KR20210027426A - Fgf21 제제 - Google Patents

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KR20210027426A
KR20210027426A KR1020217003055A KR20217003055A KR20210027426A KR 20210027426 A KR20210027426 A KR 20210027426A KR 1020217003055 A KR1020217003055 A KR 1020217003055A KR 20217003055 A KR20217003055 A KR 20217003055A KR 20210027426 A KR20210027426 A KR 20210027426A
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KR
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fgf
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histidine
polypeptide
sucrose
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KR1020217003055A
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토마스 팜
메르나즈 코스라비
산케트 파트케
Original Assignee
브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Publication date
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Abstract

본 출원은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21, 및 하나 이상의 안정화제, 예컨대 킬레이터 DPTA를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 제제는 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80을 포함시키고/거나 pH를 약 7.1로 조정함으로써 추가로 안정화될 수 있다. 또한, 제조 방법, 치료 방법, 및 키트가 제공된다.

Description

FGF21 제제
EFS-WEB을 통해 전자 제출된 서열 목록의 참조
본 출원과 함께 제출된, 전자 제출된 서열 목록 (파일명: 3338_133PC01_SeqListing.txt; 크기: 5,532 바이트; 및 생성일: 2019년 6월 26일)의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
배경
분야
본 출원은, 무엇보다도, 예를 들어, 피하 투여를 포함한, 다양한 경로를 통한 투여를 위한, 킬레이터 (예를 들어, DTPA), 계면활성제 (예를 들어, PS80)를 사용하여 안정화된, 또한 특정 pH 범위 (예를 들어, 약 7.1)를 갖는 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제에 관한 것이다.
섬유모세포 성장 인자 (FGF)는 다수의 생리적 기능에 있어 결정적 역할을 하는 발달 및 성체 조직에서 (Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991) 폭넓게 발현되는 폴리펩티드이다 (McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998; Burgess, W. H. et al., Annu. Rev. Biochem. 58:575-606 (1989). 문헌에 따르면, FGF 패밀리는 적어도 22개의 구성원으로 이루어진다 (Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)).
FGF-21은 섬유증과 연관된 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있다. 섬유증은 기관 또는 조직에서의 과량의 섬유 결합 조직의 형성이다. 섬유 조직의 과량의 침착은 기관 또는 조직 기능의 손상을 초래할 수 있는 병리적 상태와 연관된다. 영향받는 기관은 폐 (폐 섬유증)), 간 (간 섬유증), 신장 (신장 섬유증), 및 심장 (심장 섬유증)을 포함할 수 있다. 섬유증은 또한 관절, 피부, 장, 골수 등을 포함한 다른 조직 및 기관에 영향을 미칠 수 있다. 예시적 섬유증성 병태 또는 질환은 간에 영향을 미치는 비알콜성 지방간염 (NASH); 신장에 영향을 미치는 당뇨병성 신장 질환 및 당뇨병성 신장병; 및 심장에 영향을 미치는 대사성 심부전을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, NASH는 알콜을 소비하지 않거나 거의 소비하지 않는 사람들의 간에서의 지방 축적, 염증 및 손상을 특징으로 하고, 질환은 간 경화증을 초래할 수 있다. NASH는 종종 특정 지질의 상승된 혈액 수준 및 당뇨병 또는 당뇨병전증을 갖는 과체중 또는 비만인 중년의 사람에서 진단되는 경향이 있다.
FGF-21은 생체내에서 단백질분해에 놓이고, 시험관내에서 응집물을 형성하고, 탈아미드화에 놓이는 경향이 있어 (Gimeno and Moller, Trends Endocrinol Metab. 2014 June; 25(6):303-11; 미국 특허 번호 8,361,963; Hecht et al., PLoS One. 2012; 7(11):e49345; 미국 특허 공개 번호 2007/0293430; WO 2006/0065582), 잠재적으로 FGF-21을 함유하는 제약 조성물의 사용-수명을 제한하는 것으로 보고되었다. 치료적 폴리펩티드의 응집물 및 탈아미드화된 형태는 잠재적으로 면역원성을 증가시킬 수 있다 (문헌 [U.S. Department of Health and Human Services, "Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products", August 2014]; [Subramanyam (ed.), "Therapeutic Protein Immunogenicity Focus Group Newsletter", American Association of Pharmaceutical Scientists, Vol. 1, Issue 3 (December 2011)] 참조).
본 개시내용은, 무엇보다도, FGF-21 폴리펩티드, 또한 특히, 변형된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제의 제조와 연관된 문제를 해결하는 제약 제제의 필요성을 다루는 것이다.
본 개시내용은 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF-21) 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 및 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (또한 펜테트산 또는 DTPA로서 공지됨)을 포함하는 제약 제제로서, 여기서 제제는 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 함유하지 않는 참조 제제에 비해 개선된 안정성을 갖는 것인 제약 제제를 제공한다. 이들 제약 제제는 관련 기술분야에 공지된 대안적 제제에 대하여 하나 이상의 향상, 예를 들면, 예를 들어, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 탈아미드화 속도, 및/또는 예를 들어, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 고분자량 (HMW) 응집 속도를 나타낸다.
개시된 제제 중의 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터의 존재는 또한 FGF-21 폴리펩티드 산화, 또한 특히 메티오닌 산화를 경감시킨다. 예를 들어, 제제 중의 DTPA의 존재는 25℃ 및/또는 40℃에서 서열식별번호(SEQ ID NO): 3의 아미노산 1 및/또는 아미노산 169에 상응하는 하나 이상의 FGF-21 메티오닌 (또는 서열식별번호: 1 및 2에서의 상응하는 메티오닌)의 산화를 경감시키거나 방지할 수 있다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 10 μM 내지 약 100 μM DTPA, 약 20 μM 내지 약 90 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 80 μM DTPA, 약 25 μM 내지 약 75 μM DTPA, 약 40 μM 내지 약 60 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 70 μM DTPA, 또는 약 40 μM 내지 약 70 μM DTPA의 양으로 존재한다. 다른 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 또는 약 60 μM DTPA의 양으로 존재한다.
본원에 개시된 제약 제제의 일부 측면에서, 제제의 pH는 6.5 초과, 6.6 초과, 6.7 초과, 6.8 초과, 6.9 초과, 7.0 초과, 7.1 초과, 7.2 초과, 7.3 초과, 7.4 초과, 또는 7.5 초과이다.
일부 측면에서, pH는 약 6.7 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 7.5, 약 6.9 내지 약 7.4, 약 7.0 내지 약 7.3, 약 7.1 내지 7.2, 약 7.1 내지 약 7.3, 약 7.1 내지 약 7.4, 또는 약 7.1 내지 약 7.5이다. 일부 측면에서, pH는 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5이다. 일부 측면에서, 제약 제제는 6.5의 pH를 갖는 참조 제제보다 더 안정적이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제는 계면활성제, 예를 들어, 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 비음이온성 계면활성제는 폴리소르베이트, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (폴리소르베이트 80)이다. 일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.06% (w/v)의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 적어도 약 0.01% (w/v), 적어도 약 0.02% (w/v), 적어도 약 0.03% (w/v), 적어도 약 0.04% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.06% (w/v), 적어도 약 0.07% (w/v), 적어도 약 0.08% (w/v), 적어도 약 0.09% (w/v) 또는 적어도 약 0.1% (w/v)의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 계면활성제는, 예를 들어, 진탕기 상에서 교반 시, 미립자 및/또는 기포 형성을 경감시킨다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제는 아미노산 완충제, 예를 들어, 히스티딘을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 17.5 내지 약 22.5 히스티딘, 또는 약 40 mM 내지 약 60 mM 히스티딘의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 약 20 mM 히스티딘, 약 25 mM 히스티딘, 약 30 mM 히스티딘, 약 35 mM 히스티딘, 약 40 mM 히스티딘, 약 45 mM 히스티딘 또는 약 50 mM 히스티딘의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제는 삼투 조절제, 예를 들어, 당을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 당은 수크로스이다. 일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 또는 약 500 mM 내지 약 600 mM 수크로스의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 수크로스, 약 200 mM 수크로스, 약 300 mM 수크로스, 약 400 mM 수크로스, 약 500 mM 수크로스, 약 600 mM 수크로스, 약 700 mM 수크로스, 약 800 mM 수크로스, 약 900 mM 수크로스, 또는 약 1 M 수크로스의 양으로 존재한다.
본원에 개시된 제약 제제의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 변형된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진다. 일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 FGF-21 폴리펩티드의 서열 내의 비-자연적으로 코딩된 아미노의 측쇄를 통해 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 G (IgG), 알부민-결합 폴리펩티드 (ABP), PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, Fc 영역, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 측면에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 일부 측면에서, PEG는 약 10 kDa 내지 약 40 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 약 30 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
본원에 개시된 제제의 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 페닐알라닌 유도체이다. 일부 측면에서, 페닐알라닌 유도체는 파라-아세틸-L-페닐알라닌이다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 옥심 연결을 통해 비-자연적으로 코딩된 아미노산에 연결된다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 서열식별번호: 3의 아미노산 글루타민 109를 대체한다.
본원에 개시된 제제의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 10 mg/ml 또는 약 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 용량당 약 1 mg 내지 약 40 mg의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 용량당 약 1 mg, 용량당 약 5 mg, 용량당 약 10 mg, 용량당 약 20 mg, 또는 용량당 약 40 mg의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 제제는 피하 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 안전 시린지로의 피하 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 매일 또는 매주 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 수성 제제이다. 본원에 개시된 제제의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)이다.
본 개시내용은 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드; (ii) 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 100 mM 내지 약 1 M 농도의 수크로스; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (v) 약 10 μM 내지 약 100 μM 농도의 DTPA; 여기서 제제의 pH는 약 6.7 내지 약 7.5인 제약 제제를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 μM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제를 제공한다. 또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 μM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 7.1인 제약 제제가 제공된다.
본 개시내용은 또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; 및 (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; 여기서 pH는 약 7.0인 제약 제제를 제공한다. 또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; 및 (iii) 600 mM 농도의 수크로스; 여기서 pH는 7.0인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF21; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 7.1인 제약 제제가 제공된다.
본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 혼합하는 것을 포함하며, 여기서 제제는 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 함유하지 않는 참조 제제에 비해 개선된 안정성을 갖는 것인 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 안정성에서의 개선은 (i) 물리적 안정성에서의 증가, (ii) 화학적 안정성에서의 증가, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다. 하나의 측면에서, 물리적 안정성에서의 증가는 (i) 폴리펩티드 응집의 방지 또는 감소, (ii) 폴리펩티드 단편화의 방지 또는 감소, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 화학적 안정성에서의 증가를 (i) 탈아미드화의 방지 또는 감소, (ii) 산화의 방지 또는 감소, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 안정성에서의 개선은 하기 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 참조 제제에 대하여, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 탈아미드화 속도;
(b) 참조 제제에 대하여, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 고분자량 (HMW) 응집 속도; 또는
(c) (a) 및 (b) 둘 다.
본원에 개시된 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법의 일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터는 25℃ 및/또는 40℃에서 서열식별번호: 3의 아미노산 1 및/또는 아미노산 169에 상응하는 하나 이상의 메티오닌 (또는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2, 또는 다른 변형된 FGF-21 폴리펩티드에서의 상응하는 메티오닌)의 산화를 경감시킨다. 일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터는 DTPA이다. 일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 10 μM 내지 약 100 μM DTPA, 약 20 μM 내지 약 90 μM DTPA, 약 25 μM 내지 약 75 μM DTPA, 약 40 μM 내지 약 60 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 70 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 80 μM DTPA, 또는 약 40 μM 내지 약 70 μM DTPA의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 또는 약 60 μM DTPA의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 제제의 pH를 6.5 초과, 6.6 초과, 6.7 초과, 6.8 초과, 6.9 초과, 또는 7.0 초과로 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, pH는 약 6.8 내지 약 7.5, 또는 약 6.9 내지 약 7.4, 또는 약 7.0 내지 약 7.3, 또는 약 7.1 내지 7.2, 또는 약 7.1 내지 약 7.3, 또는 약 7.1 내지 약 7.4, 또는 약 7.1 내지 약 7.5의 pH 값으로 조정된다. 일부 측면에서, 조정된 pH는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5이다. 일부 측면에서, pH-조정된 제제는 6.5의 pH를 갖는 참조 제제 (즉, 동일한 성분을 동일한 농도로 갖지만 상이한 pH를 갖는 제제)보다 더 안정적이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 계면활성제를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트이다. 일부 측면에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80이다. 일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.06% (w/v)의 양으로 혼합된다. 일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 적어도 약 0.01% (w/v), 적어도 약 0.02% (w/v), 적어도 약 0.03% (w/v), 적어도 약 0.04% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.06% (w/v), 적어도 약 0.07% (w/v), 적어도 약 0.08% (w/v), 적어도 약 0.09% (w/v) 또는 적어도 약 0.1% (w/v)의 양으로 혼합된다. 일부 측면에서, 계면활성제는, 예를 들어, 진탕기 상에서 제제 교반 시에 미립자 및/또는 기포 형성을 경감시킨다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 아미노산 완충제, 예를 들어, 히스티딘을 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 17.5 mM 내지 약 22.5 mM 히스티딘, 또는 약 40 mM 내지 약 60 mM 히스티딘의 양으로 혼합된다. 일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 약 20 mM 히스티딘, 약 25 mM 히스티딘, 약 30 mM 히스티딘, 약 35 mM 히스티딘, 약 40 mM 히스티딘, 약 45 mM 히스티딘, 또는 약 50 mM 히스티딘의 양으로 혼합된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 삼투 조절제, 예를 들어, 당을 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 당은 수크로스이다. 일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 또는 약 500 mM 내지 약 600 mM 수크로스의 양으로 혼합된다. 일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 수크로스, 약 200 mM 수크로스, 약 300 mM 수크로스, 약 400 mM 수크로스, 약 500 mM 수크로스, 약 600 mM 수크로스, 약 700 mM 수크로스, 약 800 mM 수크로스, 약 900 mM 수크로스, 또는 약 1 M 수크로스의 양으로 혼합된다.
본원에 개시된 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 변형된 FGF-21 폴리펩티드이다. 일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 FGF-21 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 FGF-21 폴리펩티드의 서열 내의 비-자연적으로 코딩된 아미노의 측쇄를 통해 반감기 연장 모이어티에 연결된다.
일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는, 예를 들어, 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, IgG, ABP, PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, Fc 영역, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 측면에서, 수용성 중합체는 PEG이다. 일부 측면에서, PEG는 약 10 kDa 내지 약 40 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 약 30 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 페닐알라닌 유도체이다. 일부 측면에서, 페닐알라닌 유도체는 파라-아세틸-L-페닐알라닌이다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 옥심 연결을 통해 비-자연적으로 코딩된 아미노산에 연결된다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 서열식별번호: 3의 아미노산 글루타민 109를 대체한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 10 mg/ml 또는 약 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 제제는 수성 제제이다. 상기에 개시된 방법의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)이다.
본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 100 mM 내지 약 1 M 농도의 수크로스; (iii) 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (iv) 약 10 μM 내지 약 100 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 제제의 pH는 약 6.7 내지 약 7.5인 방법을 제공한다. 또한, FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 약 50 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.1인 방법이 제공된다. 또한, FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 50 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.1인 방법이 제공된다.
본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.0인 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.0인 방법을 제공한다. 또한, 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 약 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.1인 방법이 제공된다.
본 개시내용은 또한, 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 약 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.1인 방법을 제공한다. 또한, 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.1인 방법이 제공된다.
또한, 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.1인 방법이 제공된다.
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법 중 임의의 것에 따라 제조된 제약 제제를 제공한다. 또한, (i) 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제약 제제, 및 (ii) 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
본 개시내용은 또한, 섬유증과 연관된 질환 또는 병태 및/또는 당뇨병의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 섬유증과 연관된 질환 또는 병태 및/또는 당뇨병을 치료 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 질환 또는 병태는 당뇨병이다. 일부 측면에서, 당뇨병은 2형 당뇨병이다. 일부 측면에서, 질환 또는 병태는 비알콜성 지방간염 (NASH)이다. 일부 측면에서, 대상체에 대한 유효량의 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제약 제제의 투여는 간 경직도를 감소시키거나, 체지방률을 감소시키거나, 체중을 감소시키거나, 간-대-체중 비율을 감소시키거나, 간 지질 함량을 감소시키거나, 간 섬유증 영역을 감소시키거나, 공복 혈당 수준을 감소시키거나, 공복 트리글리세리드 수준을 감소시키거나, LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키거나, ApoB 수준을 감소시키거나, ApoC 수준을 감소시키거나, HDL 콜레스테롤을 증가시키거나, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 용량당 약 1 mg 내지 약 40 mg의 FGF-21 폴리펩티드가 투여된다. 일부 측면에서, 용량당 약 1 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 20 mg, 또는 약 40 mg의 FGF-21 폴리펩티드가 투여된다. 일부 측면에서, 제약 제제는 피하 투여된다. 일부 측면에서, 제약 제제는 안전 시린지를 사용하여 피하 투여된다. 일부 측면에서, 제약 제제는 매일 또는 매주 투여된다.
일부 측면에서, 대상체에 대한 본원에 개시된 치료 방법에 따른 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제약 제제의 투여는, 치료되지 않은 대상체에서의 수준에 비해 또는 제약 제제의 투여 전의 대상체에 비해, (i) 간 지방의 수준에서의 감소; (ii) 간 손상의 수준에서의 감소; (iii) 섬유증의 수준에서의 감소; (iv) 섬유증 바이오마커 혈청 Pro-C3 (N-말단 III형 콜라겐 프로펩티드)의 수준에서의 감소; (v) 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 수준에서의 감소; (vi) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 수준에서의 감소; (vii) 혈청 아디포넥틴의 수준에서의 증가; (viii) 혈장 LDL의 수준에서의 감소, 혈장 HDL의 수준에서의 증가; (ix) 혈장 트리글리세리드의 수준에서의 감소; (x) 간 경직도의 수준에서의 감소; 또는 (xi) 이들의 임의의 조합을 제공한다.
일부 측면에서, 제약 제제는 (i) 약 10 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 약 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 제약 제제는 (i) 약 20 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 약 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 제약 제제는 (i) 10 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 히스티딘 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의; (iii) 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 제약 제제는 (i) 20 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
도 1a 및 1b는 제제 조성의 함수로서의 PEG-FGF-21의 탈아미드화를 나타낸다. 도 1a는 펜테트산 (DTPA) 또는 폴리소르베이트 80이 없는 제제에서의 탈아미드화를 나타낸다. 도 1b는 펜테트산 (DTPA) 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 제제에서의 탈아미드화를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 50 μM DTPA (또한 펜테트산으로서 공지됨)의 존재 및 부재 하에 메티오닌 1 (도 2a) 및 메티오닌 169 (도 2b)에서의 PEG-FGF-21 폴리펩티드의 금속 촉매화된 산화를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 PEG-FGF-21 응집에 대한 pH의 효과를 나타낸다. 도 3a는 시간, pH, 및 사용되는 완충 시스템의 함수로서의 응집을 나타낸다. 도 3b는 상이한 온도 및 시간 (5℃, 14개월; 25℃, 1개월; 40℃, 1일) 및 상이한 pH에서의 응집을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 제제 조성의 함수로서의 PEG-FGF-21의 응집을 나타낸다. 도 4a는 펜테트산 (DTPA) 또는 폴리소르베이트 80이 없는 제제에서의 응집을 나타낸다. 도 4b는 펜테트산 (DTPA) 및 폴리소르베이트 80을 갖는 제제에서의 응집을 나타낸다.
도 5는 300 rpm 오비탈 진탕기에서 24h (좌측) 또는 6h 동안 리스트액션 진탕 (우측) 후에 PS80이 없는 보다 고농도의 PEG-FGF-21이 탁하게 변하였음을 보여준다. 0.01% 내지 0.1% (w/v)의 폴리소르베이트 80의 첨가는 샘플의 탁도를 감소시켰다.
본 개시내용은 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF-21) 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)을 포함하는 안정화된 제약 제제를 제공한다. 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예컨대 DTPA의 존재는 FGF-21 폴리펩티드에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어, 메티오닌의 산화를 경감시키는 것으로 관찰된 바 있다. FGF-21 제제 중의 DTPA의 혼입은 또한 저장 동안 FGF-21 폴리펩티드의 탈아미드화 속도를 감소시키고, 또한 저장 동안 고분자량 응집 속도를 감소시킨다. 제제의 pH를 7.1로 조정함으로써 추가의 안정화가 달성될 수 있다. 또한, 제제는 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80의 첨가에 의해 추가로 안정화될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 개시된 제제의 제조 방법, 뿐만 아니라 개시된 방법을 적용함으로써 제조된 제제를 제공한다. 또한, 섬유증과 연관된 질환, 예를 들어, NASH 및 당뇨병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 대한 개시된 안정화된 제제의 투여를 포함하는 섬유증과 연관된 질환, 예를 들어, NASH 및 당뇨병의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
정의
본 개시내용을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공되는 경우를 제외하고는, 하기 용어 각각은 하기에 기재되는 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 기재된다.
본 개시내용은 그룹 중 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에서 존재하는, 사용되는, 또는 다른 방식으로 그에 관련되는 측면을 포함한다. 본 개시내용은 그룹 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에서 존재하는, 사용되는, 또는 다른 방식으로 그에 관련되는 측면을 포함한다.
단수형은 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 단수형, 뿐만 아니라 용어 "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 단수형은 "단일"을 의미한다. 다른 측면에서, 단수형은 "둘 이상" 또는 "다수"를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "FGF-21" 또는 "FGF-21 폴리펩티드"의 언급은 하나 이상의 이러한 단백질의 언급이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물을 포함하고, 기타 등등이다.
또한, "및/또는"은 본원에서 사용되는 경우 다른 것들을 갖거나 갖지 않는 두 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 구체적 개시로서 고려되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B" 등의 어구에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C" 등의 어구에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포함하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은, 부분적으로 값 또는 조성이 측정되는 또는 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라지는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같은 특정 값 또는 조성에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성에 대한 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 관행에 따라 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 20%까지의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어는 최대 10배 크기 또는 최대 5배의 값을 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에 특정 값 또는 조성이 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"의 의미는 그 특정 값 또는 조성에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 경계를 기재된 수치 초과 및 미만으로 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 따라서, "약 10-20"은 "약 10 내지 약 20"을 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치를, 예를 들어, 10 퍼센트 위 또는 아래의 (더 높은 또는 낮은) 변동만큼 언급된 값 초과 및 미만으로 수정할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에서 사용되는 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.
본원에서 측면이 용어 "포함하는"으로 기재되는 부분에서는, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 다른 방식의 유사한 측면이 또한 제공됨을 이해한다.
단위, 접두사, 및 기호는 이들의 국제 단위계 (SI: Systeme International de Unites) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자에 대해 포함적이다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다. 본원에 제공되는 제목은 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니며, 이는 전체적으로 명세서를 참조하여 제공될 수 있다. 따라서, 바로 하기에 정의되는 용어는 전체적으로 명세서를 참조하여 보다 완전히 정의된다.
아미노산은 본원에서 이들의 통상적으로 공지된 3 문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회 (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고되는 1-문자 기호에 의해 언급된다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다.
응집: 용어 "응집"은 본원에 개시된 폴리펩티드, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드가 다른 분자 (예컨대 동일한 폴리펩티드의 다른 분자)와 비-공유 연결 복합체를 형성함으로써 고분자량 복합체를 형성하는 경향을 지칭한다. 응집물의 형성을 측정하는 예시적 방법은 본원 실시예에 기재된 바와 같은 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 감소된 응집을 갖는 폴리펩티드를 식별하기 위해, 참조 화합물에 대하여 응집의 상대적 양이 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드가 감소된 응집을 갖는 제제를 식별하기 위해, 참조 제제에 대하여 응집의 상대적 양이 결정될 수 있다.
아미노산 치환: 용어 "아미노산 치환"은 모 서열 또는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 서열) 내에 존재하는 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 지칭한다. 아미노산은, 예를 들어, 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 통해, 모 서열 또는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 폴리펩티드 서열)에서 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환"의 언급은 위치 X에 존재하는 아미노산의 대안적 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 일부 측면에서, 치환 패턴은 표식 AnY에 따라 기재될 수 있고, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 다른 측면에서, 치환 패턴은 표식 An(YZ)에 따라 기재될 수 있고, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y 및 Z는 A를 대체할 수 있는 대안적 치환 아미노산 잔기들이다.
본 개시내용의 문맥에서, 치환 (이들이 아미노산 치환으로서 언급되는 경우에도)은 핵산 수준에서 수행되고, 즉, 아미노산 잔기의 대안적 아미노산 잔기로의 치환은 제1 아미노산을 코딩하는 코돈을 제2 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 수행된다.
대략: 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략"은, 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 측면에서, 용어 "대략"은, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않은 한 (이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고), 언급된 참조 값의 양 방향으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 있는 (이들 초과 또는 미만의) 값의 범위를 지칭한다.
와 연관된: 본원에서 질환과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "와 연관된"은 문제의 증상, 측정, 특징, 또는 상태가 그 질환의 진단, 발달, 존재, 또는 진행과 관련됨을 의미한다. 연관은, 질환과 원인적으로 관련될 수 있으나, 그러할 필요는 없다.
생물학적 활성: 본원에 개시된 분자, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드에 적용되는 용어 "생물학적 활성"은, 살아있는 유기체와 관련되는 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성 분자는, 인간 또는 다른 동물에서, 질환 또는 병태, 예를 들어, 섬유증과 연관된 질환 또는 병태의 진단, 치유, 경감, 치료, 또는 방지를 위해 의도된, 또는 다른 방식으로는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 복지를 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
보존적 아미노산 치환: "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산), 비대전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 히스티딘)를 포함한 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되었다. 따라서, 폴리펩티드 내의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체된 경우, 아미노산 치환은 보존적인 것으로 고려된다. 또 다른 측면에서, 아미노산의 스트링이 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
비-보존적 아미노산 치환은 (i) 양전성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Arg, His 또는 Lys)가 음전성 잔기 (예를 들어, Glu 또는 Asp)로 치환된 또는 그에 의해 대체된, (ii) 친수성 잔기 (예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기 (예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)로 치환된 또는 그에 의해 대체된, (iii) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로 치환된 또는 그에 의해 대체된, 또는 (iv) 벌키 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Val, His, Ile 또는 Trp)가 보다 작은 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Ala 또는 Ser) 또는 측쇄를 갖지 않는 잔기 (예를 들어, Gly)로 치환된 또는 그에 의해 대체된 것들을 포함한다.
다른 아미노산 치환이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌에 대하여, 치환은 D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인 중 임의의 하나로부터 취할 수 있다. 리신에 대하여, D-리신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴, 또는 D-오르니틴 중 임의의 하나로 대체될 수 있다. 일반적으로, 단리된 폴리펩티드의 특성의 변화를 유도할 것으로 예상될 수 있는 기능적으로 중요한 영역에서의 치환은 (i) 극성 잔기, 예를 들어, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예를 들어, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 또는 알라닌으로 (또는 그에 의해) 치환된; (ii) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기로 (또는 그에 의해) 치환된; (iii) 양전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 음전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산으로 (또는 그에 의해) 치환된; 또는 (iv) 벌키 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 이러한 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어, 글리신으로 (또는 그에 의해) 치환된 것들이다. 상기 비-보존적 치환 중 하나가 단백질의 기능적 특성을 변경시킬 수 있는 가능성은 또한 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대한 치환의 위치와 상관된다 (따라서 일부 비-보존적 치환은 생물학적 특성에 영향을 주지 않거나 거의 주지 않을 수 있음).
보존된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존된"은, 각각, 비교되는 둘 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않고 나타나는 것들인 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존된 아미노산은 서열 내의 다른 곳에서 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 많은 관련 서열 사이에서 보존되는 것들이다.
일부 측면에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로 100% 동일한 경우에 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로 적어도 70% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 경우에 "고도로 보존된" 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로 약 70% 동일한, 약 80% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 경우에 "고도로 보존된" 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로 적어도 30% 동일한, 적어도 40% 동일한, 적어도 50% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 경우에 "보존된" 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로 약 30% 동일한, 약 40% 동일한, 약 50% 동일한, 약 60% 동일한, 약 70% 동일한, 약 80% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 98% 동일한, 또는 약 99% 동일한 경우에 "보존된" 것으로 언급된다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 그의 일부, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
탈아미드화: 용어 "탈아미드화"는, 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기가 자발적으로 탈아미드화 반응에 놓임으로써, 아미노산의 화학적 구조를 변화시키고, 잠재적으로 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치는 경향을 지칭한다. 탈아미드화를 측정하는 예시적 방법은 본원 실시예에 개시되어 있다. 예를 들어, 감소된 탈아미드화를 갖는 폴리펩티드를 식별하기 위해, 참조 화합물에 대하여 탈아미드화의 상대적 양이 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드가 감소된 탈아미드화를 갖는 제제를 식별하기 위해, 참조 제제에 대하여 탈아미드화의 상대적 양이 결정될 수 있다.
섬유증과 연관된 질환: 용어 "섬유증과 연관된 질환"은, 섬유증이 나타나는 것으로 관찰된, 또는 섬유증이 질환 병인, 진행, 또는 증상과 연관되는 것으로 공지된 또는 그와 같이 여겨지는, 또는 섬유증이 질환 진행에 따라 나타나는 것으로 공지된 또는 그와 같이 여겨지는 질환, 장애, 및 병태를 포함한다.
섬유증은 췌장, 폐, 심장, 신장, 간, 눈, 신경계, 골수, 림프절, 심내막심근, 또는 후복막강 등의 기관 및 조직에 영향을 미칠 수 있다. 예시적인 섬유증과 연관된 질환은 비알콜성 지방간염 (NASH), 간 섬유증, 전-경변증, 경변증, 미만성 폐실질성 질환, 낭포성 섬유증, 폐 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 주입 섬유증, 신장 섬유증, 만성 신장 질환, 당뇨병성 신장 질환, 국소 분절 사구체경화증, 막성 신장병, IgA 신장병, 골수섬유증, 심부전, 대사성 심부전, 심장 섬유증, 백내장 섬유증, 백내장, 안구 흉터, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 장 섬유증, 장 협착, 심내막심근 섬유증, 심방 섬유증, 종격 섬유증, 크론병, 후복막 섬유증, 켈로이드, 신성 전신 섬유증, 경피증, 전신 경화증, 관절섬유증, 페이로니 증후군, 듀프이트렌 구축, 당뇨병성 신경증, 유착성 관절낭염, 알콜성 간 질환, 지방간염, 바이러스성 간염, 담관 질환, 원발성 혈색소침착증, 약물-관련 경변증, 잠원성 경변증, 윌슨병, 및, 알파 1-항트립신 결핍증, 간질성 폐질환 (ILD), 인간 섬유증성 폐 질환, 황반 변성, 망막 망막병증, 유리체 망막병증, 심근 섬유증, 그레이브스 눈병, 약물 유도 맥각중독, 심혈관 질환, 아테롬성경화증/재발협착증, 비후 흉터, 원발성 또는 특발성 골수섬유증, 및 염증성 장 질환 (콜라겐성 결장염을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 간 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증 및 심장 섬유증을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 간 섬유증일 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 NASH일 수 있다.
유효량: 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 개시된 FGF-21 제제의 "유효량"이라는 용어는, 유익한 또는 요망되는 결과, 예를 들어 임상적 결과를 달성하기에 충분한 양이며, 이와 같이, "유효량"은 이것이 적용되는 문맥에 따라 달라진다. 예를 들어, NASH를 치료하는 FGF-21 폴리펩티드의 투여에 대한 문맥에서, FGF-21 폴리펩티드의 유효량은, 예를 들어, 간 지방, 간 손상 또는 섬유증을 개선 (예를 들어, 치료되지 않은 대상체에서의 수준에 대한 또는 치료의 투여 이전의 대상체에서의 수준에 대한 간 지방, 간 손상 또는 섬유증의 감소)시키기에 충분한 양이다.
일부 측면에서, NASH를 치료하기 위한 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 유효량은, 치료되지 않은 대상체에서의 수준에 대하여 또는 치료의 투여 이전의 대상체에서의 수준에 대하여, 하기와 같이 하나 이상의 섬유증 바이오마커의 수준을 변화시킬 수 있다: 예를 들어, 혈청 Pro-C3 감소; ALT 또는 AST 감소; 혈청 아디포넥틴 증가; 혈장 LDL 감소; 혈장 HDL 증가; 혈장 트리글리세리드 수준 감소, 또는 이들의 임의의 조합.
용어 "유효량"은 "유효 용량", "치료 유효량", 또는 "치료 유효 용량"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
FGF-21 활성: 용어 "FGF-21 활성"은 FGF-21 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 지칭한다. 용어 "생물학적 활성"은 분자, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드가, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물, 및 인간을 포함하나 이에 제한되지는 않는 유기체와 관련된 생물학적, 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미치는 능력을 지칭한다.
예를 들어, 변형되지 않은 또는 변형된 FGF-21의 문맥에서, 생물학적 활성은 FGF-21에 의해 수행되는 생물학적 기능 중 임의의 것을 포함한다. 분자가 야생형 FGF-21 (예컨대 서열식별번호: 3의 야생형 FGF-21 폴리펩티드)의 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는지의 여부를 결정하는 예시적 방법은, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 공개 번호 2017/0189486의 실시예 5 및 17에 개시된 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 기능 검정을 포함할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 활성을 갖는 또는 의도된 치료적 사용을 위한 충분히 높은 생물학적 활성을 갖는, 예를 들어, 참조 화합물의 EC50보다 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 50배 미만, 또는 100배 미만 더 높은 EC50을 갖는 폴리펩티드를 식별하기 위해, 참조 화합물에 대하여 생물학적 활성의 상대적 수준이 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드가 생물학적 활성을 갖는 또는 의도된 치료적 사용을 위한 충분히 높은 생물학적 활성을 갖는, 예를 들어, 참조 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드의 EC50보다 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 50배 미만, 또는 100배 미만 더 높은 EC50을 갖는 제제를 식별하기 위해, 참조 제제에 대하여 생물학적 활성의 상대적 수준이 결정될 수 있다.
본원에 기재된 참조 화합물은 변형, 예컨대 본원에 기재된 변형이 없는 FGF-21 서열일 수 있다. 예를 들어, 참조 화합물은 야생형 FGF-21 또는 융합 파트너가 없는, 예를 들어, PEG가 없는 동일한 변형된 FGF-21 폴리펩티드 서열일 수 있다. PEG-FGF-21에 대한 예시적 참조 화합물은 비제한적으로 서열식별번호: 3의 야생형 FGF-21 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 1의 변형된 FGF-21 폴리펩티드를 포함한다.
일부 측면에서, 참조 화합물은 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, PEG)에 연결될 수 있는 적어도 하나의 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 참조 화합물은 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, PEG)에 연결될 수 없는 적어도 하나의 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 참조 화합물은 추가의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드의 PEG화된 또는 비-PEG화된 형태와 비교가 수행될 수 있고; 전자의 경우, 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 또는 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교가 수행될 수 있다.
FGF-21 폴리펩티드: 용어 "FGF-21 폴리펩티드"는 야생형 FGF-21 폴리펩티드 및 변형된 FGF-21 폴리펩티드를 지칭한다.
반감기 연장 모이어티: 용어 "반감기 연장 모이어티"는, 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 컨쥬게이션되지 않은 형태 또는 야생형 FGF-21 폴리펩티드 등의 참조 화합물에 비해, 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 생체내 단백질분해성 분해 또는 다른 활성-약화 화학적 변형을 막거나 경감시키는, 반감기를 증가시키는, 및/또는 흡수 속도 증가, 독성 감소, 용해도 개선, 단백질 응집 감소, 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성 증가, 제조능 증가, 및/또는 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 면역원성 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 약동학적 또는 생물리적 특성을 개선 또는 변경시키는, 임의로 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 통해, 직접적으로 또는 링커를 통해, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 FGF-21 폴리펩티드에 공유 연결된 ("컨쥬게이션된" 또는 "융합된") 제약상 허용가능한 모이어티, 도메인, 또는 분자를 지칭한다.
동일성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은, 중합체 분자 사이의, 예를 들어, 폴리펩티드 분자 사이의 전체적 단량체 보존을 지칭한다. 임의의 추가의 수식어구가 없는 용어 "동일한" (예를 들어, 단백질 A가 단백질 B와 동일함)은 서열이 100% 동일함 (100% 서열 동일성)을 의미한다. 두 서열을, 예를 들어, "70% 동일한" 것으로 기재하는 것은, 이들을, 예를 들어, "70% 서열 동일성"을 갖는다고 기재하는 것과 동등하다.
두 폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교를 위해 두 서열을 정렬시킴으로써 수행될 수 있다 (예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 폴리펩티드 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비-동일 서열은 비교를 위해 무시될 있음). 특정 측면에서, 비교를 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산을 비교한다.
제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 각각의 갭의 길이, 및 갭의 수를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 공급원으로부터, 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 다의 정렬에 대하여 입수가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 bl2seq이며, 이는 미국 정부의 국립 생명 공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수가능한 프로그램의 BLAST 모음의 부분이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열의 비교에 사용되며, BLASTP는 아미노산 서열의 비교에 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어, Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이며, 이는 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 모음의 부분이며 또한 유럽 생물정보학 연구소 (EBI) (www.ebi.ac.uk/Tools/psa)로부터 입수가능하다. 서열 정렬은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등을 사용하여 수행될 수 있다.
폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그들 자체의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 소수점 첫째 자리로 반올림됨을 인지한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반올림되며, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한, 길이 값은 항상 정수임을 인지한다.
특정 측면에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 백분율 동일성 (%ID)은 %ID = 100 x (Y/Z)로서 계산되고, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬 (시각적 검사에 의해 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 매치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열 내의 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열의 길이보다 더 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성보다 더 높을 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해서만 구동되는 2원 서열-서열 비교로 제한되지 않음을 인지할 것이다. 또한, 서열 정렬은 이질적 공급원으로부터의 데이터, 예컨대 구조 데이터 (예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터 (예를 들어, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생 데이터와 서열 데이터를 통합함으로써 생성될 수 있음을 인지할 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이질적 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 입수가능한 T-Coffee이며, 이는 대안적으로, 예를 들어, EBI로부터 입수가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 계산하기 위해 사용되는 최종 정렬은 자동적으로 또는 수동적으로 큐레이션될 수 있음을 인지할 것이다.
생체내 단백질분해성 분해: 용어 "생체내 단백질분해성 분해"는 살아있는 시스템으로 도입 시 (예를 들어, 유기체로 주입 시) 상기 유기체에서 나타나는 프로테아제로부터 유래될 수 있는 폴리펩티드의 절단을 지칭한다. 단백질분해는 잠재적으로 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 야생형 FGF-21은 C-말단에서 절단에 놓일 수 있으며, 이는 말단절단된, 불활성 폴리펩티드를 생성한다. FGF-21의 생체내 단백질분해를 측정하는 예시적 방법은 미국 출원 공개 번호 US2017/0189486의 실시예 10에 기재된 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD) 기반 전기화학발광 면역흡착 검정 (ECLIA)이다. 예를 들어, 감소된 생체내 단백질분해를 갖는 폴리펩티드를 식별하기 위해, 참조 화합물에 대하여 생체내 또는 시험관내 단백질분해의 상대적 양이 결정될 수 있다. 또한, 즉, FGF-21 폴리펩티드가 감소된 시험관내 단백질분해를 갖는 제제를 식별하기 위해, 참조 제제에 대하여 생체내 단백질분해의 상대적 양이 결정될 수 있다.
단리된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은, 회합되었던 (자연적으로 또는 실험적 셋팅에서) 성분의 적어도 일부로부터 분리된 물질 또는 엔티티 (예를 들어, 폴리펩티드)를 지칭한다. 단리된 물질 (예를 들어, 단백질)은 이들이 회합되었던 물질에 대하여 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다.
연결된: 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "연결된" 또는 "부착된"은, 분자, 예를 들어, 수용성 중합체에 공유적으로 또는 비-공유적으로 합쳐진 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "연결된"은 C-말단 또는 N-말단에서의 아미노산 서열 (예를 들어, FGF-21 폴리펩티드)과 제2 아미노산 서열 (예를 들어, 알부민 반감기 연장제)의 접합 또는 연쇄를 의미한다. 이는 또한 전체 아미노산 서열 (예를 들어, XTEN 반감기 연장제)의 제2 아미노산 서열 (예를 들어, FGF-21 폴리펩티드) 내의 임의의 2개의 아미노산으로의 삽입을 포함한다. 일부 측면에서, 연결은 제1 아미노산 서열 (예를 들어, FGF-21 폴리펩티드) 내의 아미노산의 측쇄와 제2 분자 (예를 들어, 제2 아미노산 서열 또는 가용성 중합체, 예컨대 PEG) 사이에서 일어날 수 있다. 본 개시내용의 문맥에서, 용어 "융합된" 또는 "융합"은, 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄가 작동가능하게 연결되고 재조합 발현되었음을 지시한다. 일부 측면에서, 2개의 폴리펩티드 쇄는 화학적 합성의 결과로 "융합"될 수 있다. 본 개시내용의 문맥에서, 용어 "컨쥬게이트" 또는 "컨쥬게이션"은, 2개의 분자 엔티티 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 및 중합체, 예컨대 PEG)가 화학적으로 연결되었음을 나타낸다.
변형된 FGF-21 폴리펩티드: 본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 FGF-21 폴리펩티드", "변형된 섬유모세포 성장 인자 21" 또는 "변형된 FGF-21" 및 이들의 하이픈 불포함 형태는 상호교환가능하게 사용되며, 야생형 FGF-21 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 야생형 humFGF-21)과 상이하고 전형적으로 섬유모세포 성장 인자 21의 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질, 뿐만 아니라, 그의 생물학적 활성과 관계없이, FGF-21 유사체, FGF-21 이소형, FGF-21 모방체, FGF-21 단편, 하이브리드 FGF-21 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 멀티머, 동족체, 글리코실화 패턴 변형물, 변형물, 스플라이스 변형물, 및 그의 돌연변이 단백질을 포함할 것이다. 이 정의에 포함되는 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 하기에 보다 상세히 기재된다.
돌연변이: 본 개시내용의 내용에서, 상기에 정의된 바와 같은 용어 "돌연변이" 및 "아미노산 치환" (때때로 간단히 "치환"으로서 언급됨)은 상호교환가능한 것으로 고려된다.
비-자연적으로 코딩된 아미노산: "비-자연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 통상적 아미노산 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 "비-자연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-자연 아미노산", "자연적이 아닌 아미노산", "비-자연 발생 아미노산", 및 이들의 다양한 하이픈 포함 및 하이픈 불포함 버전이다. 용어 "비-자연적으로 코딩된 아미노산"은 또한, 자연적으로 코딩된 아미노산 (20개의 통상적 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 변형 (예를 들어, 번역 후 변형)에 의해 나타내는, 그러나 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 쇄로 자연적으로 혼입되지는 않는 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 비-자연적으로 코딩된 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 하나의 구체적 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 파라-아세틸-L-페닐알라닌이다.
환자: 본원에서 사용되는 바와 같이, "환자"는 치료를 추구하거나 필요로 할 수 있는, 치료를 요구하는, 치료를 수용하고 있는, 치료를 수용할 대상체, 또는 특정 질환 또는 병태에 대하여 훈련된 전문가에 의해 관리 중인 대상체를 지칭한다.
제약 조성물: 용어 "제약 조성물"은 활성 성분 (FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 생물학적 활성이 효과적이 되는 것을 가능하게 하는 형태의, 또한 조성물이 투여되는 대상체에 대하여 허용불가능하게 독성인 추가 성분 (예를 들어, 부형제 및 물)을 함유하지 않는 조제물을 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균 상태일 수 있다.
제약상 허용가능한: 어구 "제약상 허용가능한"은 본원에서, 타당한 이익/위험 비율에 맞는, 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다. 일반적으로, 동물에서의, 또한 보다 특히 인간에서의 사용에 대한 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의한 승인 (또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 기재된)은, 이들 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태가 제약상 허용가능한 것임을 의미한다. 치료 목적상 안전한 것으로 일반적으로 허용가능한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태는 "치료적으로 허용가능한" 것이다.
제약상 허용가능한 부형제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "제약상 허용가능한 부형제"는, 대상체에서 실질적으로 비독성 및 비-염증성인 특성을 갖는, 본원에 기재된 활성 화합물 이외의 임의의 성분 (예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭한다. 부형제는, 예를 들어 킬레이터, 계면활성제, 완충제, 삼투 조절제, 산화방지제, 유화제, 충전제 (희석제), 보존제, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화수를 포함할 수 있다. 치료 목적상 안전한 것으로 일반적으로 허용되는 부형제는 "치료적으로 허용가능한 부형제"이다.
제약상 허용가능한 염: 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 화합물의 제약상 허용가능한 염을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용가능한 염"은, 모 화합물이 기존의 산 또는 염기 모이어티를 그의 염 형태로 전환시킴으로써 (예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기 산과 반응시킴으로써) 변형된 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 제약상 허용가능한 염의 예는, 아민 등의 염기성 잔기의 미네랄 또는 유기 산 염; 카르복실산 등의 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다
폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 자연적이 아닌 아미노산, 예컨대 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴)을 함유하는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형물이 정의 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어는, 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 생성물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 동족체, 오르토로그, 파라로그, 이들의 단편 및 다른 등가물, 변형물, 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 다분자 복합체, 예컨대 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 이들은 또한 단일 쇄 또는 다중 쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 통상적으로 디술피드 연결이 다중 쇄 폴리펩티드에서 나타난다. 용어 폴리펩티드는 또한, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, "펩티드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
방지: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "방지"는 질병, 장애 및/또는 병태의 개시를 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 또는 임상적 표명의 개시를 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 또는 표명의 개시를 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 병적 측면의 발달 위험을 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 측면에서, 본 출원에 개시된 제약 제제는 섬유증과 연관된 질환 또는 병태, 예컨대 NASH 또는 당뇨병의 개시를 방지하거나, 증상을 방지하거나, 또는 합병증을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
예방적: 본원에서 사용되는 바와 같이, "예방적"은 질환 또는 병태의 개시를 방지하기 위해, 또는 섬유증과 연관된 질환 또는 병태, 예를 들어, NASH의 증상을 방지하거나 지연시키기 위해 사용되는 치료적 또는 작용 과정을 지칭한다. 일부 측면에서, 본 출원에 개시된 제약 제제는 예방적으로 사용될 수 있다.
예방: 본원에서 사용되는 바와 같이, "예방"은 건강을 유지하고 섬유증과 연관된 질환 또는 병태, 예를 들어, NASH 또는 당뇨병의 개시를 방지하거나 지연시키기 위해, 또는 질환 또는 병태와 연관된 증상을 방지하거나 지연시키기 위해 취해지는 조치를 지칭한다.
재조합: "재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 조작된 숙주 세포에서 발현되는 재조합 생성된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적합한 기술에 의해 분리된, 분별된, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 네이티브 또는 재조합 폴리펩티드와 같이, 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 고려된다. 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 재조합 생성될 수 있다. 본원에 개시된 단백질 및 펩티드는 또한 화학적으로 합성될 수 있다.
유사성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유사성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어 폴리펩티드 분자 사이의 전체적 관련성을 지칭한다. 중합체 분자의 서로에 대한 퍼센트 유사성의 계산은, 퍼센트 유사성의 계산이 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려하는 것을 제외하고는, 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
용해도: 용어 "용해도"는 또 다른 물질 중에 용해될 수 있는 물질의 양, 예를 들어, 수용액 중에 용해될 수 있는 변형되지 않은 또는 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 변형되지 않은 또는 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 용해도를 측정하는 예시적 방법은 미국 출원 공개 번호 US2017/0189486의 실시예 8에 기재된 플러그 유동 용해도 시험이다. 예를 들어, 증가된 용해도를 갖는 폴리펩티드를 식별하기 위해, 참조 화합물에 대하여 상대적 용해도가 결정될 수 있다. 일부 측면에서는, 예를 들어, 폴리펩티드가 증가된 용해도를 갖는 제제를 식별하기 위해, 참조 제제에 대하여 상대적 용해도가 결정될 수 있다.
대상체: "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "포유류"는, 진단, 예후, 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과 동물, 예컨대 개 및 늑대; 고양이과 동물, 예컨대 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대 말, 당나귀, 및 얼룩말; 곰, 식용 동물, 예컨대 젖소, 돼지, 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 측면에서, 포유류는 인간 대상체이다. 다른 측면에서, 대상체는 인간 환자이다. 특정 측면에서, 대상체는 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 본원에 기재된 방법에 적용가능한 인간 환자 또는 그의 세포이다.
앓고 있는: 질환, 장애, 및/또는 병태를 "앓고 있는" 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상을 갖는 것으로 진단된 또는 이를 나타내는 것이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제는 섬유증과 연관된 질환 또는 병태, 예컨대 NASH 또는 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
걸리기 쉬운: 질환, 장애, 및/또는 병태에 "걸리기 쉬운" 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태를 갖는 것으로 진단되지 않았고/거나 이들의 증상을 나타내지 않을 수 있으나 질환 또는 그의 증상이 발달하는 경향을 갖는다. 일부 측면에서, 질환, 장애, 및/또는 병태 (예를 들어, 암)에 걸리기 쉬운 개체는 하기 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: (1) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 연관된 유전적 돌연변이; (2) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 연관된 유전적 다형성; (3) 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 단백질 및/또는 핵산의 증가된 및/또는 감소된 발현 및/또는 활성; (4) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 연관된 습관 및/또는 생활방식; (5) 질환, 장애, 및/또는 병태의 가족력; 및 (6) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 연관된 미생물에 대한 노출 및/또는 그로의 감염.
일부 측면에서, 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태를 발달시킬 것이다. 일부 측면에서, 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태를 발달시키지 않을 것이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제는 섬유증과 연관된 질환 또는 병태, 예컨대 NASH 또는 당뇨병에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 수 있다.
치료 작용제: 용어 "치료 작용제" 또는 "작용제"는, 대상체에게 투여 시, 치료적, 진단적, 및/또는 예방적 효과를 갖고/거나 요망되는 생물학적 및/또는 약리적 효과를 끌어내는 분자 엔티티를 지칭한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, PEG-FGF-21)는 치료 작용제일 수 있다. 일부 측면에서, 작용제는 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드 중 적어도 하나와 조합 요법의 부분으로서 공동-투여되는 또 다른 분자이다.
치료 유효량: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은, 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있는 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여 시, 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하고/거나, 그의 증상을 개선시키고/거나, 진단하고/거나, 방지하고/거나, 그의 개시를 지연시키기에 충분한, 전달되는 작용제 (예를 들어, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 제제)의 양을 의미한다. 일반적으로, 치료 유효량의 투여는 치료 유효 결과를 제공할 것으로 예상된다.
치료 유효 결과: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효 결과"는, 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있는 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에서 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하고/거나, 그의 증상을 개선시키고/거나, 진단하고/거나, 방지하고/거나, 그의 개시를 지연시키기에 충분한 결과를 의미한다.
치료하다, 치료, 요법: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "요법" 또는 이들의 문법적 변형은, 섬유증과 연관된 질환 또는 병태, 예를 들어, NASH 또는 당뇨병의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 방지하고/거나, 경감시키고/거나, 개량시키고/거나, 개선시키고/거나, 완화시키고/거나, 그의 개시를 지연시키고/거나, 그의 진행을 억제하고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 발병률을 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 섬유증과 연관된 질환을 "치료하는" 것은 질환 또는 병태 또는 그의 증상에 대한 증상 방지, 증상 개량, 개시 지연 등을 지칭할 수 있다. 치료는, 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 병적 측면의 발달 위험을 감소시키기 위해, 질환, 장애, 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태의 단지 조기 징후를 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
ug, uM, uL: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ug", "uM", 및 "uL"은 각각 "μg", "μM", 및 "μL"과 상호교환가능하게 사용된다.
수용성 중합체: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. 변형된 FGF-21 폴리펩티드에 대한 수용성 중합체의 연결은 증가된 또는 변조된 혈청 (생체내) 반감기, 또는 변형되지 않은 형태에 비해 증가된 또는 변조된 치료적 반감기, 변조된 면역원성 또는 독성, 변조된 물리적 회합 특징, 예컨대 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 변경된 결합, 및 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 변화를 제공할 수 있다.
수용성 중합체는 그 자체의 생물학적 활성을 가질 수 있거나 가질 수 없고, 하나 이상의 변형되지 않은 또는 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 물질에 대한 변형된 FGF-21의 부착을 위한 링커로서 활용될 수 있다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 그의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체 (본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,252,714에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 별개의 PEG, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 술페이트를 포함한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 셀룰로스 및 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르타미드 등, 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 다양한 측면을 하기 서브섹션에서 더욱 상세히 기재한다.
I. FGF-21 제제
본 개시내용은, 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF-21) 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21, 및 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)을 포함하며, 참조 제제, 즉, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 함유하지 않는 것을 제외하고는 동일한 성분을 함유하는 상응하는 제제에 비해 개선된 안정성을 갖는 제약 제제를 제공한다.
용어 "킬레이터" 또는 "양이온 킬레이터"는 상호교환가능하고, 원래의 금속 이온의 것과 상이한 화학적 특성을 갖는 새로운 착물 이온을 형성함으로써 용액 시스템으로부터 금속 이온을 제거할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 특히, 본원에 개시된 양이온 킬레이터는 2가 금속, 예를 들어, Ca++에 특이적으로 결합하는 킬레이터이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제는 안정성에서의 하나 이상의 개선, 예를 들어, 보다 낮은 탈아미드화 속도, 및/또는 보다 낮은 응집 속도를 나타낸다. 예를 들어, 제약 제제 중의 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예컨대 DTPA의 포함은, 참조 제제에 대하여, 특정 시간 기간 (예를 들어, 1개월) 동안 특정 온도 (예를 들어, 40℃)에서 저장 시, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 25℃에서, 약 30℃에서, 약 35℃에서, 약 40℃에서, 또는 약 45℃에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 25℃ 초과, 30℃ 초과, 35℃ 초과, 약 40℃, 또는 약 45℃의 온도에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 30℃ 내지 약 35℃, 또는 약 40℃ 내지 약 45℃에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 또는 약 4개월 동안 저장 후 상기에 개시된 온도 또는 온도 범위에서 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다. 구체적 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 1개월 동안 40℃에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 25℃에서, 약 30℃에서, 약 35℃에서, 약 40℃에서, 또는 약 45℃에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 고분자량 (HMW) 응집 속도를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 25℃ 초과, 30℃ 초과, 35℃ 초과, 약 40℃, 또는 약 45℃의 온도에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 30℃ 내지 약 35℃, 또는 약 40℃ 내지 약 45℃에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 또는 약 4개월 동안 저장 후 상기에 개시된 온도 또는 온도 범위에서 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다. 구체적 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 약 1개월 동안 40℃에서 저장된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예를 들어, DTPA는, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)에서, 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 메티오닌의 산화를 방지하거나 경감시킨다. 특정 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예를 들어, DTPA는, 25℃ 및/또는 40℃에서, 서열식별번호: 3의 아미노산 1 및/또는 아미노산 169 (또는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2 또는 임의의 다른 FGF-21 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산)의 산화를 방지하거나 경감시킨다.
일부 구체적 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터는 DTPA이다. 펜테트산 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)은 5개의 카르복시메틸 기를 갖는 디에틸렌트리아민 백본으로 이루어진 아미노폴리카르복실산이다. DTPA의 컨쥬게이트 염기는 금속 양이온에 대한 높은 친화도를 갖는다. 따라서, 5가 음이온 DTPA5-는, 각각의 질소 중심 및 각각의 COO--기가 배위에 대한 중심으로서 카운팅된다고 가정하면 잠재적으로 여덟자리 리간드이다. 그의 착물에 대한 형성 상수는 EDTA에 대한 것보다 약 100 더 크다. 킬레이팅제로서, DTPA는 최대 8개의 결합을 형성함으로써 금속 이온 주위를 둘러싼다. 그러나, 전이 금속은, 통상적으로 8개 미만의 배위 결합을 형성한다. 따라서, 금속과의 착물 형성 후, DTPA는, 그의 유도체 펜데티드에 의해 나타나는 바와 같이, 여전히 다른 시약에 결합하는 능력을 갖는다. 예를 들어, 그의 구리(II)와의 착물에서, DTPA는 3개의 아민 중심 및 5개의 카르복실레이트 중 3개를 활용하여 여섯자리 방식으로 결합한다.
일부 다른 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터는 또 다른 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예컨대 에틸렌디아민 아세트산 (EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 또는 관련 화합물, 예를 들어, 티욱세탄 (탄소 백본이 이소티오시아네이토벤질 및 메틸 기를 함유하는 DTPA의 변형된 버전)일 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 DTPA 및 EDTA와 관련된 다른 킬레이팅제는 아미드 기의 질소가 하나 이상의 C1-18 알킬 기에 의해 치환될 수 있는 것들, 예를 들어 DTPA.BMA 및 EDTA.BMA이다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 10 μM 내지 약 100 μM, 15 μM 내지 약 95 μM, 약 20 μM 내지 약 90 μM, 약 25 μM 내지 약 85 μM, 약 30 μM 내지 약 80 μM, 약 35 μM 내지 약 75 μM, 약 40 μM 내지 약 70 μM, 약 45 μM 내지 약 65 μM, 약 50 μM 내지 약 60 μM, 약 25 μM 내지 약 75 μM, 약 40 μM 내지 약 60 μM, 약 30 μM 내지 약 70 μM, 또는 약 40 μM 내지 약 75 μM의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 10 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 약 60 μM, 약 65 μM, 약 70 μM, 약 75 μM, 약 80 μM, 약 85 μM, 약 90 μM, 약 95 μM 또는 약 100 μM의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 적어도 약 15 μM, 적어도 약 20 μM, 적어도 약 25 μM, 적어도 약 30 μM, 적어도 약 35 μM, 적어도 약 40 μM, 적어도 약 45 μM, 적어도 약 50 μM, 적어도 약 55 μM, 적어도 약 60 μM, 적어도 약 65 μM, 적어도 약 70 μM, 또는 적어도 약 75 μM의 양으로 존재한다.
구체적 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예를 들어, DTPA는 50 μM의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제제의 pH는 약 6.5 초과, 약 6.6 초과, 약 6.7 초과, 약 6.8 초과, 약 6.9 초과, 약 7.0 초과, 약 7.1 초과, 약 7.2 초과, 약 7.3 초과, 약 7.4 초과, 또는 약 7.5 초과이다. 일부 측면에서, 제제의 pH는 6.5 초과, 6.6 초과, 6.7 초과, 6.8 초과, 6.9 초과, 7.0 초과, 7.1 초과, 7.2 초과, 7.3 초과, 7.4 초과, 또는 7.5 초과이다. 일부 측면에서, 제제의 pH는 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5이다.
일부 측면에서, 제제의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5, 약 6.6 내지 약 7.5, 약 6.7 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 7.5, 약 6.9 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.1 내지 약 7.5, 약 7.2 내지 약 7.5, 약 7.3 내지 약 7.5, 약 7.4 내지 약 7.5, 약 6.5 내지 약 7.4, 약 6.5 내지 약 7.3, 약 6.5 내지 약 7.2, 약 6.5 내지 약 7.1, 약 6.5 내지 약 7.0, 약 6.5 내지 약 6.9, 약 6.5 내지 약 6.8, 약 6.5 내지 약 6.7, 약 6.6 내지 약 7.4, 약 6.7 내지 약 7.4, 약 6.8 내지 약 7.4, 약 6.9 내지 약 7.4, 약 7.0 내지 약 7.4, 약 7.1 내지 약 7.4, 약 7.2 내지 약 7.4, 약 7.3 내지 약 7.4, 약 6.5 내지 약 7.3, 약 6.6 내지 약 7.3, 약 6.7 내지 약 7.3, 약 6.7 내지 약 7.3, 약 6.8 내지 약 7.3, 약 6.9 내지 약 7.3, 약 7.0 내지 약 7.3, 약 7.1 내지 약 7.3, 약 7.2 내지 약 7.3, 약 6.5 내지 약 7.2, 약 6.6 내지 약 7.2, 약 6.7 내지 약 7.2, 약 6.8 내지 약 7.2, 약 6.9 내지 약 7.2, 약 7.0 내지 약 7.2, 약 7.1 내지 약 7.2, 약 6.9 내지 약 7.1, 또는 약 7.0 내지 약 7.1이다.
일부 측면에서, 제제의 pH는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5이다. 일부 측면에서, 제약 제제는 6.5의 pH를 갖는 참조 제제보다 더 안정적이다.
일부 측면에서, 제약 제제는 계면활성제를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "계면활성제"는, 물 또는 수용액 중에 용해 또는 현탁 시 표면 장력을 감소시키는, 또는 두 액체 사이의 또는 액체와 고체 사이의 계면 장력을 감소시키는 임의의 화합물, 전형적으로는 양친매성 분자를 의미한다. 본 개시내용의 문맥에서, 계면활성제는 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 용액 중에서 계면 응력 및 전단을 감소시키는 임의의 화합물이다.
일부 측면에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이고, 즉, 중성 용액 중에서 순전하를 갖지 않는 경향이 있는 계면활성제이다. 일부 측면에서, 비음이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 폴리소르베이트는 계면-유도된 응집에 대항하여 단백질을 안정화시키고 단백질의 표면 흡착을 최소화하기 위해 단백질 제약에서 폭넓게 사용되는 비-이온성 계면활성제의 중요한 부류이다 (Wang W 2005. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics. Int J Pharm 289 (1-2):1-30). 폴리소르베이트는 폴리옥시에틸렌 (POE) 소르비탄의 지방 산 에스테르로 구성된 양친매성, 비-이온성 계면활성제이다. 상업적으로 입수가능한 폴리소르베이트는 주로 소르비탄 POE 지방 산 에스테르를 함유하는 화학적으로 다양한 혼합물이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리소르베이트"는, 전형적으로 에틸렌 옥시드와 공중합된, 소르비톨 및 그의 무수물의 올레에이트 에스테르를 지칭한다. 예시적 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN) 20; PS20) (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트); 폴리소르베이트 40 (트윈 40; PS40) (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트); 폴리소르베이트 60 (트윈 60; PS60) (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트); 및 폴리소르베이트 80 (트윈 80; PS80) (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트)이다.
'폴리옥시에틸렌' 부분에 이어지는 숫자 20은 분자 내에서 나타나는 옥시에틸렌 -(CH2CH2O)- 기의 총 수를 지칭한다. '폴리소르베이트' 부분에 이어지는 숫자는 분자의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 부분과 회합된 지방 산의 유형에 관한 것이다. 모노라우레이트는 20으로 표시되고, 모노팔미테이트는 40으로, 모노스테아레이트는 60으로, 또한 모노올레에이트는 80으로 표시된다. 일부 측면에서, 비-이온성 계면활성제는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방 산 에스테르의 경우에 대략 적어도 0.01 mg/ml의 양인 임계 미셀 농도 (CMC) 초과의 양으로 존재한다. 문헌 [Wan and Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p.136, 1974] 참조.
일부 측면에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 (PS80)이다. 일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.07% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.08% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.09% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.07% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.08% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.07% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.07% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.07% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.06% (w/v)의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 적어도 약 0.01% (w/v), 적어도 약 0.02% (w/v), 적어도 약 0.03% (w/v), 적어도 약 0.04% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.06% (w/v), 적어도 약 0.07% (w/v), 적어도 약 0.08% (w/v), 적어도 약 0.09% (w/v) 또는 적어도 약 0.1% (w/v)의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80은, 예를 들어, 진탕기 상에서 제제 교반 시에 미립자 및/또는 기포 형성을 경감시킨다. 일부 측면에서, 제제 중의 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80의 존재는, 미립자 형성을, 참조 제제 중의 미립자 형성의 수준에 비해, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 제제 중의 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80의 존재는, 기포 형성을, 참조 제제 중의 기포 형성의 수준에 비해, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 제약 제제는 아미노산 완충제를 추가로 포함한다. 아미노산은, 이들이 용이하게 대사가능한 자연적으로 존재하는 물질이기 때문에 제약 응용에서 완충제로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 완충제로서 사용되는 아미노산은 또한 제제가 동결-건조되는 경우 비정질 상 중의 단백질을 보호할 수 있다. 적합한 아미노산 완충제는 히스티딘, 리신, 및/또는 아르기닌을 함유할 수 있다. 히스티딘은 약 pH 7에서 우수한 완충능을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "히스티딘"은 L-히스티딘 또는 D-히스티딘, 히스티딘의 용매화 형태, 히스티딘의 수화 형태 (예를 들어, 일수화물), 또는 히스티딘의 무수 형태, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 본 개시내용의 제제 중의 다른 적합한 완충제는, 몇가지만 언급하면, 글루타메이트, 트리스(Tris), 또는 숙시네이트이다.
일부 구체적 측면에서, 아미노산 완충제는 L-히스티딘이다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 35 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 70 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 75 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 80 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 85 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 90 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 또는 약 95 mM 내지 약 100 mM 히스티딘의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 20 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 25 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 35 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 70 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 75 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 80 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 85 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 35 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 80 mM 히스티딘의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 50 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 70 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 75 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 25 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 또는 약 20 mM 내지 약 25 mM의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 15 mM 내지 약 20 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 60 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 60 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 60 mM 히스티딘, 약 15.5 mM 내지 약 24.5 mM 히스티딘, 약 16 mM 내지 약 24 mM 히스티딘, 약 16.5 mM 내지 약 23.5 mM 히스티딘, 약 17 mM 내지 약 23 mM 히스티딘, 약 17.5 mM 내지 약 22.5 mM 히스티딘, 약 18 mM 내지 약 22 mM 히스티딘, 약 18.5 mM 내지 약 21.5 mM 히스티딘, 약 19 mM 내지 약 21 mM 히스티딘, 또는 약 19.5 mM 내지 약 20.5 mM 히스티딘의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 히스티딘, 약 11 mM 히스티딘, 약 12 mM 히스티딘, 약 13 mM 히스티딘, 약 14 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 약 16 mM 히스티딘, 약 17 mM 히스티딘, 약 18 mM 히스티딘, 약 19 mM 히스티딘, 약 20 mM 히스티딘, 약 21 mM 히스티딘, 약 22 mM 히스티딘, 약 23 mM 히스티딘, 약 24 mM 히스티딘, 약 25 mM 히스티딘, 약 26 mM 히스티딘, 약 27 mM 히스티딘, 약 28 mM 히스티딘, 약 29 mM 히스티딘, 약 30 mM 히스티딘, 약 31 mM 히스티딘, 약 32 mM 히스티딘, 약 33 mM 히스티딘, 약 34 mM 히스티딘, 약 35 mM 히스티딘, 약 36 mM 히스티딘, 약 37 mM 히스티딘, 약 38 mM 히스티딘, 약 39 mM 히스티딘, 약 40 mM 히스티딘, 약 41 mM 히스티딘, 약 42 mM 히스티딘, 약 43 mM 히스티딘, 약 44 mM 히스티딘, 약 45 mM 히스티딘, 약 46 mM 히스티딘, 약 47 mM 히스티딘, 약 48 mM 히스티딘, 약 49 mM 히스티딘, 또는 약 50 mM 히스티딘의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 제약 제제는 삼투 조절제 (또한 관련 기술분야에서 등장화제로서 공지됨)를 추가로 포함한다. 본 개시내용에 따라, 삼투 조절제 (등장화제)는 폴리올, 사카라이드, 탄수화물, 염, 예컨대 염화나트륨, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예시적 폴리올은 약 600 kD 미만 (예를 들어, 120 내지 400 kD 범위)인 분자량을 갖는 것들, 예를 들어, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨, 에리트리톨, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 크실리톨, 글리세롤, 락티톨, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이노시톨, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
사카라이드 또는 탄수화물 삼투 조절제는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 측면에서, 사카라이드 또는 탄수화물은 프룩토스, 글루코스, 만노스, 수크로스, 소르보스, 크실로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분, 수용성 글루칸, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 삼투 조절제는 환원 당 또는 비-환원 당 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택된 사카라이드를 포함한다. 일부 측면에서, 삼투 조절제 등장화제는 비-환원 당, 바람직하게는 수크로스, 트레할로스, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 당을 포함한다. 일부 구체적 측면에서, 비-환원 당은 수크로스이다.
일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 300 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 400 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 500 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 600 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 700 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 800 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 900 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 500 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 600 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 700 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 800 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 500 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 600 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 700 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 약 500 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 약 600 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 또는 약 500 mM 내지 약 600 mM 수크로스의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 수크로스, 약 150 mM 수크로스, 약 200 mM 수크로스, 약 250 mM 수크로스, 약 300 mM 수크로스, 약 350 mM 수크로스, 약 400 mM 수크로스, 약 450 mM 수크로스, 약 500 mM 수크로스, 약 550 mM 수크로스, 약 600 mM 수크로스, 약 650 mM 수크로스, 약 700 mM 수크로스, 약 750 mM 수크로스, 약 800 mM 수크로스, 약 850 mM 수크로스, 약 900 mM 수크로스, 약 950 mM 수크로스, 또는 약 1 M 수크로스의 양으로 존재한다.
본원에 개시된 제약 제제의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 변형된 FGF-21 폴리펩티드이다. 관련 기술분야에 공지된 많은 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,012,931 및 9,434,788에 개시된 것들이 본원에 개시된 제제에서 사용될 수 있다. 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF-21)은 문헌에 기재되어 있다 (Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000); WO 01/36640; 및 WO 01/18172, 및 미국 특허 공개 번호 20040259780, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 다른 FGF와 달리, FGF-21은 증식 및 종양형성 효과를 갖지 않는 것으로 보고되었다 (Ornitz and Itoh, Genome Biology 2001, 2(3):reviews3005.1-3005.12).
특정 FGF-21 폴리펩티드 및 그의 용도는 미국 특허 공개 번호 20010012628, 미국 특허 번호 6,716,626, 미국 특허 공개 번호 2004/0259780, WO 03/011213, Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 June; 115(6): 1627-35, WO 03/059270, 미국 특허 공개 번호 2005/0176631, WO 2005/091944, WO 2007/0293430, 미국 특허 공개 번호 2007/0293430, WO/2008/121563, 미국 특허 번호 4,904,584, WO 99/67291, WO 99/03887, WO 00/26354, 및 미국 특허 번호 5,218,092에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있는 추가의 FGF-21은 하기에 보다 상세히 기재된다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성이다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어지며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드의 서열 내의 비-자연적으로 코딩된 아미노의 측쇄를 통해, 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 본 개시내용의 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 FGF-21 폴리펩티드에 연결될 수 있는 반감기 연장 모이어티는, 예를 들어, 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 G (IgG), 알부민-결합 폴리펩티드 (ABP), PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, Fc 영역, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. FGF-21 폴리펩티드를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 반감기 연장 모이어티는 하기에 보다 상세히 기재된다.
일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 수용성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 일부 측면에서, PEG는 약 10 kDa 내지 약 40 kD의 평균 분자량을 갖는다. 따라서, 일부 측면에서, PEG는 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 약 35 kDa, 또는 약 40 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
일부 측면에서, PEG는 약 30 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 약 15 kDa 내지 약 40 kDa, 약 20 kDa 내지 약 40 kDa, 약 25 kDa 내지 약 40 kDa, 약 30 kDa 내지 약 40 kDa, 약 35 kDa 내지 약 40 kDa, 약 15 kDa 내지 약 35 kDa, 약 15 kDa 내지 약 30 kDa, 약 15 kDa 내지 약 25 kDa, 약 15 kDa 내지 약 20 kDa, 약 20 kDa 내지 약 35 kDa, 약 25 kDa 내지 약 35 kDa, 또는 약 30 kDa 내지 약 35 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티, 예를 들어, PEG는, 비-자연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌 유도체를 통해, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 변형된 FGF-21 폴리펩티드)에 연결된다. 일부 측면에서, 페닐알라닌 유도체는 파라-아세틸-L-페닐알라닌이다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 옥심 연결을 통해 비-자연적으로 코딩된 아미노산에 연결된다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 서열식별번호: 3 (야생형 FGF-21)의 아미노산 글루타민 109를 대체한다.
본 개시내용의 일부 구체적 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는, PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2), 즉, 야생형 FGF-21 (서열식별번호: 3)의 글루타민 109가 파라-아세틸-L-페닐알라닌으로 대체되고 30 kDa PEG 쇄가 옥심 연결을 통해 위치 109에서 파라-아세틸-L-페닐알라닌에 공유 부착된 서열식별번호: 1의 변형된 FGF-21의 유도체이다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)는 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 10 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 또는 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)는 약 1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 약 15 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 20 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 약 25 mg/ml 내지 약 30 mg/ml, 약 30 mg/ml 내지 약 35 mg/ml, 또는 약 35 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)는 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml, 26 mg/ml, 27 mg/ml, 28 mg/ml, 29 mg/ml, 30 mg/ml, 31 mg/ml, 32 mg/ml, 33 mg/ml, 34 mg/ml, 35 mg/ml, 36 mg/ml, 37 mg/ml, 38 mg/ml, 39 mg/ml, 또는 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드의 농도는 관련 기술분야에 공지된 방법, 또는 본 출원의 실시예 섹션에 개시된 구체적 방법에 따라 결정된다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)는 본원에 개시된 제제 중에 용량당 약 1 mg 내지 약 40 mg의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)는 본원에 개시된 제제 중에 용량당 약 1 mg 내지 약 5 mg, 용량당 약 5 mg 내지 약 10 mg, 또는 용량당 약 10 mg 내지 약 15 mg, 용량당 약 15 mg 내지 약 20 mg, 또는 용량당 약 20 mg 내지 약 25 mg, 용량당 약 25 mg 내지 약 30 mg, 또는 용량당 약 30 mg 내지 약 35 mg, 또는 용량당 약 35 mg 내지 약 40 mg의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21은 본원에 개시된 제제 중에 용량당 40 mg 초과의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)는 본원에 개시된 제제 중에 용량당 약 1 mg, 용량당 약 2 mg, 용량당 약 3 mg, 용량당 약 4 mg, 용량당 약 5 mg, 용량당 약 6 mg, 용량당 약 7 mg, 용량당 약 8 mg, 용량당 약 9 mg, 용량당 약 10 mg, 용량당 약 11 mg, 용량당 약 12 mg, 용량당 약 13 mg, 용량당 약 14 mg, 용량당 약 15 mg, 용량당 약 16 mg, 용량당 약 17 mg, 용량당 약 18 mg, 용량당 약 19 mg, 용량당 약 20 mg, 용량당 약 21 mg, 용량당 약 22 mg, 용량당 약 23 mg, 용량당 약 24 mg, 용량당 약 25 mg, 용량당 약 26 mg, 용량당 약 27 mg, 용량당 약 28 mg, 용량당 약 29 mg, 용량당 약 30 mg, 용량당 약 31 mg, 용량당 약 32 mg, 용량당 약 33 mg, 용량당 약 34 mg, 용량당 약 35 mg, 용량당 약 36 mg, 용량당 약 37 mg, 용량당 약 38 mg, 용량당 약 39 mg, 또는 용량당 약 40 mg의 양으로 존재한다.
일부 측면에서, 제약 제제는 피하 투여를 위해 제제화된다. 하기에 논의되는 바와 같이, 본원에 개시된 다른 제약 제제는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 제약 제제는, 예를 들어, 안전 시린지로의 피하 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 매일 또는 매주 투여, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6일마다, 매주, 또는 2주마다 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 수성 제제이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21; (ii) 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 100 mM 내지 약 1 M 농도의 수크로스; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (v) 약 10 μM 내지 약 100 μM 농도의 DTPA; 여기서 제제의 pH는 약 6.7 내지 약 7.5인 제약 제제를 제공한다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 μM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 μM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; 및 (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; 여기서 pH는 약 7.0인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; 및 (iii) 600 mM 농도의 수크로스; 여기서 pH는 7.0인 제약 제제가 제공된다.
일부 구체적 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2); (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제를 제공한다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 7.1인 제약 제제가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는 제약 제제로서, (i) 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF21; (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; (iii) 600 mM 농도의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM 농도의 DTPA; 여기서 pH는 7.1인 제약 제제가 제공된다.
본 개시내용은 또한, 하기에 개시되는 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법 중 임의의 것에 따라 제조된 제약 제제를 제공한다.
II. 제조 방법
본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제약 제제의 안정성을 개선시키거나 또는 향상시키는 방법으로서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예를 들어, DTPA를 혼합하는 것을 포함하며, 여기서 제제는 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 함유하지 않는 참조 제제에 비해 개선된 안정성을 갖는 것인 방법을 제공한다. 이들 안정화 방법은 (i) 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 제제에 혼합하는 것, (ii) 폴리소르베이트 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80을 혼합하는 것, (iii) 제제의 pH를 대략 7.1로 조정하는 것, 또는 (iv) 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 제약 제제는 (i) 약 10 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 약 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 제약 제제는 (i) 약 20 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 약 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 약 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 약 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 제약 제제는 (i) 10 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 제약 제제는 (i) 20 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21; (ii) 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘; (iii) 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스; (iv) 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및 (v) 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA를 혼합하고; pH를 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "혼합"은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 개시된 농도에 도달하기 위해 미리 정해진 순서 없이 본원에 개시된 제제의 성분들을 조합하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 제약 제제 중의 부형제는 순차적으로 또는 동시에 FGF-21 폴리펩티드 용액에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 농축된 FGF-21 폴리펩티드 용액이 제제 중의 부형제의 전부 또는 부분을 포함하는 용액에 첨가될 수 있다. 다른 측면에서, 부형제는, 예를 들어, 투석 또는 여과를 사용하여 제제에 혼입될 수 있다.
일부 측면에서, 개시된 방법의 적용으로부터 유래되는 안정성에서의 개선은, 예를 들어, (i) 참조 제제에 대한 물리적 안정성에서의 증가, (ii) 참조 제제에 대한 화학적 안정성에서의 증가, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 물리적 안정성에서의 증가는 (i) 폴리펩티드 응집의 방지 또는 감소, (ii) 폴리펩티드 단편화의 방지 또는 감소, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 응집은 참조 제제에서 관찰되는 응집의 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 또는 약 10%이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 응집은 참조 제제에서 관찰되는 응집의 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 단편화는 참조 제제에서 나타나는 단편화의 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 또는 약 10%이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 단편화는 참조 제제에서 관찰되는 단편화의 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만이다.
일부 측면에서, 화학적 안정성에서의 증가는 (i) 폴리펩티드 탈아미드화의 방지 또는 감소, (ii) 폴리펩티드 산화의 방지 또는 감소, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 탈아미드화는 참조 제제에서 관찰되는 폴리펩티드 탈아미드화의 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 또는 약 10%이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 탈아미드화는 참조 제제에서 관찰되는 폴리펩티드 탈아미드화의 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 산화는 참조 제제에서 관찰되는 폴리펩티드 산화의 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 또는 약 10%이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물에서 관찰되는 폴리펩티드 산화는 참조 제제에서 관찰되는 폴리펩티드 산화의 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 제제를 안정화시키는 (안정성을 개선시키거나 또는 향상시키는) 방법은 분해의 수준 뿐만 아니라 분해의 속도를 감소시킬 수 있다: 예를 들어, 개시된 방법은, 참조 제제에 대하여, 폴리펩티드 탈아미드화 속도를 감소시키거나, 폴리펩티드 산화 속도를 감소시키거나, 폴리펩티드 응집 속도를 감소시키거나, 단백질분해성 분해 속도를 감소시키거나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
예를 들어, 본원에 개시된 제약 제제 중의 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예컨대 DTPA의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 특정 시간 기간 동안 특정 온도에서 저장 시, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가, 예를 들어, 약 25℃에서, 약 30℃에서, 약 35℃에서, 약 40℃에서, 또는 약 45℃에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 25℃ 초과, 30℃ 초과, 35℃ 초과, 약 40℃, 또는 약 45℃의 온도에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)는, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 30℃ 내지 약 35℃, 또는 약 40℃ 내지 약 45℃에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가가 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 또는 약 4개월 동안 상기에 개시된 온도 또는 온도 범위에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
구체적 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 약 1개월 동안 40℃에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 탈아미드화 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 약 25℃에서, 약 30℃에서, 약 35℃에서, 약 40℃에서, 또는 약 45℃에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 고분자량 (HMW) 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 25℃ 초과, 30℃ 초과, 35℃ 초과, 약 40℃, 또는 약 45℃의 온도에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 30℃ 내지 약 35℃, 또는 약 40℃ 내지 약 45℃의 온도에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 또는 약 4개월 동안 상기에 개시된 온도 또는 온도 범위에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
구체적 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 참조 제제에 대하여, 제약 제제가 약 1개월 동안 40℃에서 저장될 때, FGF-21 폴리펩티드의 HMW 응집 속도를 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은 FGF-21 폴리펩티드 내의 하나 이상의 메티오닌의 산화를 방지하거나 경감시킬 수 있다.
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제에 대한 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 (예를 들어, DTPA)의 혼합은, 예를 들어, 25℃에서 및/또는 40℃에서, 서열식별번호: 3의 아미노산 1 및/또는 아미노산 169 (또는 서열식별번호: 1, 2 또는 임의의 다른 FGF-21 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산)의 산화를 방지하거나 경감시킬 수 있다.
개시된 방법은 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터 DTPA를 사용할 수 있다. 그러나, 일부 다른 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터는, 예를 들어, 또 다른 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예컨대 EDTA, EGTA, DOTA, DTPA-관련 화합물, 예컨대 티욱세탄, 또는 관련 기술분야에 공지된 DTPA 및 EDTA와 관련된 임의의 킬레이팅제, 예를 들어 DTPA.BMA 및 EDTA.BMA일 수 있다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 10 μM 내지 약 100 μM, 15 μM 내지 약 95 μM, 약 20 μM 내지 약 90 μM, 약 25 μM 내지 약 85 μM, 약 30 μM 내지 약 80 μM, 약 35 μM 내지 약 75 μM, 약 40 μM 내지 약 70 μM, 약 45 μM 내지 약 65 μM, 약 50 μM 내지 약 60 μM, 약 25 μM 내지 약 75 μM, 약 40 μM 내지 약 60 μM, 약 30 μM 내지 약 70 μM, 또는 약 40 μM 내지 약 75 μM의 양으로 혼합될 수 있다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 약 10 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 약 60 μM, 약 65 μM, 약 70 μM, 약 75 μM, 약 80 μM, 약 85 μM, 약 90 μM, 약 95 μM 또는 약 100 μM의 양으로 혼합될 수 있다.
일부 측면에서, DTPA 양이온 킬레이터는 적어도 약 15 μM, 적어도 약 20 μM, 적어도 약 25 μM, 적어도 약 30 μM, 적어도 약 35 μM, 적어도 약 40 μM, 적어도 약 45 μM, 적어도 약 50 μM, 적어도 약 55 μM, 적어도 약 60 μM, 적어도 약 65 μM, 적어도 약 70 μM, 또는 적어도 약 75 μM의 양으로 혼합될 수 있다.
구체적 측면에서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터, 예를 들어, DTPA는, 50 μM의 양으로 혼합된다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제제의 pH는 약 6.5 초과, 약 6.6 초과, 약 6.7 초과, 약 6.8 초과, 약 6.9 초과, 약 7.0 초과, 약 7.1 초과, 약 7.2 초과, 약 7.3 초과, 약 7.4 초과, 또는 약 7.5 초과의 pH로 조정된다.
일부 측면에서, 제제의 pH는 6.5 초과, 6.6 초과, 6.7 초과, 6.8 초과, 6.9 초과, 7.0 초과, 7.1 초과, 7.2 초과, 7.3 초과, 7.4 초과, 또는 7.5 초과의 pH로 조정된다.
일부 측면에서, 제제의 pH는 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5의 pH로 조정된다.
일부 측면에서, 제제의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5, 약 6.6 내지 약 7.5, 약 6.7 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 7.5, 약 6.9 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.1 내지 약 7.5, 약 7.2 내지 약 7.5, 약 7.3 내지 약 7.5, 약 7.4 내지 약 7.5, 약 6.5 내지 약 7.4, 약 6.5 내지 약 7.3, 약 6.5 내지 약 7.2, 약 6.5 내지 약 7.1, 약 6.5 내지 약 7.0, 약 6.5 내지 약 6.9, 약 6.5 내지 약 6.8, 약 6.5 내지 약 6.7, 약 6.6 내지 약 7.4, 약 6.7 내지 약 7.4, 약 6.8 내지 약 7.4, 약 6.9 내지 약 7.4, 약 7.0 내지 약 7.4, 약 7.1 내지 약 7.4, 약 7.2 내지 약 7.4, 약 7.3 내지 약 7.4, 약 6.5 내지 약 7.3, 약 6.6 내지 약 7.3, 약 6.7 내지 약 7.3, 약 6.7 내지 약 7.3, 약 6.8 내지 약 7.3, 약 6.9 내지 약 7.3, 약 7.0 내지 약 7.3, 약 7.1 내지 약 7.3, 약 7.2 내지 약 7.3, 약 6.5 내지 약 7.2, 약 6.6 내지 약 7.2, 약 6.7 내지 약 7.2, 약 6.8 내지 약 7.2, 약 6.9 내지 약 7.2, 약 7.0 내지 약 7.2, 약 7.1 내지 약 7.2, 약 6.9 내지 약 7.1, 또는 약 7.0 내지 약 7.1의 pH로 조정된다,
일부 측면에서, 제제의 pH는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5의 pH로 조정된다. 일부 측면에서, 제약 제제는, pH 조정 후, 6.5의 pH를 갖는 참조 제제보다 더 안정적이다.
일부 측면에서, 제제의 pH는 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5의 pH로 조정된다. 일부 측면에서, 제약 제제는, pH 조정 후, 6.5의 pH를 갖는 참조 제제보다 더 안정적이다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 계면활성제를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 혼합된 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 즉, 중성 용액 중에서 순전하를 갖지 않는 경향이 있는 계면활성제이다. 일부 측면에서, 혼합된 비음이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 측면에서, 비-이온성 계면활성제는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방 산 에스테르의 경우에 대략 적어도 0.01 mg/ml의 양인 임계 미셀 농도 (CMC) 초과의 양으로 혼합된다. 문헌 [Wan and Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p.136, 1974] 참조. 본 발명의 방법의 일부 측면에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 (PS80)이다.
일부 측면에서, PS80 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.07% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.08% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.09% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.07% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.08% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.07% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v), 약 0.05% 내지 약 0.07% (w/v), 약 0.06% 내지 약 0.07% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.06% (w/v)의 양으로 제약 제제에 혼합된다.
일부 측면에서, 폴리소르베이트 80 계면활성제는 적어도 약 0.01% (w/v), 적어도 약 0.02% (w/v), 적어도 약 0.03% (w/v), 적어도 약 0.04% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.06% (w/v), 적어도 약 0.07% (w/v), 적어도 약 0.08% (w/v), 적어도 약 0.09% (w/v) 또는 적어도 약 0.1% (w/v)의 양으로 혼합된다. 일부 측면에서, 계면활성제, 예를 들어, PS80은, 예를 들어, 제제 교반 시에 (예를 들어, 진탕기 상에서) 미립자 형성 및/또는 기포 형성을 경감시키거나 방지하기에 충분한 양으로 혼합된다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 아미노산 완충제, 예를 들어, 히스티딘 (즉, L-히스티딘, D-히스티딘, 용매화된 히스티딘, 수화된 히스티딘, 무수 히스티딘, 또는 이들의 혼합물)을 혼합하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 25 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 35 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 70 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 75 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 80 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 85 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 90 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 95 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 25 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 35 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 70 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 75 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 80 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 85 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 35 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 70 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 75 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 55 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 60 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 65 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 25 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 약 15 mM 내지 약 20 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 60 mM 히스티딘, 약 45 mM 내지 약 60 mM 히스티딘, 약 50 mM 내지 약 60 mM 히스티딘, 약 15.5 mM 내지 약 24.5 mM 히스티딘, 약 16 mM 내지 약 24 mM 히스티딘, 약 16.5 mM 내지 약 23.5 mM 히스티딘, 약 17 mM 내지 약 23 mM 히스티딘, 약 17.5 mM 내지 약 22.5 mM 히스티딘, 약 18 mM 내지 약 22 mM 히스티딘, 약 18.5 mM 내지 약 21.5 mM 히스티딘, 약 19 mM 내지 약 21 mM 히스티딘, 또는 약 19.5 mM 내지 약 20.5 mM 히스티딘의 양으로 혼합된다.
일부 측면에서, 히스티딘 완충제는 약 10 mM 히스티딘, 약 11 mM 히스티딘, 약 12 mM 히스티딘, 약 13 mM 히스티딘, 약 14 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 약 16 mM 히스티딘, 약 17 mM 히스티딘, 약 18 mM 히스티딘, 약 19 mM 히스티딘, 약 20 mM 히스티딘, 약 21 mM 히스티딘, 약 22 mM 히스티딘, 약 23 mM 히스티딘, 약 24 mM 히스티딘, 약 25 mM 히스티딘, 약 26 mM 히스티딘, 약 27 mM 히스티딘, 약 28 mM 히스티딘, 약 29 mM 히스티딘, 약 30 mM 히스티딘, 약 31 mM 히스티딘, 약 32 mM 히스티딘, 약 33 mM 히스티딘, 약 34 mM 히스티딘, 약 35 mM 히스티딘, 약 36 mM 히스티딘, 약 37 mM 히스티딘, 약 38 mM 히스티딘, 약 39 mM 히스티딘, 약 40 mM 히스티딘, 약 41 mM 히스티딘, 약 42 mM 히스티딘, 약 43 mM 히스티딘, 약 44 mM 히스티딘, 약 45 mM 히스티딘, 약 46 mM 히스티딘, 약 47 mM 히스티딘, 약 48 mM 히스티딘, 약 49 mM 히스티딘, 또는 약 50 mM 히스티딘의 양으로 혼합된다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법은 삼투 조절제 (등장화제)를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 본 개시내용에 따르면 삼투 조절제 (등장화제)는 폴리올, 사카라이드, 탄수화물, 염, 예컨대 염화나트륨, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예시적 폴리올은 약 600 kD 미만 (예를 들어, 120 내지 400 kD 범위)인 분자량을 갖는 것들, 예를 들어, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨, 에리트리톨, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 크실리톨, 글리세롤, 락티톨, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이노시톨, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 사카라이드 또는 탄수화물 삼투 조절제는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 측면에서, 사카라이드 또는 탄수화물은 프룩토스, 글루코스, 만노스, 수크로스, 소르보스, 크실로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분, 수용성 글루칸, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 삼투 조절제는 환원 당 또는 비-환원 당 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 사카라이드를 포함한다. 일부 측면에서, 삼투 조절제 등장화제는, 바람직하게는 수크로스, 트레할로스, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 비-환원 당인 사카라이드를 포함한다. 일부 구체적 측면에서, 비-환원 당은 수크로스이다.
일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 300 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 400 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 500 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 600 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 700 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 800 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 900 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 500 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 600 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 700 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 800 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 500 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 600 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 700 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 약 500 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 약 600 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 또는 약 500 mM 내지 약 600 mM 수크로스의 양으로 혼합된다.
일부 측면에서, 수크로스 삼투 조절제는 약 100 mM 수크로스, 약 150 mM 수크로스, 약 200 mM 수크로스, 약 250 mM 수크로스, 약 300 mM 수크로스, 약 350 mM 수크로스, 약 400 mM 수크로스, 약 450 mM 수크로스, 약 500 mM 수크로스, 약 550 mM 수크로스, 약 600 mM 수크로스, 약 650 mM 수크로스, 약 700 mM 수크로스, 약 750 mM 수크로스, 약 800 mM 수크로스, 약 850 mM 수크로스, 약 900 mM 수크로스, 약 950 mM 수크로스, 또는 약 1 M 수크로스의 양으로 혼합된다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 변형된 FGF-21 폴리펩티드이다. 관련 기술분야에 공지된 많은 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,012,931 및 9,434,788에 개시된 것들이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 본 출원에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있는 추가의 FGF-21은 하기에 보다 상세히 기재된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 (야생형 humFGF-21)에 대한 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 (야생형 humFGF-21)에 대한 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지거나 본질적으로 그로 이루어지며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 변형된 FGF-21 폴리펩티드는, 예를 들어, FGF-21 폴리펩티드의 서열 내의 비-자연적으로 코딩된 아미노의 측쇄를 통해, 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 본 개시내용의 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 변형된 FGF-21 폴리펩티드에 연결될 수 있는 반감기 연장 모이어티는, 예를 들어, 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, IgG, ABP, PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, Fc 영역, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. FGF-21 폴리펩티드를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 반감기 연장 모이어티는 하기에 보다 상세히 기재된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 반감기 연장 모이어티는 수용성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 일부 측면에서, PEG는 약 10 kDa 내지 약 40 kDa, 예를 들어, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 약 35 kDa, 또는 약 40 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 약 30 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 약 15 kDa 내지 약 40 kDa, 약 20 kDa 내지 약 40 kDa, 약 25 kDa 내지 약 40 kDa, 약 30 kDa 내지 약 40 kDa, 약 35 kDa 내지 약 40 kDa, 약 15 kDa 내지 약 35 kDa, 약 15 kDa 내지 약 30 kDa, 약 15 kDa 내지 약 25 kDa, 약 15 kDa 내지 약 20 kDa, 약 20 kDa 내지 약 35 kDa, 약 25 kDa 내지 약 35 kDa, 또는 30 kDa 내지 약 35 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티, 예를 들어, PEG는, 비-자연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌 유도체를 통해, FGF-21 폴리펩티드에 연결된다. 일부 측면에서, 페닐알라닌 유도체는 파라-아세틸-L-페닐알라닌이다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 옥심 연결을 통해 비-자연적으로 코딩된 아미노산에 연결된다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 서열식별번호: 3의 아미노산 글루타민 109를 대체한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2), 즉, 글루타민 109가 파라-아세틸-L-페닐알라닌으로 대체되고 30 kDa PEG 쇄가 옥심 연결을 통해 파라-아세틸-L-페닐알라닌에 공유 부착된 서열식별번호: 1의 FGF-21이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 약 10 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 또는 약 40 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드의 농도는 관련 기술분야에 공지된 방법, 또는 본 출원의 실시예 섹션에 개시된 구체적 방법에 따라 결정된다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제제는 피하 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 안전 시린지로의 피하 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 매일 또는 매주 투여를 위해 제제화된다. 일부 측면에서, 제제는 수성 제제이다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 100 mM 내지 약 1 M 농도의 수크로스; (iii) 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (iv) 약 10 μM 내지 약 100 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 제제의 pH는 약 6.7 내지 약 7.5인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 15 mM 내지 약 45 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 200 mM 내지 약 900 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (iv) 약 20 μM 내지 약 90 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 제제의 pH는 약 6.8 내지 약 7.4인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 15 mM 내지 약 40 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 300 mM 내지 약 800 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (iv) 약 30 μM 내지 약 80 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 제제의 pH는 약 6.9 내지 약 7.3인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 15 mM 내지 약 30 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 400 mM 내지 약 800 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (iv) 약 40 μM 내지 약 70 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 제제의 pH는 약 7 내지 약 7.2인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 15 mM 내지 약 25 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 500 mM 내지 약 700 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.04% 내지 약 0.06% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및, (iv) 약 45 μM 내지 약 55 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 제제의 pH는 약 7 내지 약 7.1인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 약 50 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.1인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 50 μM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.1인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; 및 (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.0인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; 및 (ii) 600 mM 농도의 수크로스를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.0인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 약 10 mg/mL의 농도로 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 약 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.1인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 약 20 mg/mL의 농도로 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 약 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 약 7.1인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 약 10 mg/mL의 농도로 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.1인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 약 20 mg/mL의 농도로 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, (i) 20 mM 농도의 히스티딘; (ii) 600 mM 농도의 수크로스; (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (iv) 50 uM 농도의 DTPA를 혼합하는 것을 포함하며; 여기서 pH는 7.1인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제약 제제 중에 포함된 개개의 부형제 (예를 들어, DTPA, PS80, 히스티딘, 수크로스)의 농도는 완성된 제약 제제의 최종 부피 단위당 그의 제조 과정에서 제약 제제에 첨가된 개개의 부형제의 양 (중량, 몰 등)인 것으로 결정/계산될 수 있다. 다른 구현예에서, 제약 제제 중에 포함된 부형제 (예를 들어, DTPA, PS80, 히스티딘, 수크로스)의 농도는 제약 제제 중의 개개의 부형제의 실제 양을 기준으로 한다.
III. 치료 방법
본 개시내용은 또한, 섬유증과 연관된 질환 또는 병태 및/또는 당뇨병의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 섬유증과 연관된 질환 또는 병태 및/또는 당뇨병을 치료 또는 방지하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 질환 또는 병태는 당뇨병, 예를 들어, 2형 당뇨병이다. 일부 측면에서, 질환 또는 병태는 비알콜성 지방간염 (NASH)이다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21은, 용량당 약 1 mg 내지 약 40 mg의 양으로 본원에 개시된 치료 또는 방지 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21은, 용량당 약 1 mg 내지 약 5 mg, 또는 용량당 약 5 mg 내지 약 10 mg, 또는 용량당 약 10 mg 내지 약 15 mg, 또는 용량당 약 15 mg 내지 약 20 mg, 또는 용량당 약 20 mg 내지 약 25 mg, 또는 용량당 약 25 mg 내지 약 30 mg, 또는 용량당 약 30 mg 내지 약 35 mg, 또는 용량당 약 35 mg 내지 약 40 mg의 양으로 본원에 개시된 치료 또는 방지 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21은, 용량당 40 mg 초과의 양으로 본원에 개시된 치료 또는 방지 방법에서 사용될 수 있다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드, 예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21은, 용량당 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg, 약 10 mg, 약 11 mg, 약 12 mg, 약 13 mg, 약 14 mg, 약 15 mg, 약 16 mg, 약 17 mg, 약 18 mg, 약 19 mg, 약 20 mg, 약 21 mg, 약 22 mg, 약 23 mg, 약 24 mg, 약 25 mg, 약 26 mg, 약 27 mg, 약 28 mg, 약 29 mg, 약 30 mg, 약 31 mg, 약 32 mg, 약 33 mg, 약 34 mg, 약 35 mg, 약 36 mg, 약 37 mg, 약 38 mg, 약 39 mg, 또는 약 40 mg의 양으로 본원에 개시된 치료 또는 방지 방법에서 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 제약 제제는, 예를 들어, 안전 시린지를 사용하여, 피하 투여된다. 일부 측면에서, 제약 제제는 매일 또는 매주 투여된다.
일부 측면에서, 대상체에 대한 유효량의 본원에 개시된 FGF-21 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)을 포함하는 제약 제제의 투여는 간 경직도를 감소시키거나, 체지방률을 감소시키거나, 체중을 감소시키거나, 간-대-체중 비율을 감소시키거나, 간 지질 함량을 감소시키거나, 간 섬유증 영역을 감소시키거나, 공복 혈당 수준을 감소시키거나, 공복 트리글리세리드 수준을 감소시키거나, LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키거나, ApoB 수준을 감소시키거나, ApoC 수준을 감소시키거나, HDL 콜레스테롤을 증가시키거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 측면에서, 대상체에 대한 본원에 개시된 치료 방법에 따른 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 제약 제제의 투여는, 치료되지 않은 대상체에서의 수준에 비해 또는 제약 제제의 투여 전의 대상체에 비해, (i) 간 지방의 수준에서의 감소; (ii) 간 손상의 수준에서의 감소; (iii) 섬유증의 수준에서의 감소; (iv) 섬유증 바이오마커 혈청 Pro-C3 (N-말단 III형 콜라겐 프로펩티드)의 수준에서의 감소; (v) 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 수준에서의 감소; (vi) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 수준에서의 감소; (vii) 혈청 아디포넥틴의 수준에서의 증가; (viii) 혈장 LDL의 수준에서의 감소, (ix) 혈장 HDL의 수준에서의 증가; (x) 혈장 트리글리세리드의 수준에서의 감소; (xi) 간 경직도의 수준에서의 감소; 또는 (xii) 이들의 임의의 조합을 제공한다.
본 개시내용은, 섬유증과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 섬유증과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 췌장, 폐, 심장, 신장, 간, 눈, 신경계, 골수, 림프절, 심내막심근, 및/또는 후복막강 등의 기관 및 조직에 영향을 미칠 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 간 섬유증 또는 전-경변증일 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 하기로부터 선택될 수 있다: 비알콜성 지방간염 (NASH), 경변증, 미만성 폐실질성 질환, 낭포성 섬유증, 폐 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 주입 섬유증, 신장 섬유증, 만성 신장 질환, 당뇨병성 신장 질환, 국소 분절 사구체경화증, 막성 신장병, IgA 신장병, 골수섬유증, 심부전, 급성 심부전, 만성 심부전, 대사성 심부전, 심장 섬유증, 백내장 섬유증, 백내장, 안구 흉터, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 장 섬유증, 장 협착, 심내막심근 섬유증, 심방 섬유증, 종격 섬유증, 크론병, 후복막 섬유증, 켈로이드, 신성 전신 섬유증, 경피증, 전신 경화증, 관절섬유증, 페이로니 증후군, 듀프이트렌 구축, 당뇨병성 신경증, 유착성 관절낭염, 알콜성 간 질환, 지방간염, 바이러스성 간염, 담관 질환, 원발성 혈색소침착증, 약물-관련 경변증, 잠원성 경변증, 윌슨병, 및, 알파 1-항트립신 결핍증, 간질성 폐질환 (ILD), 인간 섬유증성 폐 질환, 간 섬유증, 황반 변성, 망막 망막병증, 유리체 망막병증, 심근 섬유증, 그레이브스 눈병, 약물 유도 맥각중독, 심혈관 질환, 아테롬성경화증/재발협착증, 비후 흉터, 원발성 또는 특발성 골수섬유증, 및 염증성 장 질환 (콜라겐성 결장염을 포함하나 이에 제한되지는 않음). 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 폐 질환, 폐암, 약물 요법, 화학요법, 또는 방사선 요법 중 하나 이상으로부터 유래된다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 노화, 심장 마비, 뇌졸중, 심근 손상, 또는 좌심실 기능장애 중 하나 이상으로부터 유래된다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 신장 섬유증, 사구체 신염, 만성 신장 질환, 만성 신부전, 및 전신 루푸스와 관련된 신염, 암, 신체적 장애, 독소, 대사 질환, 면역 질환, 또는 당뇨병성 신장병으로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 외상, 척수 손상, 감염, 수술, 허혈 손상, 심장 마비, 화상, 환경 오염물 노출, 폐렴, 결핵, 또는 급성 호흡 장애 증후군 중 하나 이상으로부터 유래된다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 폐 섬유증, 간질성 폐질환, 인간 섬유증성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증, 간 섬유증, 심장 섬유증, 심근 섬유증, 황반 변성, 망막 망막병증, 유리체 망막병증, 그레이브스 눈병, 약물 유도 맥각중독, 심혈관 질환, 아테롬성경화증/재발협착증, 켈로이드 및 비후 흉터, 원발성 또는 특발성 골수섬유증, 염증성 장 질환, 콜라겐성 결장염, 안구 흉터 및 백내장 섬유증으로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 NASH, 간 섬유증, 및 경변증으로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 NASH일 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 당뇨병성 신장 질환, 만성 신장 질환, 및 신장 섬유증으로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 대사성 심부전 및 심장 섬유증으로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 섬유증과 연관된 질환은 폐 섬유증일 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 간 지방 분율의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 임의로 대상체는 NASH의 발달 위험에 있거나 NASH를 갖는 것으로 진단된 것인, 상기 대상체에서 간 지방 분율을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 간 경직도 감소, 체지방률 감소, 체중 감소, 간-대-체중 비율 감소, 간 지질 함량 감소, 간 섬유증 영역 감소, 공복 혈당 수준 감소, 공복 트리글리세리드 감소, LDL 콜레스테롤 감소, ApoB 감소, ApoC 감소, 및/또는 HDL 콜레스테롤 증가를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 임의로 대상체는 NASH의 발달 위험에 있거나 NASH를 갖는 것으로 진단된 것인, 상기 대상체에서의 간 경직도를 감소시키고/거나, 체지방률을 감소시키고/거나, 체중을 감소시키고/거나, 간-대-체중 비율을 감소시키고/거나, 간 지질 함량을 감소시키고/거나, 간 섬유증 영역을 감소시키고/거나, 공복 혈당 수준을 감소시키고/거나, 공복 트리글리세리드를 감소시키고/거나, LDL 콜레스테롤을 감소시키고/거나, ApoB를 감소시키고/거나, ApoC를 감소시키고/거나, HDL 콜레스테롤을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 아디포넥틴 수준 증가를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 임의로 상기 대상체는 NASH의 발달 위험에 있거나 NASH를 갖는 것으로 진단된 것인, 상기 대상체에서 아디포넥틴 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, NASH와 연관된 하나 이상의 증상의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 NASH와 관련된 하나 이상의 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, NASH의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에게, 서열식별번호: 1을 포함하며, 여기서 그의 pAF 잔기는 약 30 kDa의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 연결된 것인 변형된 FGF-21 폴리펩티드 (PEG-FGF-21)를 포함하는 본원에 개시된 제약 제제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 NASH를 치료 또는 방지하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 대상체는 NASH CRN 섬유증 스테이지 1-3을 나타낼 수 있으며, 이는 임의로 간 생검에 의해 결정된다. 일부 측면에서, 치료 전에 대상체는 적어도 약 60의 지방 간 지수를 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 치료 전에 대상체는 적어도 10%의 간 지방 분율 백분율을 나타낼 수 있으며, 이는 임의로 자기 공명 이미징에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은, 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비만을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은, 글루코스 및 지질 항상성, 글루코스 섭취, GLUT 1 발현, 및/또는 글루코스, 트리글리세리드, 인슐린 또는 글루카곤의 혈청 농도 중 적어도 하나의 조절을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 글루코스 및 지질 항상성, 글루코스 섭취, GLUT 1 발현, 및/또는 글루코스, 트리글리세리드, 인슐린 또는 글루카곤의 혈청 농도 중 적어도 하나를 조절하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 인슐린 감수성 증가, 아디포넥틴의 수준에서의 증가, 혈당의 수준에서의 감소, 글루카곤의 수준에서의 감소, 트리글리세리드의 수준에서의 감소, 프룩토사민의 수준에서의 감소, 저밀도 콜레스테롤의 수준에서의 감소, 또는 C-반응성 단백질의 수준에서의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 인슐린 감수성 증가, 아디포넥틴의 수준 증가, 혈당의 수준 감소, 글루카곤의 수준 감소, 트리글리세리드의 수준 감소, 프룩토사민의 수준 감소, 저밀도 콜레스테롤의 수준 감소, 또는 C-반응성 단백질의 수준 감소 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 비만, 당뇨병, 췌장염, 인슐린 내성, 과인슐린혈증, 글루코스 불내증, 과혈당증, 대사 증후군, 손상된 글루코스 내성, 부적절 글루코스 클리어런스, 높은 혈당, 및 프라더-윌리 증후군으로부터 선택된 병태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비만, 당뇨병, 췌장염, 인슐린 내성, 과인슐린혈증, 글루코스 불내증, 과혈당증, 대사 증후군, 손상된 글루코스 내성, 부적절 글루코스 클리어런스, 높은 혈당, 및 프라더-윌리 증후군으로부터 선택된 병태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, A형 인슐린 내성, C형 인슐린 내성 (AKA HAIR-AN 증후군), 라브손-멘덴홀 증후군, 도노휘 증후군 또는 레프리코니즘, 안드로겐과잉증, 다모증, 또는 흑색극세포증으로부터 선택된 인슐린 관련 병태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 A형 인슐린 내성, C형 인슐린 내성 (AKA HAIR-AN 증후군), 라브손-멘덴홀 증후군, 도노휘 증후군 또는 레프리코니즘, 안드로겐과잉증, 다모증, 또는 흑색극세포증으로부터 선택된 인슐린 관련 병태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 주사를 통해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 피하 주사, IV 주사, 복강내 주사, 또는 근육내 주사를 통해 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1일당 약 1회의 빈도로, 또는 1일당 약 1회 미만의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1주당 약 2회의 빈도로, 또는 1주당 약 2회 미만의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1주당 약 1회의 빈도로, 또는 1주당 약 2회 미만의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 2주당 약 1회의 빈도로, 또는 1주당 약 2회 미만의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 3주당 약 1회의 빈도로, 또는 1주당 약 2회 미만의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1개월당 약 1회의 빈도로, 또는 1개월당 약 1회 미만의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 4주당 1회의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1일당 약 1회의 빈도로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1주당 약 1회의 빈도로 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 용량당 약 1 mg, 약 2 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 30 mg, 약 35 mg, 약 40 mg, 약 45 mg, 약 50 mg, 약 55 mg, 약 60 mg, 약 65 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 80 mg, 약 85 mg, 약 90 mg, 약 95, 및 약 100 mg의 FGF-21 폴리펩티드로부터 선택된 양으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 약 0.1 내지 100 mg/kg 수용 대상체 체중의 FGF-21 폴리펩티드 농도로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 약 0.5-5 mg/kg 수용 대상체 체중의 FGF-21 폴리펩티드 농도로 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 1일당 1회 내지 2주당 1회, 예컨대 1주당 약 1회 또는 2회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 또는 6일마다 1회의 빈도로 수용 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 제약 제제는, 비경구, 예를 들어, 피하 또는 정맥내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 주사 또는 임의의 다른 형태의 주사 또는 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 단백질 또는 펩티드에 적합한 임의의 통상적 경로에 의해 투여될 수 있다.
IV. 변형된 FGF-21 폴리펩티드
본 개시내용의 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 FGF-21 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환 (예를 들어 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산으로의), 결실 (말단 또는 내부 결실), 또는 이종 모이어티의 부착 (아미노산 서열 내 끼워넣기/삽입에 의한 또는 측쇄 부착에 의한, C-말단, N-말단, 또는 내부) 등의 변형을 포함한다. 일부 구체적 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 3 (야생형 FGF-21), 또는 서열식별번호: 1 (글루타민 109의 파라-아세틸-L-페닐알라닌으로의 치환에 의해 변형된 야생형 서열)의 변형된 버전을 포함한다. 일부 구체적 측면에서, 변형된 FGF-21폴리펩티드는, 예를 들어, 이종 모이어티 (예를 들어, PEG)의 부착을 통한, 서열식별번호: 1의 유도체이다. 구체적 측면에서, 변형된 FGF-21은 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)이다.
표 1: FGF-21 폴리펩티드의 서열
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용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 또한 다형체 (예를 들어, 자연 발생 FGF-21 서열 변형물), 예를 들어 FGF-21의 P-형태 또는 L-형태를 포함한다.
자연-발생 FGF-21에서의 폭넓게 다양한 아미노산 위치에서의 치환이 기재되어 있다. 용해도 또는 안정성을 변조시키거나, 효능제 활성을 증가시키거나, 생체내 또는 시험관내 반감기를 증가시키거나, 프로테아제 내성을 증가시키거나, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키거나, 면역원성 또는 독성을 감소시키거나, 정제 또는 제조능을 용이하게 하거나, 또는 이들의 임의의 조합을 제공하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 치환 또한 용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드에 포함된다.
일부 경우에, 비-자연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은, 또 다른 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 야생형 FGF-21 폴리펩티드, 서열식별번호: 1의 변형된 FGF-21 폴리펩티드, 서열식별번호: 2의 PEG-FGF-21 폴리펩티드, 부가, 치환, 또는 결실이 없는 동일한 FGF-21 폴리펩티드, 또는 또 다른 변형되지 않은 또는 변형된 FGF-21 변형되지 않은 또는 변형된 폴리펩티드)에 대하여 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 다른 생물학적 특색을 달성하도록, 변형된 FGF-21 폴리펩티드 내의 다른 부가, 치환 또는 결실과 조합될 수 있다.
일부 경우에, 다른 부가, 치환 또는 결실은 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 안정성 (단백질분해성 분해에 대한 내성을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 증가시키거나 그의 수용체에 대한 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 다른 부가, 치환 또는 결실은 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 제약학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 다른 부가, 치환 또는 결실은 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 용해도를 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서는, 재조합 숙주 세포에서의 발현 후 폴리펩티드 용해도 증가를 제공하는 비-자연 아미노산의 혼입을 위한 또 다른 부위에 추가로, 자연적으로 코딩된 또는 비-자연 아미노산으로의 치환을 위한 부위가 선택된다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 FGF-21 폴리펩티드 수용체, 결합 단백질, 또는 회합된 리간드에 대한 친화도를 변조시키거나, FGF-21 수용체에 대한 결합 후 신호 전달을 변조시키거나, 순환 반감기를 변조시키거나, 방출 또는 생체이용률을 변조시키거나, 정제를 용이하게 하거나, 특정 투여 경로를 개선 또는 변경시키는 또 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 그의 수용체에 대한 변형된 FGF-21의 친화도를 증가시키는 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는, 검출 (GFP를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 전구약물 방출 또는 활성화, 변형된 FGF-21 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 다른 특색을 개선시키는 화학적 또는 효소 절단 서열, 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 다른 친화도 기반 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 연결된 분자 (비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다.
FGF-21의 다수의 다형체가 확인되었다. 류신 또는 프롤린이 미국 특허 공개 번호 20010012628 및 미국 특허 번호 6,716,626에서 동일한 위치에 기재되었다. 1개의 아미노산 (류신)이 상이한 N-말단 리더 또는 신호 서열이 미국 특허 번호 6,716,626 및 미국 특허 공개 번호 20040259780에 나타나 있다. FGF-21 폴리펩티드 변형물 또는 돌연변이는 미국 특허 번호 6,716,626; 미국 특허 공개 번호 2005/0176631, 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713, 및 2001/0012628; WO 01/36640; WO 03/011213; WO 03/059270; WO 04/110472; WO 05/061712; WO 05/072769; WO 05/091944; WO 05/113606; WO 06/028595; WO 06/028714; WO 06/050247; WO 06/065582; WO 06/078463; WO01/018172; WO09/149171; WO10/042747; WO12/066075; WO11/154349; WO13/052311; WO13/188181 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 또한 자연-발생 FGF-21의 생물학적-활성 단편, 생물학적 활성 변형물 및 입체이성질체 뿐만 아니라 자연-발생 FGF-21의 효능제, 모방체, 및 길항제 변형물 및 그의 폴리펩티드 융합물을 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 이들 둘 다에 추가의 아미노산을 포함하는 융합물도 용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드에 포함된다.
예시적 융합물은, 예를 들어, 리더 또는 신호 펩티드 또는 그의 일부가 없는 FGF-21의 성숙 형태의 재조합 발현으로부터 유래된 FGF-21의 N-말단에 메티오닌이 연결된 메티오닐 FGF-21 (예를 들어 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합 발현으로부터 유래된 FGF-21의 N-말단에 메티오닌이 연결됨), 정제를 위한 융합물 (폴리-히스티딘 또는 친화도 에피토프를 포함하나 이에 제한되지는 않음), PKE 아드넥틴 등의 혈청 알부민 결합 펩티드와의 융합물 및 혈청 알부민 등의 혈청 단백질과의 융합물, 및 FGF-21 및 혈청 알부민, Fc 도메인, 이뮤노글로불린 불변 영역, 구조화되지 않은 폴리펩티드, 예컨대 XTEN 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 다른 분자 (이형 모이어티)를 포함하는 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의의 이러한 단편은 표준 생화학 방법에 의해, 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 발현에 의해 단백질로부터 제조될 수 있다.
용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 PEG 등의 중합체에 컨쥬게이션된 폴리펩티드를 포함하며, 이는 임의로 시스테인, 리신, 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가의 유도체화를 포함할 수 있다. 추가로, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있거나 (여기서 링커 또는 중합체가 컨쥬게이션되는 아미노산은 본 개시내용에 따른 비-자연 아미노산일 수 있음), 리신 또는 시스테인에 대한 커플링과 같은 관련 기술분야에 공지된 기술을 활용하여 자연적으로 코딩된 아미노산에 컨쥬게이션될 수 있다.
용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 또한 글리코실화된 변형된 FGF-21, 예컨대 (이에 제한되지는 않음) 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩티드, 폴리펩티드의 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화된 형태를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 변화를 함유하는 변형물 또한 FGF-21 폴리펩티드의 생물학적 활성 변형물로서 고려된다. 추가로, 스플라이스 변형물이 또한 포함된다.
용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 또한, 화학적 수단에 의해 연결된 또는 융합 단백질로서 발현된, 임의의 하나 이상의 변형되지 않은 또는 변형된 FGF-21 폴리펩티드 또는 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 임의의 유형의 다른 생물학적 활성 분자의 FGF-21 폴리펩티드 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체, 또는 동종다량체를 포함할 뿐만 아니라, 예를 들어 특정 결실 또는 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드 유사체는 또한 생물학적 활성을 유지한다.
용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 FGF-21 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변형된 FGF-21 폴리펩티드는, 임의로 하나 이상의 비-자연 아미노산 변형과 함께, 하나 이상의 자연 아미노산으로의 변형으로 구성될 수 있다. 제약학적 안정성을 변조시키거나, FGF-21 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 변조시키거나, 예컨대 (이에 제한되지는 않음) 효능제 활성을 증가시키거나, 폴리펩티드의 용해도를 증가시키거나, 프로테아제 민감성을 감소시키거나, 탈아미드화를 감소시키거나, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키거나, 면역원성 또는 독성을 감소시키거나, 또는 정제 또는 제조능을 용이하게 하는 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는, FGF-21 폴리펩티드 내의 폭넓게 다양한 아미노산 위치에서의 예시적 치환, 삽입 또는 결실도 용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드에 포함된다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 변형된 FGF-21 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변조시키는 추가의 삽입, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 변형된 FGF-21의 하나 이상의 특성 또는 활성을 변조시킬 수 있다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 FGF-21 폴리펩티드 수용체에 대한 친화도를 변조시키거나, 순환 반감기를 변조시키거나, 치료적 반감기를 변조시키거나, 폴리펩티드의 안정성을 변조시키거나, 프로테아제에 의한 절단을 변조시키거나, 용량을 변조시키거나, 방출 또는 생체이용률을 변조시키거나, 정제를 용이하게 하거나, 탈아미드화를 감소시키거나, 사용-수명을 개선시키거나, 또는 특정 투여 경로를 개선 또는 변경시킬 수 있다. 유사하게, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 검출 (GFP를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 정제 또는 폴리펩티드의 다른 특색을 개선시키는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 다른 친화도 기반 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 연결된 분자 (비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다.
용어 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 또한, 비-자연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 직접적으로, 동일한 또는 상이한 비-자연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에, 자연-코딩된 아미노산 측쇄에, 또는 링커를 통해 간접적으로 연결된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 연결된, 또는 융합 파트너, 예컨대 Fc 도메인을 통해 형성된 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 및 이종다량체를 포함한다. 예시적 링커는 작은 유기 화합물, 다양한 길이의 수용성 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 다양한 길이의 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 모이어티를 포함하고, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 모이어티를 포함하는 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 아미드 연결을 통해 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결되는 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 아지드 모이어티를 통해 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결되는 알킨 모이어티를 포함한다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 알킨 모이어티를 포함하는 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결되는 아지드 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 하나의 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 아미드 연결을 통해 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결되는 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 옥심 연결을 통해 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결된다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 옥심 연결을 통해 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결되며, 여기서 상기 옥심 연결은 카르보닐 기 및 아미노옥시 기의 반응으로부터 유래된 구조를 갖는다. 일부 측면에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 옥심 연결을 통해 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티에 연결되며, 여기서 상기 옥심 연결은 상기 비-자연적으로 코딩된 아미노산 내에 함유된 카르보닐 기 및 상기 링커, 중합체, 생물학적 활성 분자, 또는 반감기 연장 모이어티 내에 함유된 아미노옥시 기의 반응으로부터 유래된 구조를 갖는다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 야생형 인간 FGF-21 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는다.
일부 측면에서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜)모이어티를 포함하는 수용성 중합체에 연결된 적어도 하나의 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 변형된 FGF-21 내의 하기 위치 중 하나 이상에 혼입된다: 위치 1 이전 (즉 N-말단에), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (즉, 단백질의 카르복실 말단에) (아미노산 위치는 서열식별번호: 3에 상응함).
일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 제제 중의 FGF-21 폴리펩티드는, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,273,106; 9,458,214; 9,744,213; 8,541,369; 8,188,040; 9,120,871; 9,895,417; 9,266,935; 6,716,626; 4,904,584; 또는 8,722,622; 미국 출원 공개 번호 2013/0231277; 2009/0305986; 2011/0195895; 2010/0216715; 2001/0012628; 2004/0259780; 2005/0176631; 20070293430; 또는 2012/0035099; 또는 PCT 공개 번호 WO2016048999; WO2010065439; WO2017093465; WO2003011213; WO2003059270; WO2005091944; WO2008121563; WO199967291, WO199903887, WO200026354; 또는 WO2017220706 (이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 변형된 FGF-21 폴리펩티드이다.
V. 반감기 연장 모이어티
본 개시내용의 FGF-21 폴리펩티드는 이종 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 일부 측면에서 반감기 연장 모이어티이다. 일부 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리펩티드 모이어티이며, 일부 다른 측면에서 반감기 연장 모이어티는 비-폴리펩티드 모이어티이다. 일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 단일 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 그러나, 다른 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드는 하나 초과의 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다.
반감기 연장 모이어티 비-단백성 및 단백성 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 비-단백성 반감기 연장 모이어티는, 예를 들어, 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드록시에틸 전분 (HES), 지질, 분지형 또는 비분지형 아실 기, 분지형 또는 비분지형 C8-C30 아실 기, 분지형 또는 비분지형 알킬 기, 및 분지형 또는 비분지형 C8-C30 알킬 기를 포함한다. 단백성 반감기 연장 모이어티는, 예를 들어, 혈청 알부민, 트랜스페린, 아드넥틴 (예를 들어, 알부민-결합 또는 약동학 연장 (PKE) 아드넥틴), Fc 도메인, 및 구조화되지 않은 폴리펩티드, 예컨대 XTEN 및 PAS (예를 들어, 아미노산 Pro, Ala, 및/또는 Ser로 구성된 형상 무질서 폴리펩티드 서열), 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 단편을 포함한다.
FGF-21 또는 FGF 패밀리 구성원(들)의 결정 구조 및 FGF 수용체와의 그의 상호작용의 검사는, 어떠한 특정 아미노산 잔기가 용매에 완전히 또는 부분적으로 접근가능한 측쇄를 갖는지를 나타낼 수 있다. 이들 위치에서의 비-자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄는 단백질 표면으로부터 멀리 떨어져 용매 중으로 향할 수 있고, 따라서, 예를 들어, 수용성 중합체에 연결될 수 있다.
(a) 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된다. 이뮤노글로불린 불변 영역은 CH (불변 중쇄) 도메인 (CH1, CH2 등)으로 표시되는 도메인으로 구성된다. 이소타입 (즉, IgG, IgM, IgA IgD, 또는 IgE)에 따라, 불변 영역은 3 또는 4개의 CH 도메인으로 구성될 수 있다. 일부 이소타입 (예를 들어, IgG) 불변 영역은 또한 힌지 영역을 함유한다. 문헌 [Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.] 참조.
본 개시내용의 융합 단백질의 생성을 위한 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 많은 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 측면에서, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된다. 그러나, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는, 예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그) 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함한 또 다른 포유류 종의 이뮤노글로불린으로부터 유래될 수 있음을 이해한다. 또한, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 임의의 이뮤노글로불린 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 임의의 이뮤노글로불린 이소타입으로부터 유래될 수 있다. 하나의 측면에서, 인간 이소타입 IgG1이 사용된다.
다양한 이뮤노글로불린 불변 영역 유전자 서열 (예를 들어, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 접근가능한 기탁물 형태로 이용가능하다. 불변 영역 도메인 서열은 특정 이펙터 기능을 갖는 (또는 특정 이펙터 기능이 없는) 것으로 또는 면역원성을 감소시키기 위한 특정 변형을 갖는 것으로 선택될 수 있다. 항체 및 항체-코딩 유전자의 많은 서열이 공개되었고, 적합한 Ig 불변 영역 서열 (예를 들어, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 그의 일부)은 관련 기술분야 인식 기술을 사용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 이어서, 본 개시내용의 폴리펩티드를 얻기 위해 임의의 상기 방법을 사용하여 얻어진 유전 물질을 변경시키거나 합성할 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 범주는 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변형물 및 돌연변이를 포함함을 인지할 것이다.
이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부의 서열은, 예를 들어, 관심 도메인을 증폭시키기 위해 선택된 폴리머라제 연쇄 반응 및 프라이머를 사용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부의 서열을 클로닝하기 위해, mRNA를 하이브리도마, 비장, 또는 림프 세포로부터 단리하고, DNA로 역전사시키고, 항체 유전자를 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188에; 또한 예를 들어, 문헌 ["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990)]; [Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270]에 기재되어 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기반으로 하여 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 보다 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 또한 PCR을 사용하여 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 단리할 수 있다. 이 경우 라이브러리는 공통 프라이머 또는 보다 큰 상동 프로브, 예컨대 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 많은 프라이머 세트가 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 정제된 항체의 N-말단 서열 기반의 5' 프라이머 (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 말단의 빠른 증폭 (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 리더 서열 (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). 항체 서열의 클로닝은 추가로 미국 특허 번호 5,658,570 (Newman et al., 1995년 1월 25일 출원됨)에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 이뮤노글로불린 불변 영역은 모든 도메인 및 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 CH2 도메인, CH3 도메인, 및 힌지 영역, 즉, Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 네이티브 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 상응하는, 즉, 그의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이량체 회합에 의해 형성된 폴리펩티드의 부분으로서 정의된다. 네이티브 Fc 영역은 또 다른 Fc 영역과 동종이량체를 형성한다.
하나의 측면에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위 (즉, IgG에서 잔기 216', 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114로 함)의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하고 항체의 C-말단에서 종결되는 단일 이뮤노글로불린 중쇄의 부분을 지칭한다. 따라서, 완전 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다.
이뮤노글로불린 불변 영역의 Fc 영역은, 이뮤노글로불린 이소타입에 따라, CH2, CH3, 및 CH4 도메인, 뿐만 아니라 힌지 영역을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질은 증가된 안정성, 증가된 혈청 반감기 (문헌 [Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조) 뿐만 아니라 Fc 수용체, 예컨대 신생 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 (미국 특허 번호 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1)을 포함한 여러 바람직한 특성을 융합 단백질에 부여한다.
일부 측면에서, "Fc 영역"은 Fc 도메인의 또는 Fc 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, Fc 영역은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 힌지 (예를 들어, 상부, 중앙, 및/또는 저부 힌지 영역) 도메인 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 216-230), CH2 도메인 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 231-340), CH3 도메인 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 아미노산 341-438 주위), CH4 도메인, 또는 그의 변형물, 부분, 또는 단편. 다른 측면에서, Fc 영역은 완전 Fc 도메인 (즉, 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인)을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 영역은 CH3 도메인 (또는 그의 일부)에 융합된 힌지 도메인 (또는 그의 일부), CH2 도메인 (또는 그의 일부)에 융합된 힌지 도메인 (또는 그의 일부), CH3 도메인 (또는 그의 일부)에 융합된 CH2 도메인 (또는 그의 일부), 힌지 도메인 (또는 그의 일부) 및 CH3 도메인 (또는 그의 일부) 둘 다에 융합된 CH2 도메인 (또는 그의 일부)를 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 또한 다른 측면에서, Fc 영역은 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 부분)를 갖지 않는다. 특정 측면에서, Fc 영역은 EU 번호 221 내지 447에 상응하는 아미노산을 포함하거나 그로 이루어진다.
본원에서 F, F1, 또는 F2로 표시되는 Fc 도메인은 많은 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 하나의 측면에서, 폴리펩티드의 Fc 영역은 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된다. 그러나, Fc 영역은, 예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그) 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함한 또 다른 포유류 종의 이뮤노글로불린으로부터 유래될 수 있음을 이해한다. 또한, Fc 도메인 또는 그의 일부의 폴리펩티드는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 임의의 이뮤노글로불린 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 임의의 이뮤노글로불린 이소타입으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 인간 이소타입 IgG1이 사용된다.
특정 측면에서, Fc 변형물은 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역에 의해 부여된 적어도 하나의 이펙터 기능 변화 (예를 들어, Fc 영역이 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 상보적 단백질 (예를 들어, C1q)에 결합하는, 또는 항체-의존적 세포독성 (ADCC), 식균작용, 또는 상보적-의존적 세포독성 (CDCC)을 촉발시키는 능력에서의 개선 또는 감소)를 제공한다. 다른 측면에서, Fc 변형물은 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 개시내용의 Fc 영역은 이펙터 기능 및/또는 FcR 결합의 변화 (예를 들어, 향상 또는 감소)를 부여하는 것으로 공지된 관련 기술분야-인식 Fc 변형물을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 결합 분자는, 예를 들어, 국제 PCT 공개 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2; US 특허 공개 번호 US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; 또는 미국 특허 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, 및 7,317,091에 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서의 변화 (예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 특정 변화 (예를 들어, 관련 기술분야에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정 치환)가 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 일어날 수 있다. 또 다른 측면에서, 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서의 상이한 변화 (예를 들어, 관련 기술분야에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 일어날 수 있다.
IgG의 Fc 영역은, Fc 수용체에 의해 결합될 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 그의 일부를 얻기 위한 부위 지향 돌연변이생성 등과 같은 널리 인식되는 절차에 따라 변형될 수 있다. 이러한 변형은 Fc 수용체에 대한 결합을 보존 또는 심지어 향상시키는 접촉 부위 내의 변형 뿐만 아니라 Fc 수용체 접촉 부위로부터 멀리 떨어진 변형을 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1 Fc (Fc γ1)에서의 하기 단일 아미노산 잔기가 Fc 수용체에 대한 Fc 결합 친화도의 유의한 손실 없이 치환될 수 있고: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, 및 K447A, 여기서 예를 들어 P238A는 위치 번호 238에서 알라닌에 의해 치환된 야생형 프롤린을 나타낸다. 일례로, 구체적 측면은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거하며 N297A 돌연변이를 혼입한다. 알라닌에 추가로, 다른 아미노산이 상기에 특정된 위치에서 야생형 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 돌연변이가 Fc 내로 도입되어 네이티브 Fc와 다른 100개 초과의 Fc 영역을 형성할 수 있다. 추가로, 이들 개개의 돌연변이 중 2, 3개, 또는 그 초과의 조합이 함께 도입되어, 수백개의 추가의 Fc 영역을 형성할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 구축물의 Fc 영역 중 하나가 돌연변이되고, 구축물의 다른 Fc 영역은 전혀 돌연변이되지 않을 수 있거나, 또는 이들 둘 다 상이한 돌연변이로 돌연변이될 수 있다.
특정의 상기 돌연변이는 Fc 영역에 새로운 기능성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 하나의 측면은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거하며 N297A를 혼입한다. 이 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시킴으로써 Fc 영역의 순환 반감기를 향상시키는 것, 또한 친화도 손실 없이, Fc 영역이 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 만드는 것이다 (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). 상기에 기재된 돌연변이로부터 발생하는 새로운 기능성의 추가의 예로서, Fc 수용체에 대한 친화도가 일부 경우에 야생형의 경우를 넘어 증가할 수 있다. 이러한 증가된 친화도는 증가된 "on" 속도, 감소된 "off" 속도 또는 증가된 "on" 속도 및 감소된 "off" 속도 둘 다를 반영할 수 있다. Fc 수용체에 대한 증가된 친화도를 부여하는 것으로 믿어지는 돌연변이의 예는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
추가로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마 수용체는, 일반적으로 아미노산 234-237의, 저부 힌지 영역 내의 IgG 상의 결합 부위를 인식하는 것으로 보인다. 따라서, 새로운 기능성 및 잠재적 감소된 면역원성의 또 다른 예가, 예를 들어 인간 IgG1의 아미노산 233-236 "ELLG"를 IgG2로부터의 상응하는 서열 "PVA"로 대체함으로써 (1개 아미노산 결실), 이 영역의 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 다양한 이펙터 기능을 매개하는 FcγRII, FcγRII, 및 FcγRIII은 이러한 돌연변이가 도입되면 IgG1에 결합하지 않을 것임이 나타났다. 문헌 [Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77] 및 [Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613].
특정 측면에서, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 반-글리코실화된다. 예를 들어, 2개의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 융합 단백질은 제1, 글리코실화된, Fc 영역 (예를 들어, 글리코실화된 CH2 영역) 및 제2, 비-글리코실화된, Fc 영역 (예를 들어, 비-글리코실화된 CH2 영역)을 함유할 수 있다. 하나의 측면에서, 글리코실화된 Fc 영역과 비-글리코실화된 Fc 영역 사이에 링커가 개재될 수 있다. 또 다른 측면에서, Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 완전히 글리코실화되고, 즉, 모든 Fc 영역이 글리코실화된다. 다른 측면에서는, Fc 영역이 비-글리코실화될 수 있고, 즉, Fc 모이어티가 글리코실화되지 않는다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 융합 단백질은, Ig 불변 영역의 항원-독립적 이펙터 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경시키는, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부에 대한 아미노산 치환 (예를 들어, Fc 변형물)을 포함한다.
이러한 단백질은 이들 치환을 갖지 않는 단백질에 비해 Fc 수용체에 대한 증가된 또는 감소된 결합을 나타내고, 따라서 각각 증가된 또는 감소된 혈청 내 반감기를 갖는다. Fc 수용체에 대한 개선된 친화도를 갖는 Fc 변형물은 보다 긴 혈청 반감기를 가질 것으로 예상되고, 이러한 분자는 투여된 폴리펩티드의 긴 반감기가 요망되는 포유류의 치료, 예를 들어, 만성 질환 또는 장애의 치료 방법에서 유용한 응용성을 갖는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,348,004, 7,404,956, 및 7,862,820 참조). 반면, 감소된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖는 Fc 변형물은 보다 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되고, 이러한 분자는 또한, 예를 들어, 단축된 순환 시간이 유리할 수 있는 포유류에 대한 투여를 위해, 예를 들어 생체내 진단 이미징을 위해, 또는 출발 폴리펩티드가 연장된 기간 동안 순환에서 존재하는 경우 독성 부작용을 갖는 상황에서 유용하다. 감소된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖는 Fc 변형물은 또한 태반을 횡단할 가능성이 낮고, 따라서 또한 임산부에서의 질환 또는 장애의 치료에서 유용하다.
추가로, 감소된 Fc 수용체 결합 친화도가 요망될 수 있는 다른 응용은 뇌, 신장, 및/또는 간 국소화가 요망되는 응용을 포함한다. 하나의 예시적 측면에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 혈관계로부터 신장 사구체의 상피를 가로지르는 수송 감소를 나타낸다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 뇌로부터 혈관 공간 내로의 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르는 수송 감소를 나타낸다. 하나의 측면에서, 변경된 Fc 수용체 결합을 갖는 단백질은 Ig 불변 영역의 "Fc 수용체 결합 루프" 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 영역 (예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 영역)을 포함한다. Fc 수용체 결합 루프는 야생형, 전장, Fc 영역의 아미노산 잔기 280-299 (EU 넘버링에 따름)로 구성된다.
다른 측면에서, 변경된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖는 본 개시내용의 Ig 불변 영역 또는 그의 일부는 하기 EU 위치 중 임의의 하나에 상응하는 아미노산 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 영역을 포함한다: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (예를 들어, N434A 또는 N434K), 및 438. 변경된 Fc 수용체 결합 활성을 갖는 예시적 아미노산 치환이 국제 PCT 공개 번호 WO05/047327에 개시되어 있다.
(b) 알부민 또는 그의 단편, 또는 변형물
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드는 알부민 또는 그의 기능적 단편에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된다.
그의 전장 형태에서 609개 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민 (HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 상당 부분을 담당하며, 또한 내생 및 외생 리간드의 담체로서 기능한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "알부민"은 전장 알부민 또는 그의 기능적 단편, 변형물, 유도체, 또는 유사체를 포함한다.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결된 반감기 연장 모이어티는 알부민 또는 그의 단편 또는 변형물이며, 이는 FGF-21 폴리펩티드의 반감기를 연장시킨다 (또는 연장시킬 수 있다). 알부민 또는 그의 단편 또는 변형물의 예가 미국 특허 공개 번호 2008/0194481 A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, 또는 2008/0153751 A1 또는 PCT 출원 공개 번호 2008/033413 A2, 2009/058322 A1, 또는 2007/021494 A2에 개시되어 있다.
(c) 알부민 결합 모이어티
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는, 알부민 결합 펩티드, 박테리아 알부민 결합 도메인, 알부민-결합 항체 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 알부민 결합 모이어티이다. 예를 들어, 알부민 결합 단백질은 박테리아 알부민 결합 단백질, 항체 또는 도메인 항체를 포함하는 항체 단편일 수 있다 (미국 특허 번호 6,696,245 참조). 알부민 결합 단백질은, 예를 들어, 박테리아 알부민 결합 도메인, 예컨대 연쇄상구균 단백질 G 중 하나일 수 있다 (Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). 컨쥬게이션 파트너로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩티드의 다른 예는, 예를 들어, 미국 특허 출원 2003/0069395 또는 문헌 [Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043]에 기재된 바와 같은, Cys-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Cys 공통 서열을 갖는 것들이고, 여기서 Xaa 1은 Asp, Asn, Ser, Thr, 또는 Trp이고; Xaa 2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu, 또는 Lys이고; Xaa 3은 Ala, Asp, Phe, Trp, 또는 Tyr이고; Xaa 4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 또는 Thr이다.
(d) PAS 서열
다른 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 PAS 서열이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "PAS 서열"은, 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하는 또는 주로 알라닌, 세린, 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 생리적 조건 하에 랜덤 코일 형상을 형성하는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, PAS 서열은, 융합 단백질 중의 이종 모이어티의 부분으로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린, 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지는 빌딩 블록, 아미노산 중합체, 또는 서열 카세트이다. 또한, 통상의 기술자는, 아미노산 중합체가 또한, 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에서 부수적 구성성분으로서 첨가되는 경우 랜덤 코일 형상을 형성할 수 있음을 인지한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "부수적 구성성분"은 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 아미노산이 어느 정도로, 예를 들어, 최대 약 12%, 즉, PAS 서열의 100개 아미노산 중 약 12개, 최대 약 10%, 즉, PAS 서열의 100개 아미노산 중 약 10개, 최대 약 9%, 즉, 100개 아미노산 중 약 9개, 최대 약 8%, 즉, 100개 아미노산 중 약 8개, 약 6%, 즉, 100개 아미노산 중 약 6개, 약 5%, 즉, 100개 아미노산 중 약 5개, 약 4%, 즉, 100개 아미노산 중 약 4개, 약 3%, 즉, 100개 아미노산 중 약 3개, 약 2%, 즉, 100개 아미노산 중 약 2개, 약 1%, 즉, 100개 아미노산 중 약 1개가 PAS 서열에 첨가될 수 있음을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생리적 조건 하에, PAS 서열 신장은 랜덤 코일 형상을 형성하고, 이로써 FGF-21 폴리펩티드에 대한 증가된 생체내 및/또는 시험관내 안정성을 매개할 수 있다. 랜덤 코일 도메인은 그 자체로 안정적 구조 또는 기능을 채택하지 않기 때문에, FGF-21에 의해 매개되는 생물학적 활성이 본질적으로 보존된다. 다른 측면에서, 랜덤 코일 도메인을 형성하는 PAS 서열은, 특히 혈장에서의 단백질분해, 면역원성, 등전점/정전 거동, 세포 표면 수용체에 대한 결합 또는 내재화에 대하여, 생물학적으로 불활성이지만, 여전히 생분해성이며, 이는 PEG 등의 합성 중합체에 비해 명백한 이점을 제공한다.
예시적 PAS 서열이, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2010/0292130 A1 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2008/155134 A1 (이들 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 제공되어 있다.
(e) HAP 서열
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 글리신-풍부 호모-아미노-산 중합체 (HAP)이다. HAP 서열은 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있으며, 이는 적어도 50개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 120개 아미노산, 140개 아미노산, 160개 아미노산, 180개 아미노산, 200개 아미노산, 250개 아미노산, 300개 아미노산, 350개 아미노산, 400개 아미노산, 450개 아미노산, 또는 500개 아미노산 길이를 갖는다.
하나의 측면에서, HAP 서열은 HAP 서열에 융합 또는 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비-제한적 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20임)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하나의 측면에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40이다. 또 다른 측면에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200이다.
(f) 트랜스퍼린 또는 그의 단편
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 트랜스페린 또는 그의 단편이다. 임의의 트랜스페린을 사용하여 본 개시내용의 융합 단백질을 형성할 수 있다. 일례로, 야생형 인간 Tf (Tf)는, 유전자 복제로부터 유래되는 것으로 보이는, 2개의 주요 도메인, N (약 330개 아미노산) 및 C (약 340개 아미노산)를 갖는, 대략 75 KDa (글리코실화는 고려하지 않음)의 679 아미노산 단백질이다. 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/) 참조. 트랜스퍼린은 2개의 도메인, N 도메인 및 C 도메인을 포함한다. N 도메인은 2개의 서브도메인, N1 도메인 및 N2 도메인을 포함하고, C 도메인은 2개의 서브도메인, C1 도메인 및 C2 도메인을 포함한다.
하나의 측면에서, 융합 단백질의 트랜스페린 부분은 트랜스페린 스플라이스 변형물을 포함한다. 일례에서, 트랜스페린 스플라이스 변형물은 인간 트랜스페린, 진뱅크 수탁 AAA61140의 스플라이스 변형물일 수 있다. 또 다른 측면에서, 융합 단백질의 트랜스페린 부분은 트랜스페린 서열의 하나 이상의 도메인, 예를 들어, N 도메인, C 도메인, N1 도메인, N2 도메인, C1 도메인, C2 도메인 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
(g) 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)
다른 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 또는 폴리비닐 알콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 가용성 중합체이다. 본 개시내용의 FGF-21 폴리펩티드의 화학적으로 변형된 유도체는, 폴리펩티드의 증가된 용해도, 안정성 및 순환 시간, 또는 감소된 면역원성 등의 추가의 이점을 제공할 수 있다 (미국 특허 번호 4,179,337 참조). 가용성 중합체는 FGF-21 폴리펩티드 내의 또는 그의 N- 또는 C-말단의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 가용성 중합체는 FGF-21 폴리펩티드 서열 내의 랜덤 위치에 또는 FGF-21 폴리펩티드 내의 미리 정해진 위치에 부착될 수 있고, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 부착된 가용성 중합체 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 중합체는 자연 발생 아미노산의 측쇄에 부착된다. 다른 측면에서, 중합체는 비-자연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌 유도체, 예컨대 파라-아세틸-L-페닐알라닌의 측쇄에 부착된다.
가용성 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. PEG의 경우, 하나의 측면에서, 분자량은 취급 및 제조 용이성을 위해 약 1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 일부 측면에서, 가용성 중합체, 예를 들어, PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 요망되는 프로파일 (예를 들어, 요망되는 지속 방출의 지속기간, 존재하는 경우 생물학적 활성에 대한 효과, 취급 용이성, 항원성의 정도 또는 부재 및 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지된 효과)에 따라, 다른 크기가 사용될 수 있다. 예를 들어, PEG는 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, 또는 100,000 Da의 평균 분자량을 가질 수 있다.
일부 측면에서, PEG는 분지형 구조를 가질 수 있다. 분지형 PEG는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,643,575; [Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996)]; [Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999)]; 및 [Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)]에 기재되어 있다.
FGF-21 폴리펩티드에 부착된 PEG 모이어티의 수 또한 달라질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 PEG화된 단백질은, 평균적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20개, 또는 그 초과의 PEG 분자에 연결될 수 있다. 유사하게, 평균 치환도는 단백질 분자당 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, 또는 18-20개 PEG 모이어티 등의 범위 내에 있을 수 있다. 치환도를 결정하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)]에 개시되어 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용의 제제에서 사용되는 FGF-21 폴리펩티드는 하나 이상의 중합체에 컨쥬게이션된다. 중합체는 수용성이고, FGF-21 폴리펩티드 또는 FGF-21 폴리펩티드에 컨쥬게이션된 다른 모이어티에 공유 또는 비-공유 부착될 수 있다. 중합체의 비-제한적 예는 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리옥사졸린, 또는 폴리(아크릴로일모르폴린)일 수 있다.
(h) 히드록시에틸 전분 (HES)
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 히드록시에틸 전분 (HES) 또는 그의 유도체이다. HES는 자연 발생 아밀로펙틴의 유도체이고, 체내에서 알파-아밀라제에 의해 분해된다. HES는 95 중량% 이하의 농도로 옥수수 전분 중에 존재하는 탄수화물 중합체 아밀로펙틴의 치환된 유도체이다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내고, 혈액 부피 대체제로서, 또한 진료소에서 혈액희석 요법에서 사용된다 (문헌 [Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987)]; 및 [Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)]).
아밀로펙틴은 주쇄 내에 알파-1,4-글리코시드 결합이 존재하고 분지화 부위에서 알파-1,6-글리코시드 결합이 나타나는 글루코스 모이어티를 함유한다. 이 분자의 물리적-화학적 특성은 주로 글리코시드 결합의 유형에 의해 결정된다. 닉킹된 알파-1,4-글리코시드 결합으로 인해, 턴당 약 6개의 글루코스-단량체를 갖는 나선 구조가 생성된다. 중합체의 물리화학적 뿐만 아니라 생화학적 특성이 치환을 통해 변형될 수 있다. 히드록시에틸 기의 도입은 알칼리 히드록시에틸화를 통해 달성될 수 있다. 반응 조건을 적합화함으로써, 히드록시에틸화에 대한 치환되지 않은 글루코스 단량체 내의 각각의 히드록시 기의 상이한 반응성을 이용할 수 있다. 이 사실로 인해, 통상의 기술자는 제한된 정도로 치환 패턴에 영향을 줄 수 있다.
HES는 주로 분자량 분포 및 치환도에 의해 특성화된다. DS로 표시되는 치환도는 몰 치환에 관한 것이며, 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 상기에서 인용된 문헌 [Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), 특히 p. 273] 참조.
하나의 측면에서, HES는 1 내지 300 kD, 2 내지 200 kD, 3 내지 100 kD, 또는 4 내지 70 kD의 평균 분자량 (중량 평균)을 갖는다. 히드록시에틸 전분은 추가로, 0.1 내지 3, 바람직하게는 0.1 내지 2, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.1 내지 0.8의 몰 치환도, 및 히드록시 에틸 기에 대하여 2 내지 20 범위의 C2:C6 치환 사이의 비율을 나타낼 수 있다. 약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES의 비-제한적 예는 0.2 내지 0.8 예컨대 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8, 바람직하게는 0.4 내지 0.7 예컨대 0.4, 0.5, 0.6, 또는 0.7의 치환도를 갖는 HES이다. 구체적 측면에서, 약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES는 프레세니우스(Fresenius)로부터의 볼루벤(Voluven)®이다. 볼루벤®은, 예를 들어, 저혈량증의 치료 및 예방을 위한 치료적 지시에서 사용되는 부피 대체를 위해 사용되는 인공 콜로이드이다. 볼루벤®의 특징은 130,000+/-20,000 D의 평균 분자량, 0.4의 몰 치환 및 약 9:1의 C2:C6 비율이다. 다른 측면에서, 히드록시에틸 전분의 평균 분자량의 범위는, 예를 들어, 4 내지 70 kD 또는 10 내지 70 kD 또는 12 내지 70 kD 또는 18 내지 70 kD 또는 50 내지 70 kD 또는 4 내지 50 kD 또는 10 내지 50 kD 또는 12 내지 50 kD 또는 18 내지 50 kD 또는 4 내지 18 kD 또는 10 내지 18 kD 또는 12 내지 18 kD 또는 4 내지 12 kD 또는 10 내지 12 kD 또는 4 내지 10 kD이다. 또한 다른 측면에서, 사용되는 히드록시에틸 전분의 평균 분자량은 4 kD 초과 및 70 kD 미만의 범위, 예컨대 약 10 kD, 또는 9 내지 10 kD 또는 10 내지 11 kD 또는 9 내지 11 kD의 범위, 또는 약 12 kD, 또는 11 내지 12 kD의 범위) 또는 12 내지 13 kD 또는 1 l 내지 13 kD, 또는 약 18 kD, 또는 17 내지 18 kD 또는 18 내지 19 kD 또는 17 내지 19 kD의 범위, 또는 약 30 kD, 또는 29 내지 30, 또는 30 내지 31 kD의 범위, 또는 약 50 kD, 또는 49 내지 50 kD 또는 50 내지 51 kD 또는 49 내지 51 kD의 범위이다.
특정 측면에서, 반감기 연장 모이어티는 상이한 평균 분자량 및/또는 상이한 치환도 및/또는 상이한 C2: C6 치환의 비율을 갖는 HES의 혼합물일 수 있다. 따라서, 상이한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 상이한 C2: C6 치환의 비율을 갖는, 또는 상이한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 동일한 또는 대략 동일한 C2:C6 치환의 비율을 갖는, 또는 상이한 평균 분자량 및 동일한 또는 대략 동일한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비율을 갖는, 또는 동일한 또는 대략 동일한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비율을 갖는, 또는 상이한 평균 분자량 및 동일한 또는 대략 동일한 치환도 및 동일한 또는 대략 동일한 C2:C6 치환의 비율을 갖는, 또는 동일한 또는 대략 동일한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 동일한 또는 대략 동일한 C2:C6 치환의 비율을 갖는, 또는 동일한 또는 대략 동일한 평균 분자량 및 동일한 또는 대략 동일한 치환도 및 상이한 C2: C6 치환의 비율을 갖는, 또는 대략 동일한 평균 분자량 ?? 대략 동일한 치환도 및 대략 동일한 C2:C6 치환의 비율을 갖는 HES의 혼합물이 사용될 수 있다.
(i) 폴리시알산 (PSA)
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 폴리시알산 (PSA) 또는 그의 유도체이다. PSA는 특정 세포에서 포유류에서, 또한 특정 박테리아 균주에 의해 생성된 시알산의 자연 발생 비분지형 중합체이다 (Roth　J.,　et al. (1993),　Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds　Roth　J.,　Rutishauser　U.,　Troy　F. A.　(Birkhaeuser Verlag,　Basel, Switzerland), pp　335-348). 이들은 제한된 산 가수분해에 의해 또는 뉴라미니다제로의 소화에 의해, 또는 중합체의 자연적, 박테리아 유래 형태의 분별에 의해 n=약 80 이상 시알산 잔기로부터 n=2까지의 다양한 중합도로 생성될 수 있다.
상이한 폴리시알산의 조성은 또한, 단독중합체 형태, 즉, 신경 세포 접착 분자 (N-CAM)의 배아 형태에서 또한 나타나는, 이. 콜라이 균주 K1 및 그룹 B 수막구균의 캡슐 폴리사카라이드를 포함하는 알파-2,8-연결된 폴리시알산이 존재하도록 달라진다. 이종중합체 형태가 또한 존재한다 (예컨대 이. 콜라이 균주 K92 및 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)의 그룹 C 폴리사카라이드의 교호 알파-2,8 알파-2,9 폴리시알산). 시알산은 또한 엔. 메닌기티디스의 그룹 Y 또는 그룹 W135 등의 시알산 이외의 단량체와의 교호 공중합체에서 나타날 수 있다. 폴리시알산은 병원성 박테리아에 의한 면역 및 상보적 시스템의 회피 및 태아 발달 동안 미성숙 뉴런의 신경교 접착성의 조절 (여기서 중합체는 항-접착 기능을 가짐)을 포함한 중요한 생물학적 기능을 갖지만 (Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431), 포유류에서 폴리시알산에 대한 공지된 수용체는 없다. 이. 콜라이 균주 K1의 알파-2,8-연결된 폴리시알산은 또한 '콜로민산'으로서 공지되어 있으며, 이는 본 개시내용을 예시하기 위해 사용된다 (다양한 길이로).
폴리펩티드에 폴리시알산을 부착시키거나 컨쥬게이션시키는 다양한 방법이 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,846,951; WO-A-0187922, 및 US 2007/0191597 A1 참조.
(j) XTEN 서열
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 XTEN 서열이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "XTEN 서열"은 생리적 조건 하에 2차 또는 3차 구조를 갖지 않거나 낮은 정도로 갖는 서열로, 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성된 비-자연 발생, 실질적으로 비-반복적 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질 파트너로서, XTEN은 FGF-21 폴리펩티드에 연결되어 융합 단백질 형성 시 특정 바람직한 약동학적, 물리화학적 및 제약학적 특성을 제공하는 담체로서 제공될 수 있다. 이러한 바람직한 특성은 향상된 약동학 파라미터 및 용해도 특징을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 XTEN 서열은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 특정 측면에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개 잔기, 60개 초과 약 1000개 잔기, 70개 초과 내지 약 900개 잔기, 80개 초과 내지 약 800개 잔기, 90개 초과 내지 약 700개 잔기, 100개 초과 내지 약 600개 잔기, 110개 초과 내지 약 500개 잔기, 또는 120개 초과 내지 약 400개 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
본 개시내용의 XTEN 서열은 9 내지 14개 아미노산 잔기의 하나 이상의 서열 모티프 또는 서열 모티프에 대해 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 모티프는 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타메이트 (E) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4 내지 6개 유형의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. US 2010-0239554 A1 참조.
일부 측면에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리, 또는 AE 모티프 패밀리, 또는 AF 모티프 패밀리, 또는 AG 모티프 패밀리, 또는 AM 모티프 패밀리, 또는 AQ 모티프 패밀리, 또는 BC 패밀리, 또는 BD 패밀리의 비-오버랩핑 서열 모티프의 다수의 단위를 포함하고, 여기서 생성된 XTEN은 동족체의 범위를 나타낸다. 다른 측면에서, XTEN은 모티프 패밀리 중 2개 이상으로부터의 모티프 서열의 다수의 단위를 포함한다. 이들 서열은, 하기에 보다 자세히 기재되는, 모티프의 아미노산 조성에 의해 제공되는 순전하, 친수성, 2차 구조의 부재, 또는 반복성의 부재 등의 특성을 포함한 요망되는 물리적/화학적 특징을 달성하도록 선택될 수 있다. 다른 측면에서, XTEN 중으로 혼입된 모티프는 약 36개 내지 약 3000개 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하여 선택되고 어셈블리될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 개시내용에서 사용되는 XTEN 서열은 본 개시내용의 융합 단백질의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어, 약동학에 영향을 미친다. 본 개시내용에서 사용되는 XTEN 서열은 하기 유리한 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 형상 가요성, 향상된 수 용해도, 높은 프로테아제 내성의 정도, 낮은 면역원성, 포유류 수용체에 대한 낮은 결합, 또는 증가된 수력학적 (또는 스톡스(Stokes)) 반경.
일부 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결된 XTEN 서열은 약동학적 특성을 증가시킬 수 있고 (예컨대 보다 긴 종결 반감기 또는 증가된 곡선 하 면적 (AUC)), 따라서 FGF-21 폴리펩티드는 XTEN이 없는 상응하는 FGF-21 폴리펩티드에 비해 증가된 시간 기간 동안 생체내에서 머무른다. 추가의 측면에서, 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드에 연결된 XTEN 서열은 약동학적 특성을 증가시킬 수 있고 (예컨대 보다 긴 종결 반감기 또는 증가된 곡선 하 면적 (AUC)), 따라서 FGF-21 폴리펩티드는 XTEN이 없는 상응하는 FGF-21 폴리펩티드에 비해 증가된 시간 기간 동안 생체내에서 머무른다.
다양한 방법 및 검정을 사용하여 XTEN 서열을 포함하는 단백질의 물리적/화학적 특성을 결정할 수 있다. 이러한 방법은 분석용 원심분리, EPR, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, HPLC-역상, 광 산란, 모세관 전기영동, 원편광 이색성, 시차 주사 열량측정, 형광 HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, IR, NMR, 라만 분광법, 굴절측정, 및 UV/가시광 분광법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 방법이 문헌 [Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)]에 개시되어 있다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 XTEN 서열의 추가의 예가 US 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, 또는 WO 2011028344 A2에 개시되어 있고, 이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
(k) 이뮤노글로불린 결합 펩티드 (또는 폴리펩티드)
특정 측면에서, FGF-21 폴리펩티드에 연결, 예를 들어, 융합 또는 컨쥬게이션된 반감기 연장 모이어티는 이뮤노글로불린 결합 펩티드이다. 이뮤노글로불린 결합 펩티드는 Fc 영역에 결합할 수 있고, 본원에 기재된 융합 단백질의 반감기를 개선시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용에서 유용한 이뮤노글로불린 결합 펩티드는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용에서 유용한 이뮤노글로불린 결합 펩티드는 13량체 IgG-Fc 도메인 결합 펩티드 (IgGBP)를 포함한다. 문헌 [DeLano WL, et al. (2000) Science 287:1279-1283]. 다른 측면에서, 본 개시내용에서 유용한 이뮤노글로불린 결합 펩티드는 미국 특허 공개 번호 20170334954, 미국 특허 공개 번호 20170210777, 또는 PCT 공개 번호 WO/2017/069158에 개시된 펩티드를 포함한다.
VI. 제조 물품 및 키트
본 개시내용은 또한 (i) 본원에 개시된 FGF-21 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 FGF-21, 예컨대 PEG-FGF-21)를 포함하는 FGF-21 제약 제제, 및 (ii) 사용에 대한 지침서를 포함하는 제조 물품 및 키트를 제공한다. 제조 물품은 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱 또는 금속으로부터 형성될 수 있다. 용기는 FGF-21 제약 제제, 예를 들어, 액체 제제를 보유한다.
용기 상의 또는 그와 합쳐진 라벨은 재구성 및/또는 사용에 대한 지시사항을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 라벨은 FGF-21 제약 제제가 상기에 기재된 바와 같은 단백질 농도로 희석되어야 함을 나타낼 수 있다. 라벨은 추가로 피하 제제가 유용하거나 피하 투여를 위해 의도됨을 나타낼 수 있다.
제제를 보유하는 용기는, 예를 들어, 피하 제제의, 반복 투여 (예를 들어, 2 내지 6회 투여, 또는 그 초과)를 가능하게 하는 다중-사용 바이알일 수 있다. 대안적으로, 용기는, 예를 들어, 피하 제제를 함유하는 예비-충전 시린지일 수 있다.
제조 물품 또는 키트는, 예를 들어, 용매를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은, 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 사용에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
요약 및 요약서 섹션이 아닌, 상세한 설명 섹션이, 청구범위를 해석하기 위해 사용되도록 의도됨을 인지하여야 한다. 요약 및 요약서는 본 발명자(들)에 의해 고려되는 본 개시내용의 하나 이상의, 그러나 모두는 아닌 예시적 측면을 기재할 수 있고, 그에 따라, 이들은 어떠한 방식으로든 본 개시내용 및 첨부된 청구범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 개시내용은 특정된 기능 및 이들의 관계의 실행을 나타내는 기능적 빌딩 블록의 보조 하에 상기에 기재되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의성을 위해 본원에서 임의적으로 정의되었다. 특정된 기능 및 이들의 관계가 적절히 수행되는 한 대안적 경계가 정의될 수 있다.
구체적 측면의 상기 설명은 본 개시내용의 일반적 성질을 매우 자세히 드러낼 것이며, 다른 것들은 관련 기술분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써, 본 개시내용의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 과도한 실험 없이, 이러한 구체적 측면을 다양한 응용을 위해 쉽게 변형시키고/거나 적합화할 수 있다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은, 본원에 제공된 교시 및 지침을 기반으로 하여, 개시된 측면의 의미 및 등가물의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 어구 또는 용어는 설명을 위한 것이며 제한을 위한 것이 아니고, 그에 따라 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되어야 함을 이해하여야 한다.
본 개시내용의 범주 및 범위는 상기에 기재된 예시적 측면 중 임의의 것에 의해 제한되지 않아야 하며, 단지 하기 청구범위 및 그의 등가물에 따라 정의되어야 한다.
실시예
실시예 1
PEG-FGF-21 제제 개발
초기 연구를 위해, PEG-FGF-21을 20 mM 트리스, 250 mM 수크로스, pH 8.3 중에서 7.5 mg/mL로 제제화하였다. 이 제제에서 관찰되는 높은 탈아미드화 속도로 인해 약물 생성물을 -20℃에서 동결 저장해야만 했다. 따라서, 약물 생성물의 2-8℃ 저장을 가능하게 하는 즉시 사용가능한 (RTU: ready-to use) 제제를 개발하기 위해 추가의 작업을 수행하였다.
선형 30-kDa PEG 모이어티를 부위-특이적 방식으로 변형된 FGF-21 (서열식별번호: 1)에 부착함으로써 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)을 제조하였다. 부위-특이적 PEG화를 달성하기 위해, 활성화된 PEG를, FGF-21 분자의 위치 109에서 비-자연 아미노산, 파라-아세틸 페닐알라닌 (pAF)과 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 반응시켜 화학적으로 안정적인 옥심-연결된 PEG-단백질 컨쥬게이트를 형성하였다.
보다 낮은 제제 pH는 분자의 응집 속도를 증가시키는 것으로 나타났지만, 보다 높은 제제 pH는 탈아미드화 속도를 증가시키는 것으로 나타났다. 10 mg/mL의 표적 단백질 농도에서, pH 7.0은 응집과 탈아미드화 속도 사이에서 최선의 균형인 것으로 나타났다. 수크로스 농도 증가는 응집에 대항하여 분자를 추가로 안정화시키는 것으로 나타났다.
추가의 연구를 위해 선택된 제제는 20 mM L-히스티딘, 600 mM 수크로스, pH 7.0 중의 10 mg/mL PEG-FGF-21이었다. 20 mg의 매주 용량을 고려하여, 예비-충전 시린지 중의 약물 생성물의 보다 고농도가 개발되었다. 보다 고농도의 약물 생성물을 가능하게 하기 위해, 제제의 추가의 최적화가 필수적이었다.
보다 고농도의 제제의 초기 개발은 3 mL I형 유리 바이알에서 수행하였다. 20 mM L-히스티딘, 600 mM 수크로스, pH 7.0 중의 15 mg/mL 및 22 mg/mL PEG-FGF-21의 교반 시, 기포 포착이 관찰되었고, 용액이 점점 더 탁해졌다 (도 5, 좌측 이미지). 문제를 경감시키기 위한 시도로, 폴리소르베이트 80을 사용하였다. 폴리소르베이트 80은 기포 포착을 방지할 수 있었다 (도 5, 우측 이미지). 따라서, PEG-FGF-21의 고농도 제제에 폴리소르베이트 80을 0.05% (w/v)의 농도로 첨가하였다.
산화는 PEG-FGF-21의 중요한 품질 속성이고, C-말단 근처의 메티오닌-169의 산화는 수용체 결합 및 그에 따라 분자의 활성을 파괴한다. 금속 촉매화된 산화는 단백질이 산화될 수 있는 메커니즘 중 하나이다. 세포 배양으로부터의 잔재, 스테인레스강 용기와의 접촉, 부형제 중의 불순물, 예비-충전가능 시린지의 형성 공정 등으로 인해 단백질 제제 중에 미량 농도의 금속이 존재할 수 있다.
PEG-FGF-21이 금속 촉매화된 산화에 대해 감수성인지의 여부를 시험하기 위해, 0.05 mM 펜테트산 (디에틸렌트리아민펜타아세트산, DTPA)의 존재 또는 부재 하에 금속 칵테일 (250 ppm Fe, 10 ppm Cu, 15 ppm Cr, 15 ppm Ni, 10 ppm Mo)을 첨가한, 또한 첨가하지 않은 샘플을 각각 25℃에서 1개월 및 40℃에서 2주 동안 인큐베이션하고, 메티오닌 1 및 메티오닌 169의 산화 수준을 트립신 펩티드 맵핑에 의해 결정하였다 (도 2a 및 2b).
펜테트산 (DTPA)의 부재 하에, 두 메티오닌 잔기 모두의 현저한 산화가 금속이 첨가되지 않은 샘플에서도 관찰되었으며, 금속 칵테일로 스파이킹된 샘플에서는 산화 수준이 훨씬 더 높았다. 50 μM 펜테트산을 갖는 샘플에서는, 양쪽 메티오닌에 대하여 산화 수준 증가가 관찰되지 않았다. 이는 PEG-FGF-21이 금속 촉매화된 산화에 대해 감수성이고 이미 미량 수준의 금속이 제제 중에 존재함을 시시한다. 펜테트산은 제제 중에 존재하는 금속 뿐만 아니라 제제 중으로 스파이킹된 추가의 금속을 효과적으로 킬레이팅하고, 메티오닌 1 및 169의 금속 촉매화된 산화를 방지하였다. 따라서, PEG-FGF-21의 고농도 제제에 50 μM 펜테트산을 첨가하였다.
보다 고농도 제제에 대하여 pH를 최적화하기 위해, 본 발명자들은 pH 6.3 내지 8.5에서 수집된 PEG-FGF-21의 응집 데이터를 검토하였으며, 이는 응집 속도가 pH 6.8 미만에서 급속히 증가하였음을 보여준다 (도 3a 및 3b). 따라서, 본 발명자들은 고농도 제제에 대한 표적 pH를 pH 7.0 내지 pH 7.1로 증가시켰다.
새로운 고농도 제제를 이전 제제와 비교하기 위해, 20 mM L-히스티딘, 600 mM 수크로스, 0.05 mM 펜테트산, 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0 중의 20 mg/mL의 PEG-FGF-21 (pH 최적화 이전)을 안정성에 배치하고, 20 mM L-히스티딘, 600 mM 수크로스, pH 7.0 중의 22.5 mg/mL의 PEG-FGF-21과 비교하였다.
도 4a 및 4b, 도 1a 및 1b에 제시된 바와 같이, PEG-FGF-21 제제에 대한 폴리소르베이트 80 및 펜테트산의 첨가는 모든 온도에서 보다 낮은 응집 속도 및 40℃에서 보다 적은 탈아미드화를 제공하였다.
시험 방법
응집: 상업적으로 입수가능한 분석용 컬럼 (토소(Tosoh) TSK 겔 G3000SWXL, 7.8 x 300 mm, P/N: 08541)이 장착된 상업적으로 입수가능한 시스템 (예를 들어, PDA 검출기를 갖는 에질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 1100 시리즈 HPLC 시스템 또는 PDA 검출기를 갖는 워터스 알리언스(Waters Alliance) e2695 시리즈 HPLC) 상의 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 응집을 시험하였다. 0.8 ml/min의 유량으로 95% 인산염 완충 식염수 (PBS) 및 5% 에탄올의 이동 상을 사용하여 단백질 단량체로부터 고분자량 종을 분리하였다. 샘플을 PBS로 0.5 mg/mL의 단백질 농도로 희석하고, 0.01 mg (0.02 mL)을 각각의 실험에 주입하였다. 기기 소프트웨어를 사용하여 고분자량 피크의 면적을 모든 관찰된 피크의 총 면적으로 나누어 응집물의 양을 결정하였다.
탈아미드화: 상업적으로 입수가능한 분석용 컬럼 (애질런트 바이오 왁스(Agilent Bio WAX), 비-다공성, 5 μm 컬럼, 4.6 x 250 mm, P/N: 5190-2487)이 장착된 상업적으로 입수가능한 시스템 (예를 들어, PDA 검출기를 갖는 에질런트 테크놀로지스 1100 시리즈 HPLC 시스템 또는 PDA 검출기를 갖는 워터스 알리언스 e2695 시리즈 HPLC) 상의 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 탈아미드화를 시험하였다. 이동 상 A는 20 mM 트리스, pH 8.2로 이루어졌고, 이동 상 B는 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, pH 8.2로 이루어졌다. 1.0 ml/min의 유량으로 20분에 걸쳐 2% B로부터 67% B까지의 선형 구배를 사용하여 대전된 단백질 변형물을 분리하였다. 샘플을 이동 상 A로 1 mg/mL의 단백질 농도로 희석하고, 0.075 mg (0.075 mL)을 각각의 실험에 주입하였다. 기기 소프트웨어를 사용하여 산성 변형물 피크의 면적을 모든 관찰된 피크의 총 면적으로 나누어 탈아미드화의 양을 결정하였다.
산화: 트립신 펩티드 맵핑에 의해 산화를 시험하였다. 단백질 샘플을 트립신으로 소화시킨 후, 생성된 펩티드를, 상업적으로 입수가능한 분석용 컬럼 (워터스 액퀴티(Waters Acquity) C18 BEH 펩티드 RP UPLC 컬럼, 2.1 x 150 mm, 1.7-μm 입자 크기, 130-Å 기공 크기 P/N: 186003556)이 장착된 상업적으로 입수가능한 시스템 (예를 들어, 워터스 액퀴티 UPLC) 상의 역상 초-고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이동 상 A는 물 중 0.2% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어졌고, 이동 상 B는 아세토니트릴 중 0.2% TFA로 이루어졌다. 0.3 ml/min의 유량으로 60℃의 온도에서 27분에 걸쳐 10% B로부터 40% B까지의 복합 구배를 사용하여 트립신 펩티드를 분리하였다. 기기 소프트웨어를 사용하여 산화된 펩티드 피크의 면적을 산화된 및 상응하는 비-산화된 피크의 총 면적으로 나누어 산화의 양을 결정하였다.
미립자 형성 및 기포 형성: 시각적 관찰.
PEG-FGF-21의 농도: 본원에 개시된 제약 제제 중의 PEG-FGF-21의 농도를 0.87 (mL/(mg*cm))의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 슬로프 분광법에 의해 측정하였다.
pH의 결정: pH는 표준 방법 (USP<791>)에 따라 결정하였다.
부형제의 농도: 본원에 개시된 제약 제제 중의 개개의 부형제 (예를 들어, DTPA, PS80, 히스티딘, 수크로스)의 농도를 완성된 제약 제제의 최종 부피 단위당 그의 제조 과정에서 제약 제제에 첨가된 개개의 부형제의 양 (중량, 몰 등)인 것으로 결정/계산하였다. 대안적으로, 부형제의 농도는 제약 제제 중의 개개의 부형제의 실제 양을 기준으로 할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> FGF-21 FORMULATIONS <130> 3338.133PC01/ELE/C-K <150> US 62/693,847 <151> 2018-07-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q109 modified FGF-21 <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> Wild-type Q109 replaced with para-acetyl-L-phenylalanine <400> 1 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Xaa Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 2 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEG-FGF-21 PEGYLATED Q109 modified FGF-21 <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> Para-acetyl-L-phenylalanine linked to a 30 kDa poly(ethylene glycol) via oxime link <400> 2 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Xaa Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 3 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF-21 wild type sequence <400> 3 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180

Claims (130)

  1. 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF-21) 폴리펩티드 및 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 포함하는 제약 제제로서, 여기서 제제는 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 함유하지 않는 참조 제제에 비해 개선된 안정성을 갖는 것인 제약 제제.
  2. 제1항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 나타내는 제약 제제:
    (a) 참조 제제에 대하여, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 폴리펩티드 탈아미드화 속도;
    (b) 참조 제제에 대하여, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 고분자량 (HMW) 폴리펩티드 응집 속도; 또는
    (c) (a) 및 (b) 둘 다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터가 25℃ 및/또는 40℃에서 서열식별번호: 1의 아미노산 1 및/또는 아미노산 169에 상응하는 하나 이상의 메티오닌의 산화를 경감시키는 것인 제약 제제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터가 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)인 제약 제제.
  5. 제4항에 있어서, DTPA 양이온 킬레이터가 약 10 μM 내지 약 100 μM DTPA, 약 20 μM 내지 약 90 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 80 μM DTPA, 약 25 μM 내지 약 75 μM DTPA, 또는 약 40 μM 내지 약 60 μM DTPA, 또는 약 30 μM 내지 약 70 μM DTPA, 또는 약 40 μM 내지 약 70 μM DTPA의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, DTPA 양이온 킬레이터가 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 또는 약 60 μM DTPA의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 6.5 초과, 6.6 초과, 6.7 초과, 6.8 초과, 6.9 초과, 7.0 초과, 7.1 초과, 7.2 초과, 7.3 초과, 7.4 초과, 또는 7.5 초과인 제약 제제.
  8. 제7항에 있어서, pH가 약 6.7 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 7.5, 약 6.9 내지 약 7.4, 약 7.0 내지 약 7.3, 약 7.1 내지 7.2, 약 7.1 내지 약 7.3, 약 7.1 내지 약 7.4, 또는 약 7.1 내지 약 7.5인 제약 제제.
  9. 제7항에 있어서, pH가 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5인 제약 제제.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 6.5의 pH를 갖는 참조 제제보다 더 안정적인 것인 제약 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 제약 제제.
  12. 제11항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 제약 제제.
  13. 제12항에 있어서, 비음이온성 계면활성제가 폴리소르베이트인 제약 제제.
  14. 제13항에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (폴리소르베이트 80)인 제약 제제.
  15. 제14항에 있어서, 폴리소르베이트 80 계면활성제가 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.06% (w/v)의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 폴리소르베이트 80 계면활성제가 적어도 약 0.01% (w/v), 적어도 약 0.02% (w/v), 적어도 약 0.03% (w/v), 적어도 약 0.04% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.06% (w/v), 적어도 약 0.07% (w/v), 적어도 약 0.08% (w/v), 적어도 약 0.09% (w/v) 또는 적어도 약 0.1% (w/v)의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 진탕기 상에서 교반 시에 미립자 및/또는 기포 형성을 경감시키는 것인 제약 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 완충제를 추가로 포함하는 제약 제제.
  19. 제18항에 있어서, 아미노산 완충제가 히스티딘인 제약 제제.
  20. 제19항에 있어서, 히스티딘 완충제가 약 10 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 17.5 내지 약 22.5 히스티딘, 또는 약 40 mM 내지 약 60 mM 히스티딘의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 히스티딘 완충제가 약 10 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 약 20 mM 히스티딘, 약 25 mM 히스티딘, 약 30 mM 히스티딘, 약 35 mM 히스티딘, 약 40 mM 히스티딘, 약 45 mM 히스티딘 또는 약 50 mM 히스티딘의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 조절제를 추가로 포함하는 제약 제제.
  23. 제22항에 있어서, 삼투 조절제가 당을 포함하는 것인 제약 제제.
  24. 제23항에 있어서, 당이 수크로스인 제약 제제.
  25. 제24항에 있어서, 수크로스 삼투 조절제가 약 100 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 900 mM, 약 300 mM 내지 약 800 mM, 약 400 mM 내지 약 700 mM, 또는 약 500 mM 내지 약 600 mM의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 수크로스 삼투 조절제가 약 100 mM 수크로스, 약 200 mM 수크로스, 약 300 mM 수크로스, 약 400 mM 수크로스, 약 500 mM 수크로스, 약 600 mM 수크로스, 약 700 mM 수크로스, 약 800 mM 수크로스, 약 900 mM 수크로스, 또는 약 1 M 수크로스의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 변형된 FGF-21 폴리펩티드인 제약 제제.
  28. 제27항에 있어서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는 것인 제약 제제.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드가 반감기 연장 모이어티에 연결된 것인 제약 제제.
  30. 제29항에 있어서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드가 FGF-21 폴리펩티드의 서열 내의 비-자연적으로 코딩된 아미노의 측쇄를 통해 반감기 연장 모이어티에 연결된 것인 제약 제제.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 G (IgG), 알부민-결합 폴리펩티드 (ABP), PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, Fc 영역, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 제약 제제.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 수용성 중합체를 포함하는 것인 제약 제제.
  33. 제32항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 제약 제제.
  34. 제33항에 있어서, PEG가 약 10 kDa 내지 약 40 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 제약 제제.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, PEG가 약 30 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 제약 제제.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산이 페닐알라닌 유도체인 제약 제제.
  37. 제36항에 있어서, 페닐알라닌 유도체가 파라-아세틸-L-페닐알라닌인 제약 제제.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 옥심 연결을 통해 비-자연적으로 코딩된 아미노산에 연결된 것인 제약 제제.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산이 서열식별번호: 3의 아미노산 글루타민 109를 대체하는 것인 제약 제제.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 제약 제제.
  41. 제40항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 약 10 mg/ml 또는 약 20 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 제약 제제.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 용량당 약 1 mg 내지 약 40 mg의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  43. 제42항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 용량당 약 1 mg, 용량당 약 5 mg, 용량당 약 10 mg, 용량당 약 20 mg, 또는 용량당 약 40 mg의 양으로 존재하는 것인 제약 제제.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 피하 투여를 위해 제제화된 것인 제약 제제.
  45. 제44항에 있어서, 제제가 안전 시린지로의 피하 투여를 위해 제제화된 것인 제약 제제.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 매일 또는 매주 투여를 위해 제제화된 것인 제약 제제.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 수성 제제인 제약 제제.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)인 제약 제제.
  49. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) FGF-21 폴리펩티드;
    (ii) 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 약 100 mM 내지 약 1 M 농도의 수크로스;
    (iv) 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (v) 약 10 μM 내지 약 100 μM 농도의 DTPA;
    여기서 제제의 pH는 약 6.7 내지 약 7.5인 제약 제제.
  50. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) FGF-21 폴리펩티드;
    (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 μM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제.
  51. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) FGF-21 폴리펩티드;
    (ii) 20 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 600 mM 농도의 수크로스;
    (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 50 μM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 7.1인 제약 제제.
  52. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) FGF-21 폴리펩티드;
    (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘; 및
    (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    여기서 pH는 약 7.0인 제약 제제.
  53. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) FGF-21 폴리펩티드;
    (ii) 20 mM 농도의 히스티딘; 및
    (iii) 600 mM 농도의 수크로스;
    여기서 pH는 7.0인 제약 제제.
  54. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21;
    (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제.
  55. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21;
    (ii) 약 20 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    (iv) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 약 7.1인 제약 제제.
  56. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21;
    (ii) 20 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 600 mM 농도의 수크로스;
    (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 7.1인 제약 제제.
  57. 하기를 포함하는 제약 제제로서:
    (i) 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF21;
    (ii) 20 mM 농도의 히스티딘;
    (iii) 600 mM 농도의 수크로스;
    (iv) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 7.1인 제약 제제.
  58. FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 혼합하는 것을 포함하며, 여기서 제제는 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터를 함유하지 않는 참조 제제에 비해 개선된 안정성을 갖는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 안정성에서의 개선이 (i) 폴리펩티드 물리적 안정성에서의 증가, (ii) 폴리펩티드 화학적 안정성에서의 증가, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 물리적 안정성에서의 증가가 (i) 폴리펩티드 응집의 방지 또는 감소, (ii) 폴리펩티드 단편화의 방지 또는 감소, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 화학적 안정성에서의 증가가 (i) 폴리펩티드 탈아미드화의 방지 또는 감소, (ii) 폴리펩티드 산화의 방지 또는 감소, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 안정성에서의 개선이 하기 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법:
    (a) 참조 제제에 대하여, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 폴리펩티드 탈아미드화 속도;
    (b) 참조 제제에 대하여, 40℃에서 약 1개월 동안 저장 시 보다 낮은 고분자량 (HMW) 폴리펩티드 응집 속도; 또는
    (c) (a) 및 (b) 둘 다.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터가 25℃ 및/또는 40℃에서 서열식별번호: 3의 아미노산 1 및/또는 아미노산 169에 상응하는 하나 이상의 메티오닌의 산화를 경감시키는 것인 방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노폴리카르복실산 양이온 킬레이터가 DTPA인 방법.
  65. 제64항에 있어서, DTPA 양이온 킬레이터가 약 10 μM 내지 약 100 μM DTPA, 약 20 μM 내지 약 90 μM DTPA, 약 25 μM 내지 약 75 μM DTPA, 약 40 μM 내지 약 60 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 70 μM DTPA, 약 30 μM 내지 약 80 μM DTPA, 또는 약 40 μM 내지 약 70 μM의 양으로 존재하는 것인 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, DTPA 양이온 킬레이터가 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 또는 약 60 μM DTPA의 양으로 존재하는 것인 방법.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, pH를 6.5 초과, 6.6 초과, 6.7 초과, 6.8 초과, 6.9 초과, 또는 7.0 초과로 조정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, pH를 약 6.8 내지 약 7.5, 또는 약 6.9 내지 약 7.4, 또는 약 7.0 내지 약 7.3, 또는 약 7.1 내지 7.2, 또는 약 7.1 내지 약 7.3, 또는 약 7.1 내지 약 7.4, 또는 약 7.1 내지 약 7.5로 조정하는 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 조정된 pH가 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5인 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 6.5의 pH를 갖는 참조 제제보다 더 안정적인 것인 방법.
  71. 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 비음이온성 계면활성제가 폴리소르베이트인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 80인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 폴리소르베이트 80 계면활성제를 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v), 약 0.02% 내지 약 0.09% (w/v), 약 0.03% 내지 약 0.08% (w/v), 약 0.04% 내지 약 0.07% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.06% (w/v)의 양으로 혼합하는 것인 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 폴리소르베이트 80 계면활성제를 적어도 약 0.01% (w/v), 적어도 약 0.02% (w/v), 적어도 약 0.03% (w/v), 적어도 약 0.04% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.06% (w/v), 적어도 약 0.07% (w/v), 적어도 약 0.08% (w/v), 적어도 약 0.09% (w/v) 또는 적어도 약 0.1% (w/v)의 양으로 혼합하는 것인 방법.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 진탕기 상에서 교반 시에 미립자 및/또는 기포 형성을 경감시키는 것인 방법.
  78. 제58항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 완충제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 아미노산 완충제가 히스티딘인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 히스티딘 완충제를 약 10 mM 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 20 mM 내지 약 90 mM 히스티딘, 약 30 mM 내지 약 80 mM 히스티딘, 약 40 mM 내지 약 70 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 30 mM 히스티딘, 약 15 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 17.5 mM 내지 약 22.5 mM 히스티딘, 또는 약 40 mM 내지 약 60 mM 히스티딘의 양으로 혼합하는 것인 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 히스티딘 완충제를 약 10 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 약 20 mM 히스티딘, 약 25 mM 히스티딘, 약 30 mM 히스티딘, 약 35 mM 히스티딘, 약 40 mM 히스티딘, 약 45 mM 히스티딘 또는 약 50 mM 히스티딘의 양으로 혼합하는 것인 방법.
  82. 제58항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 조절제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 삼투 조절제가 당을 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 당이 수크로스인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 수크로스 삼투 조절제를 약 100 mM 내지 약 1 M 수크로스, 약 200 mM 내지 약 900 mM 수크로스, 약 300 mM 내지 약 800 mM 수크로스, 약 400 mM 내지 약 700 mM 수크로스, 또는 약 500 mM 내지 약 600 mM 수크로스의 양으로 혼합하는 것인 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 수크로스 삼투 조절제를 약 100 mM 수크로스, 약 200 mM 수크로스, 약 300 mM 수크로스, 약 400 mM 수크로스, 약 500 mM 수크로스, 약 600 mM 수크로스, 약 700 mM 수크로스, 약 800 mM 수크로스, 약 900 mM 수크로스, 또는 약 1 M 수크로스의 양으로 혼합하는 것인 방법.
  87. 제58항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 변형된 FGF-21 폴리펩티드인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 FGF-21 활성을 갖는 것인 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드가 반감기 연장 모이어티에 연결된 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 변형된 FGF-21 폴리펩티드가 FGF-21 폴리펩티드의 서열 내의 비-자연적으로 코딩된 아미노의 측쇄를 통해 반감기 연장 모이어티에 연결된 것인 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 일부, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, IgG, ABP, PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, Fc 영역, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  92. 제89항 또는 제90항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 수용성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 수용성 중합체가 PEG인 방법.
  94. 제93항에 있어서, PEG가 약 10 kDa 내지 약 40 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, PEG가 약 30 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
  96. 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산이 페닐알라닌 유도체인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 페닐알라닌 유도체가 파라-아세틸-L-페닐알라닌인 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 옥심 연결을 통해 비-자연적으로 코딩된 아미노산에 연결된 것인 방법.
  99. 제90항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산이 서열식별번호: 3의 아미노산 글루타민 109를 대체하는 것인 방법.
  100. 제58항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 약 10 mg/ml 또는 약 20 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 방법.
  102. 제58항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 수성 제제인 방법.
  103. 제58항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)인 방법.
  104. FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 약 100 mM 내지 약 1 M 농도의 수크로스;
    (iii) 약 0.01% 내지 약 0.1% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 약 10 μM 내지 약 100 μM 농도의 DTPA;
    여기서 제제의 pH는 약 6.7 내지 약 7.5인 방법.
  105. FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 약 50 μM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 약 7.1인 방법.
  106. FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 20 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 600 mM 농도의 수크로스;
    (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 50 μM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 7.1인 방법.
  107. FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘; 및,
    (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    여기서 pH는 약 7.0인 방법.
  108. FGF-21 폴리펩티드를 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 20 mM 농도의 히스티딘; 및,
    (ii) 600 mM 농도의 수크로스;
    여기서 pH는 7.0인 방법.
  109. 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 약 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 약 7.1인 방법.
  110. 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 약 20 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 약 600 mM 농도의 수크로스;
    (iii) 약 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 약 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 약 7.1인 방법.
  111. 약 10 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 20 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 600 mM 농도의 수크로스;
    (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 7.1인 방법.
  112. 약 20 mg/mL 농도의 PEG-FGF-21을 포함하는 제제의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하기를 혼합하는 것을 포함하며:
    (i) 20 mM 농도의 히스티딘;
    (ii) 600 mM 농도의 수크로스;
    (iii) 0.05% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및,
    (iv) 50 uM 농도의 DTPA;
    여기서 pH는 7.1인 방법.
  113. 제58항 내지 제112항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 제약 제제.
  114. (i) 제1항 내지 제57항, 및 제113항 중 어느 한 항의 제약 제제, 및 (ii) 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  115. 섬유증과 연관된 질환 또는 병태 및/또는 당뇨병의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제57항, 및 제113항 중 어느 한 항의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 섬유증과 연관된 질환 또는 병태 및/또는 당뇨병을 치료 또는 방지하는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 질환 또는 병태가 당뇨병인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 당뇨병이 2형 당뇨병인 방법.
  118. 제115항에 있어서, 질환 또는 병태가 비알콜성 지방간염 (NASH)인 방법.
  119. 제115항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 유효량의 제약 제제의 투여가 간 경직도를 감소시키거나, 체지방률을 감소시키거나, 체중을 감소시키거나, 간-대-체중 비율을 감소시키거나, 간 지질 함량을 감소시키거나, 간 섬유증 영역을 감소시키거나, 공복 혈당 수준을 감소시키거나, 공복 트리글리세리드 수준을 감소시키거나, LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키거나, ApoB 수준을 감소시키거나, ApoC 수준을 감소시키거나, HDL 콜레스테롤을 증가시키거나, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  120. 제115항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 용량당 약 1 mg 내지 약 40 mg의 FGF-21 폴리펩티드를 투여하는 것인 방법.
  121. 제115항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 용량당 약 1 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 20 mg, 또는 약 40 mg의 FGF-21 폴리펩티드를 투여하는 것인 방법.
  122. 제115항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제를 피하 투여하는 것인 방법.
  123. 제122항에 있어서, 제약 제제를 안전 시린지를 사용하여 피하 투여하는 것인 방법.
  124. 제115항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제를 매일 또는 매주 투여하는 것인 방법.
  125. 제115항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 제약 제제의 투여가, 치료되지 않은 대상체에서의 수준에 비해 또는 제약 제제의 투여 전의 대상체에 비해, 하기를 제공하는 것인 방법:
    (i) 간 지방의 수준에서의 감소;
    (ii) 간 손상의 수준에서의 감소;
    (iii) 섬유증의 수준에서의 감소;
    (iv) 섬유증 바이오마커 혈청 Pro-C3 (N-말단 III형 콜라겐 프로펩티드)의 수준에서의 감소;
    (v) 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 수준에서의 감소;
    (vi) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 수준에서의 감소;
    (vii) 혈청 아디포넥틴의 수준에서의 증가;
    (viii) 혈장 LDL의 수준에서의 감소;
    (ix) 혈장 HDL의 수준에서의 증가;
    (x) 혈장 트리글리세리드의 수준에서의 감소;
    (xi) 간 경직도의 수준에서의 감소; 또는
    (xii) 이들의 임의의 조합.
  126. 제115항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-21 폴리펩티드가 PEG-FGF-21 (서열식별번호: 2)인 방법.
  127. (i) 약 10 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21;
    (ii) 약 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘;
    (iii) 약 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스;
    (iv) 약 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA
    를 혼합하고;
    pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된 제약 제제.
  128. (i) 약 20 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21;
    (ii) 약 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘;
    (iii) 약 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스;
    (iv) 약 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA
    를 혼합하고;
    pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된 제약 제제.
  129. (i) 10 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21;
    (ii) 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘;
    (iii) 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스;
    (iv) 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA
    를 혼합하고;
    pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된 제약 제제.
  130. (i) 20 mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 PEG-FGF-21;
    (ii) 20 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 히스티딘;
    (iii) 600 mM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 수크로스;
    (iv) 0.05% (w/v)의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 50 uM의 최종 농도를 달성하기 위한 양의 DTPA
    를 혼합하고;
    pH를 약 7.1로 조정하는 공정에 의해 제조된 제약 제제.
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