PT1758558E

PT1758558E - Microesferas contendo oligonucleótidos, sua utilização para o fabrico de um medicamento para o tratamento de diabetes do tipo 1

Info

Publication number: PT1758558E
Application number: PT57496747T
Authority: PT
Inventors: Terrence L Scott; Deborah Lafreniere; Nick Giannoukakis; Vered Bisker-Lieb; Larry L Brown; Jennifer Machen
Original assignee: Baxter Healthcare Sa; Baxter Int; Univ Pittsburgh
Priority date: 2004-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2013-12-05
Also published as: CN103432079A; AU2005244851A1; ES2442115T3; US20060024240A1; US7884085B2; JP5457414B2; WO2005112885A2; AU2005244851B2; EP1758558B1; DK1758558T3; CA2566199A1; MXPA06012989A; CA2566199C; WO2005112885A3; US20100260855A1; US9115357B2; JP2007537288A; JP2011256204A; EP1758558A2

Description

ΕΡ 1 758 558/ΡΤ DESCRIÇÃO "Microesferas contendo oligonucleótidos, sua utilização para o fabrico de um medicamento para o tratamento de diabetes do tipo 1"

Anterioridade da Invenção

Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente à entrega em microesferas de AS-oligonucleótidos de acordo com a reivindicação 1 para induzir tolerância de células dendriticas, particularmente no modelo de ratinho diabético não obeso (NOD, do inglês "non-obese-diabetic"). Mais particularmente, a invenção refere-se à tecnologia de entrega de fármacos por meio de microesferas que são fabricadas utilizando condições totalmente aquosas, em que as microesferas incorporam oligonucleótidos anti-sentido (AS). Estas microesferas são utilizadas para uma abordagem anti-sentido para prevenir uma condição de diabetes auto-imune em ratinhos NOD in vivo e in situ.

Anterioridade da Invenção

Micropartículas, microesferas e microcápsulas são partículas sólidas ou semi-sólidas possuindo um diâmetro inferior a um milímetro, mais preferivelmente inferior a 100 mícrones, que podem ser formadas de uma variedade de materiais, incluindo polímeros sintéticos, proteínas e polissacáridos. As microesferas têm sido utilizadas em muitas aplicações diferentes, principalmente separações, diagnósticos e entrega de fármacos.

Podem ser utilizadas várias técnicas diferentes para preparar estas microesferas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturais, proteínas e polissacáridos, incluindo separação de fases, evaporação de solventes, emulsão e secagem por pulverização. Geralmente os polímeros formam a estrutura de suporte destas microesferas, e o fármaco de interesse é incorporado na estrutura polimérica. Os exemplos de polímeros utilizados para a formação de microesferas incluem 2 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ homopolímeros e copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico (PLGA) como descrito na Pat. U.S. 5,213,812 de Ruiz, Pat. U.S. 5,417,986 de Reid et al., Pat. U.S. 4,530,840 de Tice et al., Pat. U.S. 4, 897,268 de Tice et al., Pat. U.S. 5,075, 109 de Tice et al., Pat. U.S. 5, 102, 872 de Singh et al., Pat. U.S. 5,384,133 de Boyes et al., Pat. U.S. 5,360,610 de Tice et al,, e na Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 248,531 de Southern Research Institute; copolímeros de blocos tais como tetronic 908 e poloxamer 407 como descrito na Pat. U.S. 4,904,479 de Illum; e polifosfazenos como descrito na Pat. U.S. 5,149,543 de Cohen et al. As microesferas produzidas utilizando polímeros tais como estes exibem uma fraca eficiência de carregamento e são frequentemente apenas capazes de incorporar uma pequena percentagem do fármaco de interesse na estrutura polimérica. Portanto, têm frequentemente que ser administradas quantidades substanciais de microesferas para se conseguir um efeito terapêutico.

Contas ou partículas esféricas têm estado comercialmente disponíveis como ferramenta para os bioquímicos desde há muitos anos. Por exemplo, anticorpos conjugados com contas criam partículas relativamente grandes específicas para ligandos particulares. As grandes partículas revestidas com anticorpo são rotineiramente utilizadas para ligação cruzada a receptores na superfície de uma célula para activação celular, são ligadas a uma fase sólida para purificação por imunoafinidade, e podem ser utilizadas para entregar um agente terapêutico que é libertado lentamente ao longo do tempo, utilizando anticorpos específicos de tecidos ou de tumores conjugados com as partículas para direccionar o agente para o local pretendido.

Uma desvantagem das micropartícuias ou contas presentemente disponíveis é que são difíceis e dispendiosas de produzir. As micropartícuias produzidas por estes métodos conhecidos têm uma ampla distribuição de tamanhos de partícula, frequentemente falta-lhes uniformidade e não exibem cinéticas de libertação de longo prazo quando a concentração de ingredientes activos é elevada. Adicionalmente, os polímeros utilizados nestes métodos conhecidos são dissolvidos em solventes orgânicos para formar as microparticulas. Têm portanto que ser produzidas em instalações especiais 3 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ desenhadas para manipular solventes orgânicos. Estes solventes orgânicos podem desnaturar proteínas ou péptidos contidos nas micropartículas. Os solventes orgânicos residuais podem ser tóxicos quando administrados a seres humanos ou animais.

Em adição, as micropartículas disponíveis raramente têm um tamanho suficientemente pequeno para caberem numa abertura do tamanho da agulha vulgarmente utilizada para administras terapêuticas ou para serem úteis para administração por inalação. Por exemplo, as micropartículas preparadas utilizando poli-ácido láctico-glicólico (PLGA) são grandes e têm uma tendência para agregar. É necessário um passo de selecção de tamanhos, que resulta em perdas de produto, para remover as partículas demasiado grandes para injecção. As partículas de PLGA que têm um tamanho adequado para injecção têm que ser administradas através de uma agulha de grande calibre para acomodar o grande tamanho de partículas, frequentemente causando desconforto para o paciente.

Geralmente, muitas micropartículas actualmente disponíveis são activadas para libertar os seus conteúdos em meios aquosos e portanto têm que ser liofilizadas para prevenir a libertação prematura. Em adição, partículas tais como as que são preparadas utilizando o sistema PLGA exibem cinéticas de libertação baseadas tanto na erosão como na difusão. Neste tipo de sistemas observa-se uma erupção ou rápida libertação inicial do fármaco. Este efeito de erupção pode resultar em efeitos secundários indesejados nos pacientes a quem as partículas foram administradas. São conhecidas micropartículas preparadas utilizando lípidos para encapsular fármacos-alvo. Por exemplo, lípidos dispostos em membranas de bicamada que circundam múltiplos compartimentos aquosos para formar partículas podem ser utilizados para encapsular fármacos solúveis em água para subsequente entrega como descrito na Pat. U.S. 5,422,120 de Sinil Kim. Estas partículas tê tamanhos geralmente superiores a 10 mícrones e são desenhadas para administração intra-articular, intratecal, subcutânea e epidural. Alternativamente, têm sido utilizados lipossomas para entrega intravenosa de moléculas pequenas. Os lipossomas são partículas esféricas compostas por uma única, ou múltiplas 4 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ bicamadas de fosfolípidos e de colesterol. Os lipossomas têm tamanhos de 30 mícrones ou mais e podem transportar uma variedade de fármacos solúveis em água ou solúveis em lípidos. A tecnologia dos lipossomas tem sido dificultada por problemas incluindo a pureza dos componentes lipídicos, a possível toxicidade, a heterogeneidade e estabilidade das vesículas, e dificuldades excessivas na assimilação e fabrico ou prazo de validade.

Um objectivo para a comunidade médica é a entrega de ácidos nucleicos às células num animal para tratamento da diabetes. Por exemplo, podem ser entregues ácidos nucleicos a células em cultura (in vitro) de modo relativamente eficiente, mas as nucleases resultam numa elevada taxa de degradação do ácido nucleico quando o ácido nucleico é entregue a animais (in vivo) .

Em adição à protecção do ácido nucleico contra a digestão por nucleases, um veículo de entrega de ácido nucleico tem que exibir baixa toxicidade, tem que ser eficientemente assimilado pelas células e ter uma formulação bem definida, facilmente fabricada. Como mostrado em ensaios clínicos, os vectores virais para entrega podem resultar in vivo numa resposta imunitária gravemente adversa, mesmo fatal. Em adição, este método tem o potencial de ter efeitos mutagénicos in vivo. A entrega por encerramento do ácido nucleico em complexos lipídicos de diferentes formulações (tais como lipossomas ou complexos de lípidos catiónicos) tem sido geralmente ineficaz in vivo e pode ter efeitos tóxicos. Complexos de ácidos nucleicos com vários polímeros ou com péptidos têm apresentado resultados inconsistentes e a toxicidade destas formulações ainda não foi resolvida. Os ácidos nucleicos também foram encapsulados em matrizes poliméricas para entrega, mas nestes casos as partículas têm uma ampla gama de tamanhos e a eficácia para aplicações terapêuticas ainda não foi demonstrada.

Portanto, existe a necessidade de3 abordar questões de entrega de ácidos nucleicos, e existe presentemente uma necessidade de desenvolvimento de microesferas e de novos métodos para a preparação de microesferas. Encontram-se detalhes relativos a microesferas nas Patentes US 6,458,387 de 5 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ

Scott et ãl.r 6,268,053, 6,090,925, 5,981,719 e 5,599,719 de Woiszwillo et al., e 5,578,709 de Woiszwillo. Estas e todas as referências aqui identificadas são aqui incorporadas por referência. US 6,458,387 e WE 2003/059474 referem-se a métodos para a formação de microesferas de libertação sustentada. Estas microesferas possuem uma superfície lisa que inclui uma pluralidade de aberturas de canais com diâmetros inferiores a 1000 angstroms. US 6,268,053 refere-se a microparticulas, métodos de produção e métodos de utilização destas micropartícuias. As macromoléculas são misturadas com um polímero solúvel ou uma mistura de polímeros solúveis, tais como polímeros lineares ou ramificados a um pH próximo do ponto isoeléctrico da macromolécula na presença de uma fonte de energia, tal como calor, por um período de tempo predeterminado. As microparticulas podem ser preparadas para exibir cinéticas de libertação de curto prazo ou de longo prazo, desse modo proporcionado uma libertação rápida ou sustentada das macromoléculas. WO 00/41679 refere-se a microesferas de 0,005-50 mícrones, mais preferivelmente inferiores a 5 mícrones. Estas microesferas compreendem ácidos nucleicos (oligonucleótidos, ADN) num teor de 20 ou 30 ou 40 ou 50 porcento em peso, e preferivelmente gelatina ou quitosano ou polissacáridos. Tipicamente, podem ser conseguidas eficiências de carregamento de ácidos nucleicos em microesferas superiores a 95%. Adicionalmente são incluídos policatiões, que podem incluir polilisina, poli-lisina-poli-arginina, poliarginina ou protamina. A preparação farmacêutica é injectada por via intramuscular ou subcutânea, também intravenosa, intra-arterial, intra-peritoneal, intratecal. As formulações contendo nucleótidos ou oligonucleótidos podem ser dirigidas para as células dos ilhéus de Langerhans como células de direccionamento. US 2004/014698 refere-se a uma composição para distribuição disseminada, expressão sistemática e entrega sustentada de um agente terapêutico e a um processo para 6 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ administração de uma agente terapêutico através de uma via gastrointestinal natural. Mais particularmente, o pedido divulga uma composição para a administração de terapia génica oral e um processo para a sua produção e utilização. WO 94/18947 refere-se a um complexo protamina-ADN de elevada pureza, produzido através de um processo consistindo essencialmente nos passos sequenciais de recolha e tratamento de uma nucleoprotamina a partir de um estádio de desenvolvimento de uma forma de vida por homogeneização numa solução aquosa salina tamponada para obter uma mistura, remoção da matéria insolúvel da mistura resultante dos referidos passos de recolha e tratamento, isolamento da proteina e remoção de lípidos da mistura através de uma extracção com clorofórmio aquoso, realização de diálise da proteina contra água estéril, para remover o sal em excesso, reconstituição da proteina com ADN heterogéneo de um tecido alvo, e esterilização por filtração para obter um complexo protamina aquosa-ADN. É igualmente divulgado um método de tratamento de um ser humano possuindo um tumor compreendendo a administração de uma quantidade eficaz para o tratamento do tumor do produto da invenção ao referido ser humano e um método de tratamento de um ser humano possuindo a síndrome da imunodeficiência adquirida compreendendo a administração de uma quantidade eficaz para o tratamento da síndrome de imunodeficiência do produto da invenção ao referido ser humano. US 2002/0146459 refere-se a novas composições compreendendo microesferas e/ou nanoesferas contendo agentes bioactivos polianiónicos condensados, tais como ADN. O agente bioactivo polianiónico nas microesferas e/ou nanoesferas é condensado utilizando um agente de condensação policatiónico, tal como poli-L-lisina. São igualmente divulgados métodos para a produção das microesferas e/ou nanoesferas contendo agentes bioactivos polianiónicos condensados. US 6 475 995 refere-se a um método de eliciação de uma resposta imunitária num mamífero contra um antigénio, compreendendo a administração oral de uma formulação imunogénica compreendendo uma nanopartícula sólida inferior a 5 pm compreendendo um coacervato de um policatião polimérico e 7 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ um polianião, em que o policatião polimérico é seleccionado do grupo que consiste em gelatina e quitosano, e em que o polianião consiste em ácidos nucleicos que codificam um antigénio, pelo que o antigénio é expresso e elicia uma resposta imunitária no mamifero. US 5 858 973 refere-se a um novo polipéptido recombinante que transactiva o promotor da somatostatina, estando o polipéptido presente em células dos duetos pancreáticos e não estando presente em células alfa pancreáticas, sendo o polipéptido codificado por um gene que codifica uma proteína da ordem de 31 kd.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, microesferas compreendendo oligonucleótidos direccionados para ligarem transcritos primários seleccionados do grupo que consiste em transcritos primários de CD40, CD80 e CD86 e suas combinações, em que os oligonucleótidos infra-regulam ou suprimem in vivo a expressão de CD40, CD80 e/ou CD86, e em que os oligonucleótidos constituem mais do que 30 porcento em peso das microesferas com base no peso total das microesferas, as referidas microesferas possuindo um tamanho médio de partícula não superior a 50 míerones sendo destinadas a entrega a células dendríticas. Crê-se que esta abordagem de entrega previne o acesso das nucleases dos ácidos nucleicos no interior da microesfera. A entrega de microesferas destes AS-oligonucleótidos é realizada de modo a induzir tolerância de células dendríticas, particularmente no modelo de ratinho NOD. As microesferas são fabricadas utilizando condições aquosas, em que as microesferas incorporam oligonucleótidos anti-sentido (AS) . Estas microesferas são utilizadas para inibir a expressão génica e prevenir uma condição de diabetes auto-imune em ratinhos NOD in vivo e in situ.

Num aspecto preferido da invenção, são sintetizados três AS-oligonucleótidos direccionados para os transcritos primários de CD40, CD80 e CD86, e é preparada uma solução aquosa da mistura de oligonucleótidos e é combinada com uma 8 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ solução de polímero. Após processamento, são proporcionadas microesferas contendo os oligonucleótidos, e estas são entregues aos ratinhos NOD.

Estes e outros aspectos, objectos, características e vantagens da presente invenção, incluindo as várias combinações, serão evidentes e claramente entendidos por consideração da seguinte descrição detalhes.

Breve Descrição dos Desenhos

Ao longo da presente descrição, será feita referência aos desenhos anexos, em que: A Fig. 1 é uma ilustração esquemática do papel de células dendríticas na destruição auto-imune de células beta pancreáticas produtoras de insulina na Diabetes do tipo 1; A Fig. 2 é um diagrama do vector plasmídico contendo o gene da Beta-Galactosidase; A Fig. 3 mostra fotomicrografias que proporcionam evidência da transfecção de células fibroblastos NIH 3T3 com as microesferas com o ADN plasmídico; A Fig. 4 é uma fotomicrografia de electroforese em gel de agarose de ADN plasmídico nu e de duas formulações de microesfera com ADN plasmídico de acordo com a invenção, cada uma após exposição a ADNase; A Fig. 5 é um gráfico de barras da actividade de Beta-Galactosidase em quatro diferentes aplicações de ADN plasmídico. A Fig. 6 é uma micrografia electrónica de varrimento de microesferas de AS-oligonucleótidos e policatião de poli-L-lisina; A Fig. 7 é uma micrografia electrónica de varrimento de microesferas de AS-oligonucleótidos e policatião de poli-L-ornitina; e 9 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ A Fig. 8 é um gráfico que resume a incidência de diabetes em três grupos de ratinhos NOD tratados com as microesferas e de acordo com outros procedimentos para entrega dos três transcritos primários.

Descrição das Concretizações Preferidas A concretização preferida previne a diabetes auto-imune dependente de insulina por formulação e injecção de microesferas de (AS)-oligonucleótido anti-sentido aqui descritas direccionados para os transcritos primários de CD40, CD80 e CD86. Estes oligonucleótidos são desenhados para induzir tolerância imunitária numa tentativa para prevenir a destruição das células beta produtoras de insulina no modelo de ratinho NOD. Os eventos que conduzem à destruição destas células beta estão ilustrados na Fig. 1. Esta ilustra como a Diabetes do tipo 1 se manifesta pela destruição auto-imune das células beta pancreáticas produtoras de insulina no ratinho NOD, bem como em seres humanos. Aquando do inicio clinico, os seres humanos têm 10-20% de massa residual de células beta. Poupar esta massa residual pode resultar em niveis de insulina remanescente que são adequados para regular os niveis de glucose. As micropartículas da invenção são proporcionadas para interferir na destruição auto-imune das células beta que é ilustrada na Fig. 1.

Será notado que as células dendríticas (DC) podem ser activadas para serem potentes células apresentadoras de antigénio presentes em todos os tecidos e que estão altamente concentradas sob a pele. Estas células dendríticas apresentadoras de antigénio funcionam como desencadeadoras da resposta imunitária através da activação de células T, particularmente em nódulos linfáticos. A Fig. 2 é um desenho de um vector plasmídico contendo o gene da Beta-galactosidase que pode ser utilizado para transfectar células fibroblastos NIH 3T3. A evidência in vitro da transfecção de células fibroblastos NIH 3T3 com as microesferas com ADN plasmídico é mostrada na Fig. 3 pelas células que coram de azul em resposta à adição do substrato x-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-galactopiranósido) da Beta-Galactosidase. 10 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ

A Fig. 4 ilustra a capacidade das microesferas protegerem o ADN em solução. É uma electrof orese em gel de agarose mostrando a protecção contra nucleases conferida pelas microesferas com ADN plasmídico produzidas genericamente como aqui notado. Nas amostras 1, 2 e 3 de plasmídeo, o ADN plasmidico nu foi exposto a ADNase, com as manchas indicando degradação de ADN plasmidico em cada um dos três níveis de aplicação de ADNase. Nas amostras de Partícula 1 e

Partícula 2, as formulações de microesferas com ADN plasmídico foram expostas a ADNase. A ausência de manchas indica as formulações de microesferas que apresenta protecção do ADN plasmídico contra a degradação. A Fig. 5 reporta a actividade de Beta-Galactosidase em quatro diferentes aplicações de ADN plasmídico. A aplicação de ADN plasmídico nu apresentou níveis muito baixos. São indicados níveis um pouco superiores para a aplicação do complexo de lípido catiónico e ADN plasmídico utilizando lipofectamina, um lípido catiónico comercial, como veículo de entrega. É mostrada uma actividade substancialmente superior para as duas microesferas com ADNp, em que as Microesferas 1 correspondem à Partícula 1 da Fig. 4, e as Microesferas 2 correspondem à Partícula 2 da Fig. 4.

Na preparação das microesferas que são utilizadas para o tratamento de diabetes auto-imune em ratinhos, três AS-oligonucleótidos são dissolvidos em solução aquosa e combinados com polímero(s) solúvel(eis) em água e um policatião. A solução é tipicamente incubada a cerca de 60-70°C, arrefecida a cerca de 23°C, e o polímero em excesso é removido. São formadas microesferas que se crê conterem os três AS-oligonucleótidos possuindo as sequências seguintes, em que um asterisco indica tioação:

Seq ID 1: CD 40-AS: 5'C*AC* AG*C C*GA* GG*C* AA*A GA*C* AC*C A*T*G c*AG* GG*C* A-3'

Seq ID 2: CD80-AS: 5'-G*GG* AA*A G*CC* AG*G A*AT* CT*A G*AG* CC*A A*TG G*A-3'

Seq ID 3: CD86-AS: 5'-T*GG* GT*G C*TT* CC*G T*AA* GT*T C*TG* GA*A C*AC* G*T*C-3' 11 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ

Os ácidos nucleicos constituem entre cerca de 30 e cerca de 100 porcento em peso das microesferas e têm um tamanho médio de particula não superior a cerca de 50 micrones. Tipicamente, preparam-se como se segue. Prepara-se uma solução aquosa da mistura de oligonucleótidos combinando alíquotas de soluções de três oligonucleótidos, cada solução contendo um destes três tipos. Prepara-se uma solução contendo os três tipos de oligonucleótidos. As soluções preferivelmente contêm cerca de 10 mg/ml de oligonucleótido. Estas são combinadas com alíquotas de uma solução-mãe a 10 mg/ml de solução de policatião em razões volumétricas policatião:oligonucleótido de cerca de 1:1 a cerca de 4:1. Preparam-se soluções de polímero de polivinilpirrolidona e/ou de polietilenoglicol e combinam-se com as outras soluções. Aquecimento, arrefecimento, centrifugação e múltiplas lavagens proporcionam uma suspensão aquosa que tipicamente é congelada e liofilizada para formar um pó seco de microesferas compreendendo oligonucleótido e policatião.

As microesferas de acordo com a invenção constituem uma ferramenta de entrega não virai viável para ADN plasmídico e oligonucleótidos anti-sentido e outros ácidos nucleicos. Permitem a entrega in vitro de ADN plasmídico de Beta-Galactosidase em células fibroblastos 3T3. As microesferas protegem o ADN plasmídico contra a actividade de nucleases. São expressos níveis elevados de actividade de Beta-Galactosidase após a transfecção com as formulações de microesferas.

As microesferas contendo os oligonucleótidos anti-sentido de interesse infra-regulam os antigénios da superfície celular CD40, CD80 e CD86, que se sabe serem críticos na activação da reacção auto-imune que resulta na destruição de células beta produtoras de insulina do pâncreas. Isto pode ser conseguido por injecção subcutânea em células dendríticas localizadas sob a pele. Estudos com ratinhos NOD demonstram uma prevenção eficaz contra a destruição auto-imune de células beta. As microesferas com ADN e oligonucleótido são veículos de transfecção eficazes in vitro e in vivo. As células dendríticas parecem assimilar as microesferas com oligonucleótido e suprimir a expressão de antigénios da superfície celular CD40, CD80 e CD86. As microesferas com 12 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ anti-sentido oligonucleótido previnem eficazmente o desenvolvimento da diabetes nos ratinhos NOD.

Os Exemplos que se seguem ilustram certas caracteristicas e vantagens da invenção para adicionalmente ilustrar a invenção. Os Exemplos não devem ser considerados limitantes ou de outro modo restritivos da invenção. EXEMPLO 1

Três AS-oligonucleótidos direccionados para os transcritos primários de CD40, CD80 e CD86 foram sintetizados nas instalações de síntese de ADN da University of Pittsburgh (Pittsburgh, PA). As sequências dos AS-oligonucleótidos são:

Seq ID 2: CD80-AS: 5'-G*GG* AA*A G*CC* AG*G A*AT* CT*A G*AG* CC*A A*TG G*A-3'

Seq ID 3: CD86-AS: 5'-T*GG* GT*G C*TT* CC*G T*AA* GT*T C*TG* GA*A C*AC* g*T*C-3'

Uma solução aquosa da mistura de oligonucleótidos foi preparada combinando alíquotas de três soluções de oligonucleótidos, cada uma contendo um tipo de

oligonucleótido, para formar uma solução 10[mg/ml] dos três tipos de oligonucleótidos. Preparou-se poli-L-lisina·HBr em diH20 a 10 [mg/ml] (poli-L-lisina · HBr até 50 000 por Bachem, King of Prussia, PA) . A poli-L-lisina·HBr foi adicionada à solução de oligonucleótidos numa razão volumétrica de 1:1. A mistura foi cuidadosamente submetida a vórtex. Foi preparada uma solução de polímero a 25% contendo 12,5% de PVP (polivinilpirrolidona, 40 000 Daltons, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) e 12,5% de PEG (polietilenoglicol, 3 350 Daltons, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) em Acetato de Sódio 1M (Spectrum, Gardena, CA) a pH=5,5. A solução de polímero foi adicionada numa razão volumétrica de 2:1 como se segue: 750 μΐ de AS-oligonucleótidos, 0,75 ml de poli-L-lisina·HBr, 3,0 ml de PEG/PVP, e um volume total de 4,50 ml. O lote foi incubado durante 30 minutos a 70°C e depois arrefecido a 23°C. Por arrefecimento, a solução ficou turva e 13 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ ocorreu precipitação. A suspensão foi então centrifugada, e o excesso de PEG/PVP foi removido. A pelete resultante foi lavada por ressuspensão da pelete em água desionizada, seguida por centrifugação e remoção do sobrenadante. 0 processo de lavagem dói repetido três vezes. A suspensão aquosa dói congelada e liofilizada para formar um pó seco de microesferas compreendendo oligonucleótido e poli-L-lisina. A Fig. 6 apresenta uma micrografia electrónica de varrimento (SEM) do material com uma razão 1:1 de poli-L-lisina : oligonucleótido . Foram fabricadas microesferas, com tamanho de 0,5-4 pm, com um tamanho médio de partícula de aproximadamente 2,5 pm. Foi também observada precipitação de um material desconhecido. Estudos adicionais por HPLC determinaram que a precipitação era constituída por PEG/PVP residual, maioritariamente PVP. EXEMPLO 2

Os AS-oligonucleótidos direccionados para os transcritos primários de CD40, CD80 e CD86 tinham as sequências dos AS-oligonucleótidos do Exemplo 1. Foi preparada uma solução aquosa da mistura de oligonucleótidos por combinação de alíquotas das três soluções de oligonucleótidos, cada uma contendo um tipo de oligonucleótido, para formar uma solução a 10[mg/ml] dos três tipos de oligonucleótidos. Foi preparada uma solução de mistura de oligonucleótidos. Foi preparada poli-L-ornitina·HBr em diH20 (poli-L-ornitina·HBr 11 900 (vis) da Sigma) a 5 [mg/ml]. A poli-L-ornitina·HBr foi adicionada à solução de oligonucleótidos. As misturas foram cuidadosamente submetidas a vórtex. Foi preparada uma solução de polímero a 25% contendo 12,5% de PVP (40 000 Daltons, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) e 12,5% de PEG (3350 Daltons, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) em Acetato de Sódio 0,1 M (Spectrum Chemicals, Gardena, CA) a pH=5,5. As soluções de polímero foram adicionadas. Seguiram-se incubação e enxaguamentos como descrito no Exemplo 1. Foram preparados 1,5 ml dos AS-oligonucleótidos, 1,5 ml da poli-L-ornitina·HBr, 3 ml do PEG/PVP, e um volume total de 6,0 ml. A Fig. 7 apresenta uma SEM deste material com uma razão 1:1 de poli-L-ornitina:oligonucleótido. Foram fabricadas 14 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ microesferas, com tamanho de 0,2-8 ym, com um tamanho médio de partícula de aproximadamente 2 ym. Foi também observada precipitação de um material desconhecido. Estudos adicionais por HPLC estudos permitiram provar que esta precipitação era constituída por PEG/PVP residual, maioritariamente PVP. EXEMPLO 3

Foram conduzidos estudos in vivo utilizando o modelo de ratinho NOD de Diabetes mellitus do tipo 1. A diabetes do tipo 1 manifesta-se pela destruição auto-imune das células beta pancreáticas produtoras de insulina como ilustrado na Fig. 1. Foram utilizados AS-oligonucleótidos em três aplicações numa tentativa para interferir com a destruição auto-imune de células beta. O objectivo foi interferir com a função das células dendríticas tendo como alvo os transcritos primários de CD40, CD80 e CD86, que codificam proteínas da superfície de células dendríticas necessárias para a activação de células T. Sabe-se que as células dendríticas com níveis baixos de CD40, CD80 e CD86 promovem redes supressoras de células imunitárias in vivo. Estas cascatas podem resultar numa hipo-responsividade de células T contra células beta in vivo.

No primeiro grupo de animais de teste, as células dendríticas foram propagadas ex vivo a partir de progenitores da medula óssea de ratinhos NOD. Combinações dos três AS-oligonucleótidos direccionados para os transcritos primários de CD40, CD80 e CD86 foram adicionadas às células em cultura de tecidos. Após incubação, as células dendríticas transfectadas com AS-oligonucleótido foram injectadas em beneficiários singénicos de 5 a 8 semanas de idade (ainda não diabéticos). Isto é conhecido como a abordagem de entrega ex-vivo .

Em paralelo, microesferas com AS-oligonucleótido foram injectadas directamente em outros ratinhos NOD da mesma idade. Foi realizada uma única injecção em cada ratinho assim tratado. Outro grupo destes ratinhos NOD não foi tratado e serviu como controlo. 15 ΕΡ 1 758 558/ΡΤ A Fig. 8 mostra que os ratinhos NOD de controlo, não tratados, desenvolveram todos diabetes até à idade de 23 semanas. Os grupos com células dendriticas transfectadas ex vivo com AS-oligonucleótido e re-infundidas (AS-ODN DC) apresentaram um desenvolvimento retardado da diabetes, com 20% permanecendo "Isentos de Diabetes", indicando que os níveis de glucose se mantinham dentro da gama não diabética. Dos ratinhos NOD injectados in vivo com microesferas, 71% permaneceram "Isentos de Diabetes" às 43 semanas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110>Brown, Larry R.;

Bisker-Leib, Vered;

Scott, Terrence L.;

Lafreniere, Deborah;

Machen, Jennifer;

Giannoukakis, Nick.

<120>Entrega de Microesferas com AS-oligonucleótidos para Induzir Tolerância de Células Dendriticas para o Tratamento de Diabetes Auto-imune do Tipo I <130> 6143PCT-1 (4362-0002) <141> 2005-05-12 <160> 3

<210> 1 <211> 31 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 1 cacagccgag gcaaagacac catgcagggc a 31

<210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 2 gggaaagcca ggaatctaga gccaatgga 29

<210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Mus Musculus <400> 3 tgggtgcttc cgtaagttct ggaacacgtc 30

Lisboa, 2013-11-28

Claims

ΕΡ 1 758 558/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Microesferas compreendendo oligonucleótidos direccionados para ligar transcritos primários seleccionados do grupo que consiste nos transcritos primários de CD40, CD80 e CD86 e suas combinações, em que os oligonucleótidos infra-regulam ou suprimem a expressão in vivo de CD40, CD80 e/ou CD86, e em que os oligonucleótidos constituem mais do que 30 porcento em peso das microesferas com base no peso total das microesferas, as microesferas possuindo um tamanho médio de partícula não superior a 50 mícrones.
2. Microesferas de acordo com a reivindicação 1 compreendendo um primeiro oligonucleótido anti-sentido que tem como alvo o transcrito primário de CD40, um segundo oligonucleótido anti-sentido que tem como alvo o transcrito primário de CD80 e um terceiro oligonucleótido anti-sentido que tem como alvo o transcrito primário de CD86, em que cada um dos referidos primeiro, segundo e terceiro oligonucleótidos infra-regulam ou suprimem a expressão in vivo de CD40, CD80 e CD86, respectivamente.
3. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que as microesferas compreendem ainda um policatião.
4. Microesferas da reivindicação 3, em que as microesferas consistem essencialmente em oligonucleótidos anti-sentido e o policatião.
5. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que as microesferas são susceptíveis de serem assimiladas por células dendríticas.
6. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que as microesferas estão numa composição injectável adequada para entrega in vivo. 1. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que as microesferas são adequadas para administração subcutânea.
ΕΡ 1 758 558/ΡΤ 2/3
8. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1- -7, em que as microesferas têm um tamanho médio de partícula inferior a 50 mícrones.
9. Microesferas de qualquer das reivindicações 1-7, em que as microesferas têm um tamanho de partícula de 0,2 mícrones a 8 mícrones.
10. Microesferas de qualquer das reivindicações 1-7, em que as microesferas têm um tamanho de partícula de 0,5 mícrones a 4 mícrones.
11. Microesferas de qualquer das reivindicações 1-7, em que as microesferas têm um tamanho médio de partícula de cerca de 2 mícrones.
12. Microesferas de qualquer das reivindicações 1-7, em que as microesferas têm um tamanho médio de partícula de cerca de 2,5 mícrones.
13. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-12 para utilização em medicina.
14. Microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-12 para utilização no tratamento de diabetes do tipo 1.
15. Microesferas injectáveis de acordo com a reivindicação 14.
16. Utilização das microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-14 no fabrico de um medicamento para entrega de ácidos nucleicos na forma de uma composição de microesferas a um indivíduo com diabetes do tipo 1 por uma via de administração seleccionada do grupo que consiste em entrega intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, intradérmica, intraperitoneal, oral, pulmonar, ocular, nasal e rectal.
17. Utilização das microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-15 no fabrico de um medicamento para protecção das células beta do pâncreas de ratinhos diabéticos não obesos contra a destruição auto-imune, compreendendo a injecção subcutânea das microesferas. ΕΡ 1 758 558/ΡΤ 3/3
18. Utilização das microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-15 no fabrico de um medicamento para protecçao das células beta do pâncreas de indivíduos contra a destruição auto-imune por injecção subcutânea da composição, opcionalmente em que o indivíduo é um ser humano.
19. Utilização das microesferas de qualquer uma das reivindicações 1-15 no fabrico de um medicamento para protecção de células beta do pâncreas de indivíduos contra a destruição auto-imune e o inicio de diabetes do tipo 1 por injecção subcutânea das microesferas. Lisboa, 2013-11-28