KR20130086623A - 항-당뇨병 화합물 - Google Patents

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타팬 칸티 다스
타마라 샤퍼 호지
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Abstract

본 발명은, 링커를 통해 항체의 조합 부위(combining site)에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 제공하며, 이때 링커는 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착된다. 당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태를 예방 또는 치료하는 방법을 포함하여, 이러한 화합물의 다양한 용도가 제공된다.

Description

항-당뇨병 화합물{ANTI-DIABETIC COMPOUNDS}
본 발명은 인슐린 분비를 촉진하고 혈액 글루코스 수준을 저하시키는 신규 화합물, 및 이러한 화합물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
제II형 당뇨병은 당뇨병 중 가장 만연한 형태이다. 이러한 질환은 인슐린 저항성 및 췌장 β 세포 부전에 의해 야기되고, 이는 감소된 글루코스-자극 인슐린 분비를 초래한다. FGF 패밀리의 구성원인 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 21은 대사 조절인자로 확인되었고, 간 및 지방 조직에서 우선적으로 발현되며, 간 및 지방 조직과 같은 표적 세포 상의 FGFR1c 및 β-클로토(Klotho)로 구성된 세포 표면 수용체를 통해 이의 생물학적 활성을 발휘한다 (WO0136640, 및 WO0118172). 이러한 수용체 복합체는 세포질 신호전달을 유발하는 것으로, 그리고 Ras/MAP 키나제(kinase) 경로를 통해 GLUT1 발현을 상향-조절하는 것으로 생각된다. 전임상 환경에서 어떠한 명백한 유해 효과도 야기하지 않으면서 지속적인 글루코스 및 지질 제어를 제공하고 인슐린 감수성 및 β-세포 기능을 개선하는 이의 능력이 FGF21을 제2형 당뇨병 및 관련된 대사 장애에 대한 매력적인 치료제로 만들었다.
FGF21을 기초로 하는 치료법을 개발하기 위한 다수의 노력이 있었다. WO2006065582, WO2006028714, WO2006028595, 및 WO2005061712는 개별적인 아미노산 치환을 포함하는, FGF21의 뮤테인(mutein)에 관한 것이다. WO2006078463은 FGF21을 사용하여 심혈관 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. WO2005072769는 FGF21과 티아졸리딘디온의 조합물을 사용하여 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다. WO03059270은 FGF21을 투여하는 것을 포함하는, 위독하게 아픈 환자의 사망률을 감소시키는 방법에 관한 것이다. WO03011213은 FGF21을 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 및 비만을 치료하는 방법에 관한 것이다.
그러나, 이러한 제안된 치료법들 중 다수는 인간에서 FGF21의 생체내 반감기가 1.5시간 내지 2시간이라는 문제를 앓고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 일부 시도가 이루어졌다. WO2005091944, WO2006050247 및 WO2008121563에는 각각 라이신 또는 시스테인 잔기, 글리코실 기 및 비-천연 아미노산 잔기를 통해 PEG에 연결된 FGF21 분자가 개시되어 있다. WO2005113606에는 폴리글리신 링커를 사용하여 자신의 C-말단을 통해 알부민 및 면역글로불린 분자에 재조합에 의해 융합된 FGF21 분자가 기술되어 있다.
그러나, 단백질 접합체를 유용하고 비용-효과적인 제약으로 발달시키는 것은 다수의 유의하고, 종종 모순되는 난제를 나타낸다: 생체내 효율, 생체내 반감기, 시험관내 보관을 위한 안정성, 및 제작 용이성 및 효율 (접합 효율 및 특이성 포함) 사이에서 균형이 맞춰져야 한다. 일반적으로, 접합 프로세스가 당해 단백질의 원하는 생물학적 작용을 제거하지 않거나 또는 실질적으로 감소시키지 않는 것이 긴요하다. 기능에 요구되는 단백질-단백질 상호작용은 단백질의 다중 영역이 일제히 작용하는 것을 필요로 할 수 있고, 접합체가 근처에 존재하는 것으로 이들 중 임의의 것을 동요시키는 것은 활성 부위(들)를 방해하거나, 또는 3차 구조에 충분한 변경을 야기하여, 활성-부위 기능을 감소시킬 수 있다. 접합이 N' 또는 C' 말단을 통한 것이지 않는 한, 연결을 용이하게 하기 위한 내부 돌연변이가 요구될 수 있다. 이러한 돌연변이들은 단백질 구조 및 기능에 대한 예측할 수 없는 효과가 있을 수 있다. 따라서, 별법적인 FGF21-기반 치료제가 계속 요구된다.
본 명세서에서의 임의의 기술에 대한 참조는 참조된 기술이 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 임의의 문구 또는 제안을 승인하는 것이 아니며, 이를 승인하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
발명의 개요
본 발명은 링커를 통해 항체의 조합 부위(combining site)에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하고, 이때 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 있는 조성물에 관한 것이다.
연결 잔기는 시스테인 또는 라이신일 수 있다. 연결 잔기는 서열 1의 번호매김(numbering)에 따른 아미노산 잔기 번호 56, 59, 69, 79, 86, 122, 125 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 위치할 수 있다. 연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 아미노산 잔기 번호 56, 59, 86 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 위치할 수 있다. 연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 잔기 79, 125 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 위치할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열 1의 번호매김에 따른 잔기 번호 56, 59, 69, 79, 86, 122, 125 및/또는 129에 위치하는 연결 잔기에서 하나 이상의 반감기-증가 모이어티(moiety)에 공유결합으로 연결된 FGF21 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 1개의 반감기-증가 모이어티에 FGF21 분자가 공유결합으로 부착된다. 일부 측면에서, 잔기 번호 79, 125 및 129로 이루어진 군으로부터 연결 잔기가 선택된다. "반감기-증가 모이어티"라는 용어는 FGF21 분자에 연결되었을 때 FGF21 분자의 혈행 반감기를 증가시키고/시키거나 FGF21 분자의 신장 소거를 억제하거나 감소시키는 임의의 분자를 지칭한다. 반감기-증가 모이어티의 예로는 PEG, mPEG, 포스포릴콜린 함유 중합체, Fc 도메인, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, VL, 디아바디(diabody), 미니바디(minibody), 항체, 촉매 항체 (하기 논의됨), 단백질 (예컨대 알부민), 및 당업계에 공지된 기타 거대분자가 포함된다.
연결 잔기의 측쇄는 티올 기를 포함할 수 있다. 연결 잔기는 시스테인일 수 있다.
FGF21 분자는 서열 3을 포함할 수 있다. FGF21 분자는 서열 4를 포함할 수 있다. FGF21 분자는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 위치 125에 위치할 수 있다. FGF21 분자는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 서열은 서열 7이다.
연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 위치 129에 위치할 수 있다. FGF21 분자는 서열 3, 서열 4, 서열 8, 서열 9, 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 서열은 서열 10이다.
연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 위치 79에 위치할 수 있다. FGF21 분자는 서열 3, 서열 4, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 서열은 서열 13이다.
일부 실시양태에서, 연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 1, 2, 56, 59, 69, 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결 잔기는 서열 1의 번호매김에 따른 1, 2, 56, 59, 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 위치할 수 있다. 연결 잔기는 라이신일 수 있다. FGF21 분자는 서열 17을 포함할 수 있다. FGF21 분자는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
특정한 적절한 링커들이 US2009098130에 개시되어 있고, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 특히, 링커를 기술하는 일반식, 특정 링커 구조, 링커 합성, 및 X, Y 및 Z 기의 여러 요소의 조합 (문헌에서 구체적으로 및 일반적으로 기술된 바와 같음)에 관한 US2009098130의 측면들이 본원에 포함된다. 링커는 선형 또는 분지형일 수 있고, 임의로 하나 이상의 탄소환식 또는 복소환식 기를 포함한다. 링커 길이는 선형 원자의 개수의 관점에서 고찰될 수 있고, 이때 방향족 고리 등과 같은 고리형 모이어티는 고리 둘레의 가장 짧은 경로를 고려하여 계수된다. 일부 실시양태에서, 링커에 원자 5-15개, 다른 실시양태에서는 원자 15-30개, 또 다른 실시양태에서는 원자 30-50개, 또 다른 실시양태에서는 원자 50-100개, 또 다른 실시양태에서는 원자 100-200개의 선형 신장물이 있다. 기타 링커 고려사항에는 생성된 화합물의 물리적 또는 약동학 성질, 예컨대 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성 (어느 정도 안정적인 것뿐만 아니라 계획적인 분해), 강도, 가요성, 면역원성, 및 항체 결합의 조정, 미셀 또는 리포솜 내로 혼입되는 능력 등에 대한 효과가 포함된다.
본 발명의 일부 측면에서, 화합물은 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 연결된 링커를 포함한다. 링커는 화학식 X-Y-Z [상기 식에서, X는 C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 원자를 포함하는 생물학적으로 상용성인 연결 사슬이고, 중합체 또는 블록 공중합체를 포함할 수 있으며, 링커가 선형인 경우에 연결 잔기에 공유결합으로 부착되고, Y는 적어도 고리 구조를 포함하는 임의로 존재하는 인식 기이고, Z는 항체의 조합 부위 내의 아미노산 측쇄에 대한 공유결합 연결을 포함하는 부착 모이어티이다]를 포함할 수 있다.
존재하는 경우, Y는 임의 치환된 구조일 수 있다:
Figure pct00001
[상기 식에서, a, b, c, d, 및 e는 독립적으로 탄소 또는 질소이고; f는 탄소, 질소, 산소 또는 황이고; Y는 충분한 원자가의 임의의 2개의 고리 위치에서 X 및 Z에 독립적으로 부착되고; a, b, c, d, e, 또는 f 중 4개 이하가 동시에 질소이고, 바람직하게는 고리 구조 내의 a, b, c, d, 및 e가 각각 탄소이다]. 일부 측면에서, Y는 페닐일 수 있다. 어떠한 이론에도 제한되기를 원치 않지만, Z 기가 반응성 아미노산 측쇄와 반응할 수 있도록 Y 기가 반응성 기를 항체 조합 부위 내로 위치시키는 것을 보조할 수 있는 것으로 생각된다.
거대분자, 예컨대 항체, 단백질 또는 이의 단편과의 결합을 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 형성할 수 있는 반응성 기를 함유하도록 링커가 디자인될 수 있다. 특정 조합 부위에서의 반응성 잔기와의 사용에 대해 반응성 기가 선택된다. 예를 들어, 알돌라제(aldolase) 항체에 의한 변형에 대한 화학 모이어티는 케톤, 디케톤, 베타 락탐, 활성 에스테르 할로케톤, 락톤, 무수물, 말레이미드, 알파-할로아세트아미드, 시클로헥실 디케톤, 에폭시드, 알데히드, 아미딘, 구아니딘, 이민, 엔아민, 포스페이트, 포스포네이트, 에폭시드, 아지리딘, 티오에폭시드, 차폐 또는 보호된 디케톤 (예를 들어, 케탈), 락탐, 할로케톤, 알데히드 등일 수 있다. 본 발명의 펩티드를 링커와 연결시키는 본 발명의 실시양태에서, Z는 반응성 기이다.
일부 실시양태에서, Z는, 항체의 조합 부위 내의 잔기의 측쇄와의 접합 전에, 아지티디논, 디케톤, 아실 베타-락탐, 활성 에스테르, 할로케톤, 시클로헥실 디케톤 기, 알데히드, 말레이미드, 활성화된 알켄, 활성화된 알킨, 또는, 일반적으로는, 친핵성 또는 친전자성 치환에 대해 감수성인 이탈기를 포함하는 분자를 형성하도록 배열된 하나 이상의 C=O 기를 포함한다. 또 다른 기에는 락톤, 무수물, 알파-할로아세트아미드, 이민, 히드라지드, 또는 에폭시드가 포함될 수 있다. 항체의 조합 부위 내의 반응성 친핵성 기 (예를 들어, 라이신 또는 시스테인 측쇄)에 공유결합으로 결합할 수 있는 예시적인 링커 친전자성 반응성 기에는 아실 베타-락탐, 단순 디케톤, 숙신이미드 활성 에스테르, 말레이미드, 링커가 있는 할로아세트아미드, 할로케톤, 시클로헥실 디케톤, 알데히드, 아미딘, 구아니딘, 이민, 엔아민, 포스페이트, 포스포네이트, 에폭시드, 아지리딘, 티오에폭시드, 차폐 또는 보호된 디케톤 (예를 들어 케탈), 락탐, 술포네이트 등, 차폐된 C=O 기 예컨대 이민, 케탈, 아세탈, 및 임의의 기타 공지된 친전자성 기가 포함된다. 특정 실시양태에서, 반응성 기에는 아실 베타-락탐, 단순 디케톤, 숙신이미드 활성 에스테르, 말레이미드, 링커가 있는 할로아세트아미드, 할로케톤, 시클로헥실 디케톤, 또는 알데히드를 형성하도록 배열된 하나 이상의 C=O 기가 포함된다. Z는 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 아릴, 치환된 아릴알킬, 치환된 헤테로시클릴, 또는 치환된 헤테로시클릴알킬일 수 있고, 이때 1개 이상의 치환체는 1,3-디케톤 모이어티, 아실 베타-락탐, 활성 에스테르, 알파-할로케톤, 알데히드, 말레이미드, 락톤, 무수물, 알파-할로아세트아미드, 아민, 히드라지드, 또는 에폭시드이다. 본 발명의 펩티드에 증가된 반감기를 제공할 수 있는 거대분자 스캐폴드(scaffold)에 Z 기가 공유결합으로 연결될 수 있다. 존재하는 경우, Z 기는 항체의 조합 부위에 공유결합으로 연결될 수 있다.
일부 측면에서, 접합 (예를 들어, 항체의 조합 부위와의 접합) 전에, Z의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00002
[상기 식에서, q=0-5이다]. q는 1 또는 2일 수 있다. q는 1일 수 있다. 다른 측면에서, q는 2일 수 있다.
일부 측면에서, 항체 조합 부위와의 접합 후에, Z의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00003
[상기 식에서, q=0-5이고, 항체-N-은 항체의 조합 부위 내의 측쇄에 대한 공유 결합이다]. q는 1 또는 2일 수 있다. q는 1일 수 있다. 다른 측면에서, q는 2일 수 있다.
X는 3개의 성분 Xp-Xs-Xy를 포함하는 기일 수 있고, 이때 Xp는 FGF21 단백질의 연결 잔기의 측쇄와 조합가능하도록 특이적으로 개조된 기이고, Xs는 X 기의 스페이서 영역이고, Xy는 Y 기에 결합하도록 개조된 기이다. 일부 측면에서, Xy는 아미드 결합, 엔아민 결합, 또는 구아니디늄 결합으로부터 선택된다. Xy는 Y 기에 인접 (원자 2개 이내)한 수소 분자를 제공하도록 선택될 수 있다. 이론에 제한되기를 원치 않으면서, H 원자가, 특히 h38C2와 같은 촉매 항체의 결합 클레프트(cleft)의 소수성 주머니와 관련하여, H-결합 상호작용을 통해 소수성 주머니의 Y 기 인식을 보조할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 예를 들어, NH 기가 Y 기에 직접적으로 결합되도록 아미드 결합이 배향되어, NH 기의 H를 수소 결합에 제공할 수 있다. 별법적으로, 아미드의 C=O 기가 Y 기에 결합될 수 있고, 이때 NH 기의 H가 Y 기에 원자 2개 이하로 인접하지만, 여전히 H-결합에 이용가능하다. 일부 실시양태에서, Xy가 부재한다. 일부 실시양태에서, Xy 기의 화학식은 하기와 같다:
Figure pct00004
일부 측면에서, Xs가 임의의 과도하게 반응성인 기를 제공하지 않도록 Xs가 선택된다. 원자 2-15개 사이의 전체적인 X 기 길이를 제공하도록 Xs가 선택될 수 있다. 원자 2개 내지 10개 사이의 전체적인 X 기 길이를 제공하도록 Xs가 선택될 수 있다. 전체적인 X 기 길이가 원자 4-8개이도록 Xs가 선택될 수 있다. 전체적인 X 기 길이가 원자 5개이도록 Xs가 선택될 수 있다. 전체적인 X 기 길이가 원자 6개이도록 Xs가 선택될 수 있다. 일부 측면에서, Xs는 하기 화학식 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00005
[상기 식에서, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고, m은 존재하거나 부재한다]; n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다; n은 1, 2, 3, 또는 4일 수 있다; n은 1일 수 있다; n은 2일 수 있다; n은 3일 수 있다; n은 4일 수 있다.
일부 측면에서, Xs는 하기 화학식 중 하나를 포함한다:
Figure pct00006
Xp는, 이상적으로는, FGF21 단백질의 연결 잔기에 대한 특이적인 지향성 공유결합 연결 전략이 가능하도록 선택된다. 예를 들어, 연결 잔기가 친핵성 기를 포함하는 경우에, Xp가 친전자성 기일 수 있고, 반대일 수도 있다. 예를 들어, 연결 잔기 측쇄가 아민 기, 예컨대 K, H, Y, 오르니틴, Dap, 또는 Dab를 포함하는 경우, Xp는 COOH, 또는 다른 유사하게 반응성인 친전자체일 수 있다. 연결 잔기가 D 또는 E이면, Xp가 친핵성 기, 예컨대 아민 기를 포함할 수 있다. 이러한 전략 중 하나는 아미드 결합 형성 전략에 의해 Xp 기와 연결 잔기 사이에 공유 결합이 형성되도록 허용한다. 연결 기가 아민 기인 경우, Xp는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00007
연결 잔기가 C, C의 상동체, 또는 기타 티올 기 함유 잔기인 경우, Xp는 말레이미드 기 (또는 유사물)를 포함하여, 티올-말레이미드 부가 반응 전략이 Xp 기를 연결 잔기에 공유결합으로 연결시키는 것을 허용할 수 있다. 일부 측면에서, Xp는 티올 기를 또한 포함하여, 연결 잔기와 Xp 기 사이에 디술피드 다리가 형성되게 할 수 있다. 일부 측면에서, Xp는 말레이미드일 수 있다:
Figure pct00008
[상기 식에서, 화살표는 FGF21 연결 잔기에 대한 부착 지점을 가리키고, 평행선은 링커의 Y 기에 대한 부착을 나타낸다]. FGF21 연결 잔기가 시스테인 잔기, 또는 기타 티올 함유 측쇄인 경우, 접합 메커니즘은 하기와 같을 수 있다:
Figure pct00009
일부 측면에서, Xp 기는 치환된 말레이미드를 포함한다:
Figure pct00010
일부 측면에서, 접합 전 및 접합 후의 링커의 XY 성분은 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00011
성분 XY-1, XY-2, XY-3, 및 XY-4는 FGF21 분자 상의 티올-기 함유 측쇄에 접합시키는 실시양태에서 특히 유용하다.
일부 실시양태에서, 링커는 링커-1 (L1)일 수 있다:
Figure pct00012
L1
L1이 항체에 접합되는 경우에, 항체-L1 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00013
Ab-L1
L1이 FGF21 분자에 접합되는 경우에, L1-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00014
L1-FGF21
L1이 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L1-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00015
Ab-L1-FGF21
일부 실시양태에서, 링커는 링커-2 (L2)일 수 있다:
Figure pct00016
L2
L2가 항체에 접합되는 경우에, 항체-L2 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00017
Ab-L2
L2가 FGF21 분자에 접합되는 경우에, L2-FGF21 복합체는 하기 화학식 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00018
L2-FGF21
Figure pct00019
L2-FGF21
L2가 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L2-FGF21 복합체는 하기 화학식 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00020
Ab-L2-FGF21
일부 실시양태에서, 링커는 링커-3 (L3)일 수 있다:
Figure pct00021
L3
L3이 항체에 접합되는 경우에, 항체-L3 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00022
Ab-L3
L3이 FGF21 분자에 접합되는 경우에, L3-FGF21 복합체는 하기 화학식 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00023
L3-FGF21
L3이 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L3-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00024
Ab-L3-FGF21
일부 실시양태에서, 링커는 링커-4 (L4)일 수 있다:
Figure pct00025
L4
항체에 접합되는 경우에, 항체-L4 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00026
Ab-L4
FGF21 분자에 접합되는 경우에, L4-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00027
L4-FGF21
L4가 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L4-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00028
Ab-L4-FGF21
일부 실시양태에서, 링커는 링커-5 (L5)일 수 있다:
Figure pct00029
L5
L5가 항체에 접합되는 경우에, 항체-L5 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00030
Ab-L5
L5가 FGF21 분자에 접합되는 경우에, L5-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00031
L5-FGF21
L5가 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L5-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00032
Ab-L5-FGF21
일부 측면에서, 링커는 링커-6 (L6)일 수 있다:
Figure pct00033
L6
L6이 항체에 접합되는 경우에, 항체-L5 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00034
Ab-L6
L6이 FGF21 분자에 접합되는 경우에, L6-FGF21 복합체는 L5-FGF21에 대한 것과 동일한 화학식을 포함할 수 있다. 유사하게, L6이 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L6-FGF21 복합체는 Ab-L5-FGF21에 대한 것과 동일한 화학식을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 링커-7 (L7)일 수 있다:
Figure pct00035
L7
항체에 접합되는 경우에, 항체-L7 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00036
L7-FGF21
FGF21 분자에 접합되는 경우에, L7-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00037
Ab-L7
항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L7-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00038
Ab-L7-FGF21
일부 실시양태에서, 링커는 링커-8 (L8)일 수 있다:
Figure pct00039
L8
L8이 항체에 접합되는 경우에, 항체-L8 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00040
Ab-L8
L8이 FGF21 분자에 접합되는 경우에, L8-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00041
L8-FGF21
L8이 항체 및 FGF21 분자에 접합되는 경우에, 항체-L8-FGF21 복합체는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
Figure pct00042
Ab-L8-FGF21
일부 실시양태에서, Ab-링커-FGF21 접합체는 하기 화학식의 것일 수 있다:
Figure pct00043
[상기 식에서, 항체 조합 부위는 링커에 공유결합으로 연결되고, S-FGF21은 FGF21 분자 상의 티올-함유 측쇄에 대한 공유결합 연결이고, n=1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고 (n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다; n은 1일 수 있다; n은 2일 수 있다; n은 3일 수 있다; n은 4일 수 있다), m은 임의적이다]. M이 부재할 수 있다. M이 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, Ab-링커-FGF21 접합체는 하기 화학식의 것일 수 있다:
Figure pct00044
[상기 식에서, 항체 조합 부위는 링커에 공유결합으로 연결되고, S-FGF21은 FGF21 분자 상의 티올-함유 측쇄에 대한 공유결합 연결이고, n=1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다 (n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다; n은 1일 수 있다; n은 2일 수 있다; n은 3일 수 있다; n은 4일 수 있다)].
일부 실시양태에서, 조성물은 하기 화학식을 포함한다:
Figure pct00045
[상기 식에서, 항체는 항체의 조합 부위에 대한 공유결합 연결이고, S-FGF21은 FGF21 분자 상의 티올-함유 측쇄에 대한 공유결합 연결이다]. 일부 실시양태에서, FGF21 분자는 서열 10을 포함한다. 일부 실시양태에서, FGF21 분자는 서열 7을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 링커 및 링커 성분, 특히 본원에 기술된 X 기에 관한 것이지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 링커 또는 링커 기에 공유결합으로 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 링커 또는 링커 기는 추가적으로 펩티드 또는 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 링커 및 항체 링커 접합체의 유용성이 FGF21 분자와 함께 적용하는 것에 의해 한정되지 않는다는 것이 명백할 것이고, 상기 Ab-링커 접합체는 다른 펩티드, 단백질 및 치료 및 표적화 작용제와 접합될 수 있다. 이러한 목적을 위해, S-FGF21 및 NH-FGF21을 도해하는 본원에 기술된 것과 동일한 구조가 다른 단백질, 펩티드 및 치료 및 표적화 작용제에 적용되는 것으로 이해될 수 있다; 제시된 구조의 FGF21 명명법이 상기 단백질, 펩티드 또는 분자로 교체될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 링커를 제공한다:
Figure pct00046
[상기 식에서, n=1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다 (n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다; n는 1일 수 있다; n은 2일 수 있다; n은 3일 수 있다; n은 4일 수 있다). M은 부재할 수 있다. M은 존재할 수 있다].
일부 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 링커를 제공한다:
Figure pct00047
[상기 식에서, n=1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다 (n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다; n는 1일 수 있다; n은 2일 수 있다; n은 3일 수 있다; n은 4일 수 있다). M은 부재할 수 있다. M은 존재할 수 있다].
일부 실시양태에서, 본 발명은 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7 및 L8로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 본원에 기술된 다른 특정한 링커 화학식 및 일반적인 링커 화학식에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 상기 링커, 및 이의 항체-링커, 단백질-링커 또는 항체-링커-단백질 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 통해 항체의 조합 부위에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하고, 이때 접합된 단백질-항체 복합체의 피하 반감기가 뮤린(murine) 모델에서 약 20시간 이상이도록, 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 접합된 단백질-항체 복합체를 형성하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, SC 반감기는 약 25시간 이상이다. 일부 실시양태에서, SC 반감기는 약 30시간 이상이다. 일부 실시양태에서, SC 반감기는 약 33시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 래트 모델에서 SC 반감기는 약 35시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 래트 모델에서 SC 반감기는 약 36시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 영장류 모델에서 SC 반감기는 약 40시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 영장류 모델에서 SC 반감기는 약 45시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 뮤린 모델에서 IV 반감기가 약 28시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 래트 모델에서 IV 반감기가 약 55시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 래트 모델에서 IV 반감기가 약 55시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 래트 모델에서 IV 반감기가 약 60시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 영장류 모델에서 IV 반감기가 약 60시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 영장류 모델에서 IV 반감기가 약 65시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간에서 단일 용량 후의 IV 반감기가 약 30시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간에서 단일 용량 후의 IV 반감기가 약 35시간 이상인 접합된 항체-단백질 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 통해 항체의 조합 부위에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하고, 이때 접합된 단백질-항체 복합체의 피하 생체이용률이 뮤린 모델에서 약 50％ 이상이도록, 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 접합된 단백질-항체 복합체를 형성하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, SC 생체이용률은 약 55％ 이상이다. 일부 실시양태에서, SC 생체이용률은 약 65％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 래트 모델에서 SC 생체이용률은 약 50％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 영장류 모델에서 SC 생체이용률은 약 50％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 영장류 모델에서 SC 생체이용률은 약 60％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 영장류 모델에서 SC 생체이용률은 약 65％ 이상이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 통해 항체의 조합 부위에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하고, 이때 접합된 단백질-항체 복합체의 피하 생체이용률이 뮤린 모델에서 약 50％ 이상이도록, 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 접합된 단백질-항체 복합체를 형성하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, SC 생체이용률은 약 55％ 이상이다. 일부 실시양태에서, SC 생체이용률은 약 65％ 이상이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 통해 항체의 조합 부위에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하고, 이때 Glut1 태크만(Taqman) 검정에서 접합된 단백질-항체 복합체의 EC50 효능이 약 5 nM 미만이도록, 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 접합된 단백질-항체 복합체를 형성하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, Glut1 태크만 검정에서의 EC50 효능은 약 4 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, Glut1 태크만 검정에서의 EC50 효능은 약 3 nM 미만이다.
일부 실시양태에서, 접합된 단백질-항체 복합체는 2개 이상의 유리한 장점, 예컨대 SC 반감기, IV 반감기, 글루코스 섭취, 효능, 생체이용률, 제작 용이성, 접합 효율, 생체내 안정성, 시험관내 안정성, 가수분해에 대한 저항, 및 항체와 링커와 단백질 사이의 상용성을 조합시킨다.
항체
US2006205670의 내용, 특히 항체 기술의 요소들 중에서도, 항체, 이의 유용한 단편 및 변이체 및 변형, 조합 부위 및 CDR, 항체 제조, 발현, 인간화, 아미노산 변형, 글리코실화, ADCC, CDC, 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 것, 발현 벡터, 포유류 숙주 시스템, 및 폴딩(folding)을 설명하는 [0153]-[0233] 단락이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 경우에, "조합 부위" (항체 결합 부위(binding site)로 또한 공지됨)는 적합한 항원 (또는 구조적으로 유사한 단백질)의 결정인자와 조합되는 (또는 조합될 수 있는) 면역글로불린 또는 Ig 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로 이러한 용어는 항원 결합에서 수반되는 CDR 및 인접한 프레임워크 잔기를 포함한다.
본원에서 사용되는 경우에, "알돌라제 항체"는 (예를 들어 접합에 의해) 얽매이지 않은 경우에, 지방족 케톤 공여자(donor)와 알데히드 수용자(acceptor) 사이의 알돌 부가 반응을 촉매하는 조합 부위 부분을 함유하는 항체를 지칭한다. 알돌라제 항체는 면역-응답성 동물을 담체 단백질에 커플링된 하기 화학식:
Figure pct00048
의 1,3 디케톤 합텐을 포함하는 면역원으로 면역화시킴으로써 생성될 수 있고, 항체의 조합 부위 내에 반응성 ε-아미노 기가 있는 라이신이 있는 것을 추가로 특징으로 한다. 알돌라제 항체는 이의 촉매 활성이 1,3-디케톤 합텐과 촉매 항체의 라이신의 ε-아미노 기 사이의 복합체 형성에 의한 1,3-디케톤 합텐으로의 억제의 대상인 것을 추가로 특징으로 한다.
논의된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는 특정 항체는 항체 조합 부위 내의 반응성 측쇄를 필요로 할 수 있다. 반응성 측쇄는 자연적으로 존재할 수 있거나, 또는 돌연변이에 의해 항체 내에 놓일 수 있다. 항체 조합 부위의 반응성 잔기는, 예컨대 항체를 제조하는 것으로 처음으로 확인된 림프계 세포 내에 존재하는 핵산에 의해 잔기가 코딩되는 경우에, 항체와 회합될 수 있다. 별법적으로, 특정 잔기를 코딩하도록 DNA를 의도적으로 돌연변이시킴으로써 아미노산 잔기가 발생될 수 있다 (예를 들어 WO 01/22922). 반응성 잔기는 본원에서 논의된 바와 같이 독특한 코돈, tRNA, 및 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 혼입에 의해 예를 들어 발생되는 비-천연 잔기일 수 있다. 또 다른 접근법에서, 아미노산 잔기 또는 이의 반응성 관능기 (예를 들어, 친핵성 아미노 기 또는 술프히드릴 기)가 항체 조합 부위 내의 아미노산 잔기에 부착될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 경우에, "항체의 조합 부위 내의 아미노산 잔기를 통해" 일어나는 항체와의 공유결합 연결은 연결이 직접적으로 항체 조합 부위의 아미노산 잔기에 대한 것일 수 있거나 또는 항체 조합 부위의 아미노산 잔기의 측쇄에 연결된 화학 모이어티를 통한 것일 수 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 시스테인이고, 측쇄의 반응성 기는 술프히드릴 기이다. 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기는 라이신이고, 측쇄의 반응성 기는 ε-아미노 기이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 카바트(Kabat) 번호매김에 따른 중쇄 상의 Lys93이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 HC h38C2 (서열 26) 상의 Lys-99이다.
촉매 항체는 하나 이상의 반응성 아미노산 측쇄를 포함하는 적절한 조합 부위가 있는 항체의 한 공급원이다. 이같은 항체에는 알돌라제 항체, 베타 락타마제(lactamase) 항체, 에스테라제(esterase) 항체, 및 아미다제(amidase) 항체가 포함된다.
한 실시양태는 알돌라제 항체 예컨대 마우스 모노클로날 항체 mAb 33F12 및 mAb 38C2, 뿐만 아니라 적절하게는 이같은 항체의 키메라 및 인간화 버전 (예를 들어 h38C2, 서열 25 및 26)을 포함한다. 마우스 mAb 38C2 (및 h38C2)는 HCDR3에 인접하지만 HCDR3 바깥인 곳에 반응성 라이신이 있고, 반응성 면역화에 의해 생성되고 기계학적으로 천연 알돌라제 효소를 모방하는 새로운 촉매 항체 클래스의 원형(prototype)이다. 문헌 [C.F. Barbas 3rd et al., Science 278:2085-2092 (1997)] 참조. 사용될 수 있는 기타 알돌라제 촉매 항체에는 ATCC 접속 번호가 PTA-1015인, 하이브리도마(hybridoma) 85A2; ATCC 접속 번호가 PTA-1014인 하이브리도마 85C7; ATCC 접속 번호가 PTA-1017인 하이브리도마 92F9; ATCC 접속 번호가 PTA-823인 하이브리도마 93F3; ATCC 접속 번호가 PTA-824인 하이브리도마 84G3; ATCC 접속 번호가 PTA-1018인 하이브리도마 84G11; ATCC 접속 번호가 PTA-1019인 하이브리도마 84H9; ATCC 접속 번호가 PTA-825인 하이브리도마 85H6; ATCC 접속 번호가 PTA-1016인 하이브리도마 90G8에 의해 생산된 항체가 포함된다. 반응성 라이신을 통해, 이러한 항체들은 천연 알돌라제의 엔아민 메커니즘을 사용하여 알돌 및 역(retro)-알돌 반응을 촉매한다. 알돌라제 항체 및 알돌라제 항체의 생성 방법이 미국 특허 번호 6,210,938, 6,368,839, 6,326,176, 6,589,766, 5,985,626, 및 5,733,75에 개시되어 있고, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 화합물을 반응성 시스테인, 예컨대 티오에스테라제(thioesterase) 및 에스테라제(esterase) 촉매 항체의 조합 부위에서 발견되는 것에 연결시킴으로써 본 발명의 화합물이 또한 형성될 수 있다. 적절한 티오에스테라제 촉매 항체가 문헌 [K.D. Janda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2532-2536 (1994)]에 기술되어 있다. 적절한 에스테라제 항체가 문헌 [P. Wirsching et al., Science 270:1775-1782 (1995)]에 기술되어 있다. 반응성 아미노산을 코딩하도록 항체 조합 부위 잔기를 돌연변이시키는 것 또는 항체 조합 부위 내의 아미노산 측쇄를 반응성 기를 포함하는 링커로 화학적으로 유도체화시키는 것이 포함되는 당업계에 주지된 방법에 의해 반응성 아미노산-함유 항체를 제조할 수 있다.
항체는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명의 화합물이 항체의 조합 부위에 공유결합으로 연결되고, 이같은 항체가 인간화 항체인 경우, 이같은 항체가 Z기에 대한 높은 연결 친화력을 유지하면서 인간화되는 것이 중요하다. 다양한 형태의 인간화 뮤린 알돌라제 항체가 구상된다. 한 실시양태는 인간 불변 도메인 Cκ 및 Cγ11이 있는 인간화 알돌라제 촉매 항체 h38c2 IgG1 또는 h38c2 Fab를 사용한다. 문헌 [C. Rader et al., J. Mol. Bio. 332:889-899 (2003)]에는 h38c2 Fab 및 h38c2 IgG1을 생산하는데 사용될 수 있는 유전자 서열 및 벡터가 개시되어 있다. 인간 생식계열 Vk 유전자 DPK-9 및 인간 Jk 유전자 JK4가 m38c2의 카파 경쇄 가변 도메인의 인간화를 위한 프레임워크로서 사용되었고, 인간 생식계열 유전자 DP-47 및 인간 JH 유전자 JH4가 m38c2의 중쇄 가변 도메인의 인간화를 위한 프레임워크로서 사용되었다. 도 1은 m38c2, h38c2, 및 인간 생식계열에서의 가변 경쇄와 중쇄 사이의 서열 정렬을 나타낸다. h38c2는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 불변 도메인 (이의 임의의 동종이형(allotype))이 포함됨)을 이용할 수 있다. 항체가 G1m(f) 동종이형의 h38c2 IgG1인 본 발명의 화합물의 특정 실시양태에서, Z는 중쇄의 위치 99에서 라이신 잔기의 측쇄에 결합한다. 또 다른 실시양태는 h38c2의 가변 도메인 (VL 및 VH) (서열 27 및 28) 및 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 불변 도메인을 포함하는 키메라 항체를 사용한다. 이러한 항체는 h38c2로부터의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, VL, 디아바디, 또는 미니바디일 수 있다. 항체는 h38c2로부터의 VL 및 VH 도메인 및 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 도메인을 포함하는 항체일 수 있다. 항체는 h38C2 IgG1 (서열 25 및 26)일 수 있다. 항체는 인간 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 항체로부터의 불변 영역을 포함하는 뮤린 알돌라제 항체의 인간화 버전일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 뮤린 알돌라제 항체로부터의 VL 및 VH 영역 및 인간 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 항체로부터의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 m38C2로부터의 VL 및 VH 영역 (서열 29 및 30)을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 항체는 천연 또는 본래의 인간 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 항체로부터의 폴리펩티드 서열을 포함하는 뮤린 알돌라제 항체의 완전히 인간형인 버전이다.
다양한 형태의 인간화 알돌라제 항체 단편이 또한 구상된다. 한 실시양태는 h38c2 F(ab')2를 사용한다. h38c2 IgG1의 단백질분해성 소화에 의해 h38c2 F(ab')2가 생산될 수 있다. 또 다른 실시양태는 개입 링커 (Gly4Ser)3 (서열 31)에 의해 임의로 연결된, h38c2로부터의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 h38c2 scFv를 사용한다. 인간화에 대한 별법으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 (또는 촉매 항체의 경우 반응성 면역화) 시 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉(transgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다.
별법적으로, 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리를 사용하여 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하기 위해 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다. 상기 지시된 바와 같이, 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 인간 항체가 또한 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275).
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 구상된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내로 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 항체의 아미노산 서열 변이체가 제조된다. 이같은 변형에는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 이러한 서열 내로의 삽입, 및/또는 이러한 서열 내의 잔기의 치환이 포함된다. 최종 구축물이 원하는 특성을 갖는 한, 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는 항체의 번역후 프로세스를 또한 변경시킬 수 있고, 예컨대 글리코실화 부위의 개수 또는 위치를 변화시킨다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부분이 유도체화되거나 또는 또 다른 분자 (예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 유도체화 또는 표지화가 항체 조합 부위에 공유결합으로 접합되는 링커의 능력에 불리하게 영향을 미치지 않도록 항체 또는 이의 일부분이 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부분은 본원에 기술된 항체의 무손상 형태 및 변형 형태 양쪽 모두를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 일부분이 하나 이상의 다른 분자 엔티티(entity), 예컨대 또 다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항체 일부분이 또 다른 분자 (예컨대 스트렙타비딘 코어(core) 영역 또는 폴리히스티딘 태그(tag))와 회합되는 것을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비-공유결합 회합 등에 의해) 관능적으로 연결될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 융합 항체 또는 또 다른 폴리펩티드에 연결된 항체일 수 있다. 일부 측면에서, 항체의 가변 영역만 이러한 폴리펩티드에 연결된다. 일부 측면에서, 조합 부위의 결합 능력을 방해하지 않도록 하는 방식으로 항체가 펩티드에 공유결합으로 접합된다.
이러한 폴리펩티드는 치료제, 예컨대 표적화제, 펩티드, 단백질 작동제, 단백질 길항제, 대사 조절인자, 호르몬, 독소, 성장 인자 또는 기타 조절 단백질일 수 있거나, 또는 진단제, 예컨대 쉽게 가시화될 수 있는 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제(peroxidase)일 수 있다. 또한, 2개 (또는 이를 초과하는 개수)의 단일쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 2가 또는 다가 항체를 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 생성시키려는 경우에 또는 이중특이적 항체를 생성시키려는 경우에 유용하다.
2개 이상의 항체 (동일한 유형, 또는 예를 들어 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 상이한 유형)를 가교시킴으로써 유도체화 항체의 한 유형이 생산된다. 적절한 가교제에는 적합한 스페이서로 분리된 2개의 별개로 반응성인 기가 있는 이종2관능성인 것 (예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 또는 동종2관능성인 것 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트)가 포함된다.
또 다른 유형의 유도체화 항체는 표지된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항체 일부분이 이것으로 유도체화될 수 있는 유용한 검출제에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란타니드 포스포어 등이 포함되는 형광 화합물이 포함된다. 검출에 유용한 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 갈락토시다제(galactosidase), 루시퍼라제(luciferase), 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 글루코스 옥시다제(oxidase) 등으로 항체가 또한 표지될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 표지되는 경우, 식별될 수 있는 반응 생성물을 생산하기 위해 효소가 사용하는 추가적인 시약을 첨가하는 것에 의해 항체가 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 작용제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미도벤지딘의 첨가가 유색 반응 생성물에 이르고, 이것이 검출가능하다. 또한 항체가 비오틴으로 표지되고 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출될 수 있다. 자기 작용제, 예컨대 가돌리늄으로 항체가 표지될 수 있다. 2차 리포터 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 인식하는 미리 정해진 폴리펩티드 에피토프로 항체가 또한 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 표지가 부착되어 잠재적인 입체 장애를 감소시킨다.
화학 기 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기로 항체가 또한 유도체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특성을 개선하는데, 예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키는데 또는 조직 결합을 증가시키는데 유용할 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 조성물 및/또는 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물을 포함하는 작용제가 제제되어 전신에 투여될 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 제제 및 투여를 위한 기술을 확인할 수 있다.
주사를 위해, 본 발명의 조성물이 수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 또는 비-수성 용액, 현탁액, 에멀션, 분산액, 또는 무균성 주사 용액 또는 분산액 내로의 재구성에 적절한 멸균 분말 또는 동결건조물에서 제제될 수 있다. 적절한 수성 및 비-수성 희석제, 용매 및 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 이의 적절한 혼합물, 및 오일이 포함된다. 예를 들어, 코팅제 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 원하는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 유동성이 유지 또는 개선될 수 있다.
생리학적으로 상용성인 완충제 예컨대 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘 또는 포스페이트를 함유하는 수성 용액에서 본 발명의 조성물이 제제될 수 있다. 필요한 경우, 이같은 제제는 다양한 등장성 조정제, 가용화제 및/또는 안정화제 (예를 들어, 염 예컨대 염화나트륨, 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 및 트레할로스, 단백질 예컨대 알부민, 아미노산 예컨대 글리신 및 히스티딘, 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트 (트윈(Tween)), 또는 공용매 예컨대 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜)를 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 보조제, 예컨대 습윤화제, 유화 및 현탁 작용제, 분산제, 및 방부제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 현탁제, 예컨대 한천-한천, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 미세결정질 셀룰로스, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 및 트래거캔스, 또는 이들의 혼합물을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 또한 포함할 수 있다. 등장성 작용제, 예를 들어, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시킬 수 있는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써, 본 발명의 주사가능한 조성물의 장기 흡수가 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 오스몰농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착, 또는 투과를 변형시키거나, 유지시키거나, 또는 보존하기 위한 제제 물질을 함유할 수 있다. 적절한 제제 물질에는 아미노산 (예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 라이신), 항미생물제, 항산화제 (예컨대 L-메티오닌 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소나트륨), 완충제 (예컨대 소듐 아세테이트, 락테이트, 보레이트, 바이카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트, 또는 기타 유기산), 벌크화제(bulking agent) (예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이팅제 (예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), DPTA), 착화제 (예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물 (예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린), 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린), 착색, 풍미 및 희석 작용제, 유화제, 친수성 중합체 (예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염-형성 카운터이온 (예컨대 나트륨), 방부제 (예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매 (예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜 (예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤화제 (예컨대 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 티록사폴), 안정성 강화제 (예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 강화제 (예컨대 알칼리금속 할로겐화물 - 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨 - 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 제약 보조제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
제제 성분은 투여 부위에 대해 허용가능한 농도로 존재할 수 있다. 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로는 약 5 내지 약 8의 pH 범위에서 유지시키기 위해 완충제가 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 화합물이 화합물의 제어 또는 지속 방출용으로 제제되어 있는 본 발명의 제약 조성물이 제조될 수 있다. 예로는 히알루론산 등, 중합체성 겔, 비드, 입자, 주사가능한 마이크로스피어, 리포솜, 필름, 마이크로캡슐, 지속 방출 매트릭스, 및 이식가능한 약물 전달 장치가 포함된다.
일부 측면에서, 미리 충전된 단일- 또는 다중-챔버 주사기에서 본 발명의 제약 조성물이 제공된다.
일부 측면에서, 본 발명은 제약 조성물에서 사용하기에 적절한 하나 이상의 추가적인 성분과 함께 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 조성물을 환자에게 전달하기 위한 하나 이상의 수단과 함께 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
FGF21 분자를 링커에 공유결합으로 연결시키고, 링커를 다가 항체의 조합 부위에 접합시킴으로써 본 발명의 조성물을 합성할 수 있다. 예를 들어, 링커가 디케톤 또는 AZD (β-락탐) 반응성 모이어티를 포함하는 FGF21-링커 접합체를 0.5 당량의 알돌라제 항체 예컨대 h38C2 IgG1와 함께 인큐베이션하여 본 발명의 조성물을 생산할 수 있다.
사용 방법
인간에서의 치료적 사용을 위해, 인간, 인간화, 또는 인간 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본 발명의 화합물 또는 조성물의 항체 부분의 바람직한 항체 형태이다.
본 발명의 한 측면은 치료 유효량의 본 발명의 조성물을 당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태를 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인슐린 분비를 증가시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈액 글루코스 수준을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 비만을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 체중 수준을 제어하거나 감소시키는 방법이다 .
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 이상지질혈증을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 고혈압을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 지방간을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심혈관 질환을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 글루카곤 수준을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 트리글리세리드 수준을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 비-에스테르화 유리 지방산 수준을 증가시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 저밀도 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 C-반응성 단백질 수준을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 프룩토사민 수준을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈당 제어를 조절하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아딥신 수준을 증가시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 이의 제약 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 HDL 수준을 증가시키는 방법이다.
일부 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 화합물 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 관련 상태, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 지방간, 또는 심혈관 질환을 치료하거나; 또는 체중 수준을 제어 또는 감소시키거나; 또는 혈당 제어를 조절하거나; 또는 인슐린 분비, 또는 비-에스테르화 유리 지방산, HDL 또는 아딥신의 수준을 증가시키거나; 또는 혈액 글루코스, 글루카곤, 트리글리세리드, 프룩토사민, 저밀도 콜레스테롤, 또는 C-반응성 단백질의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 당뇨병 관련 상태, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 지방간, 또는 심혈관 질환을 치료하거나; 또는 체중 수준을 제어 또는 감소시키거나; 또는 혈당 제어를 조절하거나; 또는 인슐린 분비, HDL, 또는 비-에스테르화 유리 지방산 수준을 증가시키거나; 또는 혈액 글루코스, 글루카곤, 트리글리세리드, 프룩토사민, 저밀도 콜레스테롤, 또는 C-반응성 단백질의 수준을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 조성물 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본원에서 사용되는 경우에, "치료 유효 용량"이라는 용어는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화가 포함되는, 연구원, 의사 또는 기타 임상의가 추구하는 조직계, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의약적 응답을 유발하는 본 발명의 화합물, 조성물 또는 제약 조성물의 양을 의미한다.
투여 방법 및 투여량
본 발명의 조성물의 투여 경로는 근육내, SC 또는 골수내 주사가 포함되는 비경구 전달, 뿐만 아니라 경막내 전달, 직접적인 뇌실내 전달, IV 전달, 및 복막내 전달을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 투여이다. 본 발명의 조성물은 제제의 직접적인 주사에 의해 또는 본 발명의 조성물의 제제과 주입 매트릭스 예컨대 예컨대 생리식염수, D5W, 락테이트화 링거 용액 또는 기타 통상적으로 사용되는 주입 매질의 혼합물의 주입에 의해 비경구 경로 중 임의의 것을 통해 투여될 수 있다.
당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태 (또는 일부 측면에서는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 지방간, 심혈관 질환, 높은 혈액 글루코스, 낮은 인슐린 수준, 또는 본원에서 논의된 상태 중 임의의 것, 또는 본원에서 논의된 증상과 관련된 상태 중 하나 이상)에 걸린 동물 (인간 포함)을 치료하는 것에서, 치료 유효량의 본 발명의 조성물 또는 제약상 허용되는 유도체가 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 약 0.1 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 15 ㎎/체중 ㎏의 매일 IV 주입으로서 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태는 약 0.5 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 다른 실시양태는 약 0.75 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 다른 실시양태는 약 1.0 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 다른 실시양태는 약 2.5 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 다른 실시양태는 약 5 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 다른 실시양태는 약 10.0 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 다른 실시양태는 약 15.0 ㎎/체중 ㎏의 용량을 제공한다. 본 발명의 조성물 또는 제약상 허용되는 유도체의 용량은 하루에 약 1회 내지 주 당 2회, 또는 별법적으로는 매주 약 1회 내지 1개월 당 1회의 간격으로 투여되어야 한다. 일부 실시양태에서, 약 0.002 ㎎/㎖ 내지 30 ㎎/㎖의 본 발명에 따른 본 발명의 조성물 또는 이의 제약상 허용되는 유도체의 최고(peak) 혈장 농도를 달성하도록 용량이 투여된다. 이는 적합한 제제 내의 투여되는 성분들의 용액의 무균 주사에 의해 달성될 수 있다 (화학 업계의 당업자에게 공지된 임의의 적절한 제제 용액을 사용할 수 있다). 인가된 분석 방법에 의해 측정된 혈장 수준에 의해 확인되는 바와 같이 본 발명에 따른 본 발명의 조성물의 지속적인 주입에 의해 바람직한 혈액 수준이 유지될 수 있다.
본 발명의 조성물을 개체에게 투여하는 한 방법은 FGF21-링커 접합체를 개체에게 투여하는 단계 및 이것이 생체 내에서 적합한 항체의 조합 부위와 공유결합 화합물을 형성하게 하는 단계를 포함한다. 생체 내에서 형성되는 본 발명의 조성물의 항체 부분은 FGF21-링커 접합체의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 적합한 면역원으로의 면역화 후에 개체의 혈행 내에 항체가 존재할 수 있다. 예를 들어, 담체 단백질에 접합된 기질의 반응성 중간체로 면역화시킴으로써 촉매 항체가 생성될 수 있다. 특히, 디케톤 모이어티에 연결된 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 함께 투여하는 것에 의해 알돌라제 촉매 항체가 생성될 수 있다.
따라서, 단일 용량으로서, 2회 이상의 용량 (이는 동일한 양의 원하는 분자를 함유할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다)으로서 경시적으로, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 조성물이 투여될 수 있다. 적합한 투여량의 추가적인 정련이 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 이들이 일상적으로 수행하는 업무의 범위 내이다. 적합한 투여량은 적합한 용량-응답 데이터의 사용을 통해 확정될 수 있다.
제약 조성물의 투여 경로는, 예를 들어, 경구적으로, SC, IV, 복막내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로를 통해; 지속 방출 시스템에 의해; 또는 이식 장치에 의해, 공지된 방법에 따른다. 원하는 경우, 볼루스 주사에 의해 또는 연속적으로 주입에 의해 또는 이식 장치에 의해 조성물이 투여될 수 있다.
별법적으로 또는 추가적으로, 원하는 분자가 흡수 또는 캡슐화되어 있는 막, 스폰지, 또는 기타 적합한 물질의 이식을 통해 국소적으로 조성물이 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 임의의 적절한 조직 또는 기관 내로 장치가 이식될 수 있고, 확산, 서방형(timed-release) 볼루스, 또는 연속 투여를 통해 원하는 분자가 전달될 수 있다.
조합 요법
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태를 치료하는데, 또는 인슐린 분비를 증가시키거나 혈액 글루코스 수준을 감소시키는데, 또는 본원에서 논의된 상태 중 임의의 것을 치료하는데 사용되는 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 속성 작용, 단기 작용, 중등도-작용 또는 장기 지속 인슐린이 포함되는, 예를 들어 합성 인간 인슐린과 같은 인슐린과 조합되어 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 α-글루코시다제(glucosidase) 억제제, 술포닐우레아, 메글리티디드, 비구아니드, 또는 티아졸리딘디온 (TZD) 패밀리에 속하는 화합물과 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 대사-변형 단백질 또는 펩티드 예컨대 글루코키나제(glucokinase) (GK), 글루코키나제 조절 단백질 (GKRP), 짝풀림(uncoupling) 단백질 2 및 3 (UCP2 및 UCP3), 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1 및 2 (Glp1 및 Glp2), 엑센딘, (예컨대 엑센딘-4), 위 억제 폴리펩티드 (GIP), Glp2과산화소체 증식인자-활성화 수용체 α (PPARα), 렙틴 수용체 (OB-Rb), DPP-IV 억제제, 술포닐우레아, 또는 기타 인크레틴 펩티드와 조합되어 투여될 수도 있다. 당업자에게 당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태의 치료에서 현재 사용되는 광범위한 작용제가 공지되어 있을 것이다.
당뇨병 또는 당뇨병-관련 상태를 치료하는데, 인슐린 분비를 증가시키는데, 또는 혈액 글루코스 수준을 감소시키는데 사용되는 다른 치료제와 조합된 본 발명의 조성물 또는 이의 제약상 허용되는 유도체의 잠재적인 치료 효능을 평가하기 위해, 이러한 조합물들을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 테스트할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물과 또 다른 치료제의 조합물이 인슐린 분비를 증가시키는 능력을 시험관내 글루코스-자극 인슐린 분비 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 이같은 검정에서, 췌장 β 세포를 다양한 농도의 글루코스로 정해진 기간 동안 처리하고, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 방사선면역검정을 사용하여 인슐린 수준을 측정한다. 대상체에게 작용제들을 직접 투여하고 다양한 시점에 체액 샘플 내의 인슐린 수준을 측정하는 것에 의해, 인슐린 분비에 대한 본 발명의 조성물 및 다른 치료제의 효과를 생체 내에서 또한 측정할 수 있다. 공지된 치료제를 조합 요법에서 사용하기 위해 대상체에게 투여하는 방법은 임상 건강 관리 제공자에게 주지되어 있을 것이다.
투여될 본 발명의 조성물의 유효 투여량은 생물학적 반감기, 생체이용률 및 독성과 같은 파라미터를 다루는 당업자에게 주지된 절차를 통해 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 이의 제약상 허용되는 유도체와 조합되어 사용될 치료제의 유효량은 이러한 작용제에 대한 당업자에게 공지되어 있는 권장 용량을 기초로 한다. 바람직하게는 이러한 권장되거나 공지된 수준은 본 발명의 조성물 또는 제약상 허용되는 유도체와 조합하여 이러한 투여량의 유효성을 테스트한 후에 인용된 투여량의 10％ 내지 50％ 만큼 저하될 것이다. 주치의는 독성, 골수, 간 또는 신장 기능이상 또는 유해한 약물-약물 상호작용으로 인해 투여량을 저하시키기 위해 치료법을 끝내거나, 중단하거나 조정하는 방법 및 시기를 알 것임을 주지하여야 한다. 주치의는 임상 응답이 부적절한 경우 (독성 배제), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 방법을 또한 알 것이다.
치료 유효 용량은 환자에서 증상 완화 또는 생존 연장을 초래하는데 충분한 화합물의 양을 지칭한다. EC50을 측정함으로써 본 발명의 조성물의 유효 시험관내 농도를 결정할 수 있다. 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차, 예를 들어, LD50 (집단의 50％에 대해 치사성인 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위한 절차에 의해 생체 내에서의 이같은 작용제들의 독성 및 치료 효능을 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비가 치료 지수이고, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 선호된다. 이러한 동물 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 인간에서의 사용에 대한 투여량 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는 이같은 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 사용된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 투여량이 변할 수 있다. 임의의 화합물에 대해, 먼저 세포 배양 검정으로부터 치료 유효 용량을 추정할 수 있다. IC50 (즉, 세포 배양에서 결정되는 경우에 처리되지 않은 대조군과 비교하여 감염된 세포로부터의 RT 생산의 최대값의 절반의 억제를 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 용량이 공식화될 수 있다. 이같은 정보를 사용하여 인간에서의 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 조성물이 다른 치료제와 조합되어 투여되는 실시양태에서, 작용제들의 조합 효과를 하기 식을 사용하여 초우(Chou) 및 탈라레이(Talalay)의 다중 약물 분석 방법 (문헌 [T.C. Chou and P. Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984)])에 의해 계산할 수 있다:
Figure pct00049
식 중, CI는 조합 지수이고, ( Dx ) 1 은 단독으로 x％ 효과를 일으키는데 필요한 약물 1의 용량이고, D 1 은 D 2 와 조합되어 동일한 x％ 효과를 일으키는데 필요한 약물 1의 용량이다. 약물 2로부터 ( Dx ) 2 및 (D) 2 값이 유사하게 유도된다. α 값은 하기의 중앙값 효과 식을 사용하여 용량 효과 곡선의 플롯으로부터 결정된다:
Figure pct00050
식 중, fa는 용량 D에 영향을 받는 분획이고, fu는 영향을 받지 않은 분획이며, Dm은 50％ 효과에 필요한 용량이고, m은 용량-효과 곡선의 기울기이다. 서로 배타적인 약물 (즉, 유사한 작용 방식)에 대해, 양쪽 약물 단독 및 이들의 혼합물은 중앙값 효과 플롯에서 평행선을 제공한다. 서로 배타적이지 않은 약물 (즉, 독립적인 작용 방식)은 중앙값 효과 플롯에서 평행선을 제공할 것이지만, 혼합물에서는 위로 오목한 곡선을 제공할 것이다. 작용제들이 서로 배타적이면 α가 0이고, 이들이 서로 배타적이지 않으면 α가 1이다. 서로 배타적이지 않음을 가정하여 수득된 값들은 서로 배타적인 약물들보다 항상 약간 더 클 것이다. <1의 CI 값은 상승작용을 가리키고, >1의 값은 길항작용을 가리키며, 1의 값은 부가 효과를 가리킨다. 조합된 약물 효과를 바이오소프트(Biosoft) (영국 캠브리지)로부터의 CalcuSyn 소프트웨어 패키지를 사용하여 또한 계산할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물이 용매화, 특히 수화될 수 있다. 화합물 또는 화합물을 포함하는 조성물을 제작하는 동안 수화가 발생할 수 있거나, 또는 화합물의 흡습성 성질로 인해 경시적으로 수화가 발생할 수 있다. 본 발명의 화합물이 동결건조될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 화합물의 입체이성질체, 호변이성질체, 용매화물, 전구약물, 및 제약상 허용되는 염을 또한 제공한다. 본 발명은 본원에 개시된 서열 중 임의의 것에 따른 화합물을 또한 제공한다.
서열
Figure pct00051
Figure pct00052
서열 1은 잔기 181개의 발현된 단백질을 나타내고, 이때 H1은 임의적이고 잔기 146은 L 또는 P일 수 있다. 접합에 대해 테스트된 잔기 위치는 밑줄친 볼드체이다. 서열 1에 대한 번호매김이 전체적으로 사용된다.
인간화 38c2 IgG1의 한 실시양태의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 (각각 서열 25 및 26)이 또한 제시된다. 가변 영역 (VC 및 VH)에 밑줄이 쳐지고, 상보성 결정 영역 (CDR)이 볼드체로 제시된다. 측쇄가 본원에 기술된 링커와 공유결합으로 조합되는 라이신 99가 HC CDR3에 인접한다.
도 1. m38c2, h38c2, 및 인간 생식계열의 가변 도메인의 아미노산 서열 정렬. 프레임워크 영역 (FR) 및 CDR은 문헌 [Kabat et al.]에 따라 정의된다. 별표는 m38c2와 h38c2 사이 또는 h38c2와 인간 생식계열 사이의 차이를 표시한다.
도 2a, 2b 및 2c. L-2, L-3, 또는 L-4과 비교하여 링커-1 (L-1)과 접합된 Ab-FGF21ΔH-A129C로의 단일 용량 마우스 약동학 연구. 성체 초기의 수컷 스위스-웹스터(Swiss-Webster) 마우스에게 3 ㎎/㎏을 IV 또는 SC 투여하였다. 모든 경우에, L-1과의 접합체가 반감기 (L-1 접합체에 대해 ~33시간 SC 및 IV, L-2, -3, 및 -4 접합체에 대해 13-23시간 SC 및 22-37시간 IV) 및/또는 SC 생체이용률 (L-1 접합체에 대해 ~100％, L-2, -3, 또는 -4 접합체에 대해 48-53％)에 관하여 더 양호하게 수행하였다.
도 3a. L-2와 비교하여 L-1과 접합된 Ab-FGF21ΔH-A129C로의 단일 용량 래트 약동학 연구. 성체 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에게 3 ㎎/㎏을 IV 또는 SC 투여하였다. 모든 투여 경로에 대해, L-1과의 접합체가 반감기 (L-1 접합체에 대해 ~39시간 SC 및 ~60시간 IV, L-2 접합체에 대해 ~33시간 SC 및 ~52시간 IV) 및 SC 생체이용률 (L-1 접합체에 대해 ~52％, L-2 접합체에 대해 36％)에 관하여 L-2 접합체보다 더 양호하게 수행하였다. 도 3b. Ab-L1-FGF21ΔH-D79C, Ab-L7-FGF21ΔH-D79C, 및 Ab-L8-FGF21ΔH-D79C의 PK 비교.
도 4a 및 4b. 단일 SC 용량이 제공된 ob/ob 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트 (OGTT) 동안의 글루코스 곡선하 면적 (AUC) (대괄호: 평균 글루코스 AUC (비히클 대조군의 ％)): 비히클 [100], FGF21ΔH (1 ㎎/㎏ [74]), FGF21ΔH (0.6 ㎎/㎏ [103]) (명확성을 위해 도 4b에서 제시되지 않음), Ab-FGF21ΔH-H125C (3 ㎎/㎏ [66] 및 1 ㎎/㎏ [87]) (L1과 접합됨), Ab-FGF21ΔH-K59 (3 ㎎/㎏ [105]) (L5와 접합됨), Ab-FGF21ΔH-Knull-H1K (3 ㎎/㎏ [100]) (L5와 접합됨), 마른 대조군 [56]. 1원 ANOVA에 의해 PBS에 대해 *P<0.05, **P<0.01.
도 5a 및 5b. 단일 SC 용량이 제공된 ob/ob 마우스에서의 OGTT 동안의 누적 체중 (A) 및 간 중량 (B) 변화 (대괄호: 평균 체중 (g), 중괄호: 평균 간 중량 (g)): 비히클 [2.6] {2.4}, FGF21ΔH (1 ㎎/㎏ [2.5] {2.2}), FGF21ΔH (0.6 ㎎/㎏ [3.2] {2.4}), Ab-FGF21ΔH-A129C (3 ㎎/㎏ [1.7] {2.0}) (L1과 접합됨), Ab-FGF21ΔH-K59 (3 ㎎/㎏ [2.7] {2.4}) (L5와 접합됨), Ab-FGF21ΔH-Knull-H1K (3 ㎎/㎏ [2.6] {2.4}) (L5와 접합됨), 마른 대조군 [0.6] {1.0}. 2원 ANOVA (A) 및 1원 ANOVA (B)에 의해 PBS에 대해 *P<0.05, **P<0.01.
도 6a. 단일 용량이 제공된 ob/ob 마우스에서의 누적 체중 변화 (대괄호: 평균 체중 (g)): 비히클 [1.7], FGF21ΔH [1.9], FGF21ΔH-D79C (2 ㎎/㎏ [2.1]), Ab-FGF21ΔH-D79C (10 ㎎/㎏ [1.4]), Ab-FGF21ΔH-H125C (10 ㎎/㎏ [0.8]), 및 Ab-FGF21ΔH-A129C (10 ㎎/㎏ [0.9]), 마른 대조군 비히클 [0.6]. d0: 제0일. 모든 Ab 접합체에서 L1이 사용되었다. 2원 ANOVA에 의해 PBS에 대해 **P<0.01.
도 6b. 단일 용량이 제공된 ob/ob 마우스에서의 OGTT 동안의 글루코스 AUC (대괄호: 평균 글루코스 AUC ％): 비히클 [100], FGF21ΔH [63], Ab- FGF21ΔH-D79C (2㎎/㎏ [86]), FGF21ΔH-D79C (10 ㎎/㎖ [54]), Ab-FGF21ΔH-H125C (10 ㎎/㎖ [51]), 및 Ab-FGF21ΔH-A129C (10 ㎎/㎏ [54]), 마른 대조군 [48]. 모든 Ab 접합체에서 L1이 사용되었다. 1원 ANOVA에 의해 PBS에 대해 **P<0.01.
도 6c. FGF21ΔH 및 Ab-FGF21ΔH-D79C (10 ㎎/㎏)가 투여된 ob/ob 마우스에서의 OGTT 동안의 글루코스 AUC. Ab-FGF21ΔH-D79C는 링커-1과 접합되었다. 비히클에 대해 **P<0.01.
도 6d. 제6일에 FGF21ΔH 및 Ab-FGF21ΔH-D79C (10 ㎎/㎏)가 투여된 ob/ob 마우스에서의 OGTT 동안의 글루코스 AUC. Ab-FGF21ΔH-D79C는 L1과 접합되었다. ob/ob-PBS에 대해 **P<0.01.
도 6e. 제0일, 제1일, 제2일, 또는 제3일에 단일 용량 (3 ㎎/㎏)의 Ab-FGF21ΔH-A129C가 제공된 ob/ob 마우스에서 d6에 수행된 OGTT 동안의 글루코스 AUC. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 1원 ANOVA에 의해 PBS에 대해 *P<0.05, ***P<0.001.
도 6f. 단일 용량 (10 ㎎/㎏)의 Ab-FGF21ΔH-A129C가 ob/ob 마우스에서 백색 지방 조직에서의 Ucp1 발현을 증가시킨다. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다.
도 6g. 단일 용량 (10 ㎎/㎏)의 Ab-FGF21ΔH-A129C가 ob/ob 마우스에서 간 트리글리세리드를 감소시킨다. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 1원 ANOVA에 의해 비히클에 대해 *P<0.05, ***P<0.001.
도 6h. 제0일, 제1일, 제2일, 또는 제3일에 단일 용량 (10 ㎎/㎏)의 Ab-FGF21ΔH-A129C가 제공된 ob/ob 마우스에서의 누적 체중 변화. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다.
도 7a. 반복 용량의 Ab-FGF21ΔH-A129C (제0일 및 제7일에 10 ㎎/㎏)가 DIO 마우스에서 글루코스 내성을 개선시킨다. 제10일에 OGTT를 수행하였다. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 1원 ANOVA에 의해 비히클에 대해 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 7b. 제0일 및 제7일에 2회 용량의 Ab-FGF21ΔH-A129C (10 ㎎/㎏)가 제공된 DIO 마우스에서의 누적 체중 변화. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 2원 ANOVA에 의해 비히클에 대해 *P<0.05.
도 7c. 반복 용량의 Ab-FGF21ΔH-A129C (10 ㎎/㎏)가 DIO 마우스에서 백색 지방 조직에서의 Ucp1 발현을 증가시킨다. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 1원 ANOVA에 의해 비히클에 대해 **P<0.01.
도 7d. Ab-FGF21ΔH-A129C (10 ㎎/㎏)가 DIO 마우스에서 혈청 트리글리세리드를 저하시킨다. 도 7e. Ab-FGF21ΔH-A129C (10 ㎎/㎏)가 DIO 마우스에서 혈청 비-에스테르화 지방산을 저하시킨다. 도 7f. Ab-FGF21ΔH-A129C 간 중량. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 1원 ANOVA에 의해 비히클 (A, B) 및 PBC (C)에 대해 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 7g, 7h, 7i. ob / ob 마우스에서의 간 유전자 발현에 대한 Ab-FGF21ΔH-A129C의 효과. (7G) SCD1: 스테아로일-CoA 디새츄라제(desaturase) 1, (7H) MOGAT2: 모노아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 2 (7i) FoxA2: 포크헤드(forkhead) 전사 인자 A2. Ab-FGF21ΔH-A129C는 L1과 접합되었다. 1원 ANOVA에 의해 비히클에 대해 **P<0.01.
도 7j, 7k. (7j) 10 ㎎/㎏ 및 (7k) 3 ㎎/㎏이 투여된 ob/ob 마우스에서의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 용량 관련 혈청 수준.
도 8a. 고인슐린혈증 정상혈당 클램프의 전체 기간에 걸친 혈장 글루코스 수준. 도 8b. 고인슐린혈증 정상혈당 클램프의 전체 기간에 걸친 글루코스 주입 속도. 도 8c. 기저 및 클램프 조건 하에서의 간 글루코스 생산 (*** = P< 0.0001).
도 9a-9e 및 9h-9p. 값들은 평균±SEM을 나타내고, AB-L1-FGF21ΔH-A129C 1.5㎎/㎏ 및 FGF21ΔH (대조군 단백질)에 대해 n=5이고, AB-L1-FGF21ΔH-A129C 0.15 ㎎/㎏ 및 비히클 군에 대해 n=6이다. AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 군에 대해, 비히클에 대해 각각의 시점의 유의성을 계산하였다. FGF21ΔH 군에 대해, 기준선에 대해 각각의 시점의 유의성을 계산하였다. 유의성 값은 a = p<0.05, b = p<0.01, c = p<0.005 및 d = p<0.001이다. Y축은 기준선으로부터의 변화를 나타낸다.
도 9a. 체중에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9b. 공복 혈장 글루코스에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9c. 공복 혈장 인슐린에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9d. 공복 혈장 프룩토사민에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9e. 공복 혈장 글루카곤에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9f. 정맥내 글루코스 내성 테스트 (IVGTT) ΔAUC 글루코스에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과. 값들은 평균 ΔAUC±SEM을 나타낸다. AB-L1-FGF21ΔH-A129C 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏으로 처치된 군에 대해, 1원 분산 분석 (ANOVA) + 던넷(Dunnetts) 사후 테스트에 의해 비히클에 대해 통계적 유의성을 평가하였다. 반복 측정 ANOVA + 던넷 사후 테스트에 의해 FGF21 대조군 단백질 군에 대해 기준선에 대한 IVGTT 시점들에 걸친 유의성을 평가하였다.
도 9g. IVGTT ΔAUC 인슐린에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과. 값들은 평균 ΔAUC±SEM을 나타낸다. AB-L1-FGF21ΔH-A129C 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏으로 처치된 군에 대해, 1원 ANOVA + 던넷 사후 테스트에 의해 비히클에 대해 통계적 유의성을 평가하였다. 반복 측정 ANOVA + 던넷 사후 테스트에 의해 FGF21 대조군 단백질 군에 대해 기준선에 대한 IVGTT 시점들에 걸친 유의성을 평가하였다.
도 9h. 공복 총 혈장 콜레스테롤에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9i. 공복 혈장 트리글리세리드에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9j. 공복 혈장 유리 지방산에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9k. 공복 혈장 저밀도 지질단백질 콜레스테롤에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9l. 공복 혈장 총 케톤체에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9m. 공복 혈장 아디포넥틴에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9n. 공복 혈장 C-반응성 단백질에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9o. 공복 혈장 렙틴에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
도 9p. 공복 혈장 아딥신에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과.
실시예
본 발명의 다능성이 하기의 실시예에 의해 설명되고, 이는 본 발명의 전형적인 실시양태를 설명하고 어떠한 방식으로도 청구항 또는 명세서를 제한하지 않는다.
실시예 1 FGF -21 상의 최적의 테더 ( tether ) 부위의 확인
촉매 항체 조합 부위로 링커를 통해 FGF21을 접합시키기 위한 최적 부위를 확인하기 위해 연구에 착수하였다. 2가지 접합 전략을 고려하였다: 표면 라이신 측쇄를 통한 접합, 및 표면 시스테인 측쇄를 통한 접합. 일반적으로, 구형 단백질은 이의 표면 상에 짝을 이루지 않은 시스테인 잔기가 없고, 따라서 단백질 표면 내의 단일 시스테인의 혼입을 특이적 접합을 위한 단일 부위에서 조작하는데 사용할 수 있다. 그러나, 시스테인으로의 표면 잔기의 돌연변이는 종종 분자간 이량체화, 천연 디술피드 결합의 잘못된 짝짓기, 및 수용체 결합의 방해와 같은 문제를 야기할 수 있다. 이러한 이유로, 단백질 접합은 가장 통상적으로 라이신 잔기를 통해 실행된다.
FGF21 수용체의 상동성 모델링 및 이의 활성화 메커니즘
FGF21은 FGFR1c 및 FGFR4 양쪽 모두에 결합하지만, 수용체 복합체는 FGFR1c를 통해서만 활성화될 수 있다. FGFR1b와 FGFR1c가 87％ 동일성을 공유하지만 (FGFR1b는 IIIb/c 별법적 스플라이싱(splicing) 영역을 제외하고는 FGFR1c와 동일하다), FGF21은 FGFR1c만 특이적으로 인식한다. 여기에서, FGFR2-FGFR1c 결정 구조를 주형으로 사용함으로써 FGF21-FGFR1c의 복합체 구조의 상동성 모델링을 수행하였다. MOE 소프트웨어를 상동성 모델링 및 구조 분석에 사용하였다. 수용체의 활성화는 또 다른 세포-표면 수용체인 β 클로토를 필요로 한다. β클로토에는 인간 세포질 β-글루코시다제와 매우 유사한 (~35％ 동일성) 2개의 도메인이 있다. 인간 세포질 β-글루코시다제를 사용함으로써 인간 β클로토 구조를 모델링하였고, FGF21-FGFR1c의 모델링된 구조에서의 구조를 정렬하였다. 이러한 모델링된 복합체 구조는 FGF21 내의 최적의 라이신 접합 부위 및 최적의 시스테인 잔기 혼입을 위한 합리적인 지침을 제공하였고, 이는 FGF21과 FGFR1c 사이 및 FGF21과 β클로토 사이의 결합 계면을 방해하지 않아야 한다.
하기의 기준을 접합 부위 선택에 사용하였다: (1) 잔기가 구조 내에서 가능한 한 많이 용매에 노출되어야 한다; (2) 잔기가 디술피드 결합에서 멀어야 한다; (3) 잔기가 수용체 및 β-클로토 결합 표면에서 멀어야 한다.
접근가능한 표면적 (ASA)을 기초로 용매에 대한 노출을 평가할 수 있다. 모델링된 FGF21 구조로부터의 ASA 계산을 CCP4 소프트웨어 (문헌 ["The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". (1994) Acta Cryst. D50, 760-763]) 및 인-하우스(in-house) 프로그램으로 수행하였다. 간략하게, CCP4 내의 프로그램은 로그 파일 내의 잔기 당 제곱 옹스트롬 단위의 값을 계산한다. ASA의 분율 (fASA)을 계산하기 위해, 인-하우스 프로그램을 사용하여 잔기 당 ASA를 표준화하였다. 표 1은 ASA, 뿐만 아니라 fASA의 잔기를 나타낸다. 측쇄가 표면을 불명확하게 할 것으로 예측되는 잔기는 포함되지 않는다. 1열은 아미노산 명칭이고, 2열은 잔기 번호이며, 3열은 ASA (제곱 옹스트롬)이고, 4는 노출 분율이다. fASA 값은 소정의 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기에 대한 용매의 접근가능성을 정의한다. fASA 값이 0에 가까운 것은 잔기가 용매에 접근하기 어려울 것으로 예측된다는 것을 가리키고, 이는 접합을 위해 링커에 접근할 가능성이 더 없다는 것을 시사한다. 0.3의 절대 최소 fASA 값이 사용되었고, 이때 >1.00의 표면적 값은 특히 가능성 있는 후보 접합 부위를 시사한다.
ASA 분석을 기초로, K122 (표면적 164.4) 및 K59 (표면적 117.2)가 접합을 위한 가장 전도유망한 후보 부위로 간주되었다. K69 (표면적 91) 및 K56 (표면적 73)이 또한 비교 목적을 위해 접합되었다.
Figure pct00053
실시예 2 FGF21 단백질 및 돌연변이체의 생성
FGF21 cDNA를 ATCC에서 구입하였다. 포유동물 및 박테리아 발현 벡터를 각각 pcDNA3.1 (인비트로젠(Invitrogen)®) 및 pET21b (EMD)를 사용하여 구축하였다. FGF21의 돌연변이 변이체를 위해, 퀵체인지(QuikChange)® 부위 지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진((Stratagene)®)을 사용하여 돌연변이를 발현 벡터 내로 도입하였다. 원하는 돌연변이의 존재를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
포유동물 발현을 위해, HEK293F 세포 (인비트로젠®)를 293펙틴(fectin) 시약 (인비트로젠®)을 사용하여 FGF21의 포유동물 발현 벡터로 형질감염시키고, 무혈청 배지에서 성장시켰다. 멸균-여과된 컨디셔닝 배지를 완충제 A (20 mM 트리스-HC1, pH 7.5)에 대해 투석하고, 완충제 A로 예비-평형화된 하이트랩(HiTrap) Q 칼럼 (지이 헬스케어(GE healthcare)®) 상에 로딩하였다. FGF21 단백질을 완충제 A에서 완충제 B (20 mM 트리스-HC1, pH 7.5, 및 100 mM NaCl)로의 선형 구배로 용출시켰다. 풀링(pooling)된 분획을 농축하고, 포스페이트 완충 염수 (PBS, pH 7.4)와 함께 세파덱스(Sephadex) 300 상에 로딩하였다. 생성된 단백질 용액을 농축하고, -80℃ 미만에서 보관하였다. SDS-PAGE 및 RP-HPLC에 의해 순도를 확인하였다.
이.콜라이(E.coli)로부터의 FGF21ΔH 생산을 위해, 박테리아 발현 벡터를 숙주 균주 BL21- (DE3)-RIL (스트라타진®) 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 1 리터의 LB 배지에서 37℃에서 성장시키고, 1 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드의 첨가에 의해 발현을 개시시켰다. 4시간 후, 세포를 수확하고, -20℃에서 동결시켰다. 동결된 세포 페이스트를 용해 완충제 (50 mM 트리스, 10 mM EDTA, pH 7.5)에 현탁시키고, 고압유화기(microfluidizer)에 4회 통과시켰다. 17,000×g, 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후, 봉입체 (IB)를 함유하는 펠릿을 50 mM 트리스, pH 7.5에 재현탁시켰다. 세정된 IB 슬러리를 원심분리하였다 (30분, 17,000×g, 4℃). IB 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 동결된 IB 펠릿을 1 내지 10 ㎎/㎖ FGF21에서 7 M 요소, 5 mM DTT 및 50 mM 비스-트리스 프로판, pH 10.5로 가용화하고, 1시간 동안 교반하여 단백질을 용해 및 환원시켰다. 그 후, 가용화된 IB를 50 mM 비스-트리스 프로판, pH 8.0 내로 10배 희석하였다. 최종 단백질 농도는 0.1 내지 1 ㎎/㎖였다. 용액을 ~2일 동안 교반하고, 4 리터의 20 mM 트리스-HCl, pH 7.5에 대해 투석하였다. 단백질 용액을 14,000×g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 하이트랩 Q (지이 헬스케어®)에 로딩하고, 완충제 A (상기 참조)로 평형화시켰다. 결합되지 않은 박테리아 단백질을 완충제 A로 세정하고, FGF21 단백질을 선형 구배의 완충제 B로 용출시켰다. 그 후, FGF21 분획을 PBS 완충제로 예비-평형화된 하이트랩 킬레이팅 HP 칼럼 (지이 헬스케어®) 상에 로딩하였다. FGF21 단백질을 PBS에서 PBS 완충제 + 100 mM 이미다졸로의 선형 구배로 용출시켰다 (pH를 7.4로 조정하였다). 분획들을 수집하여 농축하고 (50 ㎎/㎖까지), 단백질 용액을 PBS (깁코(Gibco)®, pH 7.4)로 평형화된 크기 배제 칼럼 (하이로드(Hiload) 26/60, 수퍼덱스(superdex) 300)에 적용하였다. 정제된 단백질을 0.22 ㎛ 필터로 멸균하고, -80℃에서 보관하였다. 8L 배양 배지로부터의 전형적인 FGF21ΔH 수율은 600 ~ 700 ㎎이었다. 전형적인 순도는 > 95％였다. 전형적인 내독소 수준은 ~ 1 EU/mg이었다. FGF21ΔH와 유사한 방식으로 FGF21의 시스테인 및 라이신 → 아르기닌 돌연변이체를 생산하여 정제하였다. 정제된 단백질의 전형적인 수율은 350 ~ 400 ㎎이었다. 유리 시스테인을 엘만(Ellman) 시약을 사용하여 확인하였다.
실시예 3 링커 1의 합성
Figure pct00054
링커 1의 합성: 질소 대기 하에 약 35℃에서 메탄올 (예를 들어 약 200 ㎖) 내의 13A (예를 들어 약 5 g, 약 20.1 mmol)의 현탁액에 탄소 상의 팔라듐 (예를 들어 약 1.0 g, 약 0.47 mmol)을 한번에 첨가하고, 이어서 염산 (예를 들어 약 2.5 ㎖, 약 30.2 mmol)을 적가하였다. 약 35℃에서 수소를 용액 내로 천천히 기포화시키고, 용액을 대략적으로 약 2시간 동안 이러한 온도에서 교반하였다. 고체를 셀라이트 베드를 통과시켜 여과하고, 수집하였다. 여과액을 감압 하에 농축하고, 고체를 진공 하에 건조시켜, 히드로클로라이드 염으로서 13B를 제공하였다. 화합물 13B를 디클로로메탄 (예를 들어 약 200 ㎖) 및 중탄산나트륨의 포화 용액 (예를 들어, 약 250 ㎖)과 혼합하고, 디클로로메탄 층을 분리하였다. 디클로로메탄 층을 포화 염화나트륨 (예를 들어 약 250 ㎖)으로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 유기 층을 여과하고, 감압 하에 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 내의 약 60％ 에틸 아세테이트)를 사용하여 정제하여, 약 68％ (예를 들어 약 2.94 g)의 수율의 13C를 제공하였다. 질소 하의 약 0℃의 디클로로메탄 (예를 들어 약 200 ㎖) 내의 13C (예를 들어 약 4.65 g, 약 21.3 mmol), 13D (예를 들어 약 7.00 g, 약 21.3 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (예를 들어 약 3.3 g, 약 21.3 mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (예를 들어 약 2.75 g, 약 21.3 mmol)의 용액을 5분 동안, 그리고 실온에서 약 4시간 동안 교반하였다. 유기 층을 묽은 중탄산나트륨 용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 세정하고, 진공 하에 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (SiO2, 아세토니트릴)를 사용하여 정제하여, 링커 1 (예를 들어 약 8.25 g, 수율 약 73％)을 제공하였다.
실시예 4 링커 2의 합성
Figure pct00055
DMF (예를 들어 약 10 ㎖) 내의 시트라콘산 무수물 14 (예를 들어 약 2.0 ㎎, 약 16.7 mmol), β-알라닌 17 (예를 들어 약 1.5 g, 약 16.7 mmol)의 용액을 실온에서 약 5시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 용액을 약 0℃로 냉각하고, 디이소프로필카르보디이미드 (예를 들어 약 2.6 ㎖, 약 16.7 mmol) 및 HOBT (예를 들어 약 1.9 g, 약 16.7 mmol)를 함유하는 DMF (예를 들어 약 10 ㎖) 용액을 첨가하였다. 디이소프로필에틸아민 (예를 들어 약 5 당량, 약 83.5 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 또 다른 약 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 물에 붓고, 1N HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 (예를 들어 약 3 × 약 30 ㎖)로 추출하였다. 유기 층을 물 (예를 들어 약 2 × 약 30 ㎖) 및 염수 (예를 들어 약 30 ㎖)로 세정한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 감압 하에 용매를 제거하고, 미정제(crude) 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 원하는 분획들을 풀링하고, 감압 하에 농축하여, 17A를 제공하였다.
화합물 17A (예를 들어 약 0.5 g, 약 2.09 mmol)를 디클로로메탄 내의 약 15％ 트리플루오로아세트산에서 실온에서 약 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 건조 상태로 농축하였다. 유리산 18을 테트라히드로푸란 (예를 들어 약 20 ㎖) 내의 N-히드록시숙신이미드 (예를 들어 약 0.25 g, 약 2.09 mmol)에 첨가하고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드 (예를 들어 약 0.33 ㎖, 약 2.09 mmol)를 첨가하고, 약 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 디이소프로필 우레아를 여과로 제거하였다. 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 석유 에테르 (예를 들어 약 30 ㎖)를 잔류물에 첨가하고, 분쇄하고, 진탕시키고, 석유 에테르 층을 경사분리하였다. 이러한 절차를 석유 에테르로 1번 더 반복하고, 생성물 18을 진공 하에 건조시켰다.
아민-peg2-t부틸 에스테르 19 (예를 들어 약 0.5 g, 2.09 mmol)를 활성화된 18의 THF 용액에 첨가한 후, 과량의 DIPEA (예를 들어 약 3당량)가 이어졌다. 용액을 실온에서 최소 1시간 동안 교반하고, 질량 343 및 399을 수집하는 HPLC-MS에 의해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획들을 풀링하고 동결건조하여 20을 수집하였다. 잔류물을 디클로로메탄 내의 약 15％ 트리플루오로아세트산 및 몇몇 물방울에 용해시키고, 실온에서 약 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 약 1 ㎖로 농축하고, 물로 처리하여 생성물을 침전시켰다. 미정제 물질을 HPLC-MS를 사용하여 정제하여, 21 (M+343)이 산출되었다.
DMF (예를 들어 약 2 ㎖) 내의 산 21 (예를 들어 약 60 ㎎, 약 0.18 mmol), HBTU (예를 들어 약 137 ㎎, 약 0.36 mmol), 및 아닐린 히드로클로라이드 22 (예를 들어 약 45 ㎎, 약 0.18 mmol), 디이소프로필에틸아민 (예를 들어 약 0.14 ㎖, 약 0.90 mmol)의 용액을 실온에서 약 30분 동안 교반하고, HPLC-MS 상에서 정제하였다. 원하는 분획을 풀링하고 농축하여 L2 (예를 들어 약 16 ㎎, 약 0.03 mmol)를 수집하였다.
실시예 5 링커 3의 합성
Figure pct00056
DMF (예를 들어 약 10 ㎖) 내의 시트라콘산 무수물 14 (예를 들어 약 0.5 g, 약 16.4 mmol), 아민-peg2-t부틸 에스테르 23 (예를 들어 약 1.0 g, 약 4.2 mmol)의 용액을 실온에서 약 2시간 동안 교반하였다. 디이소프로필카르보디이미드 (예를 들어 약 0.8 ㎖, 약 5.2 mmol) 및 HOBT (예를 들어 약 0.7 g, 약 6.1 mmol)를 첨가하고, 반응물을 약 80℃에서 약 2시간 동안 가열하였다. 반응물을 밤새 실온으로 냉각되게 하고, 요소를 여과하였다. 여과액을 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세정하고, 오일로 농축하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴 내의 약 50％ 6N HCl에 용해시켜 산을 탈보호시켰다. 생성물을 DMF에 용해시키고, 여과하고, HPLC-MS을 사용하여 정제하여, 24 (예를 들어 약 208 ㎎, 약 0.7 mmol)를 수집하였다.
DMF 내의 말레이미드 24 (예를 들어 약 0.16 g, 약 0.6 mmol) 및 아닐린 히드로클로라이드 22 (예를 들어 약 150 ㎎, 약 0.6 mmol)의 용액을 과량의 HBTU 및 DIEA (예를 들어 각각 약 3을 초과하는 당량)에 첨가하였다. 미정제 물질을 HPLC-MS 상에서의 약 2회의 주입을 통해 정제하였다. 가장 순수한 물질을 함유하는 원하는 분획들을 풀링하고 동결건조하여, L3 (예를 들어 약 17.3 ㎎, 약 36.7 mmol)을 수집하였다.
실시예 6 링커 4의 합성
Figure pct00057
질소 (N2) 하의 디메틸포름아미드 (예를 들어 DMF에 관하여 약 5 ㎖) 내의 시트라콘산 무수물 (14, 예를 들어 약 510 ㎎, 약 4.55 mmol) 및 트랜스-4-아미노메틸 시클로헥산 카르복실산 (13, 예를 들어 약 716 ㎎, 약 4.55 mmol)의 용액을 실온에서 약 6시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 약 0℃로 냉각하고, DIPEA (예를 들어 약 1.98 ㎖, 약 11.4 mmol)에 이어서 DMF (예를 들어 약 3 ㎖) 내의 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (예를 들어 약 1.96 ㎖, 약 11.4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, N2 하에 또 다른 약 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 여과액을 약 30 ㎖의 물에 붓고, 디클로로메탄 (예를 들어 약 2 × 약 30 ㎖)으로 추출하고, 디클로로메탄 층을 Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 미정제 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 약 550 ㎎의 펜타플루오로페닐 에스테르 중간체 (15, 예를 들어 약 29％ 수율)가 산출되었다.
N-메틸 모르폴린 (예를 들어 약 290 ㎕, 약 2.64 mmol)을 테트라히드로푸란 (THF, 예를 들어 약 5 ㎖) 내의 펜타플루오로페닐 에스테르 중간체 (15, 예를 들어 약 550 ㎎, 약 1.32 mmol) 및 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로피온산 tert-부틸 에스테르 (예를 들어 약 295 ㎎, 약 1.32 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 약 2시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 DMF에 용해시키고, 분취 HPLC에 의해 정제하였다. 수득된 tert-부틸 에스테르 중간체를 디클로로메탄 (예를 들어 약 4 ㎖) 내의 약 50％ 트리플루오로아세트산으로 약 30분 동안 처리하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 분취 HPLC에 의해 정제하여, 약 300 ㎎의 산 중간체 16이 백색 고체로서 제공되었다 (예를 들어 약 55％ 수율; MS: 411.2 (M+H+)).
DMF (예를 들어 약 1 ㎖) 내의 상기 산 중간체 (16, 예를 들어 약 33 ㎎, 약 0.08 mmol), 1-[3-(4-아미노-페닐)-프로피오닐]-아제티딘-2-온 (예를 들어 약 18 ㎎, 약 0.08 mmol), HOBT (예를 들어 약 25 ㎎, 약 0.16 mmol) 및 HBTU (예를 들어 약 61 ㎎, 약 0.16 mmol), 및 N-메틸 모르폴린 (예를 들어 약 44 ㎕, 약 0.4 mmol)의 용액을 실온에서 약 2시간 동안 교반하였다. 미정제 혼합물을 분취 HPLC로 정제하여, 무색 오일로서 L4가 제공되었다 (예를 들어 약 22 ㎎, 45％ 수율; MS: 611.4 (MH+)).
실시예 7 링커 5의 합성
Figure pct00058
L5
디이소프로필 카르보디이미드 (예를 들어 약 3.11 ㎖, 약 19.86 mmol, 약 2.95 당량)를 약 0℃에서 건조 테트라히드로푸란 (예를 들어 약 500 ㎖) 내의 링커 6 (예를 들어, 약 6.63 g, 약 20.69 mmol, 약 3.07 당량) 및 N-히드록시숙신이미드 (예를 들어 약 2.29 g, 약 19.86 mmol, 약 2.95 당량)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 약 0℃에서 약 1시간 동안 교반한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 진공에서 용매를 제거하고, 잔류물을 석유 에테르 (예를 들어 약 2 × 약 200 ㎖)로 세정하고, 분말을 진공 하에 약 2시간 동안 건조하고, 다음 단계에서 사용하였다.
실시예 8 링커 6의 합성
Figure pct00059
실시예 9 링커 7의 합성
Figure pct00060
디메틸 포름아미드 (예를 들어 약 25 ㎖) 내의 I (예를 들어 약 438 ㎎, 약 4.47 mmol) 및 II (예를 들어 약 1.04 g, 약 4.47 mmol)의 용액을 질소 대기 하에 약 2.5시간 동안 교반하였다. 얼음 욕조를 사용하여 반응물을 약 0℃로 냉각하였다. 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온 (예를 들어 약 647 ㎎, 약 5.62 mmol), 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (예를 들어 약 1.71 g, 약 8.92 mmol)를 첨가하고, 대략적인 실온에서 밤새 교반하였다. 유기 층을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 세정하고, 감압 하에 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 내의 약 75％ 에틸 아세테이트 → 디클로로메탄 내의 약 5％ 메탄올)를 사용하여 정제하여, III (예를 들어 약 767 ㎎)이 제공되었다. 디클로로메탄 (예를 들어 약 15 ㎖) 및 트리플루오로아세트산 (예를 들어 약 1.16 ㎖) 내의 III (예를 들어 약 573 ㎎, 약 1.83 mmol)의 용액을 대략적인 실온에서 약 9.5시간 동안 교반하였다. 물질을 감압 하에 농축하고, 진공 펌프 상에서 밤새 건조시켜, IV가 제공되었다. 미정제 IV를 디클로로메탄 (예를 들어 약 15 ㎖), 및 디메틸 포름아미드 (약 2 방울)에 용해시키고, 옥살릴 클로라이드 (예를 들어 약 465 ㎎, 약 3.66 mmol)와 함께 약 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 오일을 진공 하에 1시간 동안 건조하였다. 오일을 디클로로메탄 (예를 들어 약 15 ㎖)에 용해시키고, 질소 하에 13B (예를 들어 약 464 ㎎, 약 1.83 mmol) 및 디이소프로필 에틸아민 (예를 들어 약 2.9 ㎖, 약 16.5 mmol)과 함께 약 30분 동안 교반하였다. 유기 층을 포화 중탄산나트륨 용액, 포화 염화나트륨 용액으로 세정하고, 감압 하에 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 내의 약 85％ 에틸 아세테이트 → 약 100％ 에틸 아세테이트)를 사용하여 정제하여, 링커 7 (예를 들어 약 323 ㎎, 약 39％)이 제공되었다.
실시예 10 링커 8의 합성
Figure pct00061
디클로로메탄 내의 V (예를 들어 약 980 ㎎, 약 1.91 mmol), 13C (예를 들어 약 484 ㎎, 약 1.91 mmol), 디이소프로필에틸아민 (예를 들어 약 2 ㎖, 약 11.5 mmol)의 용액을 약 6시간 동안 대략적인 실온에서 교반하였다. 또 다른 약 1 당량의 13C (예를 들어 약 484 ㎎, 약 1.91 mmol) 및 약 3 당량의 디이소프로필에틸아민 (예를 들어 약 1 ㎖, 약 5.73 mmol)을 첨가하고, 대략적인 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액, 포화 염화나트륨 용액으로 세정하고, 건조시키고 (황산나트륨), 여과하고, 감압 하에 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (약 100％ 에틸 아세테이트 → 에틸 아세테이트 내의 약 5％ 메탄올 → 에틸 아세테이트 내의 약 10％ 메탄올)를 사용하여 정제하여, 링커 8 (예를 들어 약 285 ㎎, 약 24％)이 제공되었다.
실시예 11 단백질과 링커의 접합
FGF21 돌연변이체 단백질을 실온에서 2시간 동안 반응성 링커와 1:10 몰비로 반응시켰다. 그 후, 모든 링커-부착 FGF21 단백질을 PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 완충제를 20 mM 트리스-HCl, 20 mM NaCl, pH 7.0로 교환하였다.
실시예 12 단백질-링커 복합체를 항체와 접합시킴
모든 링커-부착 FGF21 단백질을 실온에서 밤새 h38C2 IgG1 (서열 25 및 26) (20 mM 트리스-HCl, 20 mM NaCl, pH 7.0)과 6:1 몰비로 융합시켰다. 단백질-링커-항체 복합체를 SEC에 의해 정제하였다. 접합 효율을 LCMS 분석으로 확인하였다.
실시예 13 단백질 생산 검정
모든 FGF21 단백질이 이. 콜라이에서 발현되었다. 박테리아로 발현된 FGF21 단백질은 봉입체 내에서 확인되었다. 세포를 용해하고 상층액을 제거한 후, 펠릿을 4℃의 7 M 요소, 50 mM 비스-트리스 프로판, pH 10.5에서 용해시켰다. 용해된 봉입체를 50 mM 비스-트리스 프로판, 10 mM 산화 글루타티온, ph 9.0 내로 희석하고, 2시간 동안 교반한 후, 4℃에서 20 mM 트리스-HCI, ph 7.5에 대해 밤새 투석하였다. 가용성 분획을 하이트랩 Q 칼럼으로 정제하였다. 단백질을 SDS-PAGE 분석으로 특성화하였다. 라이신 돌연변이체의 발현 수준은 10-50 ㎎/ℓ였다.
실시예 14 Glut1 태크만 검정
분화된 3T3-L1 지방세포를 사용하여, qPCR 방법에 의해 Glut1 mRNA 발현을 측정하였다. 밤새 혈청이 고갈된 제10일-14일의 분화된 3T3-L1 지방세포를 화합물로 6시간 동안 처리하였다. 총 RNA를 이러한 세포로부터 추출하고, Glut1 및 GAPDH mRNA 발현을 퀀티텍트 프로브(Quantitect Probe) RT-PCR 키트를 사용하여, 그리고 태크만 기계 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)®)에서 정량적 실시간 PCR 반응을 실행하여 측정하였다. 각각의 샘플로부터의 GAPDH mRNA 수준에 의해 표준화된 Glut1 mRNA 수준에서의 배수 변화에 의해 화합물의 생활성을 결정하였다. 이러한 검정에서 용량 응답 곡선으로부터 화합물 효능의 측정치로서의 EC50 값을 수득하였다.
실시예 15 글루코스 흡수 검정
분화된 3T3-L1 지방세포를 24시간 동안 혈청의 부재 하에 화합물로 처리하였다. 그 후, 세포를 14C-2-데옥시글루코스와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 세포 내로의 글루코스 흡수를 왈락 1450 마이크로베타(Wallac 1450 MicroBeta) (트릴룩스(Trilux)) 장치에서 정량하였다. 글루코스 흡수는 카운트(count)/분 (CPM)으로 표현되었다. 이러한 검정에서 용량 응답 곡선으로부터 화합물 효능의 측정치로서의 EC50 값을 수득하였다.
실시예 16 마우스 약동학
FGF21 항체 접합체의 PK를 IV 또는 SC 투여 후 마우스에서 시험하였다. 항체 접합체를 성체 초기의 수컷 스위스-웹스터 마우스 (20-25 g)에게 주사하고, 혈액 샘플을 투여 후 5분 내지 120시간의 시점에 수득하였다. 96웰 플레이트에 결합된 모노클로날 항-hFGF21 항체를 통해 항체 접합체의 FGF21 부분을 포획한 ELISA를 사용하여 혈청 내의 항체 접합체 농도를 결정하였다. 플레이트에 결합된 FGF21 항체 접합체를 항-hFc 모노클로날 항체를 통해 검출하였고, 혈청-함유 검정 완충제 내로 희석된 PK 투여 용액의 표준 곡선을 사용하여 농도를 결정하였다. SC 혈청 농도 프로파일의 곡선하 면적 (AUC)을 IV 혈청 농도 프로파일의 AUC로 나눈 비로서 SC 생체이용률이 계산되었다.
실시예 17 마우스 효능
FGF21 항체 접합체의 효능을 2가지 뮤린 비만 인슐린 저항성 모델인 ob/ob 마우스 및 고지방 식이로 유도된 비만 마우스에서 평가하였다. 양쪽 모델에 대해, 수컷 마우스 (ob/ob는 6-8주령, DIO는 12-14주령이고, 이때 고지방 식이는 6주령에 시작되었음)를 우리 당 2-4마리로 수용하고, FGF21 항체 접합체를 SC 주사로 투여하였다. 체중을 매일 아침에 측정하였다. 경구 글루코스 내성 테스트에 의해 글루코스 내성을 평가하였다. 간략하게, 마우스를 테스트하는 날 아침에 4-5시간 동안 금식시켰다. 기저 혈액 샘플을 수득하고, 혈액 글루코스 수준을 휴대용 혈당측정기를 사용하여 결정하였다. 기저 샘플 후에, 경구 급식에 의해 글루코스를 투여하였고, 그 후 15분 내지 120분 동안 혈액 샘플을 채혈하였다. 기준선에서 120분 시점까지의 AUC로서 글루코스 내성을 계산하였다.
실시예 18 K56 Ab - L5 - FGF21 ΔH- K56 활성
FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122R (서열 18)을 상기 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122R은 Glut1 태크만 검정에서 효능이 있는 것으로 발견되었다 (EC50=0.9 nM; n=2). 글루코스 흡수는 5.5 nM인 것으로 나타났다. 기술된 바와 같이 FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122R이 K56에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L5-FGF21ΔH-K56이 형성되었다. Ab-L5-FGF21ΔH-K56은 Glut1 태크만 검정에서 효능을 유지하였고 (EC50=1.9 nM; n=1), IV 반감기 17시간, 및 SC 반감기 13시간을 나타냈다. 생체이용률은 66％였다.
실시예 19 K59 Ab - L5 - FGF21 ΔH- K59 활성
FGF21ΔH-K56R-K59-K69R-K122R (서열 19)을 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-K56R-K59-K69R-K122R은 Glut1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=0.6 nM; n=1). 글루코스 흡수는 0.9 nM이었다. FGF21ΔH-K56R-K59-K69R-K122R이 K59에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L5-FGF21ΔH-K59가 형성되었다. Ab-L5-FGF21ΔH-K59는 Glut1 태크만 검정에서 시험관내 효능을 유지하였고 (EC50=6.5 nM; n=2), IV 반감기 13시간을 나타냈다.
실시예 20 K69 Ab - L5 - FGF21 ΔH- K69 활성
FGF21ΔH-K56R-K59R-K69-K122R (서열 20)을 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-K56R-K59R-K69-K122R은 Glut 1 태크만 검정 (EC50=1.3 nM; n=1) 및 글루코스 흡수 검정 (EC50=5.2 nM) 양쪽 모두에서 효능이 있는 것으로 발견되었다. FGF21ΔH-K56R-K59R-K69-K122R이 K69에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어 Ab-L5-FGF21ΔH-K69가 형성되었다.
실시예 21 K122 Ab - L5 - FGF21 ΔH- K122 활성
FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122 (서열 21)을 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122는 Glut 1 태크만 검정 (EC50=2.6 nM; n=2) 및 글루코스 흡수 검정 (EC50=1.7 nM) 양쪽 모두에서 효능이 있었다. FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122가 K122에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L5-FGF21ΔH-K122가 형성되었다. Ab-L5-FGF21ΔH-K122는 시험관내 효능 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=1.6 nM; n=2)을 유지하였고, IV 반감기 16시간, 및 SC 반감기 14시간을 나타냈다. 생체이용률은 40％였다.
실시예 22 K- null - P2 Ab - L5 - FGF21 ΔH- Knull - P2 활성
FGF21ΔH-Knull-P2 (서열 22)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-Knull-P2는 Glut 1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=1.2 nM; n=2). FGF21ΔH-Knull-P2가 P2의 N' 말단에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-P2가 형성되었다. Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-P2는 감소된 시험관내 효능 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=16.6 nM; n=1) 및 IV 반감기 17시간을 나타냈다.
실시예 23 Knull - H1K Ab - L5 - FGF21 ΔH- Knull - H1K 활성
FGF21ΔH-Knull-H1K (서열 23)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-Knull-H1K는 Glut 1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=6.4 nM; n=2). FGF21ΔH-Knull-H1K가 H1K에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L5-FGF21ΔK-Knull-H1K가 형성되었다. FGF21ΔH-Knull-H1K는 시험관내 효능을 유지하였고 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=4.3 nM; n=2), IV 반감기 16시간, SC 반감기 11시간 및 SC 생체이용률 51％를 나타냈다.
실시예 24 K- null - S181K Ab - L5 - FGF21 ΔH- Knull - S181K 활성
FGF21ΔH-Knull-S181K (서열 24)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-Knull-S181K는 Glut 1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=7.5 nM; n=2). FGF21ΔH-Knull-S181K가 S181K에서 L5와 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-S181K가 형성되었다. Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-S181K는 시험관내 효능의 상실 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=>500 nM; n=2)을 나타냈다.
실시예 25 라이신 돌연변이체들의 활성 결과의 요약
모든 라이신 돌연변이체 단백질이 Glut1 태크만 검정에서 활성이었다. 접합된 경우에, 대다수의 접합체 (K56, K59, K122, Knull-H1K)가 태크만 검정에서 활성을 유지하였고, 이때 EC50 값들이 천연 FGF21 단백질의 것과 유사하였다. Knull-P2 접합체는 초기 효능에서의 약간의 감소를 나타냈고, Knull-S181K 접합체는 태크만 검정에서 활성 상실을 나타냈다.
실시예 26 시스테인- 말레이미드 접합을 사용하여 FGF21 상의 최적의 테더 부위를 확인함
연결 잔기로서 시스테인 치환 돌연변이를 도입할 때 난제 중 하나는 시스테인 잔기가 다른 잔기와 접촉하고 있을 수 있고/있거나 염 다리 또는 수소 결합을 형성할 수 있다는 것이다. 모델링된 구조를 사용하여 원자-수준 거리를 예상하는 것이 어려울 수 있지만, FGFR1c 및 β클로토 결합 부위로부터 멀리 위치하는 것에 대한 가능성을 기초로 다수의 잔기를 선택하였다: His1, Thr40, Asp79, Leu86, His125 및 Ala129.
6개 잔기 모두 구조 요소 (회전 및 루프), 접근가능한 표면적 (ASA), 및 환경 형상 (볼록 및 오목) 면에서 서로 별개이고, 모두를 FGFR1c 상호작용에 대한 단백질의 맞은편 측면 상에서 모델링하였다 (표 2). 특히, His1, Asp79, Leu86 및 His125가 이러한 부위들과 관련된 높은 ASA 값으로 인해 잠재적으로 매력적인 접합 부위인 것으로 확인되었다.
Figure pct00062
실시예 27 H1C FGF21 ΔH- H1C
FGF21ΔH-H1C (서열 16)을 생성시키고 발현하였다. 그러나, FGF21ΔH-H1C 돌연변이체에는 N' 시스테인 기가 없었고, 따라서 이러한 돌연변이체의 연구를 중단하였다.
실시예 28 T40C FGF21 ΔH- T40C
FGF21ΔH-T40C (서열 15)의 생성이 유의한 난제들을 제시하였다. 위치 40의 트레오닌의 시스테인 돌연변이가 리폴딩(refolding) 후 RP-HPLC에서 FGF21ΔH-T40C의 다중 종을 야기하였다. 글루타티온의 부가와 함께 또는 부가 없이, 단백질 농도 및 pH를 변화시킴으로써 리폴딩 프로세스를 개선하기 위해 추가적인 시도가 이루어졌다. RP-HPLC에 의해 리폴딩 프로세스를 모니터링하였다. 글루타티온 부가로 T40C의 효율적인 리폴딩이 초래되었다; 그러나, 글루타티온이, 가장 가능하게는 위치 40의 도입된 시스테인을 통해, FGF21 상에 부착되었다는 것이 발견되었다. 글루타티온 부가물은 야생형 FGF21ΔH와 동일한 생물학적 활성을 나타냈고, 이는 위치 40이 FGF21에 의한 수용체 활성화에서 수반되지 않는다는 것을 가리킨다.
실시예 29 D79C Ab - L1 - FGF21 ΔH- D79C 활성
FGF21ΔH-D79C (서열 12)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-D79C는 Glut 1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=2.1 nM; n=4). FGF21ΔH-D79C가 D79C에서 L1과 조합되고 h38C2와 접합되어, Ab-L1-FGF21ΔH-D79C가 형성되었다. Ab-L1-FGF21ΔH-D79C는 시험관내 효능을 유지하였고 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=3.7 nM; n=3), IV 반감기 17시간 및 19시간 (n=2), SC 반감기 20시간 및 20시간 (n=2) 및 SC 생체이용률 55％ 및 70％ (n=2)를 나타냈다.
실시예 30 FGF21 ΔH- D79C 의 안정성 검정
FGF21ΔH-D79C 돌연변이체 단백질을 상기 기술된 바와 같이 이. 콜라이에서 생산하고 정제하였다. 1 ℓ의 배양물로부터 FGF21ΔH-D79C가 발현되었다. 150 ㎎의 봉입체를 수득하고, 85 ㎎의 정제된 단백질을 수득하여, 60％ 수율이 나타났다. FGF21ΔH-D79C, 뿐만 아니라 FGF21ΔH (서열 2)의 안전성을 테스트하기 위해, 신선하게 해동된 샘플을 7일에 걸쳐 4℃에서 유지시켰고, 제0일, 제3일 및 제7일에 RP-HPLC, SEC_HPLC, 엘만 검정 및 SDS-PAGE에 의해 이들의 통합성에 대해 시험하였다. FGF21ΔH-D79C가 중성 pH 7.4에서 안정적이라는 것이 발견되었다: 미량의 FGF21ΔH-D79C만 4℃에서의 7일 인큐베이션 후에도 산화 및 이량체화된 것으로 나타난 한편, 절반을 초과하는 FGF21ΔH-D79C가 더 낮은 pH 6.0에서 4℃에서의 3일 인큐베이션 후 산화되었다. PBS (pH7.4) 및 20 mM 트리스-HCl 50 mM NaCl (pH 7.5)은 FGF21ΔH-D79C의 안전성의 유의한 차이를 만들지 않았다.
FGF21ΔH-D79C의 유리 시스테인이 pH 6.0에서보다 pH 7.4에서 더 안정적인 이유는 명확하지 않다. WT FGF21의 계산된 등전점 (pI)은 5.43이었고 (예를 들어, FGF21-H1-P146), FGF21ΔH의 pI는 5.27이었으며; FGF21ΔH-D79C의 pI는 5.47이었다. pH 6.0에서 FGF21ΔH-D79C의 가용성이 감소될 수 있다는 것이 가능할 수 있다. FGF21ΔH-D79C의 안정성을 다중 동결/해동 사이클에 대해 시험하였다. 단백질을 반복하여 9회 동결 (-80℃) 및 해동 (4℃)시켰다. 샘플은 RP-HPLC, SEC 및 엘만 검정에서 사이클 1과 사이클 9 사이에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 끝으로, FGF21ΔH-D79C는 -80℃에서보다 4℃에서 유의하게 덜 안정적인 것으로 나타났다.
실시예 31 L86C FGF21 ΔH- L86C
FGF21ΔH-L86C (서열 14)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. 대부분의 소수성 잔기가 단백질 코어(core) 내에 묻혀있지만, 일부 잔기들은 용매에 노출되고, 이는 단백질의 불용성을 야기할 수 있다. Leu86은 소수성 잔기이고, 모델링된 FGF21 구조에서 용매에 노출되는 것으로 보인다. 돌연변이 L86C가 가용성 이점을 제공할 수 있을 것으로 가정되었다.
L86C 돌연변이는 비효율적인 리폴딩 및 낮은 단백질 수율을 초래하였다. 글루타티온 부가가 L86C의 효율적인 리폴딩을 초래하였다; 그러나, 1개를 초과하는 글루타티온이, 가장 가능하게는 도입된 C86, 뿐만 아니라 천연 시스테인 잔기를 통해, 1개의 FGF21 분자 상에 부착되었다는 것이 발견되었다. 글루타티온 부가물은 생물학적 활성의 약 10배 감소를 나타냈고, 따라서 FGF21ΔH-L86C 조사를 중단하였다.
실시예 32 H125C Ab - L1 - FGF21 ΔH- H125C 활성
FGF21ΔH-H125C (서열 7)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-H125C는 Glut 1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=1.2 nM; n=3). FGF21ΔH-H125C가 H125C에서 L1과 조합되고 h38C2와 접합되어 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C가 형성되었다. 접합된 경우에, Ab-L1-FGF21ΔH-H125C는 시험관내 효능을 유지하였고 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=3.2 nM; n=4), IV 반감기 37시간, SC 반감기 32시간 및 SC 생체이용률 67％를 나타냈다.
실시예 33 A129C Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C 활성
FGF21ΔH-A129C (서열 10)를 기술된 바와 같이 생성시키고 정제하였다. FGF21ΔH-A129C는 Glut 1 태크만 검정에서 효능이 있었다 (EC50=1.4 nM; n=6). FGF21ΔH-A129C가 A129C에서 L1과 조합되어 h38C2와 접합되어 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 형성되었다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C는 시험관내 효능을 유지하였고 (Glut1 태크만 검정에서 EC50=2.7 nM; n=7), IV 반감기 33시간, SC 반감기 37시간 및 SC 생체이용률 69％를 나타냈다 (마우스). Ab-L1-FGF21ΔH-A129C는 래트에서의 IV 반감기 60시간, 래트에서의 SC 반감기 39시간, 및 래트에서의 SC 생체이용률 52％를 나타냈다. 원숭이에서, IV 반감기는 65시간이었고, SC 반감기는 48시간이었으며, SC 생체이용률은 68％였다.
실시예 34 내독소 순도의 개선
FGF21ΔH-H125C 및 FGF21ΔH-A129C 단백질을 이.콜라이 발효 배양에 의해 생산하였다. 내독소 수준을 감소시키기 위해, 내독소 수준을 10 EU/㎖ → 0.1 EU/㎖로 감소시킨 제1 Q 후에 추가적인 Q 단계를 이용하였다. 정제 프로토콜을 하기와 같이 변형시켰다. 약 10 g IB를 1ℓ 배양 배지로부터 수득하고, 40 ㎖의 7M 요소, 5 mM DTT, 50 mM BTP (비스-트리스 프로판) pH 10.5로 가용화시켰다 (1 ~ 2시간). FGF21 단백질의 환원을 RP-HPLC로 모니터링하였다. 가용화된 단백질을 400 ㎖의 50 mM BTP, pH 8.0 내로의 희석에 의해 리폴딩시켰다 (24 ~ 36시간). FGF21의 천연 디술피드 결합의 산화를 RP-HPLC로 모니터링하였다. 일단 리폴딩이 거의 완료되면, 4ℓ의 20 mM 트리스-HCl, pH 7.5에 대해 용액을 2회 투석하였다. 가용화되지 않은 단백질을 20,000×g에서 60분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 침전시켰다. 상층액을 하이트랩 Q FF 상에 로딩하고, FGF21 단백질을 0 ~ 200 mM NaCl 구배 (20 CV, 20 mM 트리스-HCl, 0.01 mM TCEP, pH 7.5)로 용출시켰다. 수집된 분획들을 0 ~ 100 mM 이미다졸 구배 (10 CV, 0.01 mM TCEP, PBS, pH 7.4)로 하이트랩 Ni-NTA FF 상에 로딩하여 잔류 DNA를 효율적으로 제거하였다. 원하는 분획들을 4ℓ의 20 mM 트리스-HCl, 0.01 mM TCEP, pH 7.5에 대해 2회 투석하고, 용출을 위해 0 ~ 100 mM NaCl 구배 (20 CV, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.5)로 하이트랩 Q HP 칼럼 상에 로딩하였다. 정제된 단백질 분획들을 수집하고, 0.22 mm 필터로 멸균하고, -80℃에서 보관하였다.
1ℓ 배양 배지로부터의 전형적인 수율은 약 350 내지 약 400 ㎎이었다. 정제된 단백질의 전형적인 수율은 약 220 내지 약 280 ㎎이었다. 이러한 정제 기술로 > 95％의 순도 및 약 1 EU/㎎의 전형적인 내독소 수준으로 단백질이 산출되었다. 진탕 플라스크 대신 발효기를 사용하는 것으로 수율이 약 4배 내지 약 5배 개선되었다.
실시예 35 링커 선택
하기의 L1의 말레이미드 고리가 개방 및 이어지는 경시적인 생성물 분해에 대해 감수성일 수 있다는 것이 공지되어 있다 ([Woodnutt, G; IBC Conference "Beyond Antibodies/Protein Engineering Design", San Diego, 21-23rd September 2009]).
반응식 1에 제시된 바와 같이 말레이미드 링커 예컨대 L1이 티올과 반응하여 말레이미드 부분이 있는 티올 부가물을 형성할 수 있다. 말레이미드에 대한 이러한 티올 부가 반응은 마이클(Michael) 부가 반응으로 지칭된다. 이어서, 아민을 함유하는 기 (예컨대 항체 h38C2)가 반응식 1에 제시된 바와 같이 AZD (β-락탐)와 반응하여 6이 산출될 수 있다. 생성된 티올-숙신이미드 부가물은 안정적이다. 그러나, 숙신이미드 고리에 경시적으로 느린 가수분해성 절단이 진행되어 7 및/또는 8이 초래될 수 있다. 따라서, 마이클 반응이 진행되는 능력은 보존하면서, 말레이미드 고리의 가수분해성 절단에 대한 안정성이 개선되는 것이 바람직하다.
<반응식 1>
Figure pct00063
실시예 36 말레이미드 변형
따라서, 말레이미드 고리를 변형시키는 것에 의해 더욱 안정적인 링커가 생성될 수 있을 것으로 예상하면서 L1 내의 말레이미드 고리의 안정성을 시험하였다. 물에 의한 말레이미드 고리의 잠재적인 가수분해성 절단을 느리게 하기 위해, 3가지 상이한 접근법 (L2 - L4)을 취하여 고리를 변형시키고 안정성을 개선하였다.
Figure pct00064
먼저, 고리에 부착된 소형 알킬 기가 숙신이미드 고리의 가수분해성 절단을 느리게 할 수 있을 것으로 구상되었다. 숙신이미드 고리 상에 메틸 기가 있는 링커 2를 제조하였다. 고리에 가수분해성 절단이 진행되기 위해, 물 분자가 카르보닐 기에 부가되고, 전이 상태로서 4면 중간체를 형성한다. 메틸 기의 존재가 4면 중간체의 형성을 입체적으로 및 전자적으로 제한할 것이고, 가수분해 속도를 현지히 감속시킬 것이다.
두 번째 변형은 말레이미드 고리의 카르보닐 기에 인접한 프로피온아미드 카르보닐 기에 집중하였다. 카르보닐 기는 일반적으로 물을 유인한다. 카르보닐 기가 말레이미드 고리에 인접하여 있는 것은 물을 유인하는 것을 돕고, 말레이미드 고리의 카르보닐 기 상에서의 공격을 용이하게 한다. 프로피온아미드 카르보닐 기를 제거함으로써, 가수분해성 고리 개방 반응이 감속된다. 이러한 변형이 L3에서 나타났다.
세 번째 변형은 L4에서 나타난 바와 같이 프로피온아미드 기 대신 시클로헥실메틸렌 기를 도입하는 것이었다. 시클로헥실 고리의 큰 부피의 소수성 성질이 고리가 개방된 가수분해성 절단에 필요한 고리의 카르보닐 기로의 물 부가에 의해 4면 중간체의 형성을 전자적으로 및 입체적으로 방해할 것이다. 이것이 가수분해성 절단을 감속시킬 것으로 예측되었다.
안정성 연구
안정성 연구를 위해, 링커 L1 - L4로부터의 1-(3-(4-아미노페닐)프로파노일)아제티딘-2-온 부분을 제거하였다. 말레이미드가 아미노산 3개의 펩티드인 글루타티온과 접합된 4개의 테스트 화합물을 제조하였다 (30-33).
실시예 37 화합물 30의 합성
디메틸술폭시드 (5 ㎖) 내의 3-(2-(2-(3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-에톡시)에톡시)프로판산 (164 ㎎, 0.5 mmol) 및 환원된 글루타티온 (154 ㎎, 0.5 mmol)의 용액을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (25 ㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 고체를 여과하였다. 고체를 추가적인 25 ㎖의 에틸 아세테이트로 세정하고, 건조시켜 252 ㎎의 화합물 30을 제공하였다.
Figure pct00065
실시예 38 화합물 31의 합성
디메틸술폭시드 (1.2 ㎖) 내의 3-(2-(2-(3-(3-메틸-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)에톡시)에톡시)프로판산 (42 ㎎, 0.12 mmol) 및 환원된 글루타티온 (37 ㎎, 0.12 mmol)의 용액을 실온에서 22시간 동안 교반하였다. 에테르 (10 ㎖) 내의 50％ 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고, 고체를 여과하였다. 고체를 추가적인 25 ㎖의 에틸 아세테이트로 세정하고, 건조시켜 67 ㎎의 화합물 31을 제공하였다.
Figure pct00066
실시예 39 화합물 32의 합성
디메틸술폭시드 (2 ㎖) 내의 3-(2-(2-(3-메틸-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)프로판산 (50 ㎎, 0.2 mmol) 및 환원된 글루타티온 (61 ㎎, 0. 2 mmol)의 용액을 실온에서 25시간 동안 교반하였다. 에테르 (30 ㎖) 내의 65％ 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고, 고체를 여과하였다. 고체를 추가적인 25 ㎖의 에틸 아세테이트로 세정하고, 건조시켜 92 ㎎의 화합물 32를 제공하였다.
Figure pct00067
실시예 40 화합물 33의 합성
디메틸술폭시드 (1.2 ㎖) 내의 3-(2-(2-(4-((3-메틸-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산카르복사미도)에톡시)에톡시)프로판산 (50 ㎎, 0.12 mmol) 및 환원된 글루타티온 (37 ㎎, 0.12 mmol)의 용액을 실온에서 22시간 동안 교반하였다. 에테르 (10 ㎖) 내의 50％ 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고, 고체를 여과하였다. 고체를 추가적인 25 ㎖의 에틸 아세테이트로 세정하고, 건조시켜 75 ㎎의 화합물 33을 제공하였다.
Figure pct00068
실시예 41 화합물 30-33의 안정성 연구
Figure pct00069
화합물 30, 31, 32 및 33을 고리가 개방된 생성물의 형성, 뿐만 아니라 글루타티온 절단에 대해 LC-MS 상에서 모니터링하였다. 이러한 새로운 유사체들을 40℃의 pH = 6.5 완충제, 40℃의 pH=7.5 완충제, 및 4℃의 pH=7.5 완충제에서의 안정성에 대해 모두 2주 기간에 걸쳐 시험하였다 (표 3A-C).
화합물 30, 31, 32 및 33을 실온에서 완충제에 용해시켰다. 샘플을 40℃에서 인큐베이션하고, 완충제 용액을 설정된 간격으로 분석하였다. 규정된 간격으로, 10 ㎕의 완충제 용액을 분석을 위해 애질런트(Agilent)의 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분광계 상에 주입하였다. 칼럼으로부터의 용리액을 210 및 254 nm에서 UV 분광계를 사용하여, 그리고 또한 질량 분광계를 사용하여 모니터링하였다. 가수분해 부산물을 질량 분광계를 사용하여 모니터링하고, 가수분해 백분율을 특정 질량의 총 이온 전류를 기초로 계산하였다.
L2, L3 및 L4의 변형된 말레이미드 고리 (31-33)가 L1 내의 말레이미드 고리 (30)와 비교하여 pH = 6.5, 40℃에서 5-10배 더 안정적이고, pH=7.5 완충제, 40℃에서 4-15배 더 안정적이며, pH=7.5 완충제, 40℃에서 20배까지 더 안정적이었다는 것이 표 3A-3C에서 ％ 가수분해를 나타내는 LC-MS 데이터로부터 명백하였다. 글루타티온 접합의 결과 (표 3A, 3B 및 3C의 데이터 포함)가 [IBC Conference "Beyond Antibodies/Protein Engineering Design", San Diego, 21-23rd September 2009]에서 논의되었다.
Figure pct00070
실시예 42 FGF21 에 접합된 링커 L1 - L4 의 안정성
하기의 실험을 수행하여 FGF21에 대한 접합 시 4개의 링커의 2주에 걸친 화학적 안정성을 조사하였다: 각각의 링커를 FGF21에 접합시키고, +4℃ 보관 조건에 놓고, 분취량을 제거하고, 특정 시점에 동결시켜 켄칭(quenching)시키고, 링커 안정성을 LCMS 분석으로 모니터링하였다.
4개의 링커를 동결건조된 스톡(stock) 물질로부터 DMSO에 용해시켰다. FGF21ΔH-A129C 단백질을 0.1 mM TCEP로 30분 동안 부분적으로 환원시킨 후, 1:1 링커:단백질 비로 링커 스톡을 첨가하였다; 접합 반응에서의 FGF21ΔH-A129C 단백질 농도는 5 ㎎/㎖였다. L1은 30분 동안 단백질과 반응시켰다; L2, L3 및 L4는 2시간 동안 반응시켰다. 크기-배제 수지를 통해 과량의 링커를 제거함으로써 접합 반응을 켄칭시켰다. 접합된 FGF21ΔH-A129C 단백질을 안정성 보관을 위해 +4℃에 놓았다. t=0일 (안정성 보관 전) 및 t=1일, 3일, 8일 및 14일에 분취량을 제거하였다. 링커 안정성 분석을 LC-MS 분석으로 수행하여 미접합 단백질, 단백질 + 링커 접합, 및 접합된 단백질 + 링커의 단일 및 이중 가수분해 이벤트의 상대적인 양을 결정하였다.
링커 가수분해가 이러한 실험에서의 결정적인 분석 변수이다. FGF21-링커 복합체로의 후속 H2O 첨가를 관찰함으로써 가수분해를 모니터링하였다. 단일 H2O 첨가인 +(1) H2O는 4개의 링커 모두에 존재하는 활성 AZD 기의 가수분해를 가리킬 것이다. 제2 H2O 분자의 첨가인 +(2) H2O는 링커에서의 가수분해 (예를 들어, 화학적 불안정성)의 강한 지표이다. 말레이미드 관능기의 존재로 인해 L1이 특히 감수성이다.
하기 표 4의 실험 결과는 L1에서 +(2) H2O의 가장 큰 증가가 진행된다는 것을 나타낸다. t=0에서, L1-L4 각각의 +(2) H2O 측정값은 측정된 전체 단백질의 6-8％ 사이였다. 이러한 샘플들을 모니터링한 2주 동안, L1에서 관찰된 +(2) H2O가 18％로 증가한 한편, 나머지 링커 L2-L4 각각에 대한 값은 6-8％로 일정하였다. 이러한 데이터는 L1이 L2-L4에 비교하여 상대적으로 불안정하다는 것을 시사한다.
Figure pct00071
실시예 43 L1 - L4 와 접합된 Ab - FGF21 ΔH-A129C
L2-L4는 다양한 조건 하에서의 글루타티온 접합 (표 3A-C 참조) 및 FGF21 (표 4)으로 L1보다 더욱 안정적인 것으로 이전에 나타났다. 변형된 말레이미드 링커 L2-L4가 FGF21ΔH-A129C에 융합되었고 (접합 효율이 표 5에서 제시됨), Glut1 태크만 검정에서 활성을 나타냈다 (표 5): FGF21ΔH에 대한 상대적인 값에 대해 EC50 값이 표준화된다).
Figure pct00072
그러나, 상기에도 불구하고, Ab-L2-FGF21ΔH-A129C, Ab-L3-FGF21ΔH-A129C, Ab-L4-FGF21ΔH-A129C가 생체 내에서 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C보다 각각 덜 안정적이었다. 이는 IV 투여 후의 혈행에서의 더 낮은 지속 수준, 및 SC 투여 후의 혈행에서의 더 낮은 피크 및 지속 수준으로서 명백하였다 (도 2a-c, 표 6). 놀랍게도, 이러한 결과들은 완충제 시스템에서 소형 펩티드에 융합된 링커로 수행된 안정성 연구의 결과와 반대이다.
Figure pct00073
이러한 결과들이 마우스 혈청에서의 추가적인 연구에서 지지되었다. FGF21ΔH-A129C를 L1, L2, L3 및 L4 각각을 사용하여 h38C2에 접합시켰다. 각각의 샘플을 마우스 혈청에서 0.3 ㎎/㎖로 희석하고, 37℃에서 인큐베이션한 후, 동결시키고, 이어서 2DLC/MS로 분석하였다. 기준 표준물과 비교하여, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 5분 후 149％, 34시간 후 66％, 72시간 후 81％로 검출되었고, 120시간에는 검출될 수 없었다. 대조적으로, Ab-L2-FGF21ΔH-A129C, Ab-L3-FGF21ΔH-A129C, Ab-L4-FGF21ΔH-A129C는 모든 샘플에서 검출될 수 없었다.
실시예 44 L1 & L2 와 접합된 Ab - FGF21 ΔH-A129C의 래트 연구
FGF21 단백질을 항체 스캐폴드에 접합시키는데 사용된 링커가 상이한 2가지 버전의 Ab-FGF21ΔH-A129C의 단일 용량 약동학 (PK)을 수컷 스프라그 돌리 래트에서 결정하였다. 래트에게 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C (말레이미드 링커) 또는 Ab-L2-FGF21ΔH-A129C (메틸 말레이미드 링커)를 IV 또는 SC 투여하고 (3 ㎎/㎏), 투여 후 5분 내지 14일 동안 때때로 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈청 Ab-FGF21ΔH-A129C 수준을 ELISA로 결정하였고, 이때 FGF21 접합체가 FGF21에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 통해 포획되었고 항-인간 Fc에 의해 검출되었다. 생성된 PK 데이터는 Ab-L2-FGF21ΔH-A129C 접합체 (T1 /2: IV = 52시간, SC = 33시간; SC 생체이용률 = 36％)와 비교하여 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 접합체의 PK 특성 (T1 /2: IV = 60시간, SC = 38시간; SC 생체이용률 = 52％)이 우월하였음을 나타냈다 (도 3a 및 표 7). 소형 펩티드에 융합된 이러한 링커들로 완충제 시스템에서 수행된 안정성 연구의 결과를 고려하면, 이러한 결과들은 예상되지 않았다.
Figure pct00074
실시예 45 Glut1 RNA 에 대한 Ab - FGF21 ΔH-A129C + L1 및 L2 의 효과
3T3-L1 지방세포를 제8일에 24웰 조직 배양 플레이트 (팔콘(Falcon)®, 카탈로그#353047)에 시딩(seeding)하고, 37℃, 5％ CO2에서 DMEM 완전 배지 (10％ FBS, 2 mM L-글루타민, 1％ P/S)에서 인큐베이션하였다. 세포를 무혈청 DMEM 배지 + 0.2％ BSA로 밤새 고갈시키고 (제12일), 0.2％ BSA를 함유하는 무혈청 DMEM 내의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 및 Ab-L2-FGF21ΔH-A129C로 37℃에서 6시간 동안 처리하였다. 배지를 흡인한 후, RN이지 미니 키트(RNeasy mini Kit)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 스펙트라맥스® 플러스(Spectramax® Plus) 분광광도계를 사용하여 A260 nm에서 RNA를 측정하였다.
Figure pct00075
FGF21ΔH, FGF21ΔH-A129C, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C, 및 Ab-L2-FGF21ΔH-A129C에 의한 3T3-L1 지방세포 자극이 용량-의존적 Glut1 유도를 초래하였다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 Ab-L2-FGF21ΔH-A129C보다 더 효능이 있는 것으로 나타났다 (표 8).
실시예 46 링커 길이 연구
Ab-L1-FGF21ΔH-D79C, Ab-L7-FGF21ΔH-D79C, 및 Ab-L8-FGF21ΔH-D79C를 서로에 대해 테스트하여, 링커 길이 허용성을 평가하였다. 세포-기반 검정에서 모두 유사한 PK (도 3b 및 표 9) 및 필적하는 효능 (데이터는 제시되지 않음)을 나타냈다.
Figure pct00076
실시예 47 잔기 위치 및 링커 선택의 요약
티올-말레이미드 접합 전략을 사용하여 잠재적인 접합 부위로서 H1C, T40C, D79C, L86C, H125C 및 A129C를 테스트하였다. 이들 중에서, H1C, T40C 및 L86C가 발현 및 리폴딩 문제를 나타냈다. D79C, H125C 및 A129C를 추가로 탐구하였는데, 이들 모두가 허용가능한 수준의 단백질 생산을 나타냈고 미접합 돌연변이체 단백질이 여전히 효능이 있었음을 실연하였기 때문이다. Ab-FGF21ΔH-D79C, Ab-FGF21ΔH-H125C, 및 Ab-FGF21ΔH-A129C는 FGF21ΔH와 유사한 생활성을 나타냈고, 이는 이러한 위치들에서 항체를 접합시키는 것이 수용체 결합을 방해하지 않는다는 것을 시사한다. D79C, H125C 및 A129C는 FGF21ΔH와 안정성 및 생활성이 유사하다.
테스트된 라이신 돌연변이체 항체 접합체 모두가 H125C 및 A129C 항체 접합체보다 열등한 마우스 PK를 나타냈고, 이때 IV 반감기는 13-17시간이었다 (표 10).
Figure pct00077
Ala129가 용매에 고도로 노출되지 않았고, D79 또는 H125보다 덜 그러하지만, FGF21ΔH-A129C가 놀랍게도 가장 안정적인 돌연변이체 중 하나 및 항체 접합에 대해 테스트된 최상의 위치였다. 이는 뜻밖이었는데, 이러한 돌연변이가 비-보존적이기 때문이다. 이론에 의해 제한되기를 원치는 않지만, A129C에서 접합되는 것의 독특한 적절성에 대한 여러 가능한 이유가 있다. 먼저, Ala129, 뿐만 아니라 His125는 양쪽 모두 모델링된 FGF21 구조에서 가요성인 루프 영역 내에 위치한다. 일반적으로 이러한 영역들은 다른 헤파린 결합 FGF 구성원들에 대한 헤파린 결합 부위이다. FGF19, FGF21 및 FGF23은 헤파린과 상호작용하지 않기 때문에, 이러한 영역의 서열 정확성을 유지하는 것은 이들의 생물학적 기능에 결정적이지 않을 수 있다. 이러한 위치의 가요성은 수용체 결합을 방해하는 것을 방지하도록 항체-접합에 이로울 수 있다. 두 번째로, 양성으로 하전된 잔기, 즉 His125, Arg126, Arg131, 및 Arg135가 Ala129를 둘러싼다. 이러한 양성으로 하전된 패치(patch)는 강한 하전 반발로 인해 FGF21ΔH-A129C의 SS-이량체화를 방지할 수 있다. 세 번째로, 이러한 하전 잔기들은 말레이미드 링커 L1의 안정화를 선호할 수 있고, 이러한 링커는 이들의 부재 시 말레이미드의 고리-개방 후 카르복실레이트를 생성시킬 수 있다. 따라서, 말레이미드 연결 전략을 사용하여 FGF21을 접합시킬 때, A129의 특정 잔기 위치에서 연결하는 것이 특히 유리한 것으로 보인다.
Ab-L1- FGF21ΔH-A129C 및 Ab-L1- FGF21ΔH-H125C 양쪽 모두 뮤린 모델에서 30시간 이상의 높은 IV 반감기 및 SC 반감기를 나타낼 뿐만 아니라, 양호한 생체이용률을 나타낸다. 양쪽 접합체 모두에서 Glut1 태크만 검정에서 4 nM 미만의 효능이 실연된다. 일반적으로, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C와 비교하여 약간 개선된 반감기 및 효능을 나타낸다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C에서의 L1 사용은 시험관내 테스트가 제안하는 것을 넘어서는 놀라운 생체내 장점을 또한 나타냈고, 테스트된 것들과 비교하여 종합적으로 가장 유리한 링커로 보인다.
Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 성분들 (항체, 링커, 연결 잔기 위치, 연결 잔기, 단백질)의 특이적인 조합이 여러 별법들과 비교하여 반감기, 생체이용률, 효능, 활성, 생산 용이성, 및 가수분해에 대한 저항성에서의 최적 조건을 제공하는 것으로 보인다.
실시예 48 화합물의 효능
글루코스 내성을 화합물 Ab-FGF21ΔH-K56 및 Ab-FGF21ΔH-Knull-H1K로 처리된 ob/ob 마우스에서 테스트하였다. 양쪽 화합물 모두 Ab-FGF21ΔH-H125C (도 4a 및 4b) 및 Ab-FGF21ΔH-A129C (도 5a 및 5b)에 비해 불량하였다. 대조적으로, Ab-FGF21ΔH-D79C 및 Ab-FGF21ΔH-H125C는 글루코스 내성을 개선하고 체중 증가를 감소시키는 것으로 나타났다 (도 4a, 4b, 6a, 6b, 6c, 6d, 및 표 11).
Figure pct00078
Ab-FGF21ΔH-A129C는 글루코스 내성을 개선하는 것으로 발견되었고, 백색 지방 조직 (WAT)에서의 증가된 Ucp1 발현으로 증명되는 증가된 에너지 소비로 인해 체중 증가를 감소시켰으며, ob/ob 마우스에서 간 지방증을 역전시켰다 (도 6e, 6f, 6g, 6h 및 표 12). Ucp1 발현에 대해, 생체내 효능 연구로부터 수집된 동결된 내장 WAT 샘플을 균질화하였다. 총 RNA를 조직 균질화물로부터 추출하고, 퀀티텍트 프로브 RT-PCR 키트를 사용하여, 그리고 태크만 기계 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 정량적 실시간 PCR 반응을 실행하여 Glut1 및 GAPDH mRNA 발현을 측정하였다. 각각의 샘플로부터의 GAPDH mRNA 수준에 의해 표준화된 Glut1 mRNA 수준에서의 배수 변화에 의해 치료 효과를 결정하였다. Ab-FGF21ΔH-A129C는 WAT에서의 증가된 Ucp1 발현에 의해 제안되는 바와 같은 증가된 에너지 소비로 인해 체중 감소를 야기하였고, DIO 마우스에서 혈청 트리글리세리드 및 지방산 수준을 감소시켰으며, 간 중량을 감소시켰다 (도 7a, 7b, 7c, 7d, 7e, 및 표 13). 간 중량에서의 감소가 ob/ob 마우스에서 또한 관찰되었다 (도 7f 및 표 14). ob/ob 마우스에서의 추가적인 테스트에서 스테아로일-코엔자임 A 디새츄라제-1 (SCD1), 모노아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 (MOGAT2), 및 포크헤드 박스 A2 (FoxA2)의 RNA 수준에서의 감소가 실연되었다 (도 7g, 7h 및 7i 및 표 15).
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
실시예 49 ob / ob 모델에서의 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 혈장 약물 수준
ob/ob 마우스에서의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 용량-관련 혈청 수준을 10 ㎎/㎏ 및 3 ㎎/㎏을 투여하고 나서 투여 후 제3일, 제4일, 제5일 및 제6일에 시험하였다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 혈청 수준이 잘 유지되는 것으로 관찰되었다 (도 7j 및 7k). 이러한 결과들은 건강한 동물에서의 약동학과 일관되었다.
실시예 50 인슐린 감도에 대한 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 생체내 효과
의식이 있는, 구속되지 않은 ob/ob 마우스에서의 고인슐린혈증 정상혈당 클램프 동안의 간 글루코스 생산 및 전신 인슐린 감도 (글루코스 주입 속도로서 측정됨)에 대한 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 생체내 효과를 결정하기 위해 연구에 착수하였다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C (30 mM 아세테이트 완충제, pH 4.8 내)를 일주일 동안 10 ㎎/㎏의 용량으로 1주일에 2번 SC 투여하였다. 투여 부피는 주사 당 2 ㎖/㎏이었다. Ab-FGF21ΔH-A129C를 연구 제2일 및 제5일에 주사하였다. 비히클 (30 mM 아세테이트 완충제 pH 4.8)을 일주일에 2번 주사 당 2 ㎖/㎏의 투여 부피로 연구의 제2일 및 제5일에 투여하였다. 마우스를 수술 직전에 케토프로펜 2 ㎎/㎏ SC 및 앰피실린 100 ㎎/㎏ SC로 처치하였다. 동물 (n=8마리/군)을 제1일 공복 혈장 글루코스 및 체중에 따라 무작위화하였다.
체중을 연구 제1일, 제4일, 제7일 및 제8일에 기록하였다. 놀랍게도, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C에서는 이러한 연구에서 체중에 대한 효과가 실연되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 공복 혈장 글루코스를 제1일 (4시간 공복) 및 제8일 (16시간 공복)에 애큐-체크(Accu-Chek) 휴대용 혈당계 (로슈(Roche))로 결정하였다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C는 이러한 연구에서 공복 혈장 글루코스 수준에 대한 효과가 없었다 (데이터는 제시되지 않음).
연구 제7일에, 마우스를 제8일의 클램프 시술 전에 16시간 동안 금식시켰다. 제8일에, 카테터를 외면화하고, 동물을 주입 라인에 연결시켰다. 클램프 시술을 시작하기 90분 전에 (-90분), 6 μCi 볼루스의 [3-3H] 글루코스를 목정맥 내로 주사하고, 이어서 클램프 종료까지 0.1 μCi/분로 일정하게 주입하였다. 기저 HGP를 결정하기 위해 -10분 및 0분에 혈액을 수집하였다. 0분 시점에, 가변성 글루코스 주입 (50％ 덱스트로스), 뿐만 아니라 인슐린 20 mU/㎏/분의 일정한 주입을 시작하였다. 꼬리 정맥으로부터 10분 마다 혈장 글루코스를 측정하였고, 항정 상태에 도달할 때까지 각각의 동물의 글루코스 수준에 따라 글루코스 주입 속도를 조정하였다. 170분 및 180분 시점에, 혈액을 수집하여 클램프 조건 하에서의 간 글루코스 생산 (HGP)을 결정하였다. 클램프 시술 동안, 동물들은 구속되지 않았고 의식이 있었다.
하기의 식을 사용하여 간 글루코스 생산 (HGP)을 계산하였다:
HPG = Ra - 콜드(cold) 글루코스 주입 속도
식 중,
Figure pct00083
출현 속도 (Ra) (정상 상태로서는 = 소실 속도 (Rd))
Ab-L1-FGF21ΔH-A129C는 비히클로 처치된 동물과 비교하여 ob/ob 마우스에서 체중 또는 공복 혈장 글루코스에 영향을 미치지 않았다. 모든 동물이 성공적으로 클램핑되었고, 마지막 30분의 클램프 동안 100-110 ㎎/㎗의 정상혈당 혈장 글루코스 수준, 뿐만 아니라 일정한 글루코스 주입 속도에 도달하였다. 비히클- 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C-처치 군에서 정상혈당 (100 ㎎/㎗ - 110 ㎎/㎗ 혈장 글루코스)이 도달되었다. 혈장 글루코스 수준을 고인슐린혈증 정상혈당 클램프의 전체 기간에 걸쳐 측정하였다 (도 8a). 실험의 마지막 30분 (클램프 기간) 동안 비히클-처치 동물과 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C-처치 동물 사이에 통계적 차이가 없었다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C는 비히클과 비교하여 글루코스 주입 속도 (GIR)를 유의하게 증가시켰다 (도 8b). Ab-L1-FGF21ΔH-A129C는 기저 간 글루코스 생산 (HGP)을 변경시키지 않았지만, 클램프 (고인슐린혈증) 조건 하에 HGP를 유의하게 억제하였다 (도 8c).
결론적으로, 이러한 연구에서 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 체중 또는 공복 혈장 글루코스 수준에 대한 효과가 없으면서 비히클로 처치된 동물과 비교하여 전신 인슐린 감도의 척도인 글루코스 주입 속도를 유의하게 증가시켰고, 간 글루코스 생산을 억제하였다.
실시예 51 사이노몰구스 마카크(cynomolgus macaques)에서의 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 효과
이러한 연구의 목적은 매주 2회의 SC 주사를 통해 비만인 인슐린 저항성 (당뇨-전) 사이노몰구스 마카크에 투여되었을 때, 혈장 혈당 및 지질 지수, 뿐만 아니라 글루코스 내성 및 염증성 바이오마커에 대한 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 효과를 평가하는 것이었다. 또한 연구는 FGF21ΔH를 매일 투여하는 것과 비교하여 원숭이에서의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 약역학 (PD) 효과의 기간을 결정하도록 디자인되었다.
22마리의 성체 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis))가 연구에 포함되었다. 원숭이 (수컷 13마리, 암컷 11마리)를 성별, 체중, 및 투여를 시작하기 2주 전에 수집된 기준선 혈장 샘플에서 측정된 기저 혈당 및 지질 지수를 기초로 개체 6마리의 처치 군 4개로 계층화하였다. 동물을 고지방 식이에서 유지시켰다. 동물에게 4주 동안 투여한 후, 4주 약효세척 기간이 이어졌다. 하기와 같이 동물에게 투여하였다: 1.5 ㎎/㎏ (A군; 수컷 (m) 4마리, 암컷 (f) 1마리) 및 0.15 ㎎/㎏ (B군; 3m, 3f)으로 25 mM 트리스, 125 mM NaCl pH 7.0 내의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C를 매주 2회 SC, 비히클 (최종 pH 7.0의 25 mM 트리스 및 125 mM NaCl)을 매주 2회 s.c. (C군; 3m, 3f), 및 0.3 ㎎/㎏으로 FGF21ΔH를 하루에 1번 (QD) (D군; 3m, 2f).
투여 및 약효세척 기간 동안 혈액 샘플을 매주 수집하였고, 예외적으로 약효세척 중 제3주에는 샘플을 수집하지 않았다. 밤새 금식시킨 후 (16-18 h), 원숭이를 근육내 (IM) 주사에 의해 케타민 10-15 ㎎/㎏으로 진정시켰다. 체중을 기록하고, ~1.8 트립신 억제제 유닛 (TIU) 아프로티닌(Aprotinin) (시그마(Sigma) 0.6 TIU/전혈 ㎖)으로 예비처리된 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)-처리 배큐테이너(Vacutainer) 튜브 내로 경피 대퇴부 정맥천자를 통해 혈액 (5 ㎖)을 수집하였다. 튜브를 즉각적으로 얼음 위에 놓았다. 원심분리에 의해 혈장을 제조하고, 생성된 혈장을 분취하여 -80℃에서 동결시켰다.
투여 기간 중 제1일, 제14일 및 제28일에 혈장 약물 수준 샘플링을 수행하였다. 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 혈장 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 수준을 결정하였다. Ab-L1-FGF21ΔH-A129C를 마우스 항-유전자형(idiotypic) h38C2를 사용하여 포획하고, FGF21의 N- 및 C-말단에 대해 지시된 비오틴화 마우스 항-FGF21 모노클로날 항체들의 혼합물로 검출하였다. C-말단 검출 항체는 FGF21의 마지막 4-5개 아미노산에 대한 특이성이 있는 한편, N-말단 검출 항체는 FGF21의 처음 11-12개 아미노산에 대해 생성되었다. 이중-검출 시약 검정에 대한 최소로 필요한 희석은 3％ BSA 포스페이트 완충 염수에서의 1:20이었다. 교정 범위는 0.03-10 ㎍/㎖였고, 정량 범위는 0.03-4 ㎍/㎖였다.
데이터를 각각의 약역학 종점에 대해 동일한 방식으로 처리하였다. 각각의 개별적인 원숭이에 대한 기준선 값을 각각의 시점에서 차감하여 기준선으로부터의 변화에 상응하는 값을 제공하였다. 기준선 값으로부터의 변화를 각각의 처치 군에서 각각의 시점에 대해 평균하였고, 평균의 표준 오차 (SEM)를 계산하였다. 결과는 연구 과정에 걸친 각각의 처치 군에 대한 기준선으로부터의 평균 변화 ± SEM으로서 보고된다. 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏ Ab-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 동물에 대해, 각각의 시점의 통계적 유의성을 기준선 값으로부터의 변화 및 스튜던트 T-테스트 (쌍을 이루지 않은 샘플, 이분산)를 사용하여 비히클에 대해 평가하였다. FGF21ΔH로 처치된 동물에 대한 비히클 대조군이 없었기 때문에, 기준선 값으로부터의 변화가 아니라 미가공 데이터가 통계적 유의성을 평가하는데 사용되었다. 이러한 경우에, 스튜던트 T-테스트 (양측, 쌍을 이룬 샘플)를 기준선에 대해 수행하였다.
실시예 52 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C 혈장 약물 수준
혈장 약물 수준이 표 16에서 제시된다. 측정가능한 수준의 약물이 1차 투여 4시간 후 및 테스트된 모든 후속 시점에 존재하였다.
Figure pct00084
실시예 53 체중
양쪽 AB-L1-FGF21ΔH-A129C 용량 군에서 2주 후 및 FGF21 대조군 단백질로 처치된 군에서 1주 후에 치료에 대한 체중에서의 유의한 감소가 있었다 (도 9a). 모든 군에서, 체중 감소가 약효세척 기간 동안 여전히 낮았지만, 양쪽 AB-L1-FGF21ΔH-A129C 군에서 4주의 약효세척에는 손실되었다. FGF21ΔH로 처치된 동물은 AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 동물보다 더 높은 체중 감소를 나타냈다. 이러한 동물들에서 음식 섭취를 직접적으로 측정하지는 않았지만, 어떠한 처치 군 내의 어떠한 동물에서도 식욕 부진이 관리 스탭에게 관찰되지 않았다.
실시예 54 공복 혈장 글루코스
에이스 알레라(Ace Alera)® 임상 화학 분석기 및 시약 (알파 와서만(Alfa Wassermann), 뉴저지주 콜드웰)을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 효소 칼로리측정 방법을 통해 혈장 글루코스를 측정하였다. 어떠한 처치 군에서도 시간에 따른 공복 혈장 글루코스 (도 9b)에서의 유의한 변화가 없었고, 이는 AB-L1-FGF21ΔH-A129C로의 장기 처치가 저혈당증을 야기하지 않는다는 것을 가리킨다.
실시예 55 공복 혈장 인슐린
머코디아(Mercodia)® (스웨덴 웁살라)로부터의 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 혈장 인슐린 농도를 결정하였다. 어떠한 처치 군에서도 시간에 따른 공복 혈장 인슐린 (도 9c) 수준에서의 유의한 변화가 없었다.
실시예 56 공복 혈장 프룩토사민
로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics)® (독일 만하임)으로부터의 키트를 사용하여 에이스 알레라 임상 화학 분석기를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 효소에 의한 비색 방법을 통해 혈장 프룩토사민을 측정하였다. 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C 처치 군에서 각각 4주 및 3주의 처치 후에, 그리고 FGF21 대조군 단백질로 처치된 동물에서 3주 후에 혈장 프룩토사민 수준이 유의하게 감소하였다 (도 9d). 이러한 유의성이, 특히 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C 처치 군에서, 약효세척 기간 내로 지속되었지만, FGF21ΔH로 처치된 동물에 대해서는 시점들에 걸쳐 일관적이지 않았다. 경시적인 혈장 프룩토사민 수준에서의 유의한 감소는 개선된 혈당 제어를 가리킨다.
실시예 57 공복 혈장 글루카곤
바이오플렉스® 인스트루먼트(BioPlex® Instrument) (루미넥스 xMAP 테크놀러지(Luminex xMAP technology)) 상에서 밀리포어(Millipore)®로부터의 인간 (비-인간 영장류와 교차반응함) 내분비 면역검정 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 혈장 글루카곤을 측정하였다. 3가지 처치 군 모두에서 글루카곤 수준이 감소하였고, 이때 연구 전반에 걸쳐 일부 시점에서 유의성에 도달하였지만, 감소 유의성이 처치 군에 걸쳐 또는 AB-L1-FGF21ΔH-A129C 용량 군에 걸쳐 일관적이지 않다 (도 9e).
실시예 58 정맥내 글루코스 내성 테스트 ( IVGTT )
정맥내 글루코스 내성 테스트 (IVGTT)를 각각의 동물에서 3가지 시점에 수행하였다: 기준선 (즉 투여 개시 2주전), 다시 4주의 투여 후, 마지막으로 4주의 투여 후 약효세척 후. 이러한 시점들에, 상기 기술된 바와 같이 원숭이를 진정시키고 공복 혈액 샘플을 수집하였다. 50％ 덱스트로스 (500 ㎎/㎏; 1 ㎖/㎏)를 말초 정맥 (노쪽피부 또는 복재 정맥) 내로 약 30초에 걸쳐 주입한 후, 염수를 플러싱하였다. 이어서 혈액 샘플을 EDTA-처리 배큐테이너 (2 ㎖) 내로 덱스트로스 후 5분, 10분, 20분, 30분 및 60분에 수집하였다.
각각의 IVGTT 시점에 글루코스 및 인슐린을 측정하였다. 글루코스 및 인슐린 곡선하 면적을 글루코스 내성 테스트 (0-60분) 동안 계산하였다. 0시 (t=0분) 값을 기준선으로 사용하여 사다리꼴 규칙에 의해 글루코스 및 인슐린 주유(excursion) 곡선으로부터 글루코스 및 인슐린에 대해 ΔAUC를 계산하였다. AB-L1-FGF21ΔH-A129C 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏으로 처치된 군에 대해, ANOVA + 던넷 사후 테스트에 의해 비히클에 대해 통계적 유의성을 평가하였다. 반복 측정 ANOVA + 던넷 사후 테스트에 의해 FGF21ΔH 군에 대해 기준선에 대한 IVGTT 시점에 걸친 유의성을 평가하였다.
글루코스 및 인슐린에 대한 계산된 평균 ΔAUC±SEM이 각각 도 9f 및 9g에서 제시된다. 어떠한 처치 군에 대해서도 계산된 파라미터 중 어느 것에서도 유의한 변화가 없었다.
실시예 59 총 혈장 콜레스테롤 ( TPC )
에이스 알레라 분석기에서 효소 방법을 사용하여 TPC 수준을 측정하였다. 모든 처치 군에서 1주의 처치 후 TPC가 유의하게 감소하였다 (도 9h). 0.15 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 동물에서는 TPC 수준이 전체 투여 및 약효세척 단계에 걸쳐 여전히 감소하여 있었던 반면, 1.5 ㎎/㎏ 및 FGF21ΔH로 처치된 군에서는 약효세척 단계 동안 수준이 기준선으로 되돌아갔다.
실시예 60 트리글리세리드 ( TG )
에이스 알레라 분석기에서 효소 방법을 사용하여 TG 수준을 측정하였다. 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 군 및 FGF21ΔH로 처치된 동물 양쪽에서 투여 기간에 걸쳐 TG가 유의하게 감소하였다 (도 9i). FGF21ΔH로 처치된 군에서는 TG 수준의 감소가 약효세척 단계에 걸쳐 지속된 반면, 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 군에서의 TG 수준은 약효세척 단계 동안 기준선으로 향하였다.
실시예 61 비- 에스테르화 유리 지방산 ( FFA )
제조사의 설명서에 따라 와코(Wako)® (와코 디아그노스틱스(Wako Diagnostics), 버지니아주 리치몬드)로부터의 프로토콜 및 시약을 사용하여 로슈의 코바스(Cobas)® C311 임상 화학 분석기에서 효소 방법을 사용하여 비-에스테르화 유리 지방산 (FFA)을 측정하였다. 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 군에서 FFA 수준에서의 유의한 변화가 없었다 (도 9j). FGF21ΔH로 처치된 동물에서의 FFA 수준은 처음 2주의 처치에 걸쳐 유의하게 증가하였고, 그 후 약효세척 단계의 제1주에는 기준선 수준으로 되돌아갔다.
실시예 62 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 ( HDL )
에이스 알레라 분석기에서 효소 방법을 사용하여 HDL 수준을 측정하였다. 어떠한 처치 군에서도 처치 치간에 걸쳐 HDL 콜레스테롤의 유의한 변화가 없었다.
실시예 63 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 ( LDL )
에이스 알레라 분석기에서 효소 방법을 사용하여 LDL 수준을 측정하였다. 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 군에서 각각 2주 및 1주의 처치부터 약효세척 기간의 제2주에 걸쳐 LDL 콜레스테롤이 유의하게 감소하였다 (도 9k). FGF21ΔH로 처치된 동물에서는 1주의 처치 후에만 LDL 콜레스테롤 수준의 유의한 감소가 관찰되었다. 이러한 처치 군에서 어떠한 다른 시점에도 유의성이 보이지 않았다.
실시예 64 총 케톤체 ( TOTK )
와코®로부터의 프로토콜 및 시약을 사용하여 로슈의 코바스® C311 임상 화학 분석기에서 효소 방법을 사용하여 TOTK를 측정하였다. 0.15 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 동물에서 총 케톤체 수준에서의 유의한 변화가 없었다 (도 9l). FGF21ΔH로 처치된 동물에서 처음 3주의 처치에 걸쳐 TOTK 수준이 유의하게 증가하였고, 이때 약효세척 기간에 걸쳐 수준이 기준선을 향했다.
실시예 65 아디포넥틴
아디포넥틴 수준을 머코디아® ELISA 키트를 사용하여 결정하였다. 혈장 아디포넥틴 수준이 도 9m에서 제시된다. 3마리의 동물 (비히클, 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C 및 FGF21ΔH 처치군에서의 각각 1마리)이 분석에서 배제되었는데, 이들의 아디포넥틴 수준이 검정에 대한 검출 한계 미만이었기 때문이었다. 어떠한 처치 군에서도 아디포넥틴 수준에서의 유의한 변화가 보이지 않았지만, FGF21ΔH로 처치된 동물에서는 이러한 수준이 상향이었다.
실시예 66 C-반응성 단백질 ( CRP )
ALPCO 디아그노틱스(ALPCO Diagnostics)® (뉴햄프셔주 세일럼)로부터의 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 C-반응성 단백질 (CRP)을 측정하였다. 0.15 및 1.5 ㎎/㎏ AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 동물에서 제2주를 제외하고는 4주 처치 기간에 걸쳐 혈장 CRP 수준이 유의하게 감소하였다 (도 9n). 약효세척 단계 동안 수준이 기준선을 향해 돌아갔다. FGF21ΔH로 처치된 동물에서 혈장 CRP 수준이 또한 감소하였지만, 1주 약효세척 시점에만 유의성에 도달하였다.
실시예 67 렙틴
루미넥스(Luminex)® 기술 (밀리포어® 카탈로그 번호 HMH-34K)에 의해 제조사의 설명서에 따른 프로토콜 및 시약으로 렙틴을 측정하였다. FGF21ΔH로 처치된 동물에서 혈장 렙틴 수준이 감소하였지만 (도 9o), 어떠한 시점에서도 이러한 감소가 유의성에 도달하지 않았다. AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 군에서는 렙틴 수준의 변화가 없었다.
실시예 68 아딥신
R&D 시스템(R&D systems)® (미네소타주 미니애폴리스)의 인간 보체 인자 D 퀀티카인(Quantikine) 키트 (카탈로그 번호 DFD00)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 아딥신 수준을 측정하였다. 처음 3주의 처치 동안 모든 처치된 동물에서 혈장 아딥신 수준이 유의하게 증가하였다 (도 9p). 이러한 수준이 약효세척 단계 동안 기준선을 향해 돌아갔다.
실시예 69 원숭이 연구로부터의 결론
경도 내지 중등도 인슐린 저항성 사이노몰구스 마카크에서 AB-L1-FGF21ΔH-A129C가 체중을 감소시키는 것, 지질 지수 (TPC, TG 및 LDL)를 개선하는 것, 및 염증성 바이오마커 (CRP)를 감소시키는 것에서 효과가 있었다. 공복 혈액 글루코스 수준에 대한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C 또는 FGF21ΔH의 명백한 효과가 없었고, 저혈당증이 발달되지 않았다. IVGTT에 의해 평가된 바와 같이 인슐린 감도에 대한 효과가 없었다. 예상 밖이지만, 이러한 결과는, 혈장 글루코스 수준에 대한 효과의 결여와 함께, 이러한 마카크에서의 글루코스 및 인슐린의 기준선 수준이 건강한 정상 마카크와 비교하여 약간만 상승되는 것으로 인한 것일 수 있다. 이는 이러한 동물이 경도의 인슐린 저항성만 나타낸다는 것을 시사한다. 원숭이 대 원숭이의 자연적인 다양성 및 군 당 동물수가 낮은 것과 조합된 기준선 수준에서의 작은 변화가 혈당 지수에서 통계적으로 유의한 변화를 관찰하는 것을 어렵게 만들 수 있다. 처치 기간 말기를 향한 AB-L1-FGF21ΔH-A129C로 처치된 동물에서의 프룩토사민 수준의 감소는 이러한 동물들에서의 개선된 혈당 제어를 가리킨다. AB-L1-FGF21ΔH-A129C (특히 1.5 ㎎/㎏ 용량)를 일주일에 2번 투여하는 것이 대조군 FGF21 단백질을 매일 투여하는 것에 필적하는 이로운 효과를 일으켰다.
실시예 70 AB - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 최초의 인간 연구
Ab-L1-FGF21ΔH-A129C (h38C2-(서열 10-L1)2)의 무작위화, 위약-제어, 병행 상승성 단일 IV 용량 연구를 제2형 당뇨병에 걸린 대상체에서 시작하였다. 위약 또는 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C를 IV 볼루스 (0.5 ㎎ 및 1.5 ㎎) 또는 IV 주입 (5, 15, 50, 100, 200 ㎎) 투여로 대상체에게 제공하였고, 이때 각각의 활성 처치 용량 군에서는 10명의 대상체를 평가하였고, 위약 군은 14명이었다. 현재까지, 200 ㎎까지의 단일 IV 용량이 일반적으로 안전하고 잘 허용되는 것으로 발견되었기 때문에 최대 허용 용량 (MTD)이 확인되지 않으면서 200 ㎎ 용량 수준까지의 7개의 코호트가 평가되었다. 관찰된 안전성/허용성, 약동학 및 약역학 데이터의 예비 요약이 여기에서 제시된다.
단일 용량 투여 후, 테스트 및 위약 양쪽 모두 감소를 나타내긴 했지만, 위약과 비교하여 7-pt 평균 혈장 글루코스 프로파일과 공복 혈장 글루코스 수준 사이의 차이가 관찰되지 않았다. 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 공복 인슐린, 공복 글루카곤, 또는 공복 베타-히드록시부티레이트에서 용량-관련 경향이 관찰되지 않았다. 연구된 용량 수준 중 높은 것 2개 (100 및 200 ㎎ IV)에서 위약과 비교하여 HDL 콜레스테롤에서의 증가가 관찰되었다. 공복 트리글리세리드에서의 용량-의존적 감소가 관찰되었다.
Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 단일 정맥내 투여 후에 건강한 자원자에서 FGF21의 무손상 C-말단 및 무손상 N-말단의 약동학을 별도로 추정하였다. 양쪽에 대한 노출은 용량이 증가됨에 따라 비례하여 증가되는 것으로 나타났다. 로그 농도 대 시간 곡선의 말기 단계들이 평행이었고, 이때 평균 최종 반감기는 각각 C-말단은 7 내지 9시간, N-말단은 30-36시간이었다.
심각한 유해 사례 (SAE)가 보고되지 않았고, 33명의 대상체에서 총 60회의 유해 사례 (AE)가 보고되었다. 이러한 AE 중에서, 54회가 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 제공되는 동안 28명의 대상체에서 보고되었다. 대부분의 AE는 강도 면에서 경도인 것으로 생각되었고, 단 15 ㎎ 용량의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 또는 위약 32.5시간 후에 시작한 중등도로 등급이 매겨진 오심 에피소드는 예외적이었으며, 이는 165시간 지속되었고, 개입을 필요로 하지 않았으며, 연구 약물 처치와 관련되는 것으로 간주되었다. 50 ㎎ 용량의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 또는 위약 2시간 후에 시작되어 156시간 동안 지속된 중등도로 등급이 매겨진 설사 에피소드가 또한 보고되었으며, 이는 개입을 필요로 하지 않았고 연구 약물 처치와 관련되는 것으로 간주되었다. 설사가 가장 빈번하게 AE로 보고되었고 (12명의 대상체에서 14회의 에피소드), 이들 중에서 9회의 에피소드는 처치와 관련되는 것으로 간주되었다. 다른 설사 에피소드들은 참여한 임상 연구 유닛에서 입원환자 구속 동안 1개의 코호트에서 대상체에게 제공된 수돗물의 변경된 염소화 처리에 관련되는 것으로 간주되었다. 위장 징후 (복부 팽만, 복부 통증, 설사, 소화불량, 고장, 위산과다, 오심 및 구토)가 용량이 증가함에 따라 빈도 면에서 증가하는 것으로 보이고, 이때 코호트 7 (200 ㎎ 용량 군 또는 위약)에서 5명의 대상체가 9회의 GI AE를 보고하였다. AE로 인해 연구 참여가 취소된 대상체가 없었다.
연구된 용량들에 걸쳐 관찰된 IGF-1 값, 실험실 테스트, 활력 징후 또는 12-리드(lead) ECG에서 용량에 관련된 경향이 관찰되지 않았다. 200 ㎎ 처치 군에서, 기준선으로부터의 최고 증가가 제1일의 투여 0.5시간 후 11.2 mmHg이면서 수축기 혈압 (SBP)에 대한 평균값이 다른 처치 군 (위약 포함)보다 수치적으로 더 높은 경향이 있었고, 제15일까지 7.0 mmHg에서 지속되었다. 200 ㎎ 처치 군에서 관찰된 기준선으로부터의 평균 변화는 군 평균 기준선의 1 표준 편차 이내였다. 또한, 200 ㎎ 처치 군의 개별적인 대상체에서 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 노출과 SBP 증가 사이에 상관관계가 없었다. 더욱이, 증가된 SBP가 제15일까지 연구 약물 약효세척 이후에 잘 지속되었다. 이러한 관찰 모두는 관찰된 평균 증가가 처치 군 가변성 이내이고 가능하게는 이에 관련된다는 것을 시사한다.
실시예 71 투여량 체계
제2형 당뇨병 환자에서의 단일 용량의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 이후의 트리글리세리드 저하의 농도-응답 관계가 저속 약리학 시작점(onset) 및 종료점(offset) PK/PD 모델을 사용하여 기술되었다. ob/ob 마우스 OGTT 데이터로부터의 모델-유래 최대 약리학 및 FIH (첫 임상(First in Human)) 트리글리세리드 데이터로부터의 저속 약리학 동역학 및 PK/PD 모델-유래 IC50이 용량 계획에 사용되었다. 4주 동안의 매주 용량의 10 ㎎ h38C2-(서열 10-L1)2 또는 일주일에 2회 용량의 5 ㎎ Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 8％ HbA1C 당뇨병 환자에서 ~25％ 공복 혈장 글루코스 저하를 달성하도록 계획된다.
따라서, 본 발명은 약 5 ㎎ 용량의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)로 환자를 처치하는 것을 포함하는 투여량 체계를 제공한다. 일부 측면에서, 약 5 ㎎의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)이 일주일에 2번 투여된다. 일부 측면에서, 약 5 ㎎의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)이 4주 이상 동안 투여된다. 일부 측면에서, 약 5 ㎎의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)이 4주 이상 동안 일주일에 2번 투여된다.
따라서, 본 발명은 약 10 ㎎ 용량의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)로 환자를 처치하는 것을 포함하는 투여량 체계를 포함한다. 일부 측면에서, 약 10 ㎎의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)이 일주일에 1번 투여된다. 일부 측면에서, 약 10 ㎎의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)이 4주 이상 동안 투여된다. 일부 측면에서, 10 ㎎의 본 발명의 화합물 (특히 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C)이 4주 이상 동안 일주일에 1번 투여된다.
일부 측면에서, 환자는 제2형 당뇨병을 앓는다. 일부 측면에서, 환자는 헤모글로빈 A1C (HbA1C)가 상승된 당뇨병 환자이다. 일부 측면에서, 투여량 체계는 트리글리세리드 수준을 저하시키기 위한 것이다. 일부 측면에서, 투여량 체계는 HDL을 상승시키기 위한 것이다. 일부 측면에서, 투여량 체계는 혈액 글루코스를 저하시키기 것이다. 일부 측면에서, 투여량 체계는 혈액 글루코스를 약 25％ 이상만큼 저하시키기 위한 것이다. 일부 측면에서, 투여량 체계는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 것이다.
실시예 72 Ab - L1 - FGF21 ΔH- H125C & Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 안정성
Ab-L1-FGF21ΔH-H125C & Ab (h38C2-(FGF21ΔH-H125C-L1)2) 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C (h38C2-(FGF21 ΔH-A129C-L1)2)의 다양한 제제를 UF-DF (30000 분자량 차단값을 사용하는 정용여과 및 초여과)에 의해 제조한 후, 멸균 여과하였다. 제제를 다양한 스트레스 조건에 적용하였다 (표 17 참조). 그 후, 샘플을 외관 검정, UV (자외선 흡광도), SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 및 iCE (영상화 모세관 전기영동)를 사용하여 분석하였다. 일부 샘플은 생물물리학 기술 예컨대 시차 주사 열량계 (DSC), 및 분석적 초원심분리에 의해 분석하였다. 샘플들을 다양한 시점 (표 17)에 분석하여, 안정성 경향을 평가하였다. 폴리소르베이트 80의 임의의 이로운 효과를 결정하기 위해, 폴리소르베이트 80과 함께 또는 폴리소르베이트 80 없이 제조된 선택된 제제에 교반 스트레스 (300 rpm 궤도 진탕에서 4시간)를 적용하였다. 추가적으로, 일부 제제는 더 높은 농도를 또한 사용하여, 접합체가 높은 농도에서 수성 완충 용매에서 가용성인지를 평가하고, 높은 농도에서의 안정성을 평가하였다.
Figure pct00085
외관 검정
다양한 온도에서의 보관 시의 입상물질 형성: 20 mM 히스티딘, pH 6 제제 내의 양쪽 후보물 (제제 A 및 F)이 5℃에서의 4주 보관 또는 25℃에서의 4주, 또는 40℃에서의 2주 또는 50℃에서의 2주 후에 입상물질 형성을 나타냈다. 이러한 데이터는 20 mM 히스티딘, pH 6 제제가 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 불안정성에 이른다는 것을 시사한다. 40℃에서 2주 동안 스트레스를 받았을 때, 아세테이트 pH 4, 및 포스페이트 pH 8은 동일한 단백질 농도 수준의 히스티딘 pH 6 제제과 대조적으로 입상물질 형성을 나타내지 않았다. 그러나, 높은 단백질 농도 (40-50 ㎎/㎖)는 더 낮은 단백질 농도 (7-10 ㎎/㎖)의 동일한 제제 (히스티딘, pH 6)과 비교했을 때 입상물질 형성이 느려진 것으로 보였다. 5℃서 4주 동안의 보관 후의 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 외관 데이터를 비교하면, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 2가지 제제 (아세테이트, pH 4, 및 포스페이트 pH 8)에서의 입상물질 형성에 대해 우월한 성능을 나타낸다.
폴리소르베이트 80가 있는 제제 및 없는 제제를 비교했을 때 표 17에 나타난 바와 같이 양쪽 후보물에서 폴리소르베이트 80의 존재가 교반 스트레스가 유도한 입상물질 형성을 방지한다. 교반 스트레스는 공기-물 계면, 뿐만 아니라 기계적 스트레스를 수반하는 다양한 공정 단계에 대한 안정성을 예측하는데 통상적으로 사용된다.
경시적으로 UV의 유의한 변화가 관찰되지 않았고, 이는 표 17에 열거된 제제들 중 일부에서 입상물질 형성이 관찰되더라도, 단백질의 순농도는 경시적으로 유의하게 영향을 받지 않았음을 가리킨다.
고분자량 종 ( HMWS ) 형성
SEC를 사용하여 표 17에 열거된 다양한 제제에 대해 HMWS 형성을 측정하였다 (결과가 도 18에 제시됨). SEC는 HMWS를 확실하게 분리할 수 있고, Ab-L1-FGF21ΔH-H125C 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C 양쪽에 대한 중요한 안정성-지시 검정이다. SEC 검정에서의 HMWS는 2 유닛의 FGF21 (즉 h38C2-(FGF21ΔH-H125C-L1)2 및 h38C2-(FGF21 ΔH-A129C-L1)2)을 보유하는 접합체 이전에 용출되는 종으로 정의된다. 양쪽 후보물에 대한 20 mM 히스티딘, pH 6 내의 제제는 높은 초기 HMWS 형성, 뿐만 아니라 시간-의존적 HMWS 형성을 나타냈다. 흥미롭게도, 고온 (40℃)에서의 양쪽 후보물의 제제 중 일부 (아세테이트, pH 4; 포스페이트, pH 8, 및 히스티딘 pH 6 내의 고농도 제제)는 첫주에 응집물의 초기 해리를 나타내는 경향이 있었다. 경시적인 단백질 제제의 비선형 응집 경향이 문헌에 공지되어 있다. 20 mM 아세트산나트륨, pH 4 내의 제제는 20 mM 히스티딘, pH 6 내의 제제과 비교하여 HMWS를 덜 나타냈다. 따라서, 20 mM 아세트산나트륨, pH 4 내의 제제가 HMWS 형성에 대해 20 mM 히스티딘, pH 6에서보다 우월한 안정성을 제공한다. SDS PAGE 분석이 이러한 결과와 일관되었다. 마지막으로, 2개의 후보를 아세테이트, pH 4 제제에서 5℃에서의 HMWS 형성 성향에 대해 비교했을 때, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C보다 우월하게 수행하는 것으로 나타났다 (표 18).
Figure pct00086
전하 비균질성
단백질은 번역후 변형 예컨대 탈아미드화 및 단편화에 의해 야기되는 전하 비균질성을 보유한다. 영상화 모세관 등전 포커싱 (iCE)은 pH 구배에서 단백질 종을 이들의 전하 차이 (pI 값)를 기초로 분리한다. iCE를 사용하여 표 19에 제시된 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 다양한 제제에서의 전하 비균질성을 모니터링하였다. iCE에 대한 실행 조건에는 하기의 것들이 포함된다: 약 1 ㎎/㎖ 단백질 + 2M 요소, 및 파말라이트(Pharmalyte) 3-10. 양쪽 후보물에 대한 20 mM 히스티딘, pH 6, 뿐만 아니라 20 mM 인산나트륨, pH 8 내의 제제가 20 mM 아세트산나트륨, pH 4 내의 것과 비교하여 더 높은 산성 종 형성 경향을 나타냈다. 따라서, 20 mM 아세트산나트륨, pH 4 내의 제제가 우월한 안정성을 제공한다. 추가적으로, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C가 20 mM 아세트산나트륨, pH 4에서 동일한 제제 내의 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C보다 덜한 산성 종 형성 경향을 나타냈고, 따라서 전하 비균질성에 대한 우월한 안정성을 실연한다.
Figure pct00087
시차 주사 열량계 ( DSC )
2개의 후보물의 열 안정성을 온도-유도 언폴딩(unfolding)의 변이 중간점 (Tm)을 측정함으로써 DSC를 사용하여 조사하였다. h38C2에 대한 주요 언폴딩 변이의 Tm 값은 73.5℃였다. 접합체들은 주요 언폴딩 변이의 더 높은 Tm을 나타냈고, 이는 언폴딩에 대한 더 높은 열 안정성을 시사한다 (Ab-L1-FGF21ΔH-H125C (h38C2-(FGF21ΔH-A129C-L1)2) 및 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C (h38C2-(FGF21ΔH-H125C-L1)2) 양쪽에 대한 Tm은 79℃였다).
온도-유도 언폴딩의 변이 중간점 (Tm-FL)을 측정함으로써 내인성 단백질 트립토판 형광을 사용하여 두 후보물의 열 안정성을 또한 조사하였다. 이러한 검정은 고온에 의해 유도되는 언폴딩 시의 3차 구조에서의 변화를 반정량적으로 모니터링한다. 주요 언폴딩 변이의 Tm-FL 값은 h38C2, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C, 및 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C에 대해 각각 약 74.1℃, 77.7℃, 및 79.7℃였다. DSC에 의해 측정된 Tm 값과 일관되게, 2개의 후보물이 h38C2의 Tm-FL보다 약간 더 높은 유사한 Tm-FL을 나타내고, 이는 h38C2 단독보다 접합체들의 더 높은 열역학적 안정성을 시사한다.
분석적 초원심분리 검정
이러한 검정은 테스트된 선택된 제제 내의 HMWS의 정성적인 양의 직교 측정으로서 사용되었다. 이는 SEC에서 보이는 것과 유사한 20 mM 히스티딘, pH 6 제제 내의 HMWS 수준을 나타낸다. 이는 SEC 검정에서 나타난 경향과 정성적으로 일관되는, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C에 대한 20 mM 아세트산나트륨, pH 4 내의 더 낮은 HMWS 수준을 또한 나타낸다. 분석적 초원심분리 데이터는 20 mM 아세트산나트륨, pH 4 제제가 20 mM 히스티딘, pH 6 제제과 비교하여 우월한 안정화를 제공한다는 것의 직교 확인을 제공한다 (표 20).
Figure pct00088
이러한 실시예에서 논의된 여러 안정성 지표들의 데이터를 비교하면, Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 전반적인 안정성 프로파일이 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C보다 우월한 것으로 보인다. 제제의 pH를 저하시키는 것 (예를 들어 아세테이트, pH 4)이 더 높은 pH (예를 들어 pH 6-8)와 비교하여 더 양호한 안정성을 제공한다는 것이 또한 명백하다.
실시예 73 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 pH - 완충제 스크린
적합한 안정화 매질을 발견하려는 목적으로 다양한 수성 완충제 내의 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C (h38C2-(FGF21ΔH-A129C-L1)2)의 안정성을 조사하였다. 링커-1의 불안정성, 뿐만 아니라 단백질 성분 (즉 h38C2 및 FG21)의 임의의 가수분해성 절단으로 저분자량 종 (LMWS)이 생성된다. 추가적으로, 테스트된 제제에서 접합체들이 응집하면 고분자량 종이 형성될 수 있다. 5-8 ㎎/㎖ 범위의 표적 단백질 농도의 원하는 제제 내로의 완충제 교환에 의해 제제들을 제조하였다. 제제들을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 유리 바이알에 포장하고, 원하는 온도에서 보관하였다. 지시된 시점에, 샘플들을 검정하였다.
SEC 에 의한 HMWS 및 LMWS 측정
완충제 및 pH의 명백한 효과가 2주 동안의 온도 스트레스 (40℃) 시 관찰되었다. 데이터가 표 21에서 제시된다. 초기 시점에, pH가 더 높은 제제에서 HMWS가 증가하는 경향이 보였다. 히스티딘 제제가 높은 ％HMWS를 나타내는 것 중 하나였다. pH 범위 4.5 내지 5의 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 말산나트륨, 및 시트르산나트륨 제제가 초기 시점에 응집물을 비교적 덜 나타냈다. 40℃에서 몇주 동안의 보관 시, ％HMWS가 pH 6.5 및 7 제제에서 실제로 감소하였다. 락트산나트륨, pH 4.5 제제가 ％HMWS에 대해 비교적 우월한 성능을 나타냈다.
LMWS 경향은 HMWS 경향과 상이하였다. 시트르산나트륨, pH 5 제제를 제외하고, 모든 제제가 초기 시점에 일관된 ％LMWS 값을 나타냈다. 40℃에서 2주 동안 보관 시, 낮은 pH 제제 중 일부는 아마도 단편화로 인한 ％LMWS의 명백한 증가를 나타냈다. 그러나, LMWS 형성에 대해 안정화하는 것에서 완충제 종의 효과가 또한 역할을 한다는 것이 명백하다. pH-의존적 ％LMWS 경향은 제제의 추가적인 정련이 안정성에서의 추가적인 개선에 도달할 수 있다는 것을 시사한다.
Figure pct00089
실시예 74 교반에 대한 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 안정성
9-11 ㎎/㎖ 범위의 표적 단백질 농도로 완충제 교환 및 부형제 첨가에 의해 제제들을 제조하였다. 제조된 제제들을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 유리 바이알에 포장하였다. 300 rpm 속도로 궤도 진탕기를 사용하여 교반을 적용하였다. 지시된 시점에, 샘플들을 검정하였다. 표 22의 결과는 폴리소르베이트 80의 존재가 교반-유도 불안정성을 방지하는 것을 돕는다는 것을 실연한다.
실시예 75 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 동결건조 제제
액체 제제가 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있지만, 동결건조 제제가 더 오랜 수명의 안정성을 제공할 수 있다. 실시예 72에서 본 발명의 화합물이 아세트산나트륨에서 가장 안정적이었다는 뜻밖의 결과가 실연되었다. 그러나, 아세트산나트륨은 승화하고, 따라서 동결건조 완충제 내로 혼입시키기 어렵다. 따라서, 동결건조 제제에서 최적의 장기 안정성을 제공하는 본 발명의 화합물을 위한 별법적인 완충제를 개발하는 것이 요구된다.
표적이 약 20 ㎎/㎖인 제제 J 및 K를 제외하고는 약 10 ㎎/㎖의 표적 단백질 농도로 완충제 교환 및 부형제 부가에 의해 제제를 제조하였다. 제조된 제제들을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 유리 바이알에 포장하였다. 동결건조 제제를 제조하기 위해, 바이알을 동결 건조시키고, 마개로 막고, 뚜껑을 덮었다. 지시된 시점에, 샘플들을 뽑아서 SEC, 및 iCE가 포함되는 다양한 분석 방법으로 검정하였다. 또한 액체 제제를 안정성을 평가하기 위해 2주 동안 평가하였다.
상승된 온도에서의 보관 시의 동결건조 제제의 성능을 평가하였다. 표 23은 지시된 시점의 SEC 및 iCE 데이터를 나타낸다. 더 높은 온도 스트레스와 비교했을 때에도 동결건조 제제에서 더 양호하게 수행되었다. 동결건조 제제 중에서, 락테이트 및 아세테이트 제제에서 비교적 더 양호하게 수행되었다. 그러나, 아세테이트는 동결건조될 때 승화가 진행되어 pH 표류를 야기하는 것으로 공지되어 있다. 실제로, 아세테이트 제제는 동결건조 시 0.3-0.5 pH 단위의 상승을 나타냈다. 따라서, 동결건조된 락테이트 제제 (제제 C)이 적절한 안정성을 달성하는데 적합하고 입상물질, HMWS, LMWS, 및 산성 종의 형성으로부터의 충분한 보호를 제공하는 것으로 결론지어졌다. 실시예 73에 제시된 제제들을 비교했을 때, 제제 C (락테이트, 트레할로스 2수화물, PS20, EDTA, L-Met로 구성됨)가 링커 불안정성 및 단백질 절단 (양쪽 모두 LMWS 형성을 초래함), 뿐만 아니라 응집 (입상 물질 및 HMWS의 형성)의 방지를 돕는다는 것이 명백하다. 실시예 72 및 73은 락테이트만 있는 h38C2-(FGF21ΔH-A129C-L1)2의 제제가, 히스티딘과 같은 다른 완충제보다 우월하기는 하지만, 원하는 더 긴 기간 동안의 사용에 대한 적합한 안정성을 제공하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 다양한 유형의 안정화제 예컨대 냉동보호제 및 동결건조보호제로서의 역할을 하는 당 또는 폴리올 (예를 들어, 트레할로스, 수크로스, 만니톨), 및 교반 안정성을 위한 계면활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머), 및 킬레이터 (예를 들어 EDTA, DTPA), 및 항산화제 (예를 들어 L-메티오닌)와 락테이트의 조합은 안정성의 상승작용성 강화를 제공한다. 락테이트가 말레이트, 숙시네이트 또는 아세테이트 중 하나로 교체된 표 23의 조합 제제는 상응하는, 완충제만 있는 제제과 비교했을 때 우월한 안정성을 제공한다. 따라서, 조합물이 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C의 안정성을 명확하게 강화한다.
실시예 76 Ab - L1 - FGF21 ΔH-A129C의 동결건조 제제
제제마다 다양한 표적 단백질 농도로 완충제 교환 및 부형제 부가에 의해 제제를 제조하였다. 제조된 제제들을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 유리 바이알에 포장하였다. 동결건조 제제를 제조하기 위해, 바이알을 동결 건조시키고, 마개로 막고, 뚜껑을 덮었다. 지시된 시점에, 샘플들을 SEC, 및 iCE가 포함되는 다양한 분석 방법으로 검정하였다. 추가적으로, 액체 제제의 안정성 경향을 평가하기 위해 2주 동안 액체 제제들을 또한 평가하였다. 동결건조 후 동결건조 제제의 물 함량을 테스트하였고, 이는 모두 0.5％ 미만이었다.
동결건조 제제를 다양한 온도 스트레스 하에 보관하였고, 표 24는 지시된 시점의 SEC, iCE, 및 환원형 CGE (모세관 겔 전기영동) 데이터를 나타낸다. CGE로 단백질 단편의 반-정량적 견적이 생성된다. 동결건조 제제들이 액체 대응물과 비교했을 때 더 양호한 안정성을 나타냈다. 안정화 부형제의 존재 (냉동보호제/동결건조보호제의 존재) 하의 락트산 (락트산나트륨)의 동결건조 제제가 양호한 안정성을 나타냈다. 따라서, 동결건조된 락트산 제제가 더 긴 기간의 보관 안정성에 대해 테스트하는데 적합한 것으로 결론지어졌다. 락트산 제제 중에서, 링커 불안정성 및 단백질 절단으로 인한 과도한 단편화를 방지하기 위해 제제들의 pH의 균형이 요구된다. 예를 들어, 제제 F, pH 4.5는, 액체 상태에서, 다른 제제과 비교하여 실질적인 단편화를 일으킨다. 마지막으로, 제제 B와 L을 비교했을 때, 안정화제 (즉, EDTA 및 L-메티오닌)가 단편화를 최소화하는 것으로 보이고, 이는 실질적인 이점을 제공하고, 특히 액체 제제에게 그러하다. 금속 킬레이터 (예를 들어 EDTA, DTPA) 및 항산화제 (예를 들어 L-메티오닌, 순수 아스코르브산)의 다른 조합물이 안정성을 달성하는데 이로울 것으로 예상되었다.
선택된 제제들을 상대적인 생활성에 대해 또한 테스트하여, 표 24의 데이터에서 보이는 물리적 및 화학적 분해에 대한 상관관계가 있는지를 탐구하였다. 간접적인 FGF-R/β-클로토 HEK-293 세포 결합 ELISA로 생활성을 측정하였고, 이는 기준 물질의 생활성에 대한 상대적인 ％로서 표현된다. 생활성 데이터가 표 25에서 제시된다. 데이터로부터, 물리적 및 화학적 분해가 상관되는 것으로 보이고, 분석 방법에 의해 검정된 유의한 분해를 나타내는 제제 (표 24)은 생활성에서의 유의한 감소를 또한 나타낸다. 이러한 데이터는 제제 A의 성분에 의해 제공되는 안정성 및 기능적 통합성에서의 추가적인 확신을 제공한다.
Figure pct00091
따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 약 0.1 내지 약 200 ㎎/㎖의 FGF21-접합체 및 약 1 내지 150 mM 락트산 또는 아세트산나트륨, pH 약 4 및 약 5.5; 및 하기의 것들 중 하나 이상을 포함하는 제제를 제공한다:
(i) 약 10 내지 약 150 ㎎/㎖ 냉동보호제;
(ii) 약 0.001 내지 약 1.0 ㎎/㎖ 킬레이터;
(iii) 약 0.01 내지 약 10 ㎎/㎖ 항산화제;
(iv) 약 0.02-2.0 ㎎/㎖ 계면활성제.
일부 측면에서, 본 발명의 제제는 (i) 내지 (iv) 중 2개 이상을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명의 제제는 (i) 내지 (iv) 중 3개 이상을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명의 제제는 (i), (ii), (iii), 및 (iv)를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은
(i) 약 0.1 내지 약 200 ㎎/㎖의 FGF21-접합체
(ii) 약 1 내지 150 mM 락트산, pH 약 4 내지 약 5.5; 및
(iii) 약 10 내지 약 150 ㎎/㎖ 냉동보호제;
(iv) 약 0.02-2.0 ㎎/㎖ 계면활성제
를 포함하는 동결건조 제제를 제공한다.
일부 측면에서, 동결건조 제제는 약 0.001 내지 약 1.0 ㎎/㎖ 킬레이터를 추가로 포함할 수 있다. 킬레이터는 EDTA 또는 DTPA일 수 있고, 약 0.02 내지 약 0.5 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다. 킬레이터는 약 0.05 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다.
일부 측면에서, 동결건조 제제는 약 0.01 내지 약 10 ㎎/㎖ 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 항산화제는 L-메티오닌일 수 있다. 항산화제는 약 0.02 내지 약 5 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다. 항산화제는 약 0.05 내지 약 0.2 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다. 항산화제는 약 0.1 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다.
일부 측면에서, FGF21-접합체는 본원에 기술된 바와 같은 본원의 화합물이다. 일부 측면에서, FGF21-접합체는 Ab-L1-FGF21ΔH-H125C 또는 Ab-L1-FGF21ΔH-A129C이다. 일부 측면에서, FGF21 접합체는 특정 종의 h38C2-(서열 10-L1)2이다. 일부 측면에서, FGF21-접합체는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, FGF21-접합체는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖의 양으로 존재한다. FGF21-접합체는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 50 ㎎/㎖의 양으로 존재한다. FGF21-접합체는 약 10 ㎎/㎖의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 락트산은 약 1 내지 약 100 mM의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 락트산은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 락트산은 약 30 mM의 양으로 존재한다. pH는 약 4.3 내지 약 5.3일 수 있다. pH는 약 4.8 ± 0.5일 수 있다. pH는 약 4.8일 수 있다.
일부 측면에서, 냉동보호제는 트레할로스 2수화물, 수크로스, 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택된다. 냉동보호제는 트레할로스 2수화물일 수 있다. 냉동보호제는 약 50 내지 약 120 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다. 냉동보호제는 약 90 ㎎/㎖의 양으로 존재할 수 있다.
일부 측면에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 계면활성제는 폴리소르베이트 20일 수 있다. 일부 측면에서, 계면활성제는 약 0.05 내지 약 1.0 ㎎/㎖의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 계면활성제는 약 0.1 내지 약 0.5 ㎎/㎖의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 계면활성제는 약 0.2 ㎎/㎖의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 본 발명은
(i) 약 10 ㎎/㎖ h38C2-(FGF21ΔH-A129C-L1)2;
(ii) 약 30 mM 락트산, pH 4.8 ± 0.5;
(iii) 약 90 ㎎/㎖ 트레할로스 2수화물;
(iv) 약 0.05 ㎎/㎖ 디소듐 EDTA 2수화물;
(v) 약 0.1 ㎎/㎖ L-메티오닌; 및
(vi) 약 0.2 ㎎/㎖ 폴리소르베이트 20
을 포함하는 동결건조에 적절한 제제를 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, "Ab-L1-FGF21ΔH-A129C"라는 용어가 특정 실시예의 정황에서 사용되는 경우, 이는 항체의 각각의 팔이 서열 26의 K99를 통해 링커-1(L1)에 공유결합으로 연결되고, 각각의 L1 분자가 서열 10의 Cys129의 티올 기에 공유결합으로 접합되어 있는 h38C2 항체 (서열 25 및 26)를 지칭한다 (서열 1의 번호매김에 따름). 이러한 화합물은 Ab-(FGF21ΔH-A129C-L1)2, h38C2-(FGF21ΔH-A129C-L1)2, 및 h38C2-(서열 10-L1)2로 또한 기술될 수 있다. 항체, 특정 링커 및 FGF21 분자의 서열에 대한 미미한 변형이 가능할 수 있다는 것이 명백할 것이다.
본 발명이 이와 같이 광범위하게 개시되었고 상기 기술된 대표적인 실시양태를 참조로 설명되었다. 당업자는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 본 발명에 이루어질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 모든 간행물, 특허 출원 및 허여된 특허는 각각의 개별적인 간행물, 특허 출원 또는 허여된 특허가 전문이 참고로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 문헌에 함유된 정의는 본 개시내용에서의 정의와 모순되는 바에서는 배제된다.
명확성을 위해 별도의 실시양태들의 정황에서 기술된 본 발명의 특정 특색들이 단일 실시양태에서 조합되어 제공될 수도 있는 것으로 이해된다. 거꾸로, 간결성을 위해 단일 실시양태의 정황에서 기술된 본 발명의 다양한 특색이 따로따로 또는 임의의 적절한 하위-조합으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 한 실시양태와 관련하여 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 실시양태에 적용될 수 있는 것으로 명확하게 생각된다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물을 본 발명의 임의의 방법에서 사용할 수 있으며, 본 발명의 임의의 방법을 본 발명의 임의의 조성물을 생산하거나 활용하는데 이용할 수 있다. 특히, 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 청구항 및/또는 상세한 설명의 측면과 조합되어 청구항에서 기술된 본 발명의 임의의 측면이 청구항 및/또는 상세한 설명의 다른 곳에서 기재된 본 발명의 다른 측면과 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
개시내용은 별법 및 "및/또는"만 지칭하는 정의를 지지하더라도, 별법만 지칭하는 것으로 명시적으로 지시되거나 또는 별법들이 상호 배타적이지 않는 한, 청구항에서의 "또는"이라는 용어의 사용은 "및/또는"을 의미하도록 사용된다.
본원에서 명세서에서 사용되는 경우에, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 달리 명백하게 지시되지 않는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 청구항(들)에서 사용되는 경우에, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, "또 다른"은 적어도 두 번째 이상을 의미할 수 있다.
본 발명과 관련하여 본원에서 사용될 때의 "포함하다/포함하는"이라는 단어 및 "있는/포함되는"이라는 단어는 언급된 특색, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 명시하도록 사용되지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 성분 또는 이들의 군의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다.
Figure pct00092
Figure pct00093
SEQUENCE LISTING <110> CovX Technologies Ireland Limited Pfizer Inc <120> Anti-Diabetic Compounds <130> PC71671 <150> US61/410,715 <151> 2010-11-05 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = H or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146) <223> X = L or P <400> 1 Xaa Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu 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Pro Pro 130 135 140 Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 12 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Cys Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 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Ser 180 <210> 14 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Cys His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 15 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Cys Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 16 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Cys Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 17 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = H or Absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> X = K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> X = K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (122)..(122) <223> X = K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146) <223> X = L or P <400> 17 Xaa Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Xaa Ala Leu Xaa Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Xaa Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Xaa Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 18 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Arg Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 19 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala 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Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 22 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp 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Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 24 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Arg Ala Leu Arg Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Arg Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Lys 180 <210> 25 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr 20 25 30 Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly 85 90 95 Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 26 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr 20 25 30 Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val 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Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly 85 90 95 Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Met Lys Leu Ser Cys Glu Ile Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Lys Tyr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Linker <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Asn Ser Asn Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala 20 25 <210> 33 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Met Asn Ser Asn Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser

Claims (38)

  1. 링커를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 조합 부위(combining site)에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 링커가 서열 1의 번호매김(numbering)에 따른 아미노산 위치 79, 125 또는 129의 연결 잔기의 측쇄를 통해 FGF21 분자에 공유결합으로 부착된 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 잔기 129가 시스테인이고, 링커가 시스테인 129의 티올 기에 공유결합으로 부착된 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 화학식 X-Y-Z를 포함하며, 상기 식에서 X는 C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 원자를 포함하는 생물학적으로 상용성인 연결 사슬이고, 중합체 또는 블록 공중합체를 포함할 수 있으며, 링커가 선형인 경우에 연결 잔기에 공유결합으로 연결되고, Y는 적어도 고리 구조를 포함하는 임의로 존재하는 인식 기이고, Z는 항체의 조합 부위 내의 아미노산 측쇄에 대한 공유결합 연결을 포함하는 부착 모이어티(moiety)인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, Y가 하기 임의로 치환된 구조를 가지는 것인 조성물:
    Figure pct00094

    [상기 식에서, a, b, c, d, 및 e는 독립적으로 탄소 또는 질소이고; f는 탄소, 질소, 산소 또는 황이다].
  6. 제5항에 있어서, Y가 페닐인 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 공유결합으로 부착되었을 때 Z가 하기 화학식을 가지고, q =1 또는 2인 조성물:
    Figure pct00095
  8. 제7항에 있어서, q=2인 조성물.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X가 3개의 성분 Xp-Xs-Xy를 포함하는 기이고, 이때 Xp는 FGF21 단백질의 연결 잔기의 측쇄와 조합가능하도록 특이적으로 개조된 기이고, Xs는 X 기의 스페이서 영역이고, Xy는 Y 기에 결합하도록 개조된 기인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, Xy가 아미드 결합, 엔아민 결합, 또는 구아니디늄 결합으로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, Xy가 하기 화학식을 가지는 것인 조성물:
    Figure pct00096
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Xp가 하기 화학식을 포함하는 것인 조성물:
    Figure pct00097
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Xs가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물:
    Figure pct00098

    [상기 식에서, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고, m은 존재하거나 부재한다].
  14. 제13항에 있어서, Xs가 하기 화학식을 포함하는 것인 조성물:
    Figure pct00099
  15. 제14항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    Figure pct00100

    [상기 식에서, 항체는 항체의 조합 부위에서 연결되고, S-FGF21은 연결 잔기의 티올-함유 측쇄에 대한 공유결합 연결이고, n=1, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이며, m은 존재하거나 부재한다].
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    Figure pct00101

    [상기 식에서, 항체는 항체의 조합 부위에서 연결되고, S-FGF21은 연결 잔기의 티올-함유 측쇄에 대한 공유결합 연결이고, n=1, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다].
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, n= 1, 2, 3, 또는 4인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    Figure pct00102

    [상기 식에서, 항체는 항체의 조합 부위에서 연결되고, S-FGF21은 연결 잔기의 티올-함유 측쇄에서 연결된다].
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 카바트(Kabat) 번호매김에 따른 항체의 중쇄의 라이신93의 ε-아미노 기에 공유결합으로 접합된 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 h38c2 또는 m38C2로부터의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, VL, 디아바디(diabody), 미니바디(minibody), 또는 h38c2 또는 m38C2로부터의 VH 및 VL 도메인 및 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 도메인을 포함하는 전장 항체이고, h38C2 IgG1일 수 있는 화합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 알돌라제(aldolase) 항체인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 알돌라제 항체가 서열 27을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 알돌라제 항체가 서열 28을 포함하는 VH 영역을 포함하는 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 알돌라제 항체가 서열 25를 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 알돌라제 항체가 서열 26을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, FGF21 분자가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, FGF21 분자가 서열 3의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, FGF21 분자가 서열 10의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    Figure pct00103

    [상기 식에서, 항체는 조합 부위에서 연결되고 서열 25 및 서열 26을 포함하며, S-FGF21은 서열 10의 Cys129의 티올-함유 측쇄이다].
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    Figure pct00104

    [상기 식에서, 항체는 조합 부위에서 연결되고 서열 25 및 서열 26을 포함하며, S-FGF21은 서열 7의 Cys125의 티올-함유 측쇄이다].
  31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    Figure pct00105

    [상기 식에서, 항체는 조합 부위에서 연결되고 서열 25 및 서열 26을 포함하며, S-FGF21은 서열 12의 Cys79의 티올-함유 측쇄이다].
  32. 서열 1의 번호매김에 따른 잔기 번호 79, 125 또는 129에 위치하는 연결 잔기에서 반감기-증가 모이어티에 공유결합으로 연결된 FGF21 분자를 포함하는 조성물.
  33. 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  34. 링커를 통해 항체의 조합 부위에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하는 조성물이며, 이때 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 접합된 단백질-항체 복합체를 형성하고, 이에 따라 접합된 단백질-항체 복합체가
    (a) 뮤린(murine) 모델에서 SC 주사 후의 혈장 T1 /2이 약 30시간 이상임,
    (b) Glut1 태크만(Taqman) 검정에서 효능이 약 4 nM 미만임
    의 특징 중 하나 이상을 가지며, 접합된 단백질-항체 복합체가 하기 화학식을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure pct00106

    [상기 식에서, 항체는 조합 부위에서 연결되고 서열 25 및 서열 26을 포함하며, S-FGF21은 서열 7의 Cys125 또는 서열 10의 Cys129의 티올-함유 측쇄이다].
  35. 링커를 통해 항체의 조합 부위에 공유결합으로 부착된 FGF21 분자를 포함하는 조성물이며, 이때 링커가 FGF21 내의 연결 잔기의 측쇄에 공유결합으로 부착되어 접합된 단백질-항체 복합체를 형성하고, 이에 따라 접합된 단백질-항체 복합체가
    (a) 뮤린 모델에서 SC 주사 후의 혈장 T1 /2이 약 33시간 이상임,
    (b) 래트 모델에서 SC 주사 후의 혈장 T1 /2이 약 35시간 이상임,
    (c) 영장류 모델에서 SC 주사 후의 혈장 T1 /2이 약 45시간 이상임,
    (d) Glut1 태크만 검정에서 효능이 약 3 nM 미만임
    의 특징 중 하나 이상을 가지며, 접합된 단백질-항체 복합체가 하기 화학식을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure pct00107

    [상기 식에서, 항체는 조합 부위에서 연결되고 서열 25 및 서열 26을 포함하며, S-FGF21은 서열 10의 Cys129의 티올-함유 측쇄이다].
  36. 제약상 허용되는 담체와 조합된 치료 유효량의 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서 청구된 화합물을 포함하는 제약 조성물.
  37. 치료 유효량의 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서 청구된 화합물 또는 제36항에서 청구된 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병, 당뇨병 관련 상태, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 지방간, 또는 심혈관 질환을 치료하거나; 또는 체중 수준을 제어 또는 감소시키거나; 또는 혈당 제어를 조절하거나; 또는 인슐린 분비, HDL 수준, 또는 비-에스테르화 유리 지방산 또는 아딥신의 수준을 증가시키거나; 또는 혈액 글루코스, 글루카곤, 트리글리세리드, 프룩토사민, 저밀도 콜레스테롤, 또는 C-반응성 단백질의 수준을 감소시키는 방법.
  38. 당뇨병 관련 상태, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 지방간, 또는 심혈관 질환을 치료하거나; 또는 체중 수준을 제어 또는 감소시키거나; 또는 혈당 제어를 조절하거나; 또는 인슐린 분비, HDL 수준, 또는 비-에스테르화 유리 지방산 수준을 증가시키거나; 또는 혈액 글루코스, 글루카곤, 트리글리세리드, 프룩토사민, 저밀도 콜레스테롤, 또는 C-반응성 단백질의 수준을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물 또는 제36항에서 청구된 제약 조성물의 용도.
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