KR100549557B1 - 알레르겐 조성물 - Google Patents

Abstract

티로신, 임의로 변형된 알레르겐 및 3-DMPL을 포함하는 약제 조성물로서, 알레르기의 예방 및 처리에 유용하다.

약제 조성물, 티로신, 변형된 알레르겐, 3-DMPL

Description

알레르겐 조성물{ALLERGEN FORMULATION}

본 발명은 알레르기 환자의 탈감치료에 사용되는 새로운 약제 조성물에 관한 것이다.

탈감 치료는 투여된 알레르겐에대해 특이한 면역학적 반응 변화를 가져오는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 변화들은 알레르기 증상의 치료와 회복에 도움이 되는 것으로 여겨지고 있다.

도움이되는 면역학적 변화들은 전체적으로 알려져 있지는 않다. 상승된 알레르겐 특이 IgG 항체 반응은 바람직한 치료 결과로 간주됨에도 불구하고, 현재 알레르겐에 대한 특이 T 림프구 반응의 몇몇 변화는 더욱 중요한 것으로 생각되어진다.

TH1 그리고 TH2와 같은, 2가지 부류의 T 세포는 다양한 전령 분자체들을 통해 다른 물질과 상호작용한다. 알레르기 환자에 있어서는 TH1 활성보다 큰 알레르겐 특이 TH2가 있는 것으로 보인다. 이것은 높은 알레르겐 특이 IgE 항체 수준 및 보다 큰 에오지노필 활성을 이끌 수 있다. 이러한 것들은 알레르기 신드롬의 중요한 2가지 요소이다.

위의 경우에서 TH2 활성보다 오히려 큰 알레르겐 특이 TH1이 있는 것으로의 상황 변화는 임상적으로 이로운 면역적 치료를 이끄는 중요한 요소로 여겨진다.

GB-A-1 377 -074에는 내부에 알레르겐이 분산된 티로신의 공침전물을 제조하는 방법이 기술되어있다.

GB-A-1 492 973에는 내부에 변형된 알레르겐이 분산된 티로신의 공침전물 제조방법이 기술되어있다. 상기 알레르겐은 글루타르알데히드와 같은 약제로 처리되어 변형되어 있는데, 글루타르알데히드는 분자내 교차 결합을 일으키고 변형되지 않은 알레르겐에 대하여 생성물의 알레르겐 활성을 감소시킨다.

3 de-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(이하 '3DMPL' 또는 'MPL' 이라한다.)는 GB 2220211(Ribi)에 의해 알려져 있다. 화학적으로 이것은 4, 5 또는 6 아실화 사슬과 3 de-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이며, Ribi Immonochen Montana에서 생산된다. 3 de-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 국제 특허 출원 번호 92/116556에 개시되어있다. 3-DMPL은 투여된 알레르겐의 특성들을 가르치는 TH2 보다 TH1을 증진시킬수 있는 물질 중 한 예이다.

본 발명에 따르면, 티로신, 선택적으로 변형된 알레르겐, 및 3-DMPL을 포함하여 구성되는 약제 조성물이 제공된다. 전형적으로 상기 알레르겐은 공침전이나 혼합등과 같은 방법에 의해 티로신으로 코팅되거나 그리고/또는 티로신에 흡착된다.

3-DMPL은 투여에 앞서 조성물의 다른 성분과 혼합될 수 있다. 선택적으로 제품 생 성동안 다른 성분과 함께 배합될 수 있다. 택일적으로, 다른 성분과 다른 위치나 시간에 투여될 수 있다. 투여는 비경구 및 경구를 포함하는 다수의 경로에 의할 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 의하면, 선택적으로 변형된 알레르겐, 및 3-DMPL을 알레르기에 민감한 환자에게 투여함을 포함하는 알레르기환자 처치방법을 제공한다.

나아가 본 발명의 다른 견지에 의하면 티로신, 선택적으로 변형된 알레르겐, 및 3-DMPL을 알레르기의 예방 또는 치료에 사용되는 의약품 조제를 위해 이용한다.

알레르겐은 꽃가루(예를들면, 두드러기쑥이나 자작나무 꽃가루와 같은), 음식물, 곤충의 독, 곰팡이, 동물의 털이나 집 먼지 진드기(D. farinae or D.pteronyssinus)와 같은 알레르기 원인 물질들로부터 유도될 수 있다. 여기서 사용되는 용어 "알레르겐(allergen)"은 하나의 알레르기 원인물질이나 하나 이상의 알레르기 유발물질로 부터 나온 알레르기 혼합물을 포함한다. 또한 예를 들어, 전체 합성에 의해, 알레르겐의 효소성 분해에의해, 혹은 기타 방법에 의해 생겨난 알레르겐 분절처럼, 하나 이상의 알레르겐 에피토프(epitopes)를 갖는 펩타이드를 포함한다.

알레르겐은 디알데히드, 특히 글루타르 알데히드와 같은 교차 결합제와 반응함으로서 임의로 변형되어질 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 본발명에 의한 약제 조성물의 제조방법을 제공하며, 그 방법은 (a) 교차 결합제와 반응하여 (임의적으로) 알레르겐을 변형시키는 단계, (b) 강산수용액내에서 티로신 용액과 상기 임의로 변형된 알레르겐 수용액을 혼합하는 단계, (c) 그 혼합물을 중화시킴으로서, 티로신과 변형된 알레르겐을 공침전시키는 단계, (d) 그 산물을 3-DMPL과 혼합하는 단계, 및 (e) 임의로, 생리적으로 수용가능한 운반제(carrier)를 첨가하는 단계, 를 포함한다.

적당한 생리적으로 수용가능한 운반제는 페놀-식염수와 멸균수가 포함된다.

전형적으로, 알레르겐은 수용액에서, pH 5-10, 전형적으로는 pH 7에서, 그리고 0-100℃ 온도에서, 통상적으로 4-37℃에서, 10시간 미만, 예를 들어 실온에서 약 2시간, 글루타르 알데히드같은 디알데히드로 처리하여 변형된다. 알레르겐과 글루타르알데히드의 비율은 전형적으로는 50:1-2:1; 예를 들어 약 10:1이다.

중간 산물은 동결건조되거나 다음단계에서 사용될 수 있다.

교차결합과정이나 혹은 고체의 용매화로부터 반응 혼합물로서 얻은, 전형적으로 pH7±1의 변형된 알레르겐 용액은 그후 강산수용액에서 티로신용액과 혼합된다. 상기 강산은 보통 무기산이며, 바람직하게는 염산이다. 이러한 단계에서 사용된 항원 용액은 전형적으로 0.1 - 1000㎍/ml의 알레르겐 단백질(예를 들면, 약 400㎍/ml)을 포함하고 있다. 혼합물내의 알레르겐과 티로신의 비율은 일반적으로 1:4 × 10⁵ ∼ 1:1 × 10²w/w의 범위이다.

알레르겐과 티로신 용액의 혼합물이 중화된다. 여기서 '중화'란 pH값을 4.0 ~ 7.5 범위로 조정함을 의미한다. 중화도중에는 용액 pH가 잠시라도, 최소 긴 시간동안은 7.5를 넘지않도록 조정하는 것이 중요하다. 이 조건은 용액을 강하게 교반하고 그리고 필요한 경우 오직 요구되는 양만의 염기를 사용하여 부합시킬 수 있다. 상기 혼합 및 중화 단계동안 pH 조절을 돕기위하여 여러 가지 완충제를 항원 용액에 첨가할 수 있다.

중화를 수행하는데 특히 유용한 방법은 티로신 용액과 중화 염기를 알레르겐 용액내로 분리하여 들어가게 하는 것이다. 첨가된 용액의 유속은 pH상태에 따라 조절된다. 즉, 반응 혼합물의 pH가 미리 결정된 수준으로 거의 일정하게 유지될 수 있도록 용액중 하나 혹은 양자 모두의 흐름을 제어하는 장치에의해 제어된다. 본 발명자들은 알레르겐(항원)의 성질에 따라 정확한 pH는 변화하지만, 최적의 결과들이 보통 pH6.5 - 7.5 범위내의 pH조절에서 얻어지는 것을 발견하였다.

중화 결과 아미노산은 즉시 침전되며, 그 내부 및/또는 그 위에서 항원 용액은 흡장되고 그리고/또는 흡수된다. 침전 후 혼합물은 즉시 세척되거나 세척하기 전에 몇 시간에서 하루 또는 이틀 정도의 기간동안 방치되어진다.

결과물인 침전물은 원심분리나 여과에 의해 용액으로부터 제거되며, 페놀-식염수 혹은 멸균수와 같이 생리학적으로 수용가능한 운반제내에 재부유되기전에 예를 들어 페놀-식염수와 같은 물질로 세척되어 3-DMPL과 조합하여 탈감치료에 사용하기 적당한 주입가능 조성물을 형성한다.

하기 제조 3 에 기술된 방법, 또는 초음파 처리에 의해 용해된 MPL은 알레르겐이나 변형된 알레르겐의 티로신 흡착물에 첨가하기 전에 다양한 수단으로 희석 될 수 있다. MPL의 제제는 초기에 전형적으로 ml당 0.5 - 4mg 사이의 농도로, 예를 들어 ml당 1mg 농도로 만들어진다. 이것은 500㎍/ml에서 20㎍/ml사이의 농도로, 바람직하게는 100㎍/ml 농도로 희석될 수 있다. 이러한 희석은 순수한 물, 또는 1 - 4%의 글리세롤, 바람직하게는 2% 글리세롤 수용액에서 수행될 수 있다. 이러한 희석물은 그후 위에서 기술된 대로 제조된 티로신 흡착 부유물에 첨가될 수 있다. 편의를 위해, MPL 용액과 티로신 흡착 부유물 농도는 주입을 위한 최종 생산물을 얻기 위해 거의 동등한 양의 부피가 얻어지도록 선택될 수 있다. 전형적인 최종 생성물은 약 100㎍/ml의 알레르겐(항원)과 약 250㎍/ml의 MPL을 포함한다.

[실시예]

이하 본 발명은 실시예에 따라 설명한다.

제조 1

투석(dialysis)이나 분획화(fractionation)에 의해 부분적으로 정제된 약 0.5mg/ml의 풀 꽃가루(grass pollen) 추출액의 중화용액은 동일 체적의 0.25%w/v 글루타르 알데히드를 첨가함으로서 화학적으로 변형되었으며, 실온에서 약 2시간동안 pH7에서 교반되었다. 상기 혼합물에 pH7±1에서 포스페이트 완충용액을 첨가하였다. 알 레르겐 용액 4 체적에 HCl내의 L-티로신(3.8M HCl 100ml에 24g의 L-티로신을 용해하여 제조됨) 1체적과 3.2M NaOH 1 체적을 동시에 첨가하고 강하게 교반하여 상기 항원액을 티로신과 함께 공침전시켰다. 이렇게 해서 형성된 부유액(서스펜션)은 원심분리되었으며, 완충 염수로 여러 번 세정하여 오염물을 제거하였으며 완충된 염수 pH6±1에서 원체적으로 재부유하였다.

상기 조성물과 함께 투여하기 적당한 3-DMPL을 하기 제조 3에 기술된 바에 따라 제조하였다.

제조 2

오발부민(XOA) 8mg을 EVANS 용액 20ml에 혼합하며 용해시켰다. 다음, 6.9ml의 포스페이트 완충제를 혼합하면서 첨가하였다. 그 용액을 자기교반기를 갖는 100ml 비이커에 장입하였다. 자기교반기로 교반하면서, 24% w/v 티로신을 함유한 3.2N NaOH 6.9ml과 3.8N HCl 6.9ml을 5분간에 걸쳐 동시에 적정 첨가하여 침전을 형성하였다. 그 혼합물을 5분 더 교반한 다음 50ml 원심분리 튜브에 옮겨져 2500 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝난후에 상층액은 비워지고 침전물은 40ml의 포스페이트 완충제에 재부유시켰다. 혼합물은 2500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝난후에 상층액은 비워지고 침전물은 포스페이트 완충제 40ml내에서 재부유되었다. 그 혼합물은 2500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리후 상층액을 제거하고 펠릿화된 침전물을 보존제로서 0.4% v/v 글리세롤과 0.01% w/v티메로잘을 함유한 포스페이트완충액 pH7.2 40ml에 재부유 시켰다. 최종 생성물은 티로신 흡착물 약 40mg/ml을 함유하였다. 그 티로신 흡착물에 XOA가 100% 결합하였다고 가정하면 XOA는 최종산물내에 200㎍/ml 농도로 있었다. XOA 티로신 흡착물은 필요할 때 까지 4℃에서 보관되었다.

제조 3

순수한 에탄올에 용해시킨 1.2-디팔미토일-SN-글리세로-3-포스포 콜린(DPPC) 용액 4mg/ml을 제조하였다. 용해되어질 MPLⓡ-TEA(트리에틸아민) 염 각각 1.0mg씩에 대하여, MPLⓡ을 용해하기위해 DPPC 27㎕를 첨가하였다. 에탄올은 유리병내에 N2를 천천히 불어넣음으로서 제거되었다. 다음에 피로겐이 없는 주사용물 1.0ml을 건조된 MPLⓡ/DPPC 혼합물 내의 MPLⓡ 각 mg에 대하여 첨가하였다. 그 용액은 투명하게 될 때까지 60 - 70℃에서 초음파 분쇄기에서 초음파처리 되었다. 그 다음에 MPLⓡ/DPPC 용액은 SFCA 290 - 4520 Nalgene 0.2㎛ 필터로 여과하여 필터 멸균되었다. MPLⓡ/DPPC 용액은 1.0mg/ml로 발열물질이 제거된 유리병에 무균적으로 분산되었으며, MPLⓡ-AF/(DPPC에 용해된 MPL)로 표기되어 4℃에서 보관되었다.

생물학적 활성

마우스내에서의 TH1 유도 활성을 IgG2a와 IgG2b 항체들의 생성물로 등식화시킬 수있으며, 그리고 TH2 유도 활성은 IgG1과 IgE 항체들로 등식화시켜 진다. 따라서, 실시예로서, 실험은 실험물로서 닭의 수정란에서 유도된 잘 알려진 음식 알레르겐인 알레르겐 오발부민(XOA)에 대한 알레르겐 특이 항체들의 프로파일을 보여주는 실험을 행하였다. MPL + XOA + 티로신으로 이루어진 배합물이 MPL + XOA, XOA + 티로신 또는 XOA 단독보다 보다 더 이익적인 항체 프로파일을 자극하였다는 것이 확인되었다.

6 - 8 주된 8마리의 BALB/c 암컷 마우스를 다음의 백신 중 한가지를 0.2ml씩 사타구니 부분에 피하주사로 주사되었다.

XOA + 티로신 상기 제조 2에서 제조된 XOA 티로신 흡착물을 주사전 30분 이내에 같은 양의 포스페이트 완충염수로 희석하였다.

XOA + 티로신 + MPL 상기 제조 2에서 제조된 XOA 티로신 흡착물을 주사전 30분이내에 포스페이트 완충염수에 500㎍/ml 수준으로 동일 체적의 MPLⓡ-AF로 희석하였다.

XOA + MPL XOA를 200㎍/ml으로 포스페이트 완충염수에 용해시키고, 주사전 30분 이내에 포스페이트 완충염수에서 500㎍/ml로 동일 체적의 MPLⓡ-AF로 희석되었다.

XOA 단독 XOA를 200㎍/ml수준으로 포스페이트 완충염수에 용해시키고, 동일체적의 포스페이트 완충 염수로 희석시켰다.

21일이 지난 후 4개 그룹의 마우스들은 새로이 제조된 백신 0.2ml로 추가 접종되었다. 접종 14일후, 마우스들의 혈액이 얻어졌으며 혈청은 분리되고, 검정될 때까지 -70℃에서 보관되었다.

혈청은 통상의 ELISA 기술에 의해 분석되었다. 재료는 Southern Biotechnology Inc.(Birmingham, AL, USA)로부터 구입한 양고추냉이가 결합된 염소 항 마우스 IgG1, IgG2a 그리고 IgG2b가 사용되었으며 제조회사의 지시에 따라 사용되었다. IgG1, IgG2a 그리고 IgG2b의 역가는 A₄₉₀에서 OD값이 0.1이상인 상호 혈청 희석을 나타낸다. 혈청 IgE 수준을 항-IgE 포획 ELISA를 이용하여, 그후 바이오틴화된 오발부민 탐침자를 이용하여 측정하였다. 결합된 수치는 양고추냉이가 결합된 스트렙토아비딘을 첨가한 다음에 측정되었다. 결과는 A₄₉₀에서 OD값으로 표기하였다.

결과

조성물	IgG1 역가	IgG2a 역가	IgG2b 역가	IgE OD값 (1/10희석시)
XOA + 티로신	102400	100	200	0.213
XOA + 티로신 + MPL	409600	102400	102400	0.104
XOA + MPL	102400	200	400	0.218
XOA 단독	6400	<100	<100	0.235
정상 마우스의 혈청	<100	<100	<100	0.095

특히 중요한 것은 알레르겐 + 티로신 + MPL의 조합이 다른 조합보다 항원 특이 IgE 항체를 덜 유도한다는 사실이다. 더욱이, IgG2a 또는 IgG2b의 IgG1 항체에대한 비율은 어떤 다른 마우스그룹에서보다 더 크며, 항원 + 티로신 + MPL이 주어진 마우 스 실험에서 보여진 최고 수준의 전의 2가지 항체 이소타이프에서 보다 크고 일정한 것이다. 이것은 다른 군의 마우스들에서 유도된 것과 비교했을 때 이 그룹에서는 TH2 세포 유도보다 TH1세포 유도의 비가 좋다는 것을 나타낸다.

본 발명은 알레르게의 예방 및 치료에 유용하다.

Claims (5)

1. 티로신, 알레르겐 또는 알레르겐 추출물, 및 3-DMPL을 포함하며 TH₂ 반응에 비하여 TH₁ 반응을 선택적으로 증가시킬 수 있는 약제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 알레르겐은 티로신으로 코팅되거나 그리고/혹은 티로신에 흡착되어있음을 특징으로하는 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. (a) 교차 결합제와 반응시켜 알레르겐을 (임의로) 변형시키는 단계, (b) 강산수용액에서 티로신용액과 상기 임의로 변형된 알레르겐 수용액을 혼합시키는 단계, (c)상기 용액 혼합물을 중화시켜 티로신과 변형된 알레르겐을 공침전시키는 단계, (d) 그 산물과 3-DMPL을 혼합하는 단계, 및 (e) 임의로 생리학적으로 수용가능한 운반제를 첨가하는 단계, 를 포함하는 청구항 1 또는 2에의한 조성물 제조 방법.