ES2218819T3 - Formulacion alergenica. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una composición farmacéutica que incluye tirosina, un alérgeno modificado opcional, y 3-DMPL, que es útil en la prevención y tratamiento de la alergia.

Description

Formulación alergénica.

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones para su utilización en la terapia de desensibilización de los pacientes alérgicos.

Es sabido que la terapia de desensibilización da lugar a un cambio en la respuesta inmunológica, que es específica para los alérgenos administrados. Dichos cambios se consideran responsables de los efectos beneficiosos del tratamiento y de la mejoría de los síntomas alérgicos.

Los cambios inmunológicos responsables de este efecto beneficioso, no han sido completamente entendidos. Aunque una respuesta elevada del anticuerpo IgG específico para el alérgeno se considera como un resultado deseable de la terapia, se cree ahora que ciertos cambios en la respuesta de las células T específicas (linfocitos T) para el alérgeno, son más importantes.

Dos subtipos de células T, TH1 y TH2, interaccionan entre ellas mediante varias moléculas mensajeras. En un individuo alérgico parece que existe una actividad alergénica específica de TH2 mayor que la de TH1. Esto puede conducir a un alto nivel del anticuerpo IgE específico para el alérgeno y a una actividad eosinofílica mayor. Estos constituyen dos componentes importantes del síndrome alérgico.

Un cambio en la situación anterior a una en la que exista una actividad alergénica TH1 específica mayor que la de TH2, se cree que puede constituir un componente importante de la inmunoterapia que conduce a un beneficio clínico.

El documento GB-A-1 377 074 describe un procedimiento para preparar coprecipitados de tirosina con un alérgeno disperso en ella.

El documento GB-A-1 492 973 describe un procedimiento para la preparación de coprecipitados de tirosina con un alérgeno modificado disperso allí. El alérgeno se ha modificado mediante tratamiento con un agente tal como glutaraldehído, que causa reticulación intramolecular y reduce la alergenicidad del producto respecto al alérgeno no modificado.

El documento WO 9634626 da a conocer una composición farmacéutica que comprende tirosina y un alérgeno polimerizado (modificado opcionalmente).

El lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado (en lo sucesivo, 3-DMPL o "MPL") se conoce a partir de GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla del lípido A 3 monofosforilo De-O-acilado con cadenas 4, 5 ó 6 aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem Montana. Una forma preferida del lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado se da a conocer en la Solicitud de Patente Internacional nº 92/116556. El 3-DMPL es un ejemplo de sustancia que puede potenciar las propiedades de predominio de TH1 sobre TH2, de los alérgenos administrados.

Según la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende tirosina, un alérgeno opcionalmente modificado, y 3-DMPL. Típicamente, el alérgeno está revestido con y/o adsorbido en tirosina, por ejemplo, mediante coprecipitación o mezclado.

El 3-DMPL puede mezclarse con los otros componentes de la composición antes de la administración. Alternativamente, puede formularse junto con los otros componentes durante la fabricación del producto. Alternativamente, puede administrarse en un sitio o tiempo diferente que los otros componentes. La administración puede realizarse a través de diversas vías incluyendo la parenteral y la enteral.

Otro aspecto de la invención proporciona, de este modo, un procedimiento para el tratamiento de un paciente que sea susceptible a la alergia, comprendiendo dicho procedimiento la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de tirosina, de un alérgeno opcionalmente modificado, y de 3-DMPL.

Otro aspecto de la invención proporciona la utilización de tirosina, de un alérgeno opcionalmente modificado y de 3-DMPL, en la preparación de un medicamento para utilizarlo en la prevención o tratamiento de la alergia.

El alérgeno puede derivarse de cualquier sustancia que provoque alergia, tal como polen (de ambrosía o de abedul), alimentos, venenos de insectos, hongos, pelo de animales, o ácaros del polvo de la casa (D. farinae o D. pteronyssinus). Tal como se utiliza en la presente memoria, "alérgeno" incluye una mezcla de alérgenos que pueden provenir de uno o varios orígenes. El término "alérgeno" incluye también péptidos que contienen uno o más epítopos de un alérgeno, tales como fragmentos de alérgeno, preparados mediante síntesis total, mediante degradación enzimática de los alérgenos, o mediante otros medios.

El alérgeno se modifica opcionalmente haciéndolo reaccionar con un agente de reticulación tal como un dialdehído, más particularmente glutaraldehído.

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica según la invención, comprendiendo dicho procedimiento (a) modificar opcionalmente un alérgeno haciéndolo reaccionar con un agente de reticulación, (b), mezclar una solución acuosa del alérgeno opcionalmente modificado con una solución de tirosina en un ácido fuerte acuoso, (c) neutralizar de la mezcla de soluciones, coprecipitando por ello tirosina y el alérgeno modificado, (d) mezclar el producto con 3-DMPL, y (e) opcionalmente, añadir un transportador fisiológicamente aceptable.

Entre los transportadores fisiológicamente apropiados se incluyen solución salina fenólica y agua estéril.

Típicamente, el alérgeno se modifica mediante tratamiento con un dialdehído tal como glutaraldehído, en solución acuosa a un pH de entre 5 y 10, típicamente alrededor de 7, y a una temperatura de entre 0 y 100ºC, más habitualmente entre 4 y 37ºC, durante hasta 10 horas, por ejemplo, dos horas aproximadamente a temperatura ambiente. La proporción de alérgeno a glutaraldehído es típicamente del orden de 50:1 a 2:1, por ejemplo de 10:1 aproximada-
mente.

El intermediario puede ser liofilizado o utilizado en la próxima etapa.

Una solución del alérgeno modificado, típicamente a un pH de 7 \pm 1, obtenida como mezcla reactiva a partir del procedimiento de reticulación o a partir de la solvatación de un sólido, se mezcla entonces con una solución de tirosina en un ácido fuerte acuoso. El ácido fuerte es habitualmente un ácido inorgánico, preferentemente ácido clorhídrico. La solución del alérgeno utilizada en esta etapa contiene típicamente entre 0,1 \mug/ml y 1000 \mug/ml de proteína alergénica, por ejemplo, 400 \mug/ml. La proporción del alérgeno: tirosina en la mezcla es típicamente del orden de 1:4 x 10^{5} a 1:1 x 10^{2} peso/peso.

La mezcla resultante de las soluciones del alérgeno y de la tirosina, se neutraliza. "Neutralización" se refiere a un ajuste del pH a un valor del orden de 4,0 a 7,5. Es importante que durante la neutralización, el pH de la solución nunca, o por lo menos, durante un tiempo no demasiado prolongado, se eleve de modo apreciable por encima de 7,5. Esta condición puede cumplirse mediante una agitación vigorosa de la solución y utilizando sólo la cantidad requerida de base, si se desea. Varios agentes tampón pueden añadirse de modo útil a las soluciones del alérgeno para que ayuden en el control del pH durante las etapas de mezclado y neutralización.

Un procedimiento particularmente útil de llevar a cabo la neutralización es que las corrientes separadas de la solución de tirosina en ácido y de la base neutralizante sean procesadas en la solución del alérgeno. Las velocidades del flujo de las soluciones que se añadieron están controladas por el estado del pH, es decir, mediante el equipo que regula el flujo de una o de las dos soluciones, de forma que el pH de la mezcla reactiva permanezca sustancialmente constante en un nivel predeterminado. Se encontró que habitualmente se obtienen resultados óptimos mediante un control del pH del orden de 6,5 a 7,5, aunque el pH exacto puede variar según la naturaleza del alérgeno.

El resultado de la neutralización es la precipitación inmediata de la tirosina, en el interior de y/o sobre la cual el alérgeno es ocluido y/o adsorbido. Después de la precipitación, la mezcla se lava inmediatamente, o se la deja reposar durante un período de entre algunas horas a un día o dos, antes de lavarla.

El precipitado resultante puede ser eliminado de la solución mediante centrifugación o filtración, y lavarse, por ejemplo, con solución salina fenólica, antes de volver a suspenderse en un transportador fisiológicamente aceptable tal como la solución salina fenólica, o el agua esterilizada, para producir una composición inyectable apropiada para utilizar en la terapia de desensibilización en combinación con 3-DMPL.

El MPL, que se disolvió mediante el procedimiento descrito en la Preparación 3 que se menciona a continuación, o mediante tratamiento con ultrasonidos, puede ser diluido mediante varios medios antes de añadirlo a adsorbatos de tirosina de alérgenos o de alérgenos modificados. La preparación de MPL se realiza inicialmente a una concentración, típicamente, de entre 0,5 mg por ml y 4 mg por ml, por ejemplo 1 mg por ml. Puede diluirse hasta una concentración de entre 500 \mug por ml y 20 \mug por ml, preferentemente hasta 100 \mug por ml, aproximadamente. Esta dilución puede llevarse a cabo en agua pura, o en una solución de glicerol acuoso que contenía entre 1% y 4%, preferentemente el 2% de glicerol. Dichas diluciones pueden añadirse entonces a una suspensión del adsorbato de tirosina preparado tal como se ha descrito anteriormente. Por conveniencia, la concentración de la solución de MPL y la suspensión de adsorbato de tirosina, respectivamente, pueden seleccionarse, de forma que de cada uno de ellos se mezclen volúmenes aproximadamente iguales para obtener el producto final inyectable. Un producto final típico contiene 100 \mug por ml de alérgeno, aproximadamente y alrededor de 250 \mug por ml de MPL.

El Ejemplo siguiente ilustra la presente invención:

Preparación 1

Una solución neutra de 0,5 mg/ml aproximadamente de extracto de polen de césped que se había purificado parcialmente mediante diálisis o fraccionamiento, se modificó químicamente añadiendo un volumen igual de glutaraldehído al 0,25% peso/vol, agitándose la mezcla durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. A la mezcla anterior se añadió una solución de tampón fosfato a un pH de 7 \pm 1. La solución alergénica se coprecipitó con tirosina mediante la adición simultánea de un volumen de L-tirosina en HCl (preparado disolviendo 24 g de L-tirosina hasta 100 ml con 3,8 M HCl) y un volumen de 3,2 M NaOH, a cuatro volúmenes de solución del alérgeno, con agitación vigorosa. La suspensión así formada se centrifugó, se lavó repetidamente con solución salina tamponada para eliminar contaminantes y se volvió a suspender en el volumen original en una solución salina tamponada de pH 6 \pm 1.

El 3-DMPL apropiado para la coadministración con la formulación anterior, se preparó tal como se describe en la Preparación 3 a continuación.

Preparación 2

Ocho mg de ovoalbúmina (XOA) se disolvieron mezclándolos en 20 ml de solución EVANS. A continuación, se añadieron, mezclando, 6,9 ml de tampón fosfato. La solución se dispuso en una cubeta de precipitación de 100 ml que contenía una varilla de agitación magnética. Mientras se mezclaba utilizando una varilla de agitación magnética, 6,9 ml de 3,2N NaOH y 6,9 ml de 3,8 N de HCl que contenían 24% de tirosina peso/vol, se añadieron simultáneamente, gota a gota, durante un tiempo de 5 minutos, para formar un precipitado. Se dejó que la mezcla se agitara durante otros 5 minutos, transfiriéndose entonces a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 2500 rpm. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el precipitado se volvió a suspender en 40 ml de tampón fosfato. La mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 2500 rpm. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el precipitado que se había sedimentado se volvió a suspender en 40 ml de solución salina tampón fosfato, pH 7,2 que contenía glicerol al 0,4% vol/vol y timerosal al 0,01% peso/vol como conservante. El producto final contenía aproximadamente 40 mg/ml de adsorbato de tirosina. Asumiendo una unión del 100% de XOA al adsorbato de tirosina, el XOA se encontraba a 200 \mug/ml en el producto final. El adsorbato XOA-tirosina se guardó a 4ºC hasta que se necesitó.

Preparación 3

Se preparó una solución de 4 mg/ml de 1,2-dipalmitoil-SN-glicero-3-fosfocolina (DPPC) en etanol absoluto. Para cada 1,0 mg de la sal MPL®-TEA que iba a ser solubilizada, se añadieron 27 \mul de DPPC para disolver el MPL^{R}. El etanol se eliminó inyectando suavemente una corriente de N_{2} en el vial. A continuación, se añadió 1,0 ml de agua para inyección, libre de pirógenos, para cada mg de MPL® en la mezcla seca MPL®/DPPC. La solución se trató con ultrasonidos en un somicador de baño a 60-70ºC hasta que quedó aclarada. La solución MPL®/DPPC se esterilizó mediante filtración a través de un filtro de 0,2 \mum SFCA 290-4520 Nalgene. La solución MPL®/DPPC se repartió asépticamente a 1,0 mg/ml en viales libres de pirógenos, marcados con MPL®-AF, y guardados a 4ºC.

Actividad biológica

La actividad inductora de TH1 en los ratones puede equipararse con la producción de anticuerpos IgG2a e IgG2b y la actividad inductora de TH2 con la producción de los anticuerpos IgG1 e IgE.

Por tanto, como ejemplo, se llevó a cabo un experimento en ratones para demostrar los perfiles de los anticuerpos específicos del alérgeno respecto a un alérgeno ejemplar de ovoalbúmina (XOA) que es un alérgeno alimentario bien conocido derivado de los huevos de pollo. Se confirmó que una formulación compuesta por MPL+XOA+tirosina estimuló un perfil más ventajoso de anticuerpo que MPL+XOA, XOA+tirosina o XOA sólo.

Grupos de 8 ratones hembra BALB/c, de 6-8 semanas de edad, fueron inyectados subcutáneamente en el área inguinal con 0,2 ml de una de las siguientes vacunas:

XOA+Tirosina: El adsorbato de XOA tirosina preparado en la Preparación 2 anterior se diluyó con un volumen igual de solución salina tamponada de fosfato en los 30 minutos anteriores a la inyección.

XOA+Tirosina+MPL: El adsorbato de XOA tirosina preparado en la Preparación 2 anterior se diluyó con un volumen igual de MPL®-AF a una dosis de 500 \mug/ml en una solución salina tamponada de fosfato en los 30 minutos anteriores a la inyección.

XOA+MPL: XOA se disolvió en una solución salina tamponada de fosfato a una dosis de 200 \mug/ml y se diluyó con un volumen igual de MPL®-AF a una dosis de 500 \mug/ml en una solución salina tamponada de fosfato en los 30 minutos anteriores a la inyección.

XOA sólo: XOA se disolvió a una dosis de 200 \mug/ml en una solución salina tamponada de fosfato y se diluyó con un volumen igual de una solución salina tamponada de fosfato. Veintiún días después, los cuatro grupos de ratones se revacunaron con 0,2 ml de vacunas recién preparadas. Catorce días después de la revacunación, los ratones se sometieron a sangrado y los sueros se separaron y guardaron a -70^{0}C hasta que se llevó a cabo el ensayo.

Los sueros se ensayaron mediante una técnica convencional ELISA utilizando anticuerpos IgG_{1}, IgG_{2a}, e IgG_{2b} anti-ratón de cabra conjugados a rábano obtenidos en Southern Biotechnology, Inc. (Birmingham, AL) y utilizados según las instrucciones del fabricante. Los títulos de IgG_{1}, IgG_{2a}, e IgG_{2b} representan la dilución recíproca del suero que da lugar a una lectura de > 0,1 unidades OD a A_{490}. Los niveles séricos de IgE se midieron utilizando un ELISA de captura anti-IgE seguido por la utilización de una sonda de ovoalbúmina biotinilada. La unión se midió después de añadir una preparación de estreptavidina conjugada a rábano. Los resultados se señalan como unidades OD a A_{490}.

Resultados

Formulación	titulación	titulación	titulación	dilución IgE OD a 1/10
	IgG1	IgG2	IgG2b
XOA+tirosina	102400	100	200	0,213
XOA+tirosina+MPL	409600	102400	102400	0,104
XOA+MPL	102400	200	400	0,218
XOA sólo	6400	<100	<100	0,235
Valores normales de suero de ratón	<100	<100	<100	0,095

De particular importancia es el hecho de que la combinación de alérgeno+tirosina+MPL induzca menos anticuerpos IgE específicos alergénicos que las otras combinaciones. Además, la proporción de IgG2a ó IgG2b a los anticuerpos IgG1 es mayor y está de acuerdo con los niveles más elevados de los isotipos de los dos anticuerpos anteriores, isotipos que se apreciaron en el experimento en el que se administró alérgeno+tirosina+MPL a un grupo de ratones, que en cualquier otro grupo de estos animales. Esto indica que en este grupo murino tiene lugar una relación de inducción de las células TH1 respecto a la de las células TH2 que es mejor que la inducida en los otros grupos de ratones.

Claims (4)

1. Composición farmacéutica que comprende tirosina, un alérgeno opcionalmente modificado, y lípido A monofosforilo 3-de-O-acilado.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el alérgeno está revestido con y/o adsorbido sobre la tirosina.

3. Utilización de tirosina, de un alérgeno opcionalmente modificado y del lípido A monofosforilo 3-de-O-acilado en la preparación de un medicamento para ser utilizado en la prevención o tratamiento de la alergia.

4. Procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, comprendiendo dicho procedimiento (a) (opcionalmente) modificar un alérgeno mediante reacción con un agente de reticulación, (b) mezclar una solución acuosa del alérgeno opcionalmente modificado con una solución de tirosina en un ácido fuerte acuoso, (c) neutralizar la mezcla de soluciones, coprecipitando por ello la tirosina y el alérgeno modificado, (d) mezclar el lípido A monofosforilo 3-de-O-acilado y (e) opcionalmente, añadir un transportador fisiológicamente aceptable.