爲h38C2之結合部位並包含SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO : 26，且 S-FGF21 爲 SEQ ID NO : 1〇 之 Cys 129的含毓基側鏈。 36. —種醫藥組成物，其包含治療上有效量之如前述 201233685 申請專利範圍任一項中之化合物與藥學上可接受之載體之 組合物。 37. 如申請專利範圍第36項之醫藥組成物，其係用 於治療糖尿病、與糖尿病相關之病況、肥胖、血脂異常（ dyslipidemia )、高血壓、肝脂肪變性（hepatosteaotosis )或心血管疾病；或控制或降低體重量：或控制血糖控制 ;或增加胰島素分泌、高密度脂蛋白量或非酯化之游離脂 肪酸或脂素（adipsin )之量；或降低血糖、胰高血糖素、 三酸甘油酯、果糖胺、低密度膽固醇或C-反應蛋白之量。 38. —種如申請專利範圍第1-35項中任一項之組成 物或如申請專利範圍第36項之醫藥組成物於製備用於下 列者之藥品的用途：治療與糖尿病相關之病況、肥胖、血 脂異常、高血壓、肝脂肪變性或心血管疾病；或控制或降 低體重量；或控制血糖控制；或增加胰島素分泌、高密度 脂蛋白量或非酯化之游離脂肪酸量；或降低血糖、胰高血 糖素 '三酸甘油酯、果糖胺、低密度膽固醇或C-反應蛋白 之量。
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