ITMI961309A1 - Frammenti f(ab')2 e relative immunoglobuline igg, attivi come anticorpi specifici verso farmaci e i loro metaboliti, e loro - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

"Frammenti F(ab')2 e relative immunoglobuline IgG, attivi come anticorpi specifici verso farmaci ed i loro metaboliti, e loro impiego nel trattamento detossificante dell'uomo e di animali trattati con detti farmaci"

1. Campo dell'invenzione

La presente invenzione riguarda l'uso di frammenti F(afa')2 e relative immunoglobuline IgG, attivi come anticorpi specifici verso farmaci ed i loro metaboliti nella detossificazione da farmaci e/o da loro metaboliti, in campo umano ed in campo animale .

La detossificazione è importante per neutralizzare gli effetti tossici indotti, ad esempio, da sovradossaggio , accumulo, avvelenamento, ipersensibilità da farmaci e, nell'uomo, anche da abuso di farmaci.

Essa riveste notevole interesse in particolare in campo zootecnico, dove negli ultimi anni, la ricerca di sempre nuovi traguardi produttivi e lo sviluppo crescente di allevamenti intensivi a carattere industriale, ha stimolato il largo ricorso a farmaci, stravolgendo i ritmi produttivi tipici dei sistemi tradizionali. Le sostanze medicamentose utilizzate in campo zootecnico sono numerose, e trovano applicazione ad esempio nella nella prevenzione e terapia delle malattie infettive, in particolare di quelle zoonotiche, ovvero malattie o infezioni comuni agli animali e all'uomo e trasmissibili reciprocamente, che rappresentano circa la metà dello oltre quattrocento malattie infettive ed infestive a potenziale rischio per gli animali da allevamento; nella prevenzione di infestazioni; nel miglioramento della velocità di accrescimento e maggiore utilizzazione dell'alimento somministrato; e nella promozione della lattazione. Fra i farmaci usati in campo zootecnico, in prevalenza nella specie bovina, per accrescere le prestazioni degli animali allevati migliorandone la velocità di assimilazione e favorendo una più completa utilizzazione degli alimenti somministrati, i più usati sono auxinici, anabolizzanti , tireostatici , cortisonici, e simpaticomimetici.

Fra gli auxinici si ricordano gli antibiotici virginiamicina, zincobacitracina, avoparcina, che agiscono sulla microflora del tubo digerente, migliorando l'assorbimento del nutrimento.

Fra gli anabolizzanti, si ricordano gli ormoni endogeni, i più usati dei quali in campo zootecnico sono il 17-β -estradiolo, il testosterone, ed il progesterone (che favorisce il mantenimento della gravidanza), e gli ormoni esogeni (sintetici), i più utilizzati dei quali in zootecnia sono 19-nortestosterone (nandrolone) e trenbolone, ad azione androgenica, zeranolo e dietilstilbestrolo (DES), ad azione estrogenica.

Fra i tireostatici, i più impiegati sono metil- e propiltiouracile.

I cortisonici agiscono sul metabolismo glucidico e protidico, provocando ritenzione idrica; si associano ad ormoni endogeni come specialità a lento assorbimento a base di desametazone.

I simpaticomimetici più impiegati sono i β-agonisti clenbuterolo e cimaterolo, che favoriscono lipolisi e sintesi proteica.

Infine, la somatotropina è utilizzata per stimolare sia crescita che produzione di latte.

A fronte di innegabili vantaggi in termini di semplicità di impiego e di risultati raggiunti, si sono però configurati una serie di rischi potenziali per il consumatore, legati alla presenza dei medicamenti o dei loro prodotti nell'organismo nei prodotti di derivazione animale (latte o carne), provenienti dagli animali trattati.

Ciò impone di attendere un periodo di tempo sufficiente per la loro totale eliminazione dall'organismo, prima del prelievo del latte o del sacrificio dell'animale, per evitare l'assunzione da parte del consumatore ed il rischio di effetti collaterali, particolarmente elevato nel caso di soggetti a basso peso corporeo, qauli lattanti e bambini.

Nel caso delle malattie infettive, si riscontra inoltre una notevole carenza di metodologie diagnostiche rapide e sensibili.

eseguibili direttamente presso l'allevamento, che va ulteriormente a complicare la possibilità di un intervento terapeutico mirato, favorendo, in alcuni casi, l’impiego congiunto di un grande numero di sostanze, e/o di livelli superiori di dosaggio.

2. Problema Tecnico

Di qui deriva l'esigenza di disporre di un metodo per il controllo della presenza di medicamenti o sostanze tossiche in circolo, come pure di un metodo per la loro eliminazione, che sia il più possibile rapido e che non apporti ulteriori rischi per il soggetto trattato, e, nel caso di animali da allevaménto, per il consumatore dei prodotti zootecnici da essi derivati.

3. Stato della tecnica

In campo clinico è nota l'immunoglobulino terapia di malattie infettive, mediante somministrazione di siero arricchito di gamma-globuline, in particolare laddove il periodo di incubazione è troppo breve per consentire una immunizzazione attiva.

4. Sommario

Ora la Richiedente ha sorprendentemente trovato che è possibile indurre una più rapida eliminazione dall'organismo umano ed animale di farmaci e/o loro metaboliti, somministrando al soggetto da trattare i frammenti Flab')2 di immunoglobuline IgG attive come anticorpi specifici verso detti farmaci ed i loro metaboliti, oppure le suddette IgG, purché provenienti da animali della stessa specie del soggetto da trattare.

Secondo la presente Invenzione, i farmaci o metaboliti, che non sono di per sè in grado di stimolare una risposta immunitaria da parte dell'organismo, sono convertiti mediante coniugazione con proteine eterologhe o polisaccaridi in derivati immunogeni, in grado cioè di stimolare negli animali in cui sono somministrati la formazione di immunoglobuline IgG attive come anticorpi specifici verso quei dati farmaci o metaboliti.

Le immunoglobuline IgG sono ricavate dal siero animale ed utilizzate per la preparazione dei frammenti F(ab')2 mediante rimozione del frammento FC, oppure esse stesse per il trattamento detossif icante , nonché come reattivi diagnostici in un procedimento per la determinazione immunodiagnostica qualitativa e quantitativa della concentrazione in un liquido biologico di un farmaco e/o di un suo metabolita verso il quale sono attive come anticorpi specifici.

Aspetti fondamentali della presente invenzione sono rappresentati dai suddetti frammenti F(ab')2 ed immunoglobuine IgG, dalle composizioni farmaceutiche che li contengono, dal loro procedimento di preparazione, e dal loro impiego nella detossificazione dell'uomo e degli animali.

Ulteriori aspetti della presente invenzione sono rappresentati dai suddetti derivati immunogeni e relativo procedimento di preparazione; dal suddetto procedimento immunodiagnostico, e dal relativo kit diagnostico; dai coniugati farmaco-enzima utili come reattivi diagnostici per il suddetto procedimento diagnostico e dal loro procedimento di preparazione, come risultano dal presente testo.

Il meccanismo attraverso il quale i frammenti F(ab')2 dell'invenzione incrementano in vivo l'eliminazione dall’organismo dei farmaci e/o metaboliti non è stato ancora chiarito.

In ogni caso, l'attività dei presenti frammenti F(ab')2 e relative IgG è estremamente sorprendente, considerando che l'eliminazione dall'organismo di sostanze da esso riconosciute come estranee mediante il sistema di difesa immunitario è nota per sostanze particellari quali batteri e leucociti, i cui complessi antigene-anticorpo sono fagocitati ad esempio da parte dei macrofagi, mentre non è assolutamente noto nulla del genere per antigeni di natura chimica quali i farmaci.

5. Descrizione dettagliata

Il peso molecolare delle presenti immunoglobuline IgG è circa 150.000 daltons, ed è inferiore per i relativi frammenti F(ab')2* I presenti frammenti F{ab’)2 trovano applicazione in generale nel trattamento detossificante dell'uomo e di animali trattati con farmaci, ad esempio in casi di avvelenamento, sovradosaggio o allergia da farmaci nell'uomo o nell'animale (ad esempio in campo umano nel trattamento di manifestazioni allergiche o shock anafilattico in soggetti trattati con antinfiammatori o antibiotici, o in caso di abuso di sostanze farmacologicamente attive).

I presenti F(ab')2 trovano in particolare applicazione in campo zootecnico nella detossificazione, prima della macellazione o della raccolta del latte, di animali da allevamento (bovini, ovini, suini) trattati con farmaci.

La rimozione dei frammenti FC dalle presenti IgG permette di rimuovere i siti responsabili di eventuale risposta anticorpale verso le proteine seriche utilizzate come vettori dei farmaci, eliminando cosi il rischio di risposta immunitaria speciespecifica non desiderata (che si avrebbe ad esempio nel caso di somministrazione a bovini di IgG preparate da immunogeni contenenti sieroalbumina bovina (BSA) come vettore, dovuta a produzione di anticorpi anti-BSA), rendendo l'impiego dei presenti frammenti F(ab')2 come detossif icanti ottimamente tollerato, sia nell'uomo che nell'animale. Il fatto di poter utilizzare frammenti F(ab')2 ottenuti da una singola specie animale nel trattamento detossificante dell’uomo o di animali di specie diverse da quelle in cui sono stati ottenuti rappresenta un elemento di indubbio vantaggio dal punto di vista industriale. II trattamento detossificante è comunque ben tollerato se si somministrano le presenti immunoglobuline IgG ad animali appartenenti alla stessa specie di quelli da cui dette IgG sono state ottenute per immunizzazione.

Il presente trattamento detossificante è diretto ad esempio a promouovere l'eliminazione dall'organismo dei seguenti farmaci: - antibiotici, ad esempio tetracicline (ossi tetraciclina , doxiciclina) ; antibiotici amminoglicosidici (quali neomicina.B, gentamicina C, tobramicina, kanamicina , amikacina e streptomicina); cefalosporine (cef tazidima, cefotaxima, cefalexina); penicilline;

- sulfamidici (derivati della sulfanilamide ), ad esempio sostituiti all’azoto sulfonammidico con un anello isossazolico, quale suifametossazolo;

- antivirali, quali idoxuridina;

- antiparassitari;

- antimicotici (arafotericina, ketoconazolo);

- antitubercolari, quali cicloserina, isoniazide;

simpaticomimetici, in particolare a struttura 2-feniletilamminica, ad esempio i β-agonisti clenbuterolo e cimaterolo;

- antitiroidei, in particolare 2-tiouracili (propiltiouracile e metiltiouracile) ;

- sostanze ad attività estrogena, utilizzate ad esempio come anabolizzanti in campo zootecnico, quali dietilstilbestrolo, 17-β-estradiolo, zeranolo;

- sostanze ad attività androgena, utilizzate ad esempio come anabolizzanti in campo zootecnico, quali trenbolone, 19-nortestosterone (nandrolone);

- sostanze progestiniche (progesterone);

- cortisonici, ad esempio adrenocorticosteroidi , quale il desametasone;

- altri ormoni endogeni, fra cui somatotropina (ormone della crescita STH);

auxinici, fra cui antibiotici, quali virginiamicina , zincobacitracina, avoparcina;

- amfetamine (amfetamina, metamfetamina);

- disinfestanti.

Secondo una forma di realizzazione tipica della presente invenzione, i presenti frammenti anticorpali F(ab')2 (° le presenti IgG) vengono somministrati al soggetto da detossificare per via parenterale, in particolare intramuscolare. sottocutanea o endovenosa, tipicamente intramuscolare.

Preferibilmente, prima della loro somministrazione si determina la concentrazione ematica o sierica del medicamento da eliminare dall'organismo per stabilire con maggiore accuratezza il dosaggio dell 'immunodetossificante da somministrare.

Per conseguire la sostanziale eliminazione in tempi brevi (ad esempio 24-48 ore) del medicamento è preferibile somministrare un eccesso di F(ab')p (o di IgG) rispetto alla concentrazione del medicamento stesso, preferibilmente uguale o maggiore di 1 mole ogni 2 moli di farmaco o metabolita presente nel sangue del soggetto da trattare [ogni mole di frammento F(ab'>2 o di IgG è in grado di legare un eccesso molare di farmaco superiore a 2 moli di farmaco].

A questa prima somministrazione di frammenti F(ab')2 (o IgG) possono seguire se necessario una o più successive sommnistrazioni, qualora si riscontri ancora nel sangue presenza dei farmaci e/o dei metaboliti. In particolare, è conveniente ripetere la determinazione della concentrazione di farmaco e/o dei suoi metaboliti nel sangue del soggetto trattato a distanza di circa 24-72 ore dopo ogni somministrazione dei presenti frammenti Fiab')2· (° IgG). per verificare se nel sangue vi sia ancora presenza di farmaco e/o di suoi metaboliti. Ciò può verificarsi specialmente nel caso di sostanze che si accumulano nel fegato o in altri tessuti dell'organismo.

Una volta eliminati dall'organismo grazie alla somministrazione dei presenti frammenti F(ab')2 (o IgG) il medicamento o metabolita presente nel circolo ematic, quello accumulato nei tessuti dell'organismo viene mobilizzato e passa in circolo, diventando così disponibile per la successiva somministrazione di frammenti F(ab')2 (o IgG).

I frammenti F(ab')2 (o IgG) secondo la presente invenzione sono tipicamente somministrati come composizioni farmaceutiche., comprendenti almeno uno dei suddetti frammenti (o IgG). in quantità terapeuticamente efficace, in combinazione con uno o più eccipienti o diluenti farmaceuticamente accettabili, da soli o in miscela, e possono essere ad esempio preparate secondo tecniche convenzionali, quali quelle riportate in Remington's Pharmaceutical Sciences, l8th Ed., 1990·

Sono preferite le preparazioni iniettabili, comprendenti almeno uno dei suddetti frammenti (o IgG), almeno un diluente (ad esempio un solvente, quale soluzione fisiologica, nel quale vengono dispersi, disciolti o emulsionati), ed eventualmente altri eccipienti. Le preparazioni iniettabili possono essere ad esempio in forma di vials per la preparazione estemporanea, ad esempio un vials contenente i frammenti F(ab')2 (o le IgG) in forma solida, ed un altro vials contenente il diluente o solvente.

Preparazione dei frammenti F(ab')2: si ottengono rimuovendo mediante digestione con pepsina il frammento FC delle corrispondenti immunoglobuline IgG ottenute dal siero di animali trattati con derivati immunogeni , a loro volta ottenuti coniugando con un vettore di natura proteica o polisaccaridica il composto prescelto come aptene per il farmaco di cui si vuole promuovere l'eliminazione dall'organismo.

Preparazione dei derivati immunogeni

Il vettore utilizzato per la preparazione degli immunogeni è tipicamente una proteina eterologa, proveniente cioè da un animale di specie diversa da quello utilizzato per la produzione di anticorpi IgG, per impedire che in quest’ultimo si scateni una reazione immunologica verso le sue stesse proteine seriche. Esempi di proteine utilizzabili come vettori sono sieroalbumina bovina (BSA), gammaglobulina bovina e gammaglobulina di pollo. Preferibilmente si utilizza sieroalbumina bovina, per la produzione di anticorpi in animali quali capra o cavallo.

I vettori proteici hanno ad esempio peso molecolare compreso fra 40.000 e 70.000 Daltons (ad esempio BSA a PM 65.000).

Il composto coniugato con il vettore per produrre un immunogeno di quel composto è detto aptene. Preferibilmente, si utilizza come aptene il farmaco stesso somministrato al soggetto da trattare (oppure un suo metabolita, se è questo il composto da eliminare dall'organismo). In alternativa, si può utilizzare un composto strutturalmente analogo, ad esempio un suo derivato funzionalizzato in modo da introdurre i gruppi funzionali adatti al tipo di coniugazione con vettore proteico o polisaccaridico che si vuole effettuare.

Ad esempio, per le cefalosporine si utilizza preferibilmente come aptene la stessa cefalosporina somministrata al soggetto da detossif icare. In alternativa si può utilizzare un composto contenente l'anello base delle cefalosporine (un derivato dell'acido 7-aminocef alosporanico ), ad esempio un'altra cefalosporina terapeuticamente attiva.

Quando il farmaco che si vuole eliminare dall'organismo è una penicillina, si utilizza preferibilmente come aptene uno dei suoi metaboliti, acido 6-aminopenicillanico (6-APA) o acido penicilloico , o in alternativa un'altro composto contenente l'anello base delle penicilline (derivato del 6-APA), ad esempio un'altra penicillina terapeuticamente attiva.

Per le tetracicline, si utilizza preferibilmente come aptene il farmaco stesso somministrato, o in alternativa un altro composto contenente la struttura ciclica base della tetraciclina, ad esempio una qualsiasi tetraciclina, quale clortetraciclina , ossitetraciclina, demetiltetraciclina, metaciclina, doxiciclina, e minociclina.

Per gli antibiotici amminoglicosidici, l'aptene è preferibilmente lo specifico antibiotico somministrato al soggetto da detossificare .

Per farmaci simpaticomimetici a struttura 2-feniletilamminica, l'aptene è preferibilmente il farmaco stesso somministrato al soggetto da detossificare, o un altro derivato a struttra 2-feniletilamminica.

Per anelli e strutture base di cefalosporine , penicilline, tetracicline e simpaticomimetici a struttura 2-feniletilamminica, e loro esempi particolari, si rimanda a Goodman & Gilman, The pharmacological basis of Therapeutics, The Macmillian Company, 3rd Ed., 1966 : pag. 1194-1227. in particolare 1195: pag. 1242-1257: pag· 484; ed inoltre alla traduione italiana Goodman e Gilman, Le basi farmacologiche della terapia. Ed. Italiana sulla sesta edizione americana. Editoriale Grasso, Bologna, 1982, pag.

1234-1239. e pagina 1265-Per le solfonilammidi, si utilizza tipicamente come aptene lo stesso composto assunto dal soggetto da detossificare, oppure una solfonammide sostituita all'azoto solfonammidico -SO NH con lo stesso tipo di anello aromatico presente nel farmaco usato. Ad esempio per il sulfametossazolo, si utilizza il sulfametossazolo stesso, o un'altra sulfonammide contenente un gruppo isossazolico eventualmente sostituito.

Per i derivati del 2-tiouracile, si utilizza preferibilmente come aptene il composto somministrato al soggetto da detossificare, oppure un altro contenente la struttura del 2-tiouracile, ad esempio un derivato del 2-tiouracile sostituito in posizione 6 con un alchile C1-C3. oppure in posizione 5 con un alogeno (cloro).

Per dietilstilbestrolo , zeranolo e trenbolone, si utilizza preferibilmente come aptene il farmaco stesso somministrato. Per 17β-estradiolo e relativi derivati (ad esempio esteri quali estradiolo 17-β-cipionato ed estradiolo 3.17-β-dicipionato), si utilizza di preferenza come aptene il 17β-estradiolo.

Il tipo di vettore e di coniugazione aptene-vettore dipende dalla struttura chimica del farmaco e/o metabolita da convertire in immunogeno. La coniugazione avviene in genere mediante formazione di uno o più legami covalenti fra parte aptenica e vettore.

Si descrivono di seguito a titolo illustrativo alcune metodiche per la preparazione di immunogeni.

Derivati immunogeni rappresentati da coniugati aptene/vettore prpetico ottenuti trattando un aptene con un vettore proteico, in presenza di una carbodiimide

Il metodo si presta alla conversione in immunogeni di apteni che contengono gruppi amminici primari -NH2. idrazidici -NHNH2. carbonilamminici -CONH2 , carbossilici -COOH.

I gruppi -COOH del vettore proteico [o dell'aptene] attivati per reazione della carbodiimide , mediante formazione della corrispondente O-acilisourea, reagiscono con i gruppi -NH2. " NHNH2 o -CONH2 dell'aptene [o del vettore proteico], con formazione di legame carbammidico . Possono inoltre formarsi legami esterei fra i gruppi -OH dell'aptene [o del vettore proteico], o di tipo anidiride fra i gruppi -COOH attivati con carbodiimide ed i gruppi -COOH dell'aptene [o del vettore proteico], non essendo esclusa la formazione di legami crociati intramolecolari o intracatena fra i gruppi reattivi del vettore proteico. Il vettore proteico è tipicamente BSA, e la carbodiimide preferibilmente N-etil-N '-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimide o un'altra carbodiimide farmaceuticamente accettabile, e che dà prodotti di reazione farmaceuticamente accettabili [ad esempio dialchilcarbodiimidi contenenti gruppi alchilici eventualmente sostituiti con un gruppo amminico terziario, quale il gruppo -N(CH3)2)].

Derivati immunogeni ottenuti per coniugazione di un aptene con un vettore proteico in presenza di carbodiimide, mediante preattivazione con carbodiimide del composto contenente i gruppi -COOH)

II coniugato aptene/vettore proteico è ottenuto ad esempio trattando il composto contenente i gruppi -COOH [ad esempio il vettore proteico, nel caso di apteni contenente gruppi NH2. oppure un aptene contenente gruppi -COOH] con carbodiimide in eccesso stechiometrico rispetto ai gruppi -COOH, in ambiente acquoso, a pH generalmente alcalino (ad esempio 8-10), a circa 10°C/+30°C (ad esempio 20°C); il prodotto così ottenuto è quindi trattato con il composto contenente i gruppi -NH2 (l'aptene contenente gruppi -NH2, oppure il vettore proteico, se è stato attivato con carbodiimide un aptene contenente gruppi -COOH], operando ad esempio nelle condizioni di temperatura, solvente, pH, rapporti fra reattivi descritti più avanti per il passaggio c) della variante messa a punto dalla Richiedente. La condensazione con carbodiimide può essere comunque effettuata secondo la metodica riportata in E.C. Beuvery, Q.J.A. Speijers, B.I.G. Lutz, D. Freudenthal, V. Kanhai, B. Haagmans e H.J.G.M. Derks, in Develop. Biol. Standard, S. Karger - Basel (1986), 63.

117.

Derivati immunogeni ottenuti per coniugazione in presenza di carbodiimide di un aptene con un vettore proteico ossidato e coniugato con un copolimero poliaminoacidico

Secondo una variante messa a punto dalla Richiedente, l'aptene è coniugato ad un vettore proteico mediante un ponte costituito da un copolimero poliaminoacidico, quale Poli(D-GLu.D-Lys), con un procedimento comprendente i seguenti passaggi:

a) si tratta una sostanza proteica con un agente ossidante dei gruppi -OH in -CHO;

b) si tratta la sostanza proteica ossidata così ottenuta con un copolimero poliaminoacidico sintetico;

c) si tratta il coniugato sostanza proteica ossidata/copolimero poliaminoacidico così ottenuto con l'aptene, in presenza di una carbodiimide .

Questo metodo presenta fra l'altro il vantaggio di consentire di controllare la quantità di aptene che si lega al vettore proteico (che si ritrova nel prodotto finale in quantità sostanzialmente corrispondente a quella fatta reagire).

Nella preparazione degli immunogeni, la sostanza proteica è il vettore proteico e l'aptene è il farmaco da detossificare o il composto prescelto come aptene per quel farmaco.

Nella preparazione degli immunogeni, si utilizza tipicamente un vettore proteico a peso molecolare 40.000-70.000, quale BSA a peso molecolare 65-000.

La sostanza proteica è tipicamente ossidata con periodato, tipicamente un periodato inorganico, in acqua, a pH preferibilmente compreso fra circa 5.0 e 7.5. preferibilmente fra 10°C e 50°C, al riparo dalla luce.

Tipicamente, l'ossidazione è condotta con NalO4, a pH 6.5 (es. in tampone acetato), a temperatura ambiente (circa 20°/+25°C).

L'agente ossidante è tipicamente in eccesso stechiometrico rispetto ai gruppi -OH della sostanza proteica.

La reazione è generalmente completa dopo circa 15-60 minuti, e l'eccesso di ossidante è generalmente eliminato per aggiunta di un eccesso molare di alcool, tipicamente glicerolo, alla temperatura di ossidazione sopra specificata. In genere si lascia quindi riposare la miscela di reazione freddo, a circa 0°C/+5°C, prima di effettuare il passaggio successivo, per permettere l'eventuale formarsi di torbidità, e la sua successiva eliminazione per filtrazione.

Il copolimero è tipicamente un copolimero fra un α-aminoacido acido (ad esempio contenente almeno un ulteriore gruppo -COOH oltre al gruppo α-carbossilico), ed un α-aminoacido basico (ad esempio contenente ulteriori gruppi -NH2 o altri gruppi basici oltre al gruppo α-amminico), contenente residui aminoacidici sia L che D, o loro miscele.

Preferibilmente, si utilizza un copolimero fra D-Glu e D-Lys, con peso molecolare tipicamente compreso circa 20.000 e 100.000, preferibilmente fra 20.000 e 50.000, quale il prodotto Poli(D-Glu, D-Lys) con peso molecolare circa 50.000 e rapporto Glu:Lys=6:4, commercializzato come Sigma<R >P7658.

La condensazione b) fra sostanza proteica ossidata e copolimero è generalmente condotta in ambiente acquoso, a pH alcalino, ad esempio a pH circa 8-10, generalmente a 4°C/+40°C, ad esempio a 4°C/+8°C per una notte (es. in frigo), oppure a 30°C/+40°C per circa 2-4 ore, e al riparo dalla luce. Tipicamente, si opera a pH circa 9 (es. in tampone CO3-/HCO3) . a 37°C.

Si utilizza un rapporto molare copolimero:proteina ossidata tipicamente compreso fra 1:5 e 1:30, ad esempio 1:15 (che si ritrova sostanzialmente nel di coniugazione così ottenuto).

A fine reazione, l'eventuale eccesso di gruppi ossidati e non reagiti della proteina è eliminato per trattamento con un agente riducente dei gruppi -CHO ad -OH, quale NaBH4, tipicamente in eccesso molare. Ad esempio, si tratta con NaBH4 a circa 0C°/+10°C, in genere 4°/+6°C.

Il coniugato sostanza proteica ossidata/copolimero poliaminoacidico così ottenuto è tipicamente purificato per dialisi, su membrane con limite di esclusione molecolare ("cutoff") tipicamente compreso fra circa 50,000 e 100.000, ad esempio circa 100.000 Daltons (100 KD), contro un tampone a pH circa 5.0-6,0, ad esempio 5.5. operando preferibilmente a freddo (circa 0°C/+10°C, in genere a 4°C/+8°C), ottenendo così anche la separazione dalla proteina non ossidata residua.

La condensazione fra aptene e vettore proteico ossidato e coniugato con il copolimero [fase c)] è tipicamente effettuata con N-etil-N '-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimide.

Preferibilmente, si opera in ambiente acquoso, a pH preferibilmente compreso fra 5.0 e 6,0 (ad esempio a pH 5.5. in tampone acetato), a circa 30°C/+40°C, in genere a 37°C.

Generalmente, si miscelano soluzioni acquose dell*aptene e del coniugato sostanza proteica/copolimero poliaminoacidico (ad esempio alle concentrazioni riportate nella parte sperimentale), si aggiunge la carbodiimide e si porta alla temperatura di reazione prescelta.

Preferibilmente, si utilizza l' aptene in rapporto molare compreso fra circa 4:1 e 20:1 rispetto al copolimero poliaminoacidico contenuto nel coniugato sostanza proteica/copolimero poliaminoacidico (rapporti aptene/copolimero sostanzialmente corrispondenti si ritrovano nel coniugato aptene/sostanza proteica finale. La quantità di copolimero è sostanzialmente corrispondente a quella aggiunta alla sostanza proteica ossidata, come confermata dalla determinazione analitica mediante titolo proteico ed analisi elettroforetica, effettuate secondo metodologie note).

La carbodiimide è tipicamente utilizzata in eccesso molare rispetto ai gruppi -COOH del coniugato copolimero-proteina, ad esempio di circa 0,3-0,6 mmoli per 8-10 pmoli di coniugato proteina/copolimero poliamicoacidico.

Il coniugato aptene/vettore è tipicamente purificato per dialisi, attraverso passaggio su membrane con valore di esclusione molecolare ("cut-off") di circa 10.000-30.000 Daltons, preferibilmente circa 30-000 Daltons, contro tampone a pH circa 6,0-8,0, preferibilmente 7.0-7. 5. ad esempio contro PBS (soluzione fisiologica-tampone fosfato), operando preferibilmente a freddo, fra circa 4° e circa 10°C (ad esempio a circa 4°C). Si eliminano casi sali e frammenti a basso peso molecolare.

La coniugazione in presenza di carbodiimide con un vettore proteico, come tale o nella forma ossidata e coniugata con copolimero polaminoacidico sopra descritta, si applica ad esempio alla conversione in immunogeni dei seguenti composti:

tetracicline, quali ossitetraciclina , doxiciclina; - antibiotici aminoglicosidici (es. neomicina, gentamicina, streptomicina) ;

- antifungini quali amfotericina;

- cefalosporine, quali ceftazidima. cefotaxima, cefalessina ; - antitubercolari quali cicloserina e isoniazide;

amfetamine, quali amfetamina e metamfetamina;

- sulfonilammidi, quali sulfametossazolo;

- acido 6-aminopenicillanico e acido penicilloico, utilizzati come apteni per la preparazione di F(ab')2 attivi come anticorpi verso le penicilline.

Apteni contenenti gruppi -OH, in particolare steroidi e composti ad attività steroidea quali dietilstilbestrolo , zeranolo, trenbolone e 17β-estradiolo, sono preferibilmente convertiti in immunogeni per coniugazione con un vettore proteico ossidato e coniugato con un copolimero poliaminoacidico secondo i passaggi a), b) e c) sopra descritti, utilizzando come apteni i corrispondenti emi-esteri con anidride succinica (emisuccinati). Negli emisuccinati, i gruppi -OH sono protetti con il residuo -O-CO-(CH2)2-COOH, che ha quindi un gruppo -COOH disponibile per la reazione con il vettore proteico in presenza di carbodiimide. Gli emisuccinati sono tipicamente preparati per trattamento con anidride succinica, ad esempio in piridina, tipicamente in rapporto molare composto con gruppi -OH (steroide) : anidride succinica 1:1, ad esempio come riportato in Bernard F, Erlanger in Pharmacol. Rev., 25(2), 271-80, 1973·

Dietilstilbestrolo, zeranolo, trenbolone e 17β-estradiolo possono anche essere convertiti in immunogeni secondo la metodologia descritta da in G.R. Gray in Meth. Enzymol. (1978). 50, 155-Derivato immunogeno ottenuto per coniugazione fra un vettore proteico ed un aptene con gruppi -OH ossidati a -CHO

Gli antibiotici aminoglicosidici ed altri farmaci contenenti gruppi -OH (ad esempio farmaci contenenti gruppi glucidici, quali neomicina, gentamicina, streptomicina e l'antifungino amfotericina), sono convenientemente convertiti in immunogeni per trattamento con un agente ossidante in grado di ossidare i gruppi -OH a -CHO, seguito da trattamento con un vettore proteico.

L'ossidazione dell 'aptene è tipicamente condotta con un periodato, quale NaIO4, in eccesso, in ambiente acquoso, a pH preferibilmente di 5.0-7.5. ad esempio a pH 5-5. (es. in tampone acetato), a temperature generalmente di 4°C/+40°C (ad esempio a 4°C/+8°C per una notte, oppure a 20°C/+37°C per 2-6 ore circa), e al riparo dalla luce. L'eccesso di ossidante è tipicamente eliminato per aggiunta di glicerolo, come sopra già descritto per l'ossidazione di vettori proteici, e la reazione fra aptene ossidato e proteina (tipicamente BSA a peso molecolare 65-000) è tipicamente condotta a pH alcalino (es. circa 8,5-9.5). alla temperatura sopra specificata per la ossidazione.

Derivato immunogeno ottenuto per coniugazione di un aptene con un vettore proteico con gruppi -OH ossidati a -CHO

Il metodo si applica alla preparazione di coniugati aptene/vettore proteico, fra apteni contenenti gruppi -NH2. quali antibiotici aminoglicosidici , e vettori proteici ossidati con agenti ossidanti in grado di ossidare i gruppi -OH a -CHO.

La sostanza proteica (vettore nel caso degli immunogeni) è tipicamente ossidata con periodato, nelle condizioni prima illustrate per il passaggio a), e l'eccesso di ossidante è eliminato per aggiunta di glicerolo, come sopra già illustrato; la successiva coniugazione con l'aptene ètipicamente condotta a pH alcalino (es. circa 8,5-9.5), a temperature generalmente di 4°C/+40°C (ad esempio a 4°C/+8°C per una notte, oppure a 20°C/+37°C per 2-6 ore circa). Il vettore proteico è tipicamente BSA (in particolare a PM 65-000), che viene ossidata con periodato, ed i farmaci convertiti in immunogeni sono ad esempio neomicina, gentamicina, streptomicina e amfotericina.

Immunogeni ottenuti per coniugazione dell'aptene con un vettore proteico in presenza di glutaraldeide

Si presta alla coniugazione con sostanze proteiche di apteni contenenti gruppi amminici -NH o idrazidici -NHNH2.

In condizioni tipiche, si aggiunge glutaraldeide ad una miscela di sostanza proteica ed aptene, in ambiente acquoso, a pH generalmente compreso fra 6,0 e 8,0, preferibilmente 6,7~6,9 (ad esempio in tampone fosfato), a circa 10°C/+40°C, tipicamente a temperatura ambiente (+20°C/+25°C).

La reazione è completa in circa 0,5-5 ore.

La glutaraldeide è tipicamente utilizzata in quantità compresa fra 0,01 e 0,1 mg, ad esempio 0 , 05 mg. per mg di sostanza proteica) , e a fine reazione il suo eccesso è eliminato per trattamento con lisina o glieina (tipicamente in quantità circa da 1 a 10 mg, ad esempio 5 mg. per mg di sostanza proteica), nelle stesse condizioni utilizzate per la coniugazione con 1 ’aptene.

Il rapporto molare aptene: sostanza proteica è preferibilmente compreso fra 5:1 e 20:1, e più preferibilmente è 15:1. Per la preparazione di immunogeni, la sostanza proteica è tipicamente BSA (ad esempio a PM circa 65.000 Daltons).

I coniugati aptene/sostanza proteica così ottenuti, e più in generale tutti i coniugati aptene/sostanza proteica descritti nel presente testo, sono preferibilmente purificati per dialisi, nelle condizioni prima descritte per gli immunogeni ottenuti con il metodo della carbodiimide.

La coniugazione in presenza di glutaraldeide può avvenire ad esempio secondo la metodologia riportata in N. Zegers, K. Gerritse, C. Deen, W. Boersma e E. Classen, in J. Immunol. Meth., (1990). voi. 130. pagina 195. con riferimento a coniugati fra peptidi sintetici e proteine, utili in procedure immunodiagnostiche e di immunizzazione.

Sono stati ad esempio convertiti in immunogeni in questo modo i seguenti apteni:

- simpaticomimetici a struttura 2-feniletilamminica, quali clenbuterolo e cimaterolo;

- antibiotici aminoglicosidici (es. neomicina, gentamicina, streptomicina) ;

- antifungini quali amfotericina;

cefalosporine contenenti gruppi amminici -NH2 . quali ceftazidima, cefotaxima, cefalessina;

amfetamine, quali amfetamina e metamfetamina;

- sulfonilammidi, quali sulfametossazolo;

- antitubercolari quali cicloserina e isoniazide:

Oltre che con i metodi sopra illustrati, i farmaci e loro metaboliti possono essere convertiti in immunogeni seguendo altre tecniche note in campo immunologico per la preparazione di coniugati fra apteni {polisaccaridi, polipeptidi, tossine o altre sostanze) e vettori proteici (ad esempio BSA) o polisaccaridici {ad esempio destrano a peso molecokare 4400), utili a scopo diagnostico o di immunizzazione (ad esempio per vaccini).

Immunogeni di simpaticomimetici a struttura 2-feniletilamminica, di sulfonilammidi e di derivati del 2-tiouracile

Sono ottenuti ad esempio operando analogamente a quanto riportato nei riferimenti bibliografici citati negli Esempi 5. 6 e 7 riportati più avanti nel presente testo.

Produzione di immunoglobuline IgG - I derivati immunogeni ottenuti come sopra illustrato sono quindi somministrati agli animali nei quali si intende far avvenire la produzione delle immunoglobuline IgG attive come anticorpi specifici, tipicamente mediante una iniezione primaria ed un richiamo; quindi si estraggono i sieri animali e da essi si isola e si purifica la frazione proteica corrispondente alle immunoglobuline IgG.

Per la produzione su scala industriale si utilizzano animali di taglia medio/grande, quali capre e cavalli.

Preferibilmente, i presenti derivati immunogeni sono somministrati in associazione con l'adiuvante di Freund, operando preferibilmente come descritto da A. Johnstone e R. Thorpe in Immunochemistry in Practice, eds. A. Johnstone e R. Thorpe, Blackwell Sci. Pubi., Oxford (1982), 28.

In genere, per l'iniezione primaria l'immunogeno è associato ad adiuvante completo di Freund (FCA) e per il richiamo ad adiuvante incompleto di Freund (FIA). La somministrazione è preferibilmente sottocutanea per la prima iniezione, ed intramuscolare per il richiamo, che è tipicamente effettuato dopo 14-21 giorni; ogni dose di immunogeno (in genere di circa 0.5-2mg) è in entrambi i casi preferibilmente somministrata mediante più iniezioni in siti diversi dell'animale.

La formazione di IgG nell'organismo dell'animale produttore può essere seguita mediante un metodo di emoagglutinazione passiva nei confronti dell'aptene coniugato covalentemente ad eritrociti di tacchino, o comunque secondo altri metodi convenzionali.

Occorrono circa 30/60 giorni per indurre nell'animale trattato con immunogeni la produzione di quantità significativamente elevate di IgG. Dopo tale tempo, si preleva il sangue, in genere dall'arteria femorale dell'animale, e si separa da esso la frazione proteica contenente le immunogobuline IgG, ad esempio precipitandola per aggiunta di solfato di ammonio.

Le IgG così ottenute sono preferibilmente purificate per cromatografia su resina a scambio ionico, a matrice contenente destrano reticolato, funzionalizzata con gruppi 2-(dietilaramino)-etilici, quale la DEAE-Trysacril 1M (commercializzata dalla IBF), eluendo con un tampone avente pH 8,8. Tipicamente, si sottopone a purificazione il plasma crioprecipitato contenente le IgG e si effettua un passaggio preliminare su colonna ULTROGEL AcA 202, per desalare.

Le IgG secondo la presente invenzione possono essere comunque purificate secondo altre metodologie convenzionali, ad esempio per cromatografia di affinità su proteina A.

Conversione delle imaunoglobuline IgG in frammenti F(ab')2

La rimozione dei frammenti FC è effettuata sottoponendo le IgG a digestione con pepsina, preferibilmente immobilizzata, nelle condizioni di solvente, pH, temperatura più sotto riportate.

In condizioni tipiche, il trattamento con pepsina è eseguito su frazioni proteiche precipitate per aggiunta di polietilenglicole, in analogia a quanto riportato da B. Favreau, D. Giurgiu e B. Bizzini, Experentia, 1983, 39, 483·

Il procedimento comprende la precipitazione delle IgG per trattamento del siero che le contiene con polietilenglicole, tipicamente a pH circa 7.0-7. 5, preferibilmente 7,0, a temperatura di circa 8°C/+25°C, ad esempio a 20°C/+23°C; il trattamento del precipitato così ottenuto con pepsina, ad esempio pepsina immobilizzata su sferette di vetro poroso, a pH circa 2,5-4,0, preferibilmente a pH 3, ad una temperatura tipicamente compresa fra 25°C e 37°C, ad esempio a circa 30°C/+32°C; la precipitazione della frazione contenente i frammenti F(ab')2 per aggiunta di polietilenglicole, tipicamente a pH circa 4,5-5,5. ad esempio 5, a temperatura compresa fra 4°C/+8°C e 20°C/+25°C. I frammenti F(ab')2 cosi ottenuti sono convenientemente purificati per dialisi, tipicamente contro soluzione di NaCl 0,9%, una notte, a freddo (+4°C/+10°C , ad esempio a 4°C), e sterilizzati per filtrazione, comunemente su filtri a 0,45 μm. Procedimento diagnostico Le presenti IgG sono utilizzate come reattivi diagnostici in un saggio ELISA (Enzyme Linked Immunosorben Assay) di tipo competitivo, analogo a quello descritto da A. Voller, D.E. Bidwell e A. Bartlett in Bull. Wld. Health Org., 1976, Voi. 53. pagina 55·

Tipicamente, si aggiunge il campione di liquido biologico (ad esempio siero, urine) da saggiare ad un supporto solido inerte, precedentemente sensibilizzato fissandovi le immunoglobuline IgG attive come anticorpi per il composto da dosare, si aggiunge un coniugato, rappresentato dal composto da dosare marcato con un enzima, miscelato al campione da saggiare o aggiuntovi poco dopo l'aggiunta del campione, dopo averlo sottoposto ad incubazione, ad esempio a 37°C; si lascia reagire, per permettere al composto da dosare e al legante di fissarsi ai siti reattivi delle IgG, si lava e si aggiunge un substrato croniogeno in grado di reagire con l'enzima marcante, che in presenza della porzione enzimatica del legante dà luogo ad un prodotto colorato; dopo sviluppo della colorazione si procede alla lettura della densità ottica della soluzione (generalmente si effettua la lettura direttamente nel pozzetto della micropiastra dove è effettuato il dosaggio), e si calcola la quantità di farmaco e/o metabolita contenuta nel liquido biologico saggiato.

Preferibilmente, l'enzima è perossidasi, più in particolare perossidasi di rafano (HRP) , ed il composto croniogeno è ortofenilendiammina o tetremetilbenzilina (TMB), la cui reazione con perossidasi è promossa da H2O2.

I farmaci sono ad esempio quelli elencati nel presente testo con riferimento al presente trattamento detossificante, e/o come apteni per la preparazione di immunogeni.

II campione da saggiare è tipicamente in quantità tale da fornire una concentrazione di composti da saggiare in difetto stechiometrico rispetto ai siti attivi dell'IgG: il composto da dosare e quello marcato con l'enzima competono per i siti di legame dello specifico anticorpo, e di conseguenza parte della attività enzimatica viene fissata al supporto solido. La concentrazione di farmaco e/o metabolita da dosare è inversamente proporzionale alla concentrazione di composto marcato con enzima che si fissa all'anticorpo, ed è calcolata per differenza, sottraendo la densità ottica di un campione in cui le immunoglobuline IgG sono state completamente saturate con il composto marcato con enzima, alla densità ottica del campione di IgG trattato con il liquido biologico saggiato.

Il supporto solido (ad esempio una piastra di plastica, quale polistirene) , è sensibilizzato ad esempio per trattamento con le IgG, a pH circa 8,5-9.5. ad una temperatura di circa 4°C/+37°C (ad esempio a 4°C/+8°C per una notte, oppure a 37°C per 2-6 ore circa), e quindi aggiungendo caseina, a pH circa 7.0-7.5. a circa 4°C/+37°C, come indicato per il trattamento con le IgG. La reazione delle IgG fissate al supporto solido con le soluzioni saggiare (soluzioni campione, soluzioni contenenti il farmaco o metabolita marcati con l'enzima, soluzioni standard di riferimento) è tipicamente effettuata per incubazione a circa 20°C/+37°C, ad esempio a 37°C, e a pH circa 7-0-7,4; le stesse condizioni di pH e temperatura valgono ad esempio anche per lo sviluppo della colorazione dopo aggiunta del croniogeno. Per i lavaggi ed altri dettagli operativi si rimanda alla parte sperimentale.

Kit diagnostico- I reagenti utili per il saggio diagnostico secondo la presente invenzione sono vantaggiosamente assemblati in forma di kit (corredo) immunodiagnostico, per l'utilizzazione diretta da parte dell'utente (ad esempio allevatore), comprendente una immunoglobulina IgG secondo la presente invenzione supportata su una fase solida, il coniugato rappresentato dal composto da dosare (farmaco o metabolita) marcato con enzima, ed un substrato cromogeno.

Il kit può essere completato dalle soluzioni tampone per diluire i campioni e dalle soluzioni standard contenenti concentrazioni prefissate del composto da saggiare.

Coniugati rappresentati dal composto da dosare (farmaco o metabolita) marcato con enzima- Si ottengono condensando il composto da dosare (farmaco o metabolita) con un enzima, in particolare una perossidasi, operando ad esempio secondo le metodologie sopra riportate per la preparazione di derivati immunogeni, dove l'aptene è il composto da dosare è l'enzima è la sostanza proteica, da utilizzare al posto del vettore proteico, oppure operando secondo altre metodologie note, quale quella riportata in A. Voller, D.E. Bidwell e A. Bartlett, in Bull. Wld. Health Org., 1976, 53. 55. facendo reagire il composto da dosare con l'enzima (perossidasi), in presenza di glutaraldeide.

Esempi di coniugati utili come reattivi diagnostici secondo la presente invenzione sono i coniugati ottenuti per coniugazione fra :

a') un farmaco o metabolita ed un enzima, in presenza di carbodiimide;

b') un farmaco o metabolita ed un enzima ossidato con un agente ossidante dei gruppi -OH a -CHO ed un copolimero poliaminoacido sintetico, in presenza di una carbodiimide;

c') un farmaco o metabolita contenente gruppi -OH, precedentemente ossidato per trattamento con un ossidante dei gruppi -OH a -CHO, ed un enzima;

d') un farmaco o metabolita ed un enzima, in presenza di glutaraldeide.

e') un farmaco o metabolita ed un vettore proteico ossidato per trattamento con un'ossidante dei gruppi -OH a -CHO.

Analogamente a quanto riportato per gli immunogeni, i coniugati con enzimi di tipo a') e b') si applicano in particolare a farmaci o metaboliti contenenti gruppi -NH , -CONH . -NHNH o -COOH; i coniugati di tipo d') ed e') ai composti contenenti gruppi -NH2. Per la preparazione dei coniugati a')-d'), valgono le considerazioni sopra svolte per gli analoghi immunogeni, sia per solvente, pH, temperatura, rapporti molari fra reattivi, e/o il copolimero poliaminoacidico.

L'enzima è tipicamente perossidasi di rafano, e il suo peso molecolare è ad esempio circa 45.000.

Esempi tipici di farmaci o metaboliti sono quelli sopra citati per il trattamento detossificante e/o come apteni per la preparazione di immunogeni.

Si riportano di seguito alcuni esempi allo scopo di illustrare, senza peraltro voler limitare, la presente invenzione.

Metodo A- Coniugazione di aptene in presenza di carbodiimide con proteina ossidata con periodato e coniugata con copolimero poliaminoacidico

a) Si trattano 20 mg di una sostanza proteica (vettore proteico per la preparazione di immunogeni, o enzima per i coniugati farmaco/enzima), con PM 40.000-70.000 Daltons, sciolti in 1,4 mi di tampone acetato 0,1 M, pH 6,5- Si aggiungono 200 μl di NaIO4 sciolto nello stesso tampone al momento dell'uso. Si lascia reagire per 30 minuti alla temperatura di laboratorio sotto lenta agitazione ed al riparo dalla luce. Si blocca la reazione per aggiunta di 400 μl di glicerolo/acqua 1:1, si lascia sotto agitazione per 5 minuti, quindi si lascia riposare per 4 ore a 4°C , e si elimina se necessario per filtrazione l'eventuale torbidità formatasi.

b) Reazione fra proteina ossidata e copolimero Poly(D-Glu, D-Lys) Sigma<R >P7658 (PM 50 KD); rapporto D-Glu: D-Lys = 6:4), con rapporto molare Poly(D-Glu,D-Lys): proteina ossidata= 1: 15-Per i 20 mg di proteina servono quindi circa 1,466 mg di Poly(D-Glu,D-Lys).

I reattivi utilizzati sono:

- proteina 20 mg 2000 μl

tampone CO3<- >/HCO3 1M, pH 9.0 200μl

Poly(D-Glu,D-Lys) (2mg/ml) 733 μl

tampone CO3<-->/HCO3 1M, pH 9.0 267μl

L'aggiunta del tampone carbonato 0,1M viene fatta per aggiustamento del volume di reazione. Si pone il tutto a reagire per 4 ore a 37°C sotto agitazione e al riparo dalla luce. fine reagire, si tratta con 465 μl di NaBH4 (2 mg/136 μl di H2O), si lascia riposare 4 ore a 4°C, sempre al riparo dalla luce. Si effettua un passaggio di concentrazione per centrifugazione a 3000 rpm (giri al minuto) per 30 minuti, su microfiltro Amicon 100 KD. Si ottiene un volume di scarto di circa 1,6 mi contenente proteina libera (non coniugata). Si reintegra il volume del concentrato per aggiunta di pari volume di tampone. Si pone in dialisi su tubo con taglio molecolare 100 KD contro tampone acetato 0,1 M, pH 5.5- Si effettuano quattro passaggi di dialisi, per un tempo complessivo di circa 30 ore, operando a freddo, c) Coniugazione con l'aptene.

Si utilizzano da 4 a 10 moli di aptene per mole di copolimero poliaminoacidico a PM 50 KD.

Si prepara una soluzione di coniugato proteina ossidata/copolimero Poly(D-Glu ,D-Lys) (PM 50 KD) con una concentrazione di 8-10 μΜ/ml (micromoli/millilitro) di copolimero Poly(D-Glu,D-Lys ), e soluzioni di apteni con concentrazioni di 30-100 μΜ/ml (micromoli/millilitro). Si miscelano:

- soluzione di coniugato proteina ossidata/copolimero Poly(D-Glu,D-Lys) ml 1,0 tampone acetato 0,1 M, pH 5.5 ml 1,5 soluzione di aptene ml 1,0

Si aggiungono 65 mg di N-etil-N '-(3-dimetialmminopropil )carbodiimide (ODI- soluzione 10 mg/μl, da preparare al momento dell'uso). Si lascia reagire per 30 minuti a 37°C. Si dializza contro tampone PBS (soluzione fisiologicatampone fosfato) a pH 7.4 su tubo a taglio molecolare 30KD, Si conserva in frigorifero.

[Nel presente esempio, il solvente, quando non specificato, è soluzione Fisiologica o PBS].

Metodo B - Coniugazione fra aptene e sostanza proteica ossidata con periodato

Reattivi : PBS; tampone carbonato/bicarbonato 1M, pH 9.5; periodato di sodio 0,1 M (21 mg per ml); glicole etilenico (1 ml di glicole etilenico in 17 mi di acqua distillata); boroidruro di sodio (soluzione con concentrazione di 4 mg/ml in acqua distillata, preparata al momento dell'uso).

Procedimento : Si sciolgono 2 mg di sostanza proteica in 0,5 ml di periodato di sodio 0,1 M in tampone acetato 0,1 M, pH 5.5· Si agita per 20 minuti alla temperatura di laboratorio. Si aggiungono 30 pi di glicerolo 1M per bloccare l'azione del periodato in eccesso, si agita per 5 minuti, si filtra attraverso colonna di Sephadex G 25 fine (1x5. equilibrata con tampone carbonato/bicarbonato 0,1 M, pH 9.5) e si raccoglie la frazione bruna). Si aggiungono 10 mg di aptene in poca fisiologica (circa 1 ml), poi si aggiunge tampone carbonato/bicarbonato 1 M. Dopo 2 ore sotto agitazione alla temperatura di laboratorio, si aggiungono 0,2 ml disodio boroidruro 4 mg/ml. Si abbandona per 2 ore e si dializza contro PBS per una notte. Si centrifuga erp 15 minuti a 10.000 x g. Si aggiunge un volume equivalente di glicerolo.

Metodo C- Coniugazione di aptene con proteina in presenza di glutaraldeide

Si sciolgono 10 mg di sostanza proteica in 1 ml di tampone fosfato 0,1 M a pH 6,8, in cui è stato precedentemente disciolto l'aptene, in rapporto molare sostanza proteica:aptene=l:15- Si aggiungono 50 μl di glutaraldeide all'1% in tampone fosfato 0,1 M a pH 6,8. Si lascia reagire per 3 ore a temperatura ambiente. Si aggiungono quindi 50 μl di lisina o glieina in PBS, per bloccare i gruppi reattivi della glutaraldeide. Si lascia riposare per 1-2 ore a temperatura ambiente o tutta la notte in frigorifero. Si dializza contro tampone PBS, su tubo a taglio 10 KD, una notte. Si centrifuga per 20 minuti, a 10.000 x g. Si aggiunge pari volume di glicerolo e si conserva fra 4°C e -20°C.

Metodo D - Coniugazione fra aptene ossidato con periodato e sostanza proteica

Si sciolgono 2 rag di aptene in 0,5 mi di NalO4 0,1 M in tampone acetato 0,1 M, pH 5.5· Si lascia sotto agitazione per 20 minuti alla temperatura di laboratorio, quindi si aggiungono 30 μl di glicerolo 1M, si lascia sotto agitazione per ulteriori 30 minuti, poi si trasferisce a 4°C per circa 1 ora e mezza. Si aggiunge NaOH fino a pH circa 9.0 e si aggiunge tampone carbonato/bicarbonato 0,1 M fino ad avere il volume finale di 1 mi contenente 8.0 mg di sostanza proteica. Si lascia sotto agitazione 2 ore alla temperatura di laboratorio, si aggiungono 200 μl di sodio boroidruro 4 mg/ml e si lascia sotto agitazione per 2 ore alla temperatura di laboratorio. Si dializza contro soluzione fisiologica.

PREPARAZIONE DI IMMUNOOENI

Esempio 1A - Derivato immunogeno di apteni coniugati con un vettore proteico rappresentato dal coniugato BSA ossidata/copolimero Poly(D-Glu.D-Lys)

Il Metodo A è stato ripetuto utilizzando BSA a PM 65.000 come proteina, utilizzando ogni volta uno dei seguenti apteni: neomicina, gentamicina, streptomicina, amfotericina, cicloserina, amfetamina, metamfetamina, sulfametossazolo, ossitetraciclina, doxiciclina, ceftazidima, cefotaxima, cefalessina, acido 6-aminopenicillanico , acido penicilloico; isoniazìde; emisuccinato di dietilstilbestrolo, zeranololo, trenbolone o 17β-estradiolo. Esempio 1B - Immunogeno delle tetracicline Ossitetraciclina e doxiciclina sono state coniugate con sieroalbumina bovina (BSA a PM 65.ΟΟΟ) in presenza di N-etil-N'- (3-dimetilamminopropil)-carbodiiimide secondo la procedura riportata da E.C. Bouverv, G.J.A. Speieres , B.I.G. Lutz, D. Freudenthal , V. Kanhai, B. Haagmans e H.J.G.M. Derks, in Develop. Biol. Standard, S. Karger - Basel (1986), 63, 117*

Esempio 2A - Immunogeno di antibiotici aminoglicosidici II Metodo B è stato ripetuto utilizzando come proteina BSA (PM 65*000) e come aptene ogni volta uno dei seguenti composti: neomicina B, gentamicina, streptomicina, amfotericina.

Esempio 2B - Immunogeno di antibiotici aminoglicosidici II Metodo D è stato ripetuto utilizzando come proteina BSA (PM 65*000) e come aptene ogni volta uno dei seguenti composti: neomicina B, gentamieina, streptomicina, amfotericina.

Esempio 3 ~ Immunogeni di farmaci coniugati con BSA in presenza di glutaraldeide II metodo C è stato ripetuto utilizzando BSA (PM 65.000) come sostanza proteica, utilizando ogni volta come aptene uno dei seguenti composti: clenbuterolo, cimaterolo; neomicina, gentamicina, streptomicina, amfotericina; cef tazidima , cefotaxima, cefalessina; cicloserina; amfeternine e metamfetamina; sulfametossazolo ; isoniazide.

Esempio 4 - laminogeno di cefalosporine e penicilline

Ceftazidima, cefotaxima e cefalessina e pecinicilline sono state trattate con sieroalbumina bovina (BSA 65-000), in presenza di glutaraldeide come reattivo di coniugazione, operando nelle condizioni descritte da N. Zegers , K. Gerritse, C. Deen, W. Boersma e E. Classen, in J. Immunol. Meth., (1990), voi. 130, pagina 195-Esempio 5 ~ Immunogeno di simpaticomimetici a struttura 2-feniletilamminica Clenbuterolo e cimaterolo sono stati coniugati con BSA come riportato in D.A. Gadkari , H.A. Fields, e J.E. Maynard, in J. Virol. Meth. (1985). 10, 215-Esempio 6 - Immunogeno di solfoneramidi 11 sulfametossazolo [3~ sulf anilammido-5-metilisossazolo] è stato coniugato nelle condizioni operative descritte da T. Piao King, Y. Li e L. Kochoumian, Biochem., (1978), 17(8), pagina 1499-Esempio 7 - Immunogeno di derivati del 2-tiouracile-Propiltiouracile è stato ottenuto operando come descritto in D.J.

O'Shannessy e R.H. Quarles, in J. Immunol. Meth. {1987). 99. 153· Esempio 8 - Immunogeni di dietilstilbestrolo [3.4-bis-(pidrossifenil) -3-eaene], 17-β-estradiolo, zeranololo [lattane dell'acido 6-(6,10-diidrossiundecil )β-resorcinolo] , trenbolone [17β-idrossi-estra-4,9.H -trien-3-one] Sono stati ottenuti operando come riportato in G.R. Gray in Meth. Enzymol. (1978), 50. 155.

Zeranololo [lattone dell'acido 6-(6,10-diidrossiundecil )βresorcinolo]

Trenbolone

ESEMPIO 9- PRODUZIONE DI ANTICORPI IgG SPECIFICI VERSO GLI IMMUNOGENI

A. Produzione degli anticorpi. Gli immunogeni preparati come descritto negli esempi sopra riportati sono stati somministrati a capre o cavalli, in presenza di adiuvante di Freund, secondo lo schema descritto da A. Johnstone e R. Thorpe in "Immunochemistry in Practice" , eds. A. Johnstone e R. Thorpe, Blackwell Sci. Pubi., Oxford (1982), 28, seguendo più in particolare il seguente protocollo:

Immunizzazione primaria: Si somministra agli animali una emulsione acqua/olio contenente immunogeno (0,5-2mg) in PBS (2ml) , emulsionato con FCA (adiuvante completo di Freund) in presenza di un emulsionante, per via sottocutanea, ripartendo la dose in più iniezioni in più siti dell'animale.

Immunizzazione secondaria ("booster"): Dopo 14-21 dall'inezione primaria, si somministra a capre o cavalli una preparazione contenente immunogeno (0,5-2mg) in PBS (2ml) e PIA (adiuvante incompleto di Freund), per via intramuscolare, ripartendo la dose in più iniezioni in più siti dell'animale.

Il controllo della risposta immunitaria è stato effettuato come più avanti descritto, su un prelievo di sangue dall'arteria femorale dell'animale dopo circa 20-40 giorni dalla somministrazione del "booster" .

Il siero contenente le IgG è stato quindi prelevato ed utilizzato per la preparazione di immunodetossicanti costituiti dalla frazione F(ab')2 dell'anticorpo, e per la purificazione di IgG da utilizzare nel test diagnostico secondo la presente invenzione. B. Purificazione delle IgG dal siero: E' effettuata mediante cromatografia su DEAE-Trysacril 1M, eluendo con tampone Tris-HCl 0,025M/NaCl 0.035M, avente pH 8,8: vengono cosi eluite le immunoglobuline di classe IgG, con grado di purezza del 99-5%. mentre sono trattenute quelle appartenenti alle altre classi. La cromatografia su colonna DEAE-Trysacril è effettuata su plasma crioprecipitato per eliminare ad esempio fibrinogeno, chilomicroni , lipoproteine, che potrebbero danneggiare le colonne cromatografiche, ed è preceduta da passaggio su colonna ULTROGEL AcA 202, eluendo con il suddetto tampone, per desalificare.

La metodologia operativa è riportata ad esempio in "Reactifs IBF", "Preparation of Albumin and IgGs by Direct Chromatographic Separation on DEAE- and CM-TRYSACRYL M", According to J. Saint-Blancard, J. Fourcart. E. Boschetti, P. Girot".

Dopo cromatografia, le IgG vengono riconcentrate al volume originale per centrifugazione su microfiltro Amicon a taglio molecolare 10 KD, quindi dializzate per 24 ore contro soluzione fisiologica. Si titola il contenuto proteico con il metodo del biureto. Si valuta l'attività anticorpale secondo un metodo immunoenzimatico ELISA di tipo competitivo, o con il metodo della precipitine o secondo altre metodologie convenzionali.

C. Dosaggio delle IgG nel siero dell'animale produttore di IgG: Le IgG sono state determinate quantitativamente mediante metodologie cpnvenzionali, ad esempio mediante il metodo della emoagglutinazione passiva nei confronti dell'aptene coniugato covalentemente ad eritrociti di tacchino, titolando l'anticorpo IgG eventualmente presente nel campione in pozzetti a cui sono aggiunti gli eritrociti sensibilizzati mediante legame con l'aptene. Una superficie del pozzetto opaca ed omogenea indica la presenza di anticorpi antiaptene nel campione saggiato.

Esempio 10 - PREPARAZIONE DEI FRAMMENTI F(ab')2

Per 1000 ml di siero: Si aggiusta il pH del siero a circa 7 (ad esempio 7.4). Sotto agitazione, goccia a goccia, a temperatura di laboratorio, si aggiungono 1000ml di PEG6000 al 32%, avente pH 7. (PEG finale 16%). Si lascia avvenire la precipitazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Si recupera il precipitato PI per filtrazione su filtro Laurent η° 1; si getta il filtrato; si discioglie il precipitato PI in 1500 ml di NaCl 0,9% (3/4 di 2000 mi, cioè 3/4 di volume della prima precipitazione); si aggiusta il pH a 7- Si aggiungono sotto agitazione goccia a goccia 1500 ml (vol/vol) di una soluzione di PEG6000 al 28% [PEG finale 14%]. Si lascia avvenire la precipitazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Si recupera il precipitato PII per filtrazione; si getta il filtrato; si discioglie il precipitato PII in 1000 ml di NaCl 0,9%; si aggiungono 16,5 grammi di glicina [0,22M]; si aggiusta il pH della soluzione a 3 con HCl IN; si pone in bagno Maria a 31.5°C.

Quando la temperatura si è equilibrata, si aggiungono 200.000 U di pepsina (200U/ml di PII). Si lascia per 90 minuti a 31.5°C a bagno Maria, agitando ogni quarto d'ora. Si elimina il fondo di pepsina per centrifugazione a 3000 rpm per 10-15 minuti.

Si aggiusta la concentrazione del surnatante a 0,5M di NaCl; essendo già a 0.15M si aggiungono 20 g di NaCl; si porta a pH 7.5 (neutralizzazione della pepsina); si riaggiusta il pH a 5·; si aggiungono 350 ml di PEG 6000 al 40% [PEG finale = 10%]. Si lascia avvenire la precipitazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Si recupera il filtrato Slld. Si legge la densità ottica D0 a 280 nra (1/20imo). Si aggiusta il pH a 7 per aggiunta di NaOH 1N. Dopo poco si aggiungono 900 ml (pari volume) di PEG 6000 al 50% [PEG finale = 30%]. Si lascia avvenire la precipitazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.

Si recupera il precipitato ottenuto, si scioglie nel minimo (200 ml) necessario di NaCl 0,9%. e si dializza contro un grande volume (2 litri) di NaCl 0,9%. per una notte a 4°C. Si recupera il dializzato, si centrifuga a 4000 rpm per 15 minuti, si misura la D0. e si aggiusta la concentrazione di F(ab')2 a 10 mg/ml. Si filtra su filtri a 0,45 pm e si ripartisce in tubi in ragione di 20mg/2ml/tubo. Si effettua un saggio di sterilità (100 μl di F(ab’)2 + 0,9 mi di mezzo con siero senza antibiotico), in stufa. Esempio 11- SAGGIO DIAGNOSTICO DI TIPO ELISA COMPETITIVO PER LA DETERMINAZIONE DEI MEDICAMENTI IN CIRCOLO - La metodologia operativa è analoga a quella descritta da A. Voller, D.E. Bidwell e A. Bartlett in Bull. Wld. Health Org., 1976, 53. 55·

A. Adesione dell'anticorpo IgG alla fase solida Si prepara una soluzione di IgG purificata, in tampone carbonato, 1M, pH 9.5. avente un titolo in proteine pari a 50 μg/ml, determinato con il metodo del biureto. Si depongono in ogni pozzetto di una micropiastra di polistirene 100 μl di soluzione e si mette ad incubare per 2 ore a 37°C. Si depongono quindi in ogni pozzetto 100 μl di una soluzione al 2% (peso/volume) di caseina, in tampone PBS 0,05 M, a pH 7.4, e si lascia saturare una notte in frigorifero. Si elimina la caseina e si lavano i pozzetti tre volte con tampone PBS. Si essicca la micropiastra in essiccatore con gel di silice, sotto vuoto.

B. Soluzione campione Siero animale da controllare.

C. Composto da dosare marcato con enzima I composti da dosare (apteni) sono stati legati a perossidasi di rafano (HRP), con vari metodi a seconda della loro struttura:

Coniugati in cui il farmaco è marcato con il coniugato perossidasi (HRB) ossidata/copolimero Poly(D-Glu.D-Lys)

Il Metodo A è stato ripetuto utilizzando HRB a peso molecolare 45.000 come proteina, ed effettuando ogni volta la coniugazione con gli apteni specificati nella presente parte sperimentale per l'ottenimento degli immunogeni secondo il Metodo A.

Apteni contenenti gruppi -NH2 : H Metodo C è stato ripetuto utilizzando come proteina HRP (PM circa 45-000), e gli apteni specificati nella parte sperimentale per la preparazione degli immunogeni secondo tale metodo.

Coniugati fra farmaco o metabolita e perossidasi (HRB), in presenza di glutaraldeide II Metodo C è stato ripetuto utilizzando come proteina HRP (PM circa 45-000) e come apteni quelli utilizzati per la preparazione degli immunogeni secondo tale metodo.

Coniugati fra antibiotici aminoglicosidici e HHP II Metodo D è stato ripetuto utilizzando come proteina HRP (PM 45.000) e come apteni quelli utilizzati per la preparazione degli immunogeni secondo tale metodo.

Saggio immunodiagnostico

Reattivi e strumentazione - Il kit diagnostico comprende:

1. Fase solida : Piastra microtitolatore a 96 pozzetti, in polistirene, con adsorbito l'anticorpo specifico per il farmaco da dosare, composta da 12 striscie di 8 pozzetti.

2. Tampone diluente (2 x 50 ml) di PBS/Caseina

3. Soluzione concentrata di lavaggio (1 x 50 ml) di PBS/Tween 4. Coniugato (aptene marcato con enzima): apteni marcati con perossidasi (1 x 320 pi)

5. Cromogeno : Soluzione tamponata di TMB (tetrametilbenzilina) (1 x 6 ml)

6. Substrato: soluzione tamponata di H2O2 (1 x 6 ml)

7. Reattivo di arresto della reazione: acido solforico 2N (4 x 100 pi)

8. Controlli positivi : 8a. Standard 1; 8b. Standard 2; 8c . Standard 3; 8d. Standard 4 (si utilizza come standard il siero di animale trattato con il farmaco da dosare, la cui concentrazione è stata determinata con un'altro metodo analitico noto per quel farmaco. In questo modo è possibile determinare il farmaco nelle varie forme in cui si trova in circolo, sia esso libero e/o legato a proteine).

9- Controllo negativo: (1 x 100 pi) (siero animale non trattato) Tutti i reattivi e la piastra vanno conservati al riparo dalla luce a 2-8°C. Si rimuove la pellicola che copre le strisce al momento dell'uso e si utilizzano i reattivi dopo averli portati a temperatura ambiente.

Procedimento: Al momento dell'uso, si diluisce come di seguito indicato:

Reattivo 4: diluire 1:40 con reattivo 2 (es. 25pl a 1 ml per ogni striscia da 8 pozzetti)

Reattivo 5: diluire con pari volume di reattivo 6 (es. 1 ml 1 mi per ogni striscia da 8 pozzetti)

Reattivo 3: diluire 1:10 con soluzione fisiologica

Campioni da saggiare: se il saggio non è eseguito nel giorno stesso del prelievo, il campione va congelato a -20°C. Non devono essere utilizzati sieri inattivati a 56°C.

Campioni : diluire 1:100 con reattivo 2.

Controlli 8a, 8b, 8c, 8d, 9: diluire 1:100 con reattivo 2.

Si eseguono le determinazioni in duplicato, su due strisele, trasferendo in ogni pozzetto 100μΙ dei reattivi indicati in Tabella i. secondo lo schema ivi riportato:

Tabella 1

Striscia N.l Striscia N.2

B= Bianco (Tampone diluente- reattivo 2); Sa, Sb , Se, Sd= Controlli positivi corrispondenti ai reattivi 8a, 8b, 8c, 8d, diluiti); N = controllo negativo (reattivo 9· diluito); C= campione in esame, diluito.

Si coprono le strisele con pellicola adesiva e si pongono ad incubare a 37°C per 1 ora. Si lavano i pozzetti 3 volte con 350 μl di soluzione di lavaggio (reattivo 3)· Dopo aver eliminato accuratamente ogni residuo di lavaggio, si aggiungono in ogni pozzetto 100 μl nell'ordine i seguenti reattivi:

- coniugato (reattivo 4)

- substrato cromogeno (reattivo 5);

dopo ogni aggiunta di reattivo, si copre la striscia, si pone ad incubare a 37°C per 1 ora, e si lavano i pozzetti come sopra specificato prima di aggiungere il reattivo successivo.

La reazione è arrestata aggiungendo il reattivo 7 (50μl per pozzetto). Si mescola su un agiatore per piastre, si legge la densità ottica (D.O.) a 492 nm (filtro secondario a 63Ο nra) entro 30 minuti, azzerando contro il Bianco. Il saggio si considera valido quando il valore medio del controllo negativo è E(negativo)≤ 0,100.

Determinazione qualitativa: Il valore soglia di positività è compreso fra 0.350 ≤ E( soglia)≤ 0.450. I campioni i cui risultati sono inferiori al valore soglia sono "negativi”, mentre i campioni con risultato superiore al valore soglia sono "positivi". Per risultati compresi nell'intervallo di valore soglia è opportuno ripetere la determinazione.

Determinazione quantitativa: Il kit è dotato di 4 diluizioni di siero standard che consentono di tracciare una curva di calibrazione. Per calcolare la concentrazione in μg/ml di aptene nel campione è sufficiente estrapolare il valore di D.O. del campione dalla curva di calibrazione precedentemente tracciata. Si riporta in Figura 1 a titolo di esempio una curva di calibrazione ottenuta riportando in ascissa la concentrazione di farmaco di soluzioni standard 1, 2 3 e 4, espressa come Log μg/ml, e in ordinata la D.O. La concentrazione di farmaco determinabile nell'animale varia da ng a μg.

Esempio 12 - IMPIEGO DEI FRAMMENTI F(ab ') 2 NELLA DETOSSIFICAZIONE DA FARMACI

Animali bovini sono stati sottosposti a trattamento con i farmaci di cui è stata prima descritta la preprazione dei corrispondenti immunogeni, per un periodo sufficiente a garantire l'effetto farmacologico. Quindi è stata determinata la concentrazione serica di farmaco, o metabolita, mediante il saggio ELISA competitivo sopra illustrato, calcolando la concentrazione serica di farmaco mediante curva di calibrazione ottenuta come sopra riportato per il saggio tipo ELISA.

Prima della detossificazione si riscontrano valori positivi al 100% (D.O. maggiore del valore soglia ("cut-off") compreso fra 0,250 e 0,350 - si veda la curva in Figura 1). Facendo riferimento alla curva di calibrazione, si determina la concentrazione di farmaco nel siero, quindi si somministra agli animali da trattare 1 mole di F(ab')2 specifico per quel farmaco ogni 2 moli di farmaco o metabolita presenti nel siero, per via intramuscolare.

Dopo 72 ore dalla somministrazione di F{ab')2 si ripete la determinazione della concentrazione serica di farmaco mediante il metodo ELISA sopra riportato. Il trattamento detossificante è efficace se si riscontrano valori serici di farmaco negativi, cioè inferiori al valore soglia di D.O. come sopra definito. Quando si riscontrano ancora valori positivi, si ripete di nuovo il trattamento detossificante, somministrando 1 mole di F(ab’)2 ogni 2 moli di farmaco.

Il trattamento detossificante cosi descritto ha portato ad una sostanziale riduzione del livello ematico del farmaco, al di sotto del suddetto valore soglia, dopo un numero di somministrazioni generalmente variabile da 1 a 3·

Claims (52)

1. RIVENDICAZIONI 1. Frammenti F(ab')2 di immunoglobuline IgG attivi come anticorpi specifici verso un farmaco o un suo metabolita.
2. 2. Frammenti secondo la rivendicazione 1, attivi come anticorpi specifici verso un farmaco scelto fra: antibiotico; sulfamidico; antivirale; antiparassitario; antimicotico; antitubercolare; simpaticomimetico; antitiroideo; sostanza ad attività estrogena, androgena o progestinica ; cortisonico; ormone endogeno; auxinico; amfetaminico ; disinfestante.
3. 3- Frammento secondo la rivendicazione 2, in cui l'antibiotico è scelto fra tetracicline, antibiotici amminoglicosidici , cefalosporine e penicilline; il simpaticomimetico è un βagonista a struttura 2-feniletilamminica; l'entitiroideo è un derivato del 2-tiouracile; il sulfamidico è sostituito all'azoto sulfonammidico con un anello isossazolico.
4. 4. Frammento secondo la rivendicazione 2, in cui l'antibiotico è scelto fra ossitetraciclina, doxiciclina, neomicina B, gentamicina C, tobramicina, kanamicina, amikacina e streptomicina, ceftazidima, cefotaxima, cefalexina, una penicillina; il sulfamidico è sulfametossazolo; l'antivirale è idoxuridina; l'antimicotico è amfotericina o ketoconazolo ; l'antitubercolare è cicloserina o isoniazide; il simpaticomimetico è clenbuterolo o cimaterolo; l'antitiroideo è propiltioruracile o metiltiouracile; la sostanza ad attività estrogenica è dietilstilbestrolo, 17-pestradiolo o zeranolo; la sostanza ad attività andrò gena è trenbolone o 19-nortestosterone; la sostanza progestinica è progesterone; il cortisonico è desametasone, l'ormone endogeno è somatotropina; l'auxinico è scelto fra virginiamicina , zincobacitracina , avoparcina; l'amfetaminico è amfetamina o metamfetamina.
5. 5. Procedimento per la preparazione di frammento F(ab')2 come definiti nelle rivendicazioni da 1 a 4, compredente la rimozione del frammento FC per digestione con pepsina delle corrispondenti immunoglobuline IgG, ottenute dal siero di animali trattati con un derivato immunogeno ottenuto per coniugazione di un composto prescelto come aptene per il farmaco con un vettore di natura proteica o polisaccaridica.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5. in cui per la preparazione dell'immunogeno si utilizza come aptene il farmaco stesso di cui si vuole promuovere la eliminazione dall’organismo, un suo metabolita, o un suo derivato.
7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui il derivato immunogeno è scelto fra i seguenti coniugati aptene/vettore proteico: a) prodotto di coniugazione fra un aptene contenente gruppi -NH2, -ΝΉ-, -CONH2, -NHNH2 o -COOH, ed un vettore proteico in presenza di carbodiimide; b) prodotto di coniugazione in presenza di una carbodiimide fra un aptene contenente gruppi -NH2. -NH-. -CONH2, -NHNH2 o -COOH, ed un coniugato fra vettore proteico ossidato e copolimero poliaminoacidico sintetico, in cui il vettore è ossidato con un ossidante dei gruppi -OH a -CHO; c) prodotto di coniugazione fra un aptene contenente gruppi -OH, precedentemente ossidato per trattamento con un agente ossidante dei gruppi -OH a -CHO, ed un vettore proteico; d) prodotto di coniugazione fra un aptene contenente gruppi -NH con un vettore proteico, in presenza di glutaraldeide. e) prodotto di coniugazione fra un aptene contenente gruppi -NH ed un vettore proteico ossidato per trattamento con un'agente in grado di ossidare i gruppi -OH a -CHO.
8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7. in cui il vettore proteico ha peso molecolare 40,000-70.000 e nel caso b) il copolimero poliaminoacidico ha peso molecolare 20.000-100.000.
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7. in cui il vettore proteico ha peso molecolare 65.000 e il copolimero poliaminoacidico ha peso molecolare 50.000.
10. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 7. in cui il derivato immunogeno è scelto fra: - coniugato a), in cui l'aptene è scelto fra antibiotici aminoglicosidici , cicloserina, amfetamine, sulfonilamidi , tetracicline, cefalosporine, acido 6-aminopenicillanico, acido penicilloico , isoniazide, esteri emisuccinici di steroidi o composti ad attività steroidea contenenti un gruppo -OH, il vettore proteico è sieroalbumina bovina e la carbodiimide è Netil-N'-(3-dimetilamminopropil )-carbodiimide; - coniugato b), in cui l'aptene è scelto fra antibiotici aminoglicosidici , cicloserina, amfetamine, sulfonilamidi , tetracicline, cefalosporine, acido 6-aminopenicillanico, acido penicilloico , isoniazide, esteri emisuccinici di steroidi o composti ad attività steroidea contenenti un gruppo -OH; il vettore proteico è sieroalbumina bovina ossidata con periodato e coniugata con Poli {D-Glu,D-Lys), e la carbodiimide è N-etil-N'-(3-dimetilamminopropil) -carbodiimide sieroalbumina bovina; - coniugato c), in cui l'aptene ossidato è un antibiotico aminoaglicosidico ed il vettore proteico è sieroalbumina bovina; - coniugato d), in cui l'aptene è scelto fra simpaticomimetici a struttura 2-feniletilamminica, antibiotici aminoglicosidici, amfetamine, sulfoniiammidi, cicloserina, cefalosporine con gruppi amminici, isoniazide, ed il vettore proteico è sieroalbumina bovina. - coniugato e), in cui l'aptene è un antibiotico aminoglicosidico ed il vettore proteico è sieroalbumina bovina ossidata con periodato.
11. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 7. in cui : nel caso b), il rapporto molare copolimero: proteina ossidata è compreso fra 1:5 e 1:30. ed il rapporto molare aptene: coniugato copolimero/proteina ossidata è compreso fra 4:1 e 20:1; nel caso d) il rapporto molare aptene : vettore proteico è compreso fra 5-1 e 20:1, e la glutaraldeide è in quantità fra 0,01 e 0,1 mg per mg di vettore proteico.
12. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui si somministra detto derivato immunogeno agli animali nei quali si intende far avvenire la produzione delle immunoglobuline IgG, mediante una iniezione primaria ed un richiamo, quindi si ricava il siero dell'animale e da esso si isola e si purifica la frazione proteica corrispondente alle immunoglobuline IgG.
13. 13- Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui si utilizzano come animali per la produzione di IgG capre o cavalli, l'immunogeno è associato ad adiuvante completo di Freund nell'iniezione primaria e ad adiuvante incompleto di Freund nel richiamo, l'iniezione primaria è somministrata per via sottocutanea ed il richiamo per via intramuscolare.
14. 14 . Procedimento secondo la rivendicazione 5. in cui la digestione con pepsina è effettuata su frazioni proteiche precipitate per aggiunta di polietilenglicole.
15. 15- Frammenti F(ab')2 di immunoglobuline IgG attive come anticorpi specifici verso farmaci ed i loro metaboliti, ottenibili secondo il procedimento rivendicato nelle rivendicazioni da 5 a 14.
16. 16. Composizioni farmaceutiche comprendenti almeno un frammento F{ab')2 come definito nelle rivendicazioni da 1 a 4, o 15. in combinazione con uno o più eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
17. 17. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 16, in forma di preparazioni iniettabili.
18. 18 . Impiego di frammenti F{ab')2 come definiti nelle rivendicazioni da 1 a 4, o 15. nel trattamento detossificante dell'uomo e di animali trattati con detti farmaci.
19. 19· Impiego secondo la rivendicazione 18, per il trattamento di casi di avvelenamento, sovradosaggio o allergia da farmaci nell'uomo o nell'animale.
20. 20. Impiego secondo la rivendicazione 19. per il trattamento in campo umano di manifestazioni allergiche o shock anafilattico in soggetti trattati con antinfiammatori o antibiotici, o in caso di abuso di sostanze farmacologicamente attive.
21. 21. Impiego secondo la rivendicazione 18, nella detossificazione di animali da allevamento trattati con farmaci, prima della macellazione o del prelievo di latte.
22. 22. Impiego secondo le rivendicazioni da 18 a 21, in cui detti frammenti sono somministrati per via parenterale.
23. 23. Impiego secondo le rivendicazioni da 18 a 22, in cui detti frammenti sono somministrati in quantità pari ad almeno 1 mole ogni 2 moli di farmaco o metabolita presente nel sangue del soggetto da trattare.
24. 24. Immunoglobuline di tipo IgG attive come anticorpi specifici verso farmaci ed i loro metaboliti.
25. 25. Immunoglobuline di tipo IgG attive come anticorpi specifici verso farmaci ed i loro metaboliti, ottenibili secondo il procedimento come definito nelle rivendicazioni da 5 a 13·
26. 26. Immunoglobuline di tipo IgG attive come anticorpi specifici verso farmaci ed i loro metaboliti, in cui i farmaci sono definiti come nelle rivendicazioni da 3 a 5·
27. 27. Impiego di immunoglobuline IgG come definite nelle rivendicazioni da 24 a 26, nel trattamento detossificante di animali della stessa specie rispetto a quelli in cui le IgG sono state prodotte.
28. 28. Composizioni farmaceutiche comprendenti almeno ima IgG come definita nelle rivendicazioni da 24 a 26, in combinazione con uno o più eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
29. 29. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 28, in forma di preparazioni iniettabili.
30. 30. Uso di immunoglobuline IgG come definite nelle rivendicazioni da 24 a 26, come reattivi diagnostici utili per l'effettuazione di un saggio di tipo ELISA competitivo per la determinazione di detti farmaci o loro metaboliti.
31. 31. Procedimento diagnostico di tipo ELISA competitivo per la determinazione della concentrazione di un farmaco o di un suo metabolita nell’organismo, comprendente i seguenti passaggi: si aggiunge il campione di liquido biologico contenente il composto da dosare ad un supporto inerte sensibilizzato fissandovi le immunoglobuline IgG attive come anticorpi verso il composto da determinare, si aggiunge un coniugato rappresentato dal composto da dosare marcato con un enzima, miscelato al campione da dosare o aggiuntovi successivamente, dopo incubazione del campione, si lascia reagire, si lava e si aggiunge un substrato croniogeno in grado di reagire con l'enzima; dopo sviluppo della colorazione si legge la densità ottica della soluzione, dalla quale si ricava per differenza la quantità di composto da dosare contenuta nel liquido biologico saggiato.
32. 32. Procedimento secondo la rivendicazione 31. in cui il supporto inerte è una piastra di plastica; il liquido biologico è siero o urina; l'enzima è una perossidasi; ed il substrato croniogeno è ortofenilendiammina o tetrametilbenzilina.
33. 33· Kit diagnostico per la determinazione di un farmaco e/o metabolita nel sangue, comprendente una fase solida alla quale è legata una immunoglobulina IgG attiva come anticorpo verso il farmaco e/o il metabolita da determinare, un coniugato rappresentato dal composto da dosare marcato con un enzima, ed un substrato cromogeno.
34. 34. Coniugato rappresentato da un farmaco o un suo metabolita, legato con un enzima, scelto nel gruppo costituito da: a) coniugato ottenuto per coniugazione di un farmaco o metabolita contenente gruppi -NH2, -CONH2, -NHNH2 o -COOH, con un enzima in presenza di carbodiimide; b) coniugato ottenuto per coniugazione in presenza di una carbodiimide di un farmaco o metabolita contenente gruppi -NH2· -CONH2. -NHNH2 o -COOH con un coniugato fra un enzima ossidato con un agente ossidante dei gruppi -OH a -CHO ed un copolimero poliaminoacido sintetico; c) coniugato ottenuto per coniugazione fra un farmaco o metabolita contenente gruppi -OH, precedentemente ossidato per trattamento con un agente ossidante dei gruppi -OH a -CHO, ed un enzima; e d) coniugato ottenuto per coniugazione di un farmaco o metabolita contenente gruppi -NH2 con un enzima, in presenza di glutaraldeide . e) coniugato ottenuto per coniugazione fra un farmaco o metabolita contenente gruppi -NH2 ed un vettore proteico ossidato per trattamento con un'agente in grado di ossidare i gruppi -OH a -CHO.
35. 35· Coniugato secondo la rivendicazione 34. in cui l'enzima è perossidasi di rafano.
36. 36. Procedimento per la preparazione di un coniugato fra un aptene ed una sostanza proteica, comprendente: a) trattamento della sostanza proteica con un agente ossidante dei gruppi -OH in -CHO; b) trattamento della sostanza proteica ossidata cosi ottenuta con un copolimero poliaminoacidico sintetico; c) trattamento del coniugato sostanza proteica ossidata/copolimero poliaminoacidico così ottenuto con l'aptene, in presenza di una carbodiimide.
37. 37· Procedimento secondo la rivendicazione 36, in cui l'ossidazione è effettuata con un periodato inorganico, in acqua, a pH compreso fra 5.0 e 7.5. fra 10°C e 50°C, al riparo dalla luce; l'agente ossidante è in eccesso stechiometrico rispetto ai gruppi -OH della sostanza proteica, e a fine reazione il suo eccesso è eliminato per aggiunta di un eccesso molare di un alcool, alla temperatura di ossidazione; nella fase b), il copolimero è un copolimero fra α-aminaocidi acidi e α-aminoacidi basici, la reazione è condotta in ambiente acquoso, a pH alcalino, fra 4° e 40°C, al riparo dalla luce, a fine reazione si tratta con un agente riducente dei gruppi -CHO; la fase c) è effettuata in ambiente acquoso, a pH fra 5,0 e 6,0, a 30°C/+40°C.
38. 38. Procedimento secondo la rivendicazione 37, in cui la sostanza proteica ha peso molecolare 40.000-70 .000, il copolimero è Poli(D-Glu, D-Lys) con peso molecolare 20.000-100.000; il rapporto molare copolimero:proteina ossidata è compreso fra 1:5 e 1:30,; l'aptene è in rapporto molare compreso fra 4:1 e 20:1 rispetto al copolimero poliaminòacidico contenuto nel coniugato copolimero-proteina ossidata e la carbodiimide è in eccesso molare rispetto ai gruppi -COOH.
39. 39- Procedimento secondo la rivendicazione 38, in cui il copolimero è Poli(D-Glu, D-Lys)a peso molecolare 50.000 e con rapporto Glu:Lys=6:4, il rapporto molare copolimero : sostanza proteica ossidata è 1:15. la carbodiimide è in eccesso di 0,3~0,6 mmoli per 8-10 pinoli di coniugato proteina ossidaia/copolimero poliaminoacidico ; la carbodiimide è N-etil-N '- (3dimetilamminopropil )-carbodiimide.
40. 40. Procedimento secondo la rivendicazione 37, in cui: - il coniugato proteina ossidata/copolimero poliaminoacidico è purificato per dialisi, su membrane con limite di esclusione molecolare compreso Fra 50.000 e 100.000; contro un tampone a pH 5,0-6,0, a 0°C/+10°C; - il coniugato aptene/vettore è purificato per dialisi attraverso membrane con valore di esclusione molecolare compreso fra 10.000 e 30.000 Daltons, contro tampone a pH 7.0-7,5. a temperatura di 0°C/+10°C.
41. 41. Procedimento secondo la rivendicazione 37, in cui l'aptene è scelto fra antibiotici aminoglicosidici, cicloserina, amfetamine, sulfonilamidi , tetracicline, cefalosporine , acido 6-aminopenicillanico , acido penicilloico , isoniazide, esteri emisuccinici di steroidi o composti ad attività steroidea contenenti un gruppo -OH.
42. 42. Procedimento per la preparazione di un coniugato fra un aptene ed una sostanza proteica, comprendente il trattamento di un aptene contenente gruppi -OH con un agente ossidante dei gruppi -OH a -CHO, ed il successivo trattamento con la sostanza proteica.
43. 43· Procedimento secondo la rivendicazione 42, in cui l'ossidazione è condotta con NalO4, in acqua, a pH fra 5,0 e 7,5, fra 4°C e 40°C, al riparo dalla luce; l'eccesso di ossidante è eliminato per aggiunta di glicerolo; la reazione dell'aptene ossidato con la proteina è tipicamente condotta a pH alcalino, alla temperatura sopra specificata per la ossidazione.
44. 44. Procedimento secondo la rivendicazione 42, in cui l'aptene è un antibiotico aminoglicosidico.
45. 45. Procedimento per la preparazione di un coniugato fra un aptene contenente gruppi -NH2 ed una sostanza proteica, comprendente l'ossidazione della sostanza proteica con un agente ossidante dei gruppi -OH in -CHO, ed il successivo trattamento della sostanza proteica ossidata cosi ottenuta con l'aptene.
46. 46. Procedimento secondo la rivendicazione 45, in cui l'ossidazione è effettuata con un periodato inorganico, in acqua, a pH compreso fra 5,0 e 7,5, fra 10°C e 50°C, al riparo dalla luce; l'agente ossidante è in eccesso stechiometrico rispetto ai gruppi -OH della sostanza proteica, e a fine reazione il suo eccesso è eliminato per aggiunta di un eccesso molare di un alcool, alla temperatura di ossidazione; il trattamento della sostanza prtoeica ossidata con l'aptene è effettuato a pH alcalino, a temperature di 4°C/+40°C.
47. 47. Procedimento secondo la rivendicazione 45, in cui l'aptene è scelto fra neomicina, gentamicina, streptomicina e amfotericina.
48. 48. Derivato immunogeno come definito nelle rivendicazioni da 7 a 11.
49. 49. Derivato immunogeno ottenibile secondo i procedimenti delle rivendicazioni da 36 a 48, in cui la sostanza proteica è sieroalbumina bovina e l'aptene è il composto prescelto come aptene per il farmaco da eliminare dall'organismo.
50. 50. Uso di un derivato immunogeno come definito nelle rivendicazioni 48 o 49, nella preparazione di IgG attive come anticorpi specifici nei confronti di detti farmaci o metaboliti.
51. 51. Coniugato rappresentato da farmaco e/o metabolita marcato con un enzima, ottenibile secondo i procedimenti delle rivendicazioni da 36 a 48, in cui la sostanza proteica è un enzima e 1*aptene è il farmaco o metabolita da determinare.
52. 52. Coniugato come definito nella rivendicazione 34, 35 o 51, in cui il faramco o metabolita è come definito nelle rivendicazioni da 2 a 4 o 10. 53· Uso di un coniugato come definito nella rivendicazione 34, 35 o 52, come reattivo diagnostico per saggio ELISA di tipo competitivo.