DE3783920T2

DE3783920T2 - Verfahren zum impraegnieren einer matrix mit antikoerpern oder antigenen.

Info

Publication number: DE3783920T2
Application number: DE8989201937T
Authority: DE
Inventors: Fon-Chiu Mia Chen; Eugene Fan; Siu-Yin Wong
Original assignee: Pacific Biotech Inc
Current assignee: Pacific Biotech Inc
Priority date: 1986-09-18
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1993-05-19
Anticipated expiration: 2007-09-18
Also published as: CA1340320C; EP0342771A3; DE3783920D1; DE3782597T3; JPS6388460A; JP2638600B2; DE3782597D1; EP0260965A2; EP0260965A3; EP0260965B1; EP0342771A2; DE3782597T2; EP0342771B1; EP0260965B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die hier beschriebene Vorrichtung und Methodik erleichtert diagnostische Untersuchungen mit der Erzeugung und Erkennung von speziellen Komplexen, insbesondere von Immunkomplexen, die schwierig oder unpraktisch durchzuführen sind. Traditionelle Methoden der Untersuchung spezieller Komplexe sind zeitaufwendig und kostspielig, insbesondere aufgrund der Wiederholung erforderlicher Stufen, um die Bestimmung durchzuführen, wie auch aufgrund der Komplexität der Laboratoriumsvorrichtung, die zur Durchführung erforderlich ist. Weiterhin erfordern derartige Tests oftmals eine Zwischen- Extraktion sowie Waschstufen zum Zwecke der Eliminierung störender Substanzen, die in der Probe vorhanden sind.
Ein Hauptziel bei der Entwicklung immunodiagnostischer Testsysteme ist es, die Zeitspanne zu reduzieren, die die Testperson benötigt, um die Untersuchung durchzuführen. Infolgedessen sind beträchtliche Anstrengungen unternommen worden, um die Anzahl von Stufen, die zur Durchführung einer Bestimmung erforderlich sind, zu reduzieren, mit dem letztlichen Ziel einer nur eine Stufe aufweisenden Bestimmungsmethode. Letztere existiert bis heute nicht.
Zusätzlich zur Verminderung der Zeitspanne, die erforderlich ist, um den diagnostischen Test durchzuführen, besteht eine andere wünschenswerte Eigenschaft solcher Systeme darin, daß sie bei Raumtemperatur über längere Zeiträume stabil sind. Ganz allgemein gehören zu diagnostischen Vorrichtungen oder Geräten verschiedene Reagenzien mit unterschiedlichen Temperaturstabilitäten. Einige dieser Reagenzien sind bei Raumtemperatur über kurze Zeitspannen stabil, wohingegen andere weniger stabil oder überhaupt nicht stabil sind. Der Effekt der Temperatur auf die Reagenzien vermindert die Empfindlichkeit und die Zuverlässigkeit der Bestimmungsmethode und erhöht den Hintergrund. Die meisten der zum gegenwärtigen Zeitpunkt im Handel erhältlichen diagnostischen Vorrichtungen erfordern, daß eine oder mehrere der verwendeten Reagenzien, die zur Durchführung des Verfahrens benötigt werden, bei niedrigen Temperaturen gehalten werden, um ihre Stabilität zu gewährleisten. Tatsächlich zeigt Tabelle 1, daß entweder die gesamten diagnostischen Kits oder die in dem Kit vorhandenen Reagenzien der drei hauptsächlichen Hersteller, die Kits für Schwangerschaftshormone produzieren, bei niedrigen Temperaturen aufbewahrt werden müssen, um wirksam zu sein. Infolgedessen würde ein diagnostisches Testsystem, das bei Raumtemperatur über längere Zeiträume hinweg stabil ist, einen klaren Vorteil über die Vorrichtungen des Standes der Technik aufweisen.
Die meisten der heutzutage in Gebrauch befindlichen diagnostischen Vorrichtungen sind für die "Sandwich"-Bestimmungsmethode bestimmt. Hier wird der Analyt oder die zu bestimmende Substanz mit einem Überschuß an Antikörper- Molekülen inkubiert, die an festes Matrixmaterial gebunden sind. Nachfolgend wird ein markierter zweiter Antikörper, ebenfalls im Überschuß, jedoch gegen einen zweiten Determinanten des Analyten gerichtet, mit dem Immunkomplex inkubiert, der aus dem ersten Antikörper gebildet worden ist, der an das feste Matrixmaterial gebunden ist. Das Vorhandensein des markierten Antikörpers auf der Oberfläche des Immunkomplexes wird durch geeignete Maßnahmen bestimmt, je nach dem Typ der verwendeten Markierung. Dieser Typ einer Bestimmung wird häufig als "Sandwich"- oder "2-Site"- Bestimmungsmethode bezeichnet, da das Antigen zwei, in zwei verschiedenen Bereichen gebundene Antikörper aufweist, oder Epitopes.
Eine Anzahl von "Sandwich"-Bestimmungsmethoden ist patentiert worden (vgl. z.B. US-PS 4 361 647 oder 4 497 899). Trotz ihrer weitverbreiteten Anwendung ist ihre Durchführbarkeit nicht ohne Schwierigkeiten. Wie oben dargelegt, erfordern sie sukzessive Manipulationen und leiden unter einer geringen Empfindlichkeit. Beispielsweise schließt ein allgemein angewandtes Verfahren zur Durchführung eines Immunoessays unter Anwendung der "Sandwicht"-Methode ein:
1. Festlegung der Arbeitslösungen des Antikörpers;
2. Entfernung eines Überschusses an Antikörper, der zur Sensibilisierung des festen Matrixmaterials verwendet wird;
3. Freiwaschen der festen Trägermatrix von nichtgebundenem Antikörper;
4. Kontaktieren der Matrix mit der Test-Bestimmungslösung;
5. Inkubierung des zu bestimmenden Analyten in der Testprobe über ausgedehnte Zeiträume, um es dem Analyten zu ermöglichen, sich an den Antikörper zu binden;
6. Waschen der Matrix zum Zwecke der Entfernung von nicht- umgesetzten Material;
7. Kontaktieren der Matrix mit markiertem zweitem Antikörper;
8. Waschen des festen Matrixmaterials zur Entfernung von nicht-umgesetztem zweitem Antikörper;
9. Bestimmung des Vorhandenseins des Immunokomplexes, entweder auf direktem Wege, wenn der zweite Antikörper eine Radiomarkierung aufweist unter Verwendung geeigneter Zähltechniken oder, wenn die Markierung eine enzymatische Markierung ist, durch Zusatz eines Substrates, das zu einer bestimmbaren Farbveränderung aufgrund einer Reaktion führt;
10. In dem Falle, in dem der zweite Antikörper eine enzymatische Markierung aufweist, wird nach einer gewissen Zeit, in der sich eine ausreichende Farbintensität entwickeln kann, die Reaktion mit starkem Alkali oder Säure unterbrochen.
Zusätzlich zu der Tatsache, daß "Sandwich"-Bestimmungsmethoden zeitaufwendig und relativ unempfindlich sind, sind derartige Bestimmungsmethoden weiter begrenzt in zweierlei Hinsicht: Erstens lassen sie sich nicht leicht anpassen an eine Verwendung mit Vorrichtungen zur Bestimmung von mehr als einer antigenen Substanz, die in einer Probe vorhanden ist. Dies bedeutet, daß man, falls man wünscht, eine Probe auf mehrere Antigene zu untersuchen, separate aliquote Teile der Probe unabhängig voneinander untersuchen muß. Zweitens machen sie oftmals nur einen uneffizienten Gebrauch von der Bestimmungsprobe, weshalb es erforderlich ist, große Probenvolumina zu untersuchen, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erhalten.
Teilweise beruht dies darauf, daß die Probe auf einem großen Oberflächenbereich des festen Matrixmaterials abgeschieden ist. Infolgedessen würde eine Vorrichtung, die für die Sandwich-Methode bestimmt ist und die es ermöglicht, mehrere Antigene zu bestimmen, und die einen effizienteren Gebrauch der Probenflüssigkeit ermöglicht, einen klaren Vorteil über die Vorrichtungen des Standes der Technik bieten.
Wie oben dargelegt, ist ein zu beanstandendes Merkmal, an denen es diagnostischen Vorrichtungen mangelt, ihre Langzeit-Raumtemperaturstabilität. Bis heute wurden alle Gründe für die Instabilität noch nicht identifiziert. Es scheint jedoch, daß Teil der Ursache auf die Instabilität des Antikörpers zurückzuführen ist, der an die feste Trägermatrix gebunden ist, sowie auf die Formation von Aggregaten in dem Antikörper-Enzym-Konjugat, das zur Bestimmung des Vorhandenseins des Antigens verwendet wird. Das zuerst genannte Problem ist noch nicht in zufriedenstellender Weise behandelt worden, wohingegen die Formation von Aggregaten gesteuert werden kann durch Aufbewahrung des Konjugates bei Temperaturen im Bereich von 2 bis 8ºC. Bei diesen Temperaturen wird die Geschwindigkeit der Aggregatbildung vermindert. Da es jedoch unpraktisch ist sowie kostspielig, die diagnostische Vorrichtung bei niedrigen Temperaturen auf zubewahren, sind beträchtliche Anstrengungen unternommen worden, um Antikörper-Enzym-Konjugate zu entwickeln, die bei Raumtemperaturen stabil sind oder Methoden zur Verminderung des Hintergrundes, der sich aus solchen Aggregaten ergibt. Bis heute waren derartige Anstrengungen nicht erfolgreich.
Ein weiteres Problem bei der Durchführung von diagnostischen Bestimmungsverfahren besteht darin, Immunoreaktionskomponenten, die kein Antigen binden und infolgedessen keinen Teil des Immunkomplexes bilden, von gebundenen Reaktanden abzutrennen, die den Komplex bilden. Das Vorhandensein von ungebundenen Reaktanden kann den Hintergrund des Bestimmungsverfahrens erhöhen. Obgleich ein Waschen des Immunkomplexes den größten Teil des Hintergrundsignales aufgrund nicht-gebundener Reaktanden entfernen kann und dies auch erreicht wird, wenden die meisten Bestimmungsverfahren eine Stufe an, die als Blockierungsstufe bezeichnet wird, um den Hintergrund weiter zu vermindern. Die Blockierungsstufe schließt die Beschichtung des festen Trägers mit proteinartigen Substanzen ein, nachdem er mit Antikörper beschichtet worden ist. Dss Blockierungsmaterial wird an Zentren auf dem festen Matrixmaterial gebunden, die nicht mit dem Antikörper bedeckt sind und verhindern somit nachfolgend eine nichtspezifische Bindung von Immun-Reaktanden, die nicht Teil des Immunkomplexes sind. Ganz allgemein wird die Blockierungsstufe durchgeführt, entweder bevor die Bestimmungsmethode durchgeführt wird, was infolgedessen eine zusätzliche zeitaufwendige Stufe erfordert oder, wie in der US-PS 3 888 629 beschrieben, wird das feste Matrixmaterial mit dem blockierenden Mittel imprägniert und dann gefriergetrocknet und in diesem Zustand vor der Verwendung aufbewahrt. Die Notwendigkeit der Vorbehandlung der festen Oberfläche mit blockierendem Material oder die Verwendung von gefriegetrockneten Filtern mit blockierenden Proteinen, die hierin enthalten sind, ist öde, zeitaufwendig und kostspielig. Infolgedessen würde ein Verfahren, das beide dieser Arbeitsweisen vermeidet, zu einer wünschenswertern diagnostischen Vorrichtung führen.
In der WO-A-84/04171 von Katz und anderen wird ein Verfahren zur Verhinderung einer Antikörperwanderung auf einem Träger unter Verwendung spezieller Kupplungsmittel beschrieben. Speziell beschrieben wird eine Methode zum Bedrucken eines mit Avidin beschichteten Trägers mit einem biotinylierten Antikörper. Die Notwendigkeit einer speziellen Behandlung des Antikörpers, Antigens oder Trägers ist ein besonderer Nachteil eines solchen Verfahrens.
Im Lichte des oben gesagten ist offensichtlich, daß, obgleich viele immunodiagnostische Geräte existieren, es wünschenswert ist, ihre Empfindlichkeit, Leichtigkeit und Schnelligkeit ihrer Anwendbarkeit, wie auch ihrer Langzeit- Raumtemperaturstabilität, zu erhöhen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Imprägnierung einer Matrix (24) mit Antikörpern oder Antigenen bereitgestellt ohne Verwendung von Kupplungsmitteln, mit den Stufen: Hindurchleiten einer Lösung der Antikörper oder Antigene durch eine Düse, um freie Flüssigkeitströpfchen zu bilden, durch die Luft in Richtung einer Matrix (24), wodurch die Antikörper oder Antigene nach einem vorbestimmten makroskopischen Muster abgeschieden werden.
Es wird ein immunodiagnostisches Bestimmungsgerät beschrieben, das beträchtliche Vorteile gegenüber den bekannten Geräten aufweist und dazu verwendet werden kann, um sowohl Sandwich- wie auch Nichtsandwich-Bestimmungsverfahren durchzuführen. Es weist mehrere Merkmale auf, die in Kombination miteinander ein Gerät oder eine Vorrichtung ergeben, die bei Raumtemperatur über lange Zeiträume hinweg stabil ist, schnelle Ergebnisse liefert, hochsensitiv ist und überdies gleichzeitig mehr als ein Antigen festzustellen vermag, das in der gleichen Bestimmungslösung vorhanden ist.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß, obgleich die diagnostische Bestimmungsvorrichtung, die hier beschrieben wird, primär dafür bestimmt ist, entweder Antigene oder Antikörper durch die Bildung eines Immunkomplexes zu bestimmen, ihre Anwendbarkeit tatsächlich jedoch beträchlich breiter ist und nicht auf diese Moleküle beschränkt ist. Als ein Minimum erfordert die Vorrichtung lediglich ein erstes Molekül, das ein zweites Molekül erkennt und bindet. Das erste Molekül kann in zweckmäßiger Weise als ein Liganden- Erkennungsmolekül bezeichnet werden und das letztere als Ligand. Obgleich Antikörper und Antigene bevorzugte Ausführungsformen eines Liganden-Erkennungsmoleküls bzw. Liganden sind, kann die Vorrichtung mit einer Vielzahl von Liganden und Liganden-Erkennungsmolekülen verwendet werden. Beispielsweise sind Hormon-Rezeptormoleküle ein Typ von Liganden-Erkennungsmolekülen und können an das feste Matrixmaterial gebunden werden, das zur Bestimmung des entsprechenden Hormonliganden verwendet wird. Alternativ kann ein Hormon an das Matrixmaterial gebunden und zur Bestimmung von Hormonrezeptoren verwendet werden. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß es viele derartiger Kombinationen von Liganden-Erkennungsmolekülen und Liganden gibt, die in geeigneter Weise in dem vorliegenden immunodiagnostischen Gerät verwendet werden können.
Wird entweder eine Sandwich- oder Nichsandwich-Bestimmung in dem vorliegenden Gerät durchgeführt, so wird ein Matrixmaterial mit Antikörper imprägniert, unter Verwendung einer neuen Druck-Codiertechnik, bei der ein oder mehrere ausgeprägte Antikörper auf die Matrix durch Aufsprühen aufgebracht werden. Bei Anwendung dieser Technik ist es möglich, Antikörper rasch in diskreten Kreisen, Linien oder anderen geometrischen Formen zur Bindung von einem oder mehreren Antigenen abzuscheiden. Infolgedessen ist die Anzahl von Antigenen, die bestimmt werden können, eine Funktion der Anzahl von verschiedenen Antikörpern, die in ausgeprägten Mustern angewandt werden.
Unterhalb des mit Antikörper imprägnierten Matrixmaterials befinden sich zwei diskrete Schichten aus absorbierenden Materialien. Direkt unterhalb des Matrixmaterials befindet sich eine Mittelschicht aus einem Material, das den Hintergrund vermindert. Weiter entfernt von dem Matrixmaterial befindet sich die zweite Schicht aus absorbierendem Material. Ihre Funktion besteht darin, Bestimmungs- oder Waschflüssigkeiten zu absorbieren und festzuhalten, wobei die Schicht aus einer Vielzahl von absorbierenden Materialien aufgebaut sein kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung, die hier beschrieben wird, der Hintergrundaktivität vermindert, ist ein Vorfilter, das mit einem geeigneten blockierenden Material imprägniert ist, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, mit einem proteinösen Material. Das Vorfilter befindet sich über dem Matrixmaterial und ist mit einem blockierenden Material durch Kontaktieren des Filters unter bestimmten Bedingungen mit proteinösem Material imprägniert worden. Wird die Bestimmung durchgeführt, so wird eine geeignete Menge von Untersuchungsflüssigkeit auf das Vorfilter gebracht, worauf sie das Vorfilter passiert und blockierendes Material mit sich führt. Die Bestimmungsflüssigkeit und die blockierenden Materialien hierin, gelangen in Kontakt mit dem mit Antikörper imprägnierten Matrixmaterial, wobei blockierendes Material an nicht-spezifische reaktive Zentren des Matrixmaterials gebunden wird, wodurch diese Zentren unverfügbar gemacht werden für die Bindung durch überschüssige Immunochemikalien, die bei der Durchführung der Bestimmung vorhanden sind.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung, das zu ihrer Empfindlichkeit und Langzeitraumtemperaturstabilität beiträgt, ist, daß sie in einer Kammer mit mindestens zwei Abteilungen durchgeführt werden kann. Eine Abteilung enthält das mit Antikörper imprägnierte Matrixmaterial, wohingegen die zweite Abteilung Feuchtigkeit absorbierende Chemikalien enthalten kann. Die letzteren kommunizieren mit dem ersteren und steigern die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Bestimmungsverfahrens, da sie eine Art trocknende Umgebung in dem ersten Abteil aufrechterhalten. Dies begünstigt die Aufrechterhaltung der Stabilität des Blockierungsmittels in dem Vorfilter und des Antikörpers, der mit dem Matrixmaterial assoziiert ist, über lange Zeiträume der Nichtverwendung. Der gleiche Effekt läßt sich realisieren, obwohl nicht in ganz so günstiger Weise, durch Verbindung der Feuchtigkeit absorbierenden Chemikalien mit dem Vorfilter und Matrixmaterial durch andere Maßnahmen.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in einer trichterförmigen Öffnung in der Eindeckung der Vorrichtung, die den Zutritt der Bestimmungsflüssigkeit zum Matrixmaterial ermöglicht. Diese Form macht einen wirksamen Gebrauch von der Bestimmungsprobe und nachfolgenden Wäschen, durch ihre Abscheidung auf einen kleinen Oberflächenbereich des Matrixmaterials.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß, obgleich die immunodiagnostische Vorrichtung unter Bezugnahme auf die Bestimmung von Antigen durch Bindung von Antikörper an das Matrixmaterial beschrieben worden ist, die Verwendbarkeit der Vorrichtung nicht hierauf beschränkt ist. Es ist offensichtlich, daß die Vorrichtung in geeigneter Weise angewandt werden kann für die Bestimmung von Antikörpern, die in Bestimmungsflüssigkeiten vorhanden sind, durch Bindung ihrer entsprechenden Antigene an das Matrixmaterial. Dieser Aspekt der Erfindung mag zur Bestimmung und Diagnose von Auto-Immunerkrankungen beitragen.
Die Kombination von Merkmalen, die zu der hier beschriebenen diagnostischen Vorrichtung gehören, führt zu einem System, das empfindlicher ist als jene, die gegenwärtig verwendet werden, das zuverlässig ist, vorteilhaft zu handhaben, eine weite Anwendbarkeit aufweist und überdies über längere Zeiträume hinweg bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann, ohne daß ein Aktivitätsverlust auftritt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung soll nun anhand eines Beispieles beschrieben werden, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, wobei dargestellt sind in:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht der diagnostischen Einheit;
Fig. 2 eine auseinandergezogene Ansicht, die die verschiedenen Komponenten zeigt, und
Fig. 3 eine vergrößerte Schnittansicht gemäß der Linien 3-3 von Fig. 1.
Die Fig. 1 und 2 veranschaulichen ein repräsentatives Beispiel einer geeigneten immunodiagnostischen Testvorrichtung, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Fig. 1 zeigt eine vollständig zusammengesetzte Vorrichtung und Fig. 2 eine auseinandergezogene Ansicht der Vorrichtung. Gemäß Fig. 1 weist sie einen Behälter 10 auf mit einem abscheidbaren Oberteil-Abschnitt 12 und einem Boden-Abschnitt 14 und einer Filtervorrichtung 28. Fig. 2 offenbart weiter den Behälter 10 und den Oberteilabschnitt 12 und den Boden-Abschnitt 14. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Bodenabschnitt 14 in zwei Kammern 16 und 18 aufgeteilt. In der Kammer 16 befindet sich absorbierendes Material 20, das Flüssigkeit von der Mittelschicht 22 aufnimmt. Die Mittelschicht 22 wiederum nimmt Flüssigkeit von dem Matrixmaterial 24 auf. In Fig. 2 sind ferner Einkerbungen 40 dargestellt, die als Entlüfungsöffnungen für einen Druckausgleich wirken, wenn der Oberteil-Abschnitt 12 und der Boden-Abschnitt 14 zusammengebracht werden. Letztere vermindern die Zeitspanne, die erforderlich ist, um die Bestimmung durchzuführen, sind jedoch zur Durchführung der Bestimmung nicht wesentlich.
Der Oberteil-Abschnitt 12 des Behälters 10 weist eine hierin befindliche Öffnung 26 auf. Wird der Oberteil-Abschnitt 12 mit dem Boden-Abschnitt 14 ausgerichtet, und zwar durch Halterungen 13, die am Oberteil-Abschnitt befestigt sind, die in die Löcher 15 im Boden-Abschnitt passen, so wird die Öffnung über das Matrixmaterial 24 gebracht. Der Oberteil- Abchnitt 12 weist ferner eine hiermit assoziierte Filtervorrichtung 28 auf. Die Filtervorrichtung 28 liegt über der Öffnung 26, so daß, wenn Flüssigkeit auf die Filtervorrichtung 28 aufgebracht wird, das Filtrat durch die Öffnung 26 gelangt und mit dem Matrixmaterial 24 in Kontakt gelangt. Die Filtervorrichtung 28 ist mit dem Oberteil-Abschnitt 12 durch eine von einer Anzahl von Maßnahmen verbunden. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, diese Verbindung herbei zuführen durch Bolzen 30 an den Ecken der Vorrichtung 28, die in Öffnungen 32 passen, die sich in dem Oberteil-Abschnitt 12 befinden.
Sowohl die Öffnung 26 wie auch die Filtervorrichtung 28 weisen vorzugsweise eine Trichterform auf. Dies ermöglicht, daß eine große Menge an Probenflüssigkeit durch eine kleine Menge des Oberflächenbereichs des Matrixmaterials 24 gelangen kann. Obgleich die Dimensionen sowohl der Öffnung 26 wie auch der Filtervorrichtung 28 weitestgehend variiert werden können, ohne die Anwendbarkeit der Vorrichtung zu beeinflussen, wurde doch gefunden, daß die folgenden ungefähren Dimensionen zu zufriedenstellenden Ergebnissen führen: Boden-Durchmesser 1,0 cm, Oberteil-Durchmesser 2,0 cm und Tiefe 0,3 cm.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, welches eine Langzeit-Aufbewahrung ohne Beeinträchtigung der in der Filtervorrichtung 28 vorhandenen Reagenzien oder des Matrixmaterials 24 ermöglicht, ist eine Feuchtigkeit absorbierende Chemikalie in der Kammer 18. Derartige Chemikalien verhindern, daß Feuchtigkeit mit den Reagenzien in Kontakt gelangt und einen Aktivitätsverlust verursachen. Eine Vielzahl von Chemikalien, die dem Fachmann bekannt sind, können zu diesem Zweck verwendet werden. Es dürfte jedoch offensichtlich sein, daß die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung nicht absolut darauf angewiesen ist, daß die Vorrichtung eine Kammer 18 für die Aufnahme von Feuchtigkeit absorbierenden Chemikalien aufweist. Eine einzelne Kammer arbeitet in adeguater Weise, vorausgesetzt, die Chemikalien sind in anderer Weise mit ihr verbunden, beispielsweise durch Abscheidung auf der Außenseite.
Fig. 3 veranschaulicht eine vergrößerte Querschnittsansicht der vorliegenden Erfindung. Die Filtervorrichtung 28 ist an den Oberteil-Abschnitt 12 durch Bolzen oder Stifte 30 befestigt, die sich in Löchern 32 befinden. Der Oberteil- Abschnitt 12 und der Boden-Abschnitt 14 sind ebenfalls miteinander über Bolzen oder Stifte 13 verbunden, die sich in dem Oberteil-Abschnitt befinden und die in die Öffnungen 15 im Boden-Abschnitt passen.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß, obgleich der Behälter, der die in Fig. 1 bis 3 dargestellte diagnostische Vorrichtung bildet, eine flache Konfiguration aufweist, nicht auf diese Form begrenzt ist. Tatsächlich ist jede andere Form geeignet, vorausgesetzt, sie weist die obenbeschriebenen Elemente auf.
Die vorliegende diagnostische Vorrichtung eignet sich für die Bestimmung eines Liganden-Liganden-Erkennungs-Molekülkomplexes auf einer festen Oberfläche. Es ist wichtig festzustellen, daß entweder der Ligand oder das Liganden- Erkennungsmolekül an das Matrixmaterial 24 gebunden werden kann und dazu benutzt werden kann, um das entsprechende Glied des Komplexes zu ermitteln. Das heißt, daß, ist das Liganden-Erkennungsmolekül an das Matrixmaterial gebunden, im allgemeinen der Ligand bestimmt werden kann; daß jedoch, ist der Ligand an das Materialmaterial 24 gebunden, das Liganden-Erkennungsmolekül bestimmt werden kann.
Liganden sind im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, Moleküle von kleinem Molekulargewicht, wie Arzneimittel, Peptidhormone und andere bioaktive Moleküle. Andererseits sind Liganden-Erkennungsmoleküle im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, Moleküle von großem Molekulargewicht, die in den meisten Fällen Protein- insbesondere Antikörpermoleküle sind. Infolgedessen ist für den Fachmann verständlich, daß, obgleich die bevorzugte Ausführungsform der diagnostischen Vorrichtung, die mit einem Antigen und Antikörper (mono oder polyclonal) als Ligand bzw. Liganden- Erkennungsmolekül ist, die Erfindung nicht auf die Verwendung dieses Paars von Ligand und Liganden-Erkennungsmolekülen beschränkt ist. Da jedoch diese die in diagnostischen Bestimmungsverfahren am häufigsten verwendeten sind, soll die Erfindung unter Bezugnahme auf sie beschrieben werden.
Die hier beschriebene diagnostische Vorrichtung wird am häufigsten zur Bestimmung eines "Sandwich"-Immunkomplexes verwendet werden, der aus Antikörper und Antigen gebildet wird, weshalb ein Trägermaterial als Matrix 24 verwendet werden wird, das zur Bindung eines nicht-markierten ersten Antikörpers geeignet ist. Zu bemerken ist jedoch, daß die Vorrichtung in gleicher Weise geeignet ist zur Durchführung von Nichtsandwich-Bestimmungsverfahren, insbesondere sogenannten konkurrienden Bindungs-Bestimmungsverfahren. Die letzteren werden oftmals angewandt, um Moleküle von kleinem Molekulargewicht zu bestimmen, die entweder ein einzelnes Antikörperbindungszentrum aufweisen oder aufgrund ihrer Größe verhindern, daß mehr als ein Antikörper aufgrund einer sterischen Behinderung gebunden wird. Infolgedessen kann die Erfindung dazu verwendet werden, um Arzneimittel, Steroide und dgl. zu ermitteln.
Die Bindung des Antikörpers an das feste Matrixmaterial kann in einer direkten Absorption bestehen oder in einer kovalenten Bindung. Geeignete Methoden zur Durchführung dieser Verfahren unter einer weiten Vielzahl von Verfahren werden beispielsweise beschrieben von Iman und Hornby in Biochemical Journal (1972), Band 129, Seite 255; von Campbell, Hornby und Morris in Biochemical Biophysical Acta (1975), Band 384, Seite 307 und von Mattison und Nilsson in F.E.B.S.-Letters (1977), Band 104, Seite 78.
Zahlreiche Materialien können zur Herstellung der Trägermaterialien verwendet werden. Derartige Materialien sind im allgemeinen entweder synthetische oder natürlich vorkommende Polymere, wobei Beispiele für geeignete synthetische Polymere Polyethylen, Polyacrylamid, Nylon, Harze, Polyvinylchlorid und Polystyrol sind. Natürlich vorkommende Polymere, die in typischer Weise verwendet werden können sind Cellulose, Polysaccharide, Sepharose , Agarose und verschiedene Dextrane. Weitere Materialien, die zur Herstellung des Trägermaterials verwendet werden können, sind Siliciumdioxid, insbesondere Glas, Collagen und Polynucleotide. Obgleich eine Vielzahl der beschriebenen Materialien in adequater Weise zur Durchführung der Erfindung geeignet ist, wird in der bevorzugten Ausführungsform ein Material aus Nylon verwendet.
Ein wichtiger Aspekt der diagnostischen Vorrichtung ist die Methode der Anbringung des Antikörpers an das feste Matrixmaterial 24. Die meisten üblichen Methoden scheiden den Antikörper nicht selektiv auf der gesamten Oberfläche des Matrixmaterials 24 ab. Dies stellt eine Verschwendung des Antikörpers dar, der oftmals teuer oder schwer zu erhalten ist und schließt überdies die Bestimmung von mehr als nur einem Antigen, das in der gleichen Probe vorhanden ist, aus. Es wurde gefunden, daß beide Probleme eliminiert werden können durch Sprüh-Zuführung von Antikörper in einem dünnen Fluid-Strom auf das Matrixmaterial 24. Am besten wird dies dadurch erreicht, daß eine Lösung, die Antikörper enthält, durch eine Düse mit einer kleinen Bohrung gepreßt wird, wodurch die Lösung in diskrete Tröpfchen zerlegt wird, unter Verwendung von Schallschwingungen oder durch andere Maßnahmen. Die Tröpfchen werden nachfolgend durch Passieren eines elektrischen Feldes aufgeladen und dann auf das Matrixmaterial 24 abgelenkt. Die Verfahren zur Durchführung dieser Methode werden in den US-PS 3 281 860 und 4 121 222 beschrieben.
Das oben beschriebene Verfahren läßt sich am leichtesten durchführen unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Druckvorrichtung, die hergestellt wird von der Firma Videojet Systems International. Die Vorrichtung wird als Videojet Coder/Printer bezeichnet und liefert einen Antikörperstrom unter einer Vielzahl von Bedingungen und bei verschiedenen Stromweiten. Bei Verwendung dieser Vorrichtung ist es möglich, eine Reihe von Linien oder anderen Mustern auf dem Matrixmaterial 24 abzuscheiden, wobei jede einen Antikörper mit verschiedenen antigenischen Spezifitäten aufweist.
Es ist offensichtlich, daß der Sprüh-Auftrag von Antikörper auf das Matrixmaterial 24 empfehlenswert ist, wenn Antikörper mit dem Matrixmaterial 24 durch einfache Absorption assoziiert werden soll.
Fig. 2 zeigt, daß unter dem festen Matrixmaterial eine Mittelschicht aus Material 22 angeordnet ist. Die Mittelschicht liegt zwischen dem absorbierenden Material 20 und dem Matrixmaterial 24 und bewirkt die Reduzierung des Hintergrundes der Bestimmung. Nachdem die Bestimmungsflüssigkeiten durch das Matrixmaterial 24 gelangt sind, gelangen sie mit der Mittelschicht 22 in Kontakt und werden durch diese filtriert. Letztere reduziert in starkem Maße den Hintergrund der Bestimmung durch Verminderung des Rückflusses von nicht-umgesetzten Reagenzien und bewahrt sie somit vor einem neuen Kontakt mit Matrixmaterial 24. Eine Vielzahl von Materialien ist zur Bildung der Mittelschicht 22 geeignet. Besonders geeignet ist ein nicht-gewebtes Polypropylenmaterial, das sich oftmals in wegwerfbaren Diapapieren befindet, wie sie beschrieben werden in den US-PS 3 860 003, 4 081 301 und 4 515 595.
Zusätzlich zu der Mittelschicht 22 besteht ein weiteres Merkmal der vorliegenden diagnostischen Vorrichtung, das zu einem niedrigen Hintergrund führt und die Einfachheit der Verwendung fördert, in der Filtervorrichtung 28, die mit dem Oberteil-Abchnitt 12 in Verbindung steht. Sie umfaßt einen trichterförmigen zentralen Bereich 38, der leicht eine Menge von Bestimmungflüssigkeit aufnimmt, die erforderlich ist, um das Bestimmungsverfahren bei einer einmaligen Aufbringung durchführen zu können, sowie einen Griff 34, der es dem Benutzer der Vorrichtung ermöglicht, die Vorrichtung 28 zu ergreifen und zu entfernen. Am Boden der Filtervorrichtung 28 befindet sich Filtermaterial 36. Dieses Material ist mit einem oder mehreren Reagenzien imprägniert, die erforderlich sind, um das Bestimmungsverfahren durchzuführen und die mit Bestimmungsflüssigkeit nach unten auf das Matrixmaterial 24 mitgeführt werden, wenn die Bestimmungsflüssigkeit auf die Filtervorrichtung 28 aufgebracht wird.
Eine Vielzahl von Materialen kann zur Herstellung des Filtermaterials 36 in der Filtervorrichtung 28 verwendet werden. Tatsächlich konnen in den meisten Fällen jene Materialien, die oben beschrieben wurden und aus denen das Matrixmaterial 24 aufgebaut ist, in geeigneter Weise für das Filtermaterial 36 verwendet werden. Es wurde gefunden, daß Glasfasern besonders geeignet sind, beispielsweise das Produkt Ultipor GF Filter U6-40 von der Firma Pall Corporation.
Eine Vielzahl von Reagenzien kann zur Imprägnierung des Materials verwendet werden, aufgestäubt werden oder in anderer Weise in Verbindung mit dem Filtermaterial 36 gebracht werden. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn mit dem Filtermaterial 36 protein blockierende Mittel in Verbindung gebracht werden. Der Typ des blockierenden Mittels ist nicht kritisch. Dies bedeutet, daß eine Vielzahl von proteinösen Materialien, Aminosäuren, Peptiden in geeigneter Weise verwendet werden können. Es wurde jedoch gefunden, daß Milchprotein den Erfordernissen genügt, so daß routinemäßig nichtfette Trockenmilch, Hersteller Carnation Corporation, verwendet wird. Zusätzlich kann es in solchen Fällen, in denen festes Matrixmaterial 24 chemisch vorbehandelt wird, um Antikörper kovalent zu binden, wünschenswert sein, Amino-reaktive Reagenzien von geringem Molekulargewicht, wie beispielsweise Glycin, als Blockierungsmittel zu verwenden.
Um Blockierungsmittel in wirksamer Weise mit dem Filtermaterial 36 zu assoziieren, ist es wünschenswert, das Filtermaterial 36 mit trockenem Material eine solche Zeitspanne lang in Kontakt zu bringen, die ausreicht, um das Material gleichförmig zu beschichten. Dies läßt sich erreichen durch Inkontaktbringen des Filtermaterials mit dem Blockierungsmittel, worauf jedes Material entfernt wird, das nicht fest auf dem Filter haftet.
Es ist offensichtlich, daß eine alternative Methode der Assoziierung des Blockierungsmittels mit dem Filtermaterial 36 darin besteht, das Material mit einer Lösung in Kontakt zu bringen, die das Blockierungsmittel enthält und das Material dann zu lyophilisieren. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn Blockierungsmittel von geringem Molekulargewicht (d.h. Glycin) verwendet werden. Obgleich Filtermaterialien, die in dieser Weise vorbehandelt sind, sich als geeignet für die vorliegende Vorrichtung erwiesen haben, ist dies doch keine bevorzugte Methode, da eine Lyophilisierung eine Härtung des Filters bewirkt, die wiederum die Zeitspanne erhöht, die erforderlich ist, damit Lösungen durch das Filtermaterial gelangen können. Das Ergebnis ist eine ungleichförmige Abscheidung des Blockierungsmittels auf dem Matrixmaterial 24 und eine Erhöhung des Hintergrundes.
Zusätzlich zur Assoziierung von Blockierungsmitteln mit dem Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 kann es ebenfalls wünschenwert sein, das Material, das zur Durchführung der Bestimmung verwendet wird, mit anderen Reagenzien zu imprägnieren, um dadurch zu verhindern, daß diese Reagenzien in separaten Stufen zugeführt werden müssen. Beispielsweise ist vorherzusehen, daß Reagenzien, die dazu verwendet werden, um die Gegenwart des Antikörper-Antigen-Komplexes anzuzeigen, d.h. von Antikörper-Enzym-Konjugaten oder Enzymsubstraten, in entsprechender Weise mit dem Filtermaterial 36 assoziiert werden können.
Ein zweites Merkmal der vorliegenden Erfindung, auf das oben angespielt wird, und das wichtig ist für die Erzielung einer Langzeit-Raumtemperaturstabilität der diagnostischen Vorrichtung, besteht in der Verwendung eines geeigneten chemischen Trockungsmittels in der Kammer 18 im Boden- Abschnitt 14. Die Stabilität oder Lebensdauer der Materialien im Matrixmaterial 24 oder des Filtermaterials 36 ist eine Funktion der Feuchtigkeit, die in der Vorrichtung vorhanden ist. Gegenwärtig verwendete immunodiagnostische Vorrichtungen weisen eine Lebensdauer von weniger als 6 Monaten bei Raumtemperatur auf, wohingegen die vorliegende Vorrichtung eine Raumtemperatur-Lebensdauer von bis zu einem Jahr hat. Es wurde gefunden, daß durch Assoziierung eines Trockungsmittels mit der diagnostischen Vorrichtung die Reagenzien stabil bleiben und über diese Zeitspanne eine außergewöhnliche Beständigkeit aufweisen. Eine Vielzahl von Trocknungsmitteln ist bekannt und ist als geeignet erkannt worden.
Um das Vorhandensein des Immunkomplexes auf dem Matrixmaterial 24 festzustellen, ist es im allgemeinen erforderlich, daß ein markiertes zweites Detektormolekül verwendet wird. In dem Falle, indem der Komplex ein Immunkomplex ist, ist das Detektormolekül ein zweiter Antikörper mit einer Spezifität für eine Antigenbindung an den ersten Antikörper, bindet jedoch Antigen an einer Stelle entfernt von der, an der der erste Antikörper gebunden wird. Traditionelle Methoden zur Feststellung des Vorhandenseins von Antigen verwenden einen markierten zweiten Antikörper, indem die Markierung oftmals ein radioaktiver Indikator ist oder in jüngerer Zeit ein Enzym, das zur Hydrolysierung eines farblosen Substrates geeignet ist, um eine erkennbare Farbveränderung herbeizuführen, wodurch der Immunkomplex erkennbar wird. Eine Vielzahl von Enzymen ist in Kombination mit dem geeigneten Substrat verwendbar. Beispielsweise lassen sich Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase und andere, die dem Fachmann bekannt sind, in geeigneter Weise verwenden. Die meisten dieser Enzyme verwenden Diazonium- oder Tetrazoliumsalze als Substrate. Beispiele für die erstgenannten sind Naphthol AS MX Phosphat sowie Diazo-2-amino-5-chloro-Anisol, das als Substrat für alkalische Phosphatase verwendet wird.
Methoden der Assoziierung von Enzymen mit einem zweiten Antikörper sind dem Fachmann bekannt und beruhen primär auf der chemischen Kupplung des Enzyms mit dem Antikörper. Verfahren zur Kupplung von Antikörpern durch chemische Quervernetzung werden beschrieben von O'Sullivan und Marks in Methods in Enzymology, (1981) (73:147), Verlag Academic Press, New York. Wird Meerrettich-Peroxidase verwendet, besteht eine geeignete Kupplungsmethode in der Methode, die von Nakane und Kanaoi in dem Journal of Histology and Cytochemistry (1974) (82:1084) beschrieben wird. Diese Methode konjugiert in effektiver und direkter Weise das Enzym an den Antikörper; jedoch sind auch andere Methoden gut bekannt, beispielsweise kann auf dem zweiten Antikörper mit an Avidin gebundener Meerrettich-Peroxidase eine Biotin- Avidin-Brücke erzeugt werden.
Anstelle einer chemischen Kupplung des Enzyms an das zweite Antikörper-Enzym-Konjugat, kann es vorteilhaft sein, das Enzym in den Antikörper zu integrieren. Dieses läßt sich beispielsweise erreichen durch einen genetischen Aufbau von Hybridmolekülen mit sowohl einem Antikörperbindungszentrum, wie auch einem aktiven Enzymzentrum. Beispielsweise läßt sich ein Antikörper modifizieren durch DNA-Recombinant- Techniken, wie sie beschrieben werden von Neuberger und Mitarbeitern in Recombinant Antibody Possessing Novel Effector Function, Nature (1984) (312:604). Es ist zu erwarten, daß dieser Typ von Enzymkonjugat direkt in das Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 eingebracht werden kann oder in einer nachfolgenden Stufe zugeführt werden kann, um den Immunkomplex zum Vorschein zu bringen, der auf dem Matrixmaterial 24 erzeugt wurde.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die Antikörper, die auf dem Matrixmaterial 24 abgeschieden werden, oder die das Antikörper-Enzym-Konjugat umfassen, entweder monoclonal oder polyclonal sein können. Nachdem das Antikörper-Enzym- Konjugat dem Matrixmaterial 24 zugegeben worden ist und eine ausreichende Zeitspanne verstrichen ist, um eine Bindung des Antikörper-Enzym-Konjugats an gebundenes Antigen zu maximieren, wird eine Lösung zugeführt, die ein geeignetes Enzymsubstrat enthält, worauf das Auftreten von Farbe beobachtet wird, als Anzeichen des Vorhandenseins des Antigens in der Bestimmungsprobe. In den meisten Fällen ist es nicht erforderlich, eine Waschstufe einzuführen, nachdem das Konjugat zugeführt worden ist und bevor die Zugabe des Substrates erfolgt. Eine Waschstufe ist deshalb nicht erforderlich, weil die Trichterform der Öffnung 26 es ermöglicht, daß eine große Menge an Substratlösung durch einen kleinen Oberlächenbereich des Substratmaterials gelangt. Infolgedessen hat der Zusatz der Substratlösung die Wirkung einer Waschstufe. Nichtsdestoweniger jedoch kann es in manchen Fällen wünschenswert sein, eine Waschstufe einzuschalten, um einen unerwünschten Hintergrund zu eliminieren.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Bestimmung von chorionischem Gonadotropinhormon (hCG)

Dieses Beispiel wird unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 beschrieben. Eine Menge von Urin, entsprechend ungefähr 0,5 ml und enthaltend 25 mIE/ml hCG wurde auf die Filtervorrichtung 28 aufgebracht. Der Urin gelangt mit dem Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 in Kontakt und gelangt durch das Filtermaterial, wobei er Protein-Blockierungsmittel, Milchprotein, mit dem das Filtermaterial 36 imprägniert ist, mitführt. Das Filtrat, das das Blockierungsmittel enthält, gelangt durch die Öffnung 26, die in dem Oberteil 12 vorhanden ist und gelangt in Kontakt mit Matrixmaterial 24. Das Matrixmaterial 24 ist mit Antikörpern von menschlichem hCG imprägniert. Das Matrixmaterial war aus Nylon hergestellt, einem Typ der bekannt ist und routinemäßig verwendet wird.
Die Imprägnierung des Matrixmaterials 24 erfolgte unter Verwendung einer Drucker/Codiermaschine, wie sie beschrieben wird in den US-PS 3 281 860 und 4 121 222 durch Aufbringung eines schmalen Flüßigkeitsstromes auf das Matrixmaterial 24, enthaltend monoclonale Mäuse-Antikörper, gerichtet gegen die α-Kette von hCG. Der Antikörper wurde in ungefähr 1,5 mm breiten Linien aufgebracht Aus Zweckmäßigkeitsgründen für den Endverbraucher der Vorrichtung wurden Antikörper in einer vertikalen Linie aufgebracht, die über eine horizontale Linie von zuvor aufgebrachten Goat-Antimäuse-Antikörper, der IgG-Klasse geführt wurde. Letztere wird im folgenden mehr im Detail beschrieben werden. Das Aufbringen von Antikörper bestand in dem Aufsprühen einer Lösung, enthaltend 4 mg pro Milliliter von monoclonalem Mäuse- Antikörper gegen die α-Kette von hCG in einem geeigneten Puffer, wobei sich eine Phosphatpuffersalzlösung als geeignet erwiesen hat. Diese bestand aus 10 mM Natriumphosphat mit 150 mM Natriumchlorid, pH-Wert 7,1. Zusätzlich enthielt die Lösung 100 Microgramm pro Milliliter Fluorescin und ein statisches bakterielles Mittel, z.B. 0,1% Natriumazid. Fluorescin wurde der Lösung zugesetzt, damit das Muster des Antikörpers, das auf dem Matrixmaterial 24 erzeugt wurde, visuell zu erkennen war.
Nachdem das Filtrat durch das Filtermaterial 36 gelangt war, gelangte es mit dem Matrixmaterial 24 in Kontakt. hCG, das im Filtrat vorhanden war, wurde an den hCG-Antikörper gebunden, mit dem das Matrixmaterial 24 imprägniert worden war. Zusätzlich, gleichzeitig hiermit, wurde das Blockierungsmittel, das im Filter 36 vorhanden war, an das Matrixmaterial 24 gebunden, und zwar in anderen Zentren als denjenigen, in denen der monoclonale Antikörper gebunden wurde. Hierdurch wurden die Zentren für die Umsetzung mit nachfolgend zugesetzten Reaktanden unzugänglich gemacht. Eine kurze Zeitspanne, nachdem das Filtrat mit dem Matrixmaterial 24 in Kontakt gelangt war, wurden zwei Tropfen einer Lösung zugegeben, die ein zweites monoclonales Mäuse- Antikörper-Enzymkonjugat enthielt. Dieser zweite Antikörper ist gerichtet gegen die β-Untereinheit von hCG, und wird an ein Epitop gebunden, das verschieden ist von dem, an das der erste Antikörper gebunden wird, der an das Matrixmaterial gebunden ist. Die Entzymkomponente des Konjugates bestand aus alkalischer Phosphatase. Das Antikörper-Enzym-Konjugat gelangte durch das Filtermaterial 36, worauf es mit dem Matrixmaterial 24 in Kontakt gelangte, und zwar eine solche Zeitspanne lang, die ausreichend war, damit das Konjugat mit hCG, gebunden an den ersten Antikörper, reagieren und sich hiermit vereinigen konnte. Im allgemeinen wird hierzu etwa 1 min benötigt.
Um den Komplex sichtbar zu machen, der sich auf dem Matrixmaterial 24 gebildet hat, wurde eine Lösung direkt auf das Matrixmaterial 24 gebracht, die ein Substrat für alkalische Phosphatase, Indoxylphospat, enthielt. In etwa 1 min bildete sich auf dem Matrixmaterial 24 eine blaue Farbe in einem "+"-Muster, wodurch angezeigt wurde, daß die Bestimmungsprobe hCG enthielt. Sollte ein "-"-Zeichen auftreten, so enthält die Probe nur unbedeutende Mengen an hCG. Es ist ausreichend, wenn ungefähr 0,5 ml der Substratlösung, enthaltend 4 mM Indoxylphosphat verwendet werden.
Zum Schluß wurde eine Menge einer geeigneten die Reaktion unterbrechenden Lösung zum Matrixmaterial 24 zugegeben. 0,5 ml einer Lösung, enthaltend 0,1% Essigsäure, arbeitet in zufriedenstellender Weise.
Das "+"-Muster, das oben erwähnt wurde, ergab sich durch Abscheidung des ersten Anti-hCG-Antikörpers in einer vertikalen Linie über einer horizontalen Linie von entweder zweitem Antikörper-Enzym-Konjugat, Enzym allein oder Goat- Antimäuse-Antikörper. Letzterer ist bevorzugt, da er mit dem Typ von Reagens zusammenpaßt (d.h. Protein-Antikörper), der verwendet wurde, um die vertikale Linie des "+"-Musters zu erzeugen. Dies bedeutet, daß ein Aktivitätsverlust mit der Zeit im Falle eines Reagens ausgeglichen wird durch einen entsprechenden Verlust beim anderen. Unabhängig vom Typ des verwendeten Reagens zur Bildung der horizontalen Linie, können sie aufgebracht werden durch Aufsprühen auf das Matrixmaterial 24, wie oben beschrieben.

Beispiel 2

Raumtemperaturstabilität

Die Materialien und Methoden, die in Beispiel 1 verwendet wurden, können in entsprechender Weise hier verwendet werden. Nach Aufbewahrung einer diagnostischen Vorrichtung mehr als 1 Jahr lang bei Raumtemperatur, wurde es erfolgreich zur Bestimmung einer Probe verwendet, die 25 mIE-ml von hCG enthielt.

Beispiel 3

Antigen-Imprägnierung des Matrixmaterials

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorliegende diagnostische Vorrichtung nicht nur zur Bestimmung von Antigenen geeignet ist. In gleicher Weise ist es möglich, zirkulierende Antikörper zu ermitteln, die in Körperflüssigkeiten eines Patienten vorhanden sind, bei dem eine Veränderung in seinem Immunsystem festgestellt wurde. Dies wird erreicht durch Anbringen des Antigens an das Matrixmaterial, und zwar des Antigens, das verantwortlich ist für die Entlockung der Immun-Erwiderung, worauf eine Untersuchung auf das Vorhandensein von Antikörper erfolgt. Dieser Aspekt der diagnostischen Vorrichtung ist anwendbar beispielsweise für die Ermittlung oder Steuerung einer Auto- Immunität oder von allergischen Leiden.
Um diesen Aspekt der Erfindung zu veranschaulichen, wurde inaktivierter Rubella-Virus an das Matrixmaterial 24, das in Fig. 2 gezeigt wird, gebunden unter Verwendung einer Druck- Codiermaschine, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Nachfolgend wurde der Filtervorrichtung 28, die in Fig. 2 dargestellt wird, eine Lösung zugeführt, die zu bestimmenden Antivirus-Antikörper enthielt, die durch das Filtermaterial 36 strömte und dadurch ein Filtrat erzeugte, das durch die Öffnung 26 gelangte. Das Filtrat gelangte mit dem Matrixmaterial 24 in Kontakt, das gebundenen Virus enthielt. Anti- Rubellavirus-Antikörper wurde an den Virus auf der Matrix gebunden, worauf die Bestimmung des Anti-Rubella-Antikörpers im Filtrat erreicht wurde durch Hindurchführen einer Lösung, enthaltend Antikörper-Enzym-Konjugat, wobei der Antikörper gegen gebundenen Anti-Rubella-Antikörper gerichtet war. Die Antikörperkomponente des Konjugats muß lediglich dazu geeignet sein, ein Epitop auf dem Anti-Rubella-Antikörper zu erkennen, um wirksam zu sein. Angenommen, der zu bestimmende Anti-Rubella-Antikörper ist menschlicher Natur, dann sollte die Antikörperkomponente des Konjugates ein menschlicher Antikörper sein. Die übrigen Stufen dieses Bestimmungsverfahrens sind analog demjenigen, das in Beispiel 1 beschrieben wird. Das Endergebnis ist das Auftreten von Farbe auf dem Matrixmaterial 24, wodurch das Vorhandensein von Anti-Rubella-Antikörper in der Bestimmungsflüssigkeit angezeigt wird.

Beispiel 4

Imprägnierung des Filtermaterials mit Bestimmungs- Reagenzien

Ein Ziel bei diagnostischen Untersuchungen ist es, eine Testvorrichtung zu entwickeln, die wenige Arbeitsstufen erfordert. Durch Verbindung von Bestimmungs-Reagenzien mit dem Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 ist es möglich, solche Stufen zu eliminieren, in denen die Reagenzien separat zum Matrixmaterial 24 zugegeben werden, um die Bestimmung durchzuführen.
Die Imprägnierung des Filtermaterials 36 mit proteinösen blockierenden Mitteln wurde erreicht durch Pulverisierung von Milchpulver, erhalten von nicht-fetter trockener Milch (Carnation Corporation), sowie Sieben zur Entfernung von großen Körnchen, die noch vorhanden sind. Danach wurde das Filtermaterial aus Glasfasern (Vorfilter-Typ Ultipor GF Filter U6-40, Hersteller Pall Corporation) in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate zerschnitten, worauf sie in einem geschlossenen Behälter mit einem geeigneten Trocknungsmittel aufbewahrt wurden. Die Papiere wurden dann mit pulverisiertem Milchpulver solange vermischt, bis die Filter mit Milchpulver imprägniert waren, wozu im allgemeinen ungefähr 3 h benötigt werden. Eine gleichförmige Verbindung des Milchpulvers mit dem Filter wurde durch Umstürzen erreicht oder durch eine andere Bewegung der Filter im Kontakt mit dem Pulver.
Überschüssiges Milchpulver wurde von den Filterquadraten durch Absieben durch ein Mehlsieb erreicht, worauf die Filter in einen Behälter überführt wurden, in dem sie eine solche Zeitspanne lang geschüttelt wurden, bis noch vorhandenes loses Milchpulver entfernt worden war. Hierzu ist im allgemeinen etwa 1 h erforderlich. An diese Stufe schloß sich eine zweite Siebstufe an, um überschüssiges Milchpulver zu entfernen, das früher noch nicht entfernt worden war. Die Filter wurden in einem Container in Gegenwart eines geeigneten Trocknungsmittels aufbewahrt. Filter, die nach dieser Technik hergestellt werden, sind direkt in der diagnostischen Testvorrichtung verwendbar.

Beispiel 5

Bestimmung von mehreren Antigenen

Die Materialien und Methoden, die in diesem Beispiel angewandt wurden, entsprachen jenen des Beispieles 1 mit den folgenden Ausnahmen. Das Matrixmaterial 24 wurde mit zwei Antikörpern behandelt, die durch ausgeprägte antigenische Eigenschaften gekennzeichnet waren, wobei einer der Antikörper gegen die β-Untereinheit von luteinisierendem Hormon (LH) gerichtet war und der andere gegen die β-Untereinheit von Stimulierendem Follikelhormon (FSH). Unter Verwendung einer Drucker-Codiermaschine, wie in Beispiel 1 beschrieben, können die Antikörper in diskreten Mustern auf dem Matrixmaterial 24 abgeschieden werden. Der zweite Antikörper, der das Antikörper-Enzym-Kojugat für die Bestimmung von entweder LH oder FSH enthält, kann entweder ein einzelner monoclonaler Antikörper sein, der ein übliches Epitop auf LH und FSH erkennt, oder er kann zwei monoclonale Antikörper umfassen, die an verschiedene Epitope auf LH und FSH gebunden werden. Im letzteren Falle können zwei verschiedene Enzyme, die zu verschiedenen Farbreaktionen führen, an die monoclonalen Antikörper gebunden werden, um ausgeprägte farbige "+"-Muster zu erzeugen. Beispielsweise können alkalische Phosphatase und B-Galactosidase verwendet werden, in welchem Falle die zuerst genannte Komponente einen roten Farbton mit einem geeigneten Substrat liefert und die zweite Komponente einen blauen Farbton. Schließlich kann die Horizontallinienkomponente des "+"-Musters für LH und FSH, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugt werden.

Beispiel 6

Empfindlichkeit der diagnostischen Vorrichtung

Die Materialien und Methoden, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden hier dazu verwendet, um die Empfindlichkeit und Zeitspanne der Leistungsdauer der vorliegenden Vorrichtung mit gegenwärtig gebrauchten handelsüblichen Vorrichtungen zu vergleichen. Im Falle der handelsüblichen Geräte wurden die Vorschriften der Hersteller befolgt. Es wurden Lösungen mit verschiedenen Mengen an hCG getestet und die Tabelle 2 veranschaulicht die bestimmbare untere Grenze oder Empfindlichkeit der Vorrichtungen. In der Tabelle sind ferner zusammengestellt die Methode, nach der die Bestimmung durchgeführt wurde, die Typen der Antikörper sowie die Zeitspanne, die benötigt wurde, um die Bestimmung durchzuführen.
Die oben beschriebene Erfindung wurde veranschaulicht unter Bezugnahme auf die Verwendung spezieller Materialien und Methoden. TABELLE 1 ICON (Hybritech, Inc.) hCG Kit erfordert die Aufbewahrung bei 2-8ºC TEST PACK (Abbott Labs, Inc.), hCG Antikörper-Enzym-Konjugat sollte bei 2-8ºC aufbewahrt werden RAMP (Monoclonal Antibodes, Inc.), hCG Kit sollte bei 2-8ºC aufbewahrt werden TABELLE 2 Diagnostische Vorrichtung Methode Antikörperlieferant Reaktions-Dauer Empfindlickeit Vorliegende Vorrichtung TEST PACK hCG-URINE Abbott Lab. ICON HCG-Urine Hybritech TANDEM Visual HCG (Urine) Hybritech RAMP Urine hCG Assay Monoclonal Antbodies, Inc. DUOCLONE Slide Organon BETA Quik Stat Pacific Biotech, Inc. EIA, beschichtetes Membran EIA, beschichtetes Filter EIA, beschichtete Perlen Latex-Agglutination EIA, beschichtete Röhre Maus Monoclon

Claims

1. Verfahren zum Imprägnieren einer Matrix (24) mit Antikörpern oder Antigenen ohne die Verwendung von Haftmitteln, mit den Schritten:

Hindurchleiten einer Lösung der genannten Antikörper oder Antigene durch eine Düse, um freie Flüssigkeitströpfchen zu bilden, die die genannten Antikörper oder Antigene enthalten; und

Führen der genannten Flüssigkeitströpfchen durch die Luft in Richtung auf eine Matrix (24) , wodurch die genannten Antikörper oder Antigene daran gemäß einem vorbestimmten makroskopischen Muster abgelagert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannten Tröpfchen elektrostatisch geladen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannten Tröpfchen zu dem genannten vorbestimmten makroskopischen Muster auf der genannten Matrix (24) mittels eines elektrostatischen Feldes abgelenkt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die genannten Antikörper oder Antigene in Form von deren bioaktiven molekularen Derivaten vorliegen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das genannte, vorbestimmte makroskopische Muster eine erste Zone, die dazu dient, ein positives Testergebnis anzuzeigen, und eine zweite Zone beinhaltet, die als Positivkontrolle für einen Immuntest dient.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das genannte Muster auf der genannten Matrix (24) so beschaffen ist, daß bei Verwendung bei einem Immuntest die genannte zweite Zone allein ein erstes Symbol beim Auftreten eines negativen Testergebnisses zur Verfügung stellt und die genannten ersten und zweiten Zonen zusammenwirken, um ein zweites Symbol beim Auftreten eines positiven Testergebnisses zur Verfügung zu stellen.

7. Verfahren zum Imprägnieren von für immundiagnostische Prüfung geeignetes Matrixmaterial mit Immunchemikalien wie in Anspruch 1 beansprucht, beinhaltend das in Lösung Bringen der genannten Immunchemikalien, das Bilden eines dünnen Stromes der genannten Lösung, das Fragmentieren des genannten dünnen Stromes in Tröpfchen, das Aufbringen einer Ladung auf die genannten Tröpfchen, das Hindurchführen der genannten geladenen Tröpfchen durch ein elektrisches Feld, um dadurch die genannten Tröpfchen zu einem vorbestimmtem Muster auf dem genannten Matrixmaterial abzulenken.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die genannten immunchemischen Reagenzien in der genannten Lösung aus der Gruppe, die aus Antikörper, Antigen sowie Kombinationen oder Derivaten dieser Moleküle besteht, ausgewählt sind.