DE69414726T2

DE69414726T2 - Gerät zur trennung,konzentrierung und zum nachweis von zielmolekuelen in einer flüssigen probe

Info

Publication number: DE69414726T2
Application number: DE69414726T
Authority: DE
Inventors: Sarah Hanagid 76875 Alajem; Avraham 76450 Rehovot Reinhartz; Menachem 70400 Ness Ziona Ritterband; Ileana 76341 Rehovot Rusu; Michal 82000 Kiryat Gat Schrift
Original assignee: Orgenics International Holdings BV
Current assignee: Orgenics International Holdings BV
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2014-12-21
Also published as: EP0738392B1; IL108159A0; DE69414726D1; JPH09506971A; WO1995017676A1; AU1384195A; US5698395A; IL108159A; EP0738392A1

Description

VORRICHTUNG ZUR ABTRENNUNG, KONZENTRATION UND ZUM NACHWEIS VON ZIELMOLEKÜLEN IN EINER FLÜSSIGEN PROBE

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe.
Die Verwendung von Versuchsvorrichtungen, die als ein Abtrennungs-, Konzentrations- und Nachweisverfahren die Chromatographie nutzen, ist dem Stand der Technik gut bekannt. Zum Beispiel beschreibt die europäische Patentanmeldung 0 262 328 A3 einen Teststreifen zum Nachweis von Analyten wie beispielsweise Antigenen und Antikörpern. Chromatographische Testvorrichtungen wie beispielsweise die im US-Patent 4.857.453 von Ullman et al. beschriebenen, können auch in einem Gehäuse eingeschlossen sein.
Eine Einschränkung von chromatographischen Vorrichtungen wie beispielsweise jenen oben beschriebenen ist die, daß die Waschverfahren langsam sind, da die Waschflüssigkeit die gesamte Länge des chromatographischen Weges durchlaufen muß. Eine Vorrichtung, in der eine Waschlösung nur über einen Abschnitt des chromatographischen Weges transportiert wird, ist in der PCT-Anmeldung WO 91/15769 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Vorrichtung zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe bereit. Es wird so eine Vorrichtung zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer die Zielmoleküle und Nicht-Zielmoleküle enthaltenden flüssigen Probe bereitgestellt, die mindestens einen Absorptionsbereich, einen saugfähigen Träger, der einen ersten Flüssigkeitstransportpfad in Flüssigkeitskontakt mit dem mindestens einen Absorptionsbereich definiert, mindestens einen Reaktionsbereich stromaufwärts des mindestens einen Absorptionsbereichs, wobei der Reaktionsbereich ein den Probenbereich aufgegeben wird, mittels Kapillarwirkung bis hinter den Reaktionsbereich transportiert wird, wo mindestens ein Teil der Zielmoleküle an das Einfangreagens gebunden werden kann, um den Nachweis der Zielmoleküle zu erlauben, und wonach die flüssige Probe durch Kapillarwirkung auf den Absorptionsbereich transportiert wird, und wobei die Vorrichtung einen zweiten Flüssigkeits-Transportpfad in Flüssigkeitsverbindung mit dem Reaktionsbereich des saugfähigen Trägers zum Transport einer Waschlösung, die auf den Reaktionsbereich aufgegeben wird, zu dem mindestens einen Absorptionsbereich hin umfaßt, wodurch interferierende Substanzen aus dem Reaktionsbereich entfernt werden; und wobei die Vorrichtung Mittel zur Alternativauswahl zwischen dem ersten und zweiten Flüssigkeitstransportpfad während des Kapillartransportes der flüssigen Probe umfaßt, wobei das Mittel eine flüssigkeitsundurchlässige zersetzbare Wandung zwischen dem saugfähigen Träger und dem Absorptionsbereich umfaßt.
In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Vorrichtung zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis in einem Gehäuse eingeschlossen.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Gehäuse eine Probenöffnung, die in Fluidverbindung zum Probenbereich steht.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Gehäuse eine Waschöffnung, die in Fluidverbindung zum Reaktionsbereich steht.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der mindestens eine Absorptionsbereich einen ersten Absorptionsbereich und einen zweiten Absorptionsbereich.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht der zweite Absorptionsbereich in unmittelbarer Fluidverbindung mit dem ersten Absorptionsbereich, um einen Rückfluß aus dem ersten Absorptionsbereich durch den saugfähigen Träger in den zweiten Absorptionsbereich zu verhindern.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der saugfähige Träger eine Nitrozellulose-Membran, worin die Absorptionsstellen blockiert wurden, um den Transport der Zielmoleküle zu erleichtern.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der saugfähige Träger eine Glasfasermatrix.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zersetzbare Wandung durch die flüssige Probe zersetzt.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zersetzbare Wandung durch eine Substanz zersetzt, die zu der flüssigen Probe hinzugegeben wird.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zersetzbare Wandung durch eine Lösung zersetzt, die auf den Probenbereich aufgegeben wird, nachdem die flüssige Probe aufgegeben worden ist.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zersetzbare Wandung durch eine Substanz zersetzt, die auf den Reaktionsbereich aufgegeben wird, nachdem die Zielmoleküle an den Reaktionsbereich gebunden sind.
In Übereinstimmung mit noch: einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zersetzbare Wandung über eine vorbestimmte Zeitspanne zersetzt.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zersetzbare Wandung aus einem Netzwerk hergestellt, das in eine Verbindung eingebettet ist, die aus der Gruppe gewählt wird, die wasserlösliche Polymere, pH-labile Substanzen, Ionenstärkelabile Substanzen und enzymatisch aufschließbare Substanzen einschließt.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die wasserlöslichen Polymere wasserlösliche Polyester.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Zielmoleküle Ziel-Nukleinsäuresequenzen.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Ziel- Nukleinsäuresequenzen DNA-Sequenzen.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Ziel- Nukleinsäuresequenzen RNA-Sequenzen.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Zielmoleküle Antigene.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Zielmoleküle Antikörper.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Einfangreagens mindestens ein Nukleinsäure-Einfangreagens; das Nukleinsäure-Probensequenzen umfaßt, die zu zumindest einem Teil der Ziel-Nukleinsäuresequenzen komplementär sind.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Einfangreagens mindestens ein Antigen.
In Übereinstimmung mit wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Einfangreagens mindestens einen Antikörper.
Die vorliegende Erfindung wird im Zusammenhang mit der nachfolgenden detaillierten Beschreibung besser verstanden und geschätzt werden, und zwar unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 eine in Einzelteile zerlegte bildliche Darstellung der Vorrichtung zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe ist, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung montiert worden ist und gemäß der vorliegenden Erfindung betriebsbereit ist; und
Fig. 2 eine seitliche Querschnittsansicht der Vorrichtung entlang der Linie 11-11 der Fig. 1 ist.
Es wird nun auf die Fig. 1 und 2 Bezug genommen, die eine Vorrichtung 10 zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe darstellen, das in Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung montiert worden und betriebsbereit ist.
Die Vorrichtung 10 umfaßt ein Gehäuse 12, das aus einem spritzgußfähigen, strahlungssterilisierbaren Kunstoff wie beispielsweise Polyethylen hergestellt wird. Das Gehäuse 12 umfaßt ein oberes Glied 14 und ein unteres Glied 16, die durch irgendeine geeignete Maßnahme wie beispielsweise Verklebung miteinander vereint sind.
Das Gehäuse beinhaltet für gewöhnlich eine saugfähige Matrix 18, einen Absorptionsbereich 20 und eine zersetzbare Barriere 22. Die saugfähige Matrix 18 bildet, sobald sie benetzt ist, einen Kapillartransportpfad in Flüssigkeitsverbindung mit dem Absorptionsbereich und umfaßt stromaufwärts von einem Reaktionsbereich 26 einen Probenbereich 24, der in Flüssigkeitsverbindung mit dem Absorptionsbereich 20 steht.
Für gewöhnlich wird eine flüssige oder verdünnte Probe in der Menge von 0,1 ml bis 1,0 ml, die Ziel- und Nicht- Zielmoleküle umfaßt, durch eine Probenöffnung 28 im oberen Glied 14 des Gehäuses 12 auf den Probenbereich 24 aufgegeben. Die flüssige oder verdünnte Probe wird daraufhin durch Kapillarwirkung entlang einem ersten Transportweg in der saugfähigen Matrix 18 aus dem Probenbereich 24 in den Reaktionsbereich 26 transportiert, wo die Zielmoleküle zum späteren Nachweis durch ein Einfangreagens eingefangen werden können.
Das Einfangreagens ist typischerweise ein Antikörper gegen das Zielmolekül oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, die gegenüber wenigstens einem Teil des Zielmoleküls komplementär ist. Der Nachweis wird für gewöhnlich durch eine kolorimetrische Reaktion im Reaktionsbereich 26 zwischen einem Nachweisreagenz und den eingefangenen Zielmolekülen geführt.
Aus dem Reaktionsbereich 26 wird die flüssige Probe für gewöhnlich entlang dem ersten Transportpfad durch Kapillarwirkung zum Absorptionsbereich 20 geführt. Ein Abschnitt 31 des Absorptionsbereichs 20 grenzt normalerweise an eine untere Fläche der saugfähigen Matrix 18, die sich stromabwärts vom Reaktionsbereich 26 befindet, damit die Kapillarflußkräfte in der saugfähigen Matrix 18 maximiert werden.
Die saugfähige Matrix 18 und der Absorptionsbereich 20 werden für gewöhnlich durch einen druckempfindlichen schwach saugfähigen Kleber wie beispielsweise einen abscheidbaren Kleber - I.D. Nr. 62-9985-4830-4, 3M Industrial Specialties Div., ST. Paul MN, USA - am oberen Glied 14 befestigt.
Die zersetzbare Wandung 22 wird für gewöhnlich zwischen dem ersten Durchflußpfad und dem Absorptionsbereich 20 stromaufwärts von Abschnitt 31 angeordnet. Die zersetzbare Wandung 22 grenzt für gewöhnlich an den Absorptionsbereich 20 und trennt ihn von der saugfähigen Matrix 18, und zwar von einem stromabwärts von der Probenöffnung 28 gelegenen Punkt aus bis zu einem Teil des stromabwärts vom Reaktionsbereich 26 und stromaufwärts vom Abschnitt 31 des Absorptionsbereichs 20 befindlichen Absorptionsbereichs 20. Die zersetzbare Wandung 22 erstreckt sich für gewöhnlich seitlich über die saugfähige Matrix 18 und den Absorptionsbereich 20 hinaus und wird normalerweise in den Bereichen, die nicht durch die saugfähige Matrix 18 bzw. den Absorptionsbereich 20 abgedeckt werden, durch einen druckempfindlichen, schwach saugfähigen Kleber befestigt. Die seitliche Ausdehnung der zersetzbaren Wandung 22 über den Absorptionsbereich 20 hinaus blockiert, außer am Abschnitt 31, den unmittelbaren Flüssigkeitskontakt zwischen der saugfähigen Matrix 18 und dem Absorptionsbereich 20, bis die zersetzbare Wandung 22 zersetzt wird.
Wenn die zersetzbare Wandung 22 zersetzt wird, wird für den Kapillartransport zwischen dem Reaktionsbereich 26 und dem Absorptionsbereich 20 durch die saugfähige Matrix 18 ein zweiter Transportweg errichtet. Dieser zweite Transportweg kann dazu verwendet werden, aus dem Reaktionsbereich 26 interferierende Verbindungen herauszuwaschen, indem durch die Waschöffnung 30 im oberen Glied 14 einen Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben wird.
Die zersetzbare Wandung 22 kann für gewöhnlich aus Verbindungen hergestellt sein, die auf einem Netzträger aus polymerem Kunststoffmaterial eingebettet sind. Diese Verbindungen umfassen normalerweise wasserlösliche Polymere wie beispielsweise Polyester aus Milchsäure- und Glykolsäurecopolymeren, pH- oder Ionenstärkelabile Substanzen wie beispielsweise Polyhydroxymethylacrylat und Carbopol und enzymatisch aufschließbare Substrate wie beispielsweise Gelatine, die von Gelatinase aufgeschlossen werden kann.
Der Absorptionsbereich 20 ist für gewöhnlich in einer Vertiefung 31 im unteren Glied 16 eingepaßt. Der Absorptionsbereich 20 ist normalerweise so hergestellt, daß er die ganze Flüssigkeit absorbiert, die bei der Verwendung in einem Assayverfahren in die Vorrichtung 10 eingebracht wird.
Das zur Abtrennung, Konzentration und, zum Nachweis von Zielmolekülen verwendete Verfahren, das die Vorrichtung 10 verwendet, umfaßt für gewöhnlich das Aufgeben von 0,05 ml bis 0,5 ml einer Probenflüssigkeit durch die Probenöffnung 28 auf den Probenbereich 24 der saugfähigen Matrix 18. Eine Waschflüssigkeit kann danach auf den Probenbereich 24 aufgegeben werden, wenn das Probenflüssigkeitsvolumen für den wirkungsvollen Kapillartransport der Probenflüssigkeit zum Reaktionsbereich 26 nicht ausreicht. Die Probenflüssigkeit oder die Waschflüssigkeit kann eine Verbindung enthalten, die die zersetzbare Wandung 22 zersetzt.
Die Kapillar- und die chromatographischen Kräfte innerhalb der saugfähigen Matrix 18 ziehen den flüssigen Teil der Probe entlang dem ersten Transportweg aus dem Probenbereich 24 in Richtung des Reaktionsbereichs 26 und auf den Absorptionsbereich 20. Wenn die Flüssigkeit durch den Reaktionsbereich 26 wandert, reagieren die Zielmoleküle in der Probenflüssigkeit mit einem spezifischen komplementären Einfangreagens wie beispielsweise einem immunologischen Reagenz, einem chemischen Testreagenz oder einem Nukleinsäuresequenzreagenz, das am Reaktionsbereich 26 immobilisiert wurde, oder sie binden daran.
Das Absorptionsvermögen des Abschnitts 31 und der Kontakt zwischen dem Absorptionsbereich 20 und der saugfähigen Matrix 18 am Abschnitt 31 verhindern einen Gegenstrom der Flüssigkeit entlang dem ersten Transportweg vom Absorptionsbereich 20 zurück zum Reaktionsbereich 26, sofern die saugfähige Matrix 18 überladen ist. Auf diese Weise strömt alle überschüssige Flüssigkeit, die auf die saugfähige Matrix 18 oder den Absorptionsbereich 20 aufgegeben wird, zum Abschnitt 31 anstatt im Gegenstrom.
Wenn die Flüssigkeiten entlang dem ersten Transportweg zur saugfähigen Matrix 18 transportiert werden, beginnt die entweder in der Probe oder in der Waschflüssigkeit enthaltene zersetzende Verbindung, die zersetzbare Wandung 22 zu zerstören, die die saugfähige Matrix 18 und den Absorptionsbereich 20 trennt. Die Zeit, die nach der Aufgabe der zersetzenden Verbindung für die Zersetzung der zersetzbaren Wandung 22 vergeht, kann üblicherweise in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der zersetzbaren Wandung im Bereich von 0,5 bis 45 Minuten liegen.
Nachdem der Kapillartransport der in den Probenbereich 24 eingegebenen Flüssigkeiten abgeschlossen ist, kann ein geeignetes Waschflüssigkeitsvolumen, normalerweise 0,1 ml bis 1,5 ml, durch die Reaktionsöffnung 30 unmittelbar auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben werden. Für gewöhnlich vollendet die auf den Reaktionsbereich 26 aufgegebene Waschflüssigkeit die Zerstörung der zersetzbaren Wandung 22, wodurch zwischen dem Reaktionsbereich 26 und dem Absorptionsbereich 20 der zweite Transportpfad durch die saugfähige Matrix 18 errichtet wird. Dieser zweite Durchflußweg erlaubt das schnelle und wirksame Auswaschen des Reaktionsbereichs 26, um alle nicht in Reaktion getretenen Probenmoleküle bzw. andere Verbindungen, die bei den nachfolgenden Schritten stören können, zu beseitigen. Die unmittelbar auf den Reaktionsbereich 26 aufgegebene Waschflüssigkeit kann jedoch alternativ den auflösenden Bestandteil enthalten.
Nach dem Waschen des Reaktionsbereichs 26 wird ein Immunoassay-Reagens bzw. ein chemisches Testreagenz, das komplementär zu den Zielmolekülen ist und mit einem Enzym oder einem anderen geeigneten Tracer konjugiert ist, durch die Reaktionsöffnung 30 direkt auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das meiste des ungebundenen Immunreagens-Konjugats bzw. des chemischen. Testreagenzes wird daraufhin durch das Aufgeben einer Waschflüssigkeit auf den Reaktionsbereich 26 aus dem Reaktionsbereich 26 heraus in den Absorptionsbereich 20 ausgewaschen. Wenn der Tracer ein Enzym ist, das ein Substrat benötigt, um eine Farbe zu entwickeln, wird ein Volumen dieses Substrats bzw. Chromogens unmittelbar nach dem Auswaschen des ungebundenen Reagenzes durch die Reaktionsöffnung 30 auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben.
Es wird nun auf die folgenden Beispiele Bezug genommen, die zusammen mit den Fig. 1 und 2 die Erfindung veranschaulichen.

BEISPIEL 1

NACHWEIS VON HIV

Synthetische HIV -1 (gp -41, gp -120) Antigen-Peptide wurden auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Etwa 300 Mikroliter eines vorverdünnten Blutserums wurden auf den Probenbereich 24 des Geräts 10 aufgegeben. Danach wurden 150 Mikroliter einer Waschlösung, die aus 1% Gelatine und 0,3% Tween®-20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung besteht, auf den Probenbereich 24 aufgegeben.
Unmittelbar nach dem Transport der Flüssigkeit zum Reaktionsbereich 26, was durch die Benetzung des Reaktionsbereichs 26 und das Verschwinden der Flüssigkeit aus dem Probenbereich 24 angezeigt wird, wurden 300 Mikroliter eines affinitätsgereinigten Kaninchen-anti-Human IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, und in einer Konjugatlösung größerer Viskosität verdünnt wurde, die eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween® 20,1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte, unmittelbar auf die benetzte Reaktionszone aufgegeben. Das nicht abreagierte Enzymkonjugat wurde aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen, indem 500 Mikroliter der Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben wurden. Zuletzt wurden 100 Mikroliter eines Substrat- Chromogens BCTP/NBT auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das Auftreten eines gefärbten Produkts an der Reaktionszone lieferte den Beweis für eine enzymatische Aktivität, die die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV -1 in der Probe andeutete.

BEISPIEL 2

NACHWEIS VON HIV-1

Rekombinantes HIV-1(gp-41) -Antigen wurde auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Nach der Immobilisierung des Antigens wurde die Reaktionszone blockiert, indem in den Reaktionszonenbereich 150 u1 eines Matrix-Blockers hinzugeben wurden, der eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die seinerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kalberserum, 0,05% Tween®20, 1% PVP 700.000 und 0,05% Thimerosal umfaßte. Der Matrix-Blocker wanderte aufgrund der Kapillarwirkung und benetzte beinahe die gesamte Glasfasermatrix.
Etwa 300 Mikroliter eines vorverdünnten Blutserums wurden auf den Probenbereich 24 der Vorrichtung 10 aufgegeben. Danach folgte die Aufgabe von 150 Mikroliter Waschlösung, die aus 1% Gelatine, 0,05% Thimerosal und 0,3% Tween®20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung bestand, auf den Probenbereich 24.
Nach dem Transport der Flüssigkeiten zum Reaktionsbereich 26, was durch die Benetzung des Reaktionsbereichs 26 und durch das Verschwinden der Flüssigkeit aus dem Probenbereich 24 angezeigt wird, wurden 300 Mikroliter eines affinitätsgereinigten Kaninchen-anti-Human IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert war und in einer Konjugatlösung größerer Viskosität verdünnt wurde, die eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kalberserum, 0,05% Tween® 20,1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte, unmittelbar auf die benetzte Reaktionszone aufgegeben. Das nicht abreagierte Enzymkonjugat wurde aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen, indem 600 Mikroliter der Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben wurden. Zuletzt wurden 300 Mikroliter eines Substrat- Chromogens BCIP/NBT auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das Auftreten eines gefärbten Produkts an der Reaktionszone lieferte den Beweis für eine Enzymaktivität, die die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV -1 in der Probe andeutete.

BEISPIEL 3

ERFASSUNG VON HIV-1 IM SPEICHEL

Synthetische HIV-1(gp - 41, gp - 120)-Antigen-Peptide wurden auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Nach der Immobilisierung des Antigens wurde die Reaktionszone blockiert, indem zum Reaktionszonenbereich 150 ul eines Matrix-Blockers hinzugeben wurden, der eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween®20, 1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte. Der Matrix-Blocker wanderte aufgrund der Kapillarwirkung und benetzte beinahe die gesamte Glasfasermatrix.
Etwa 200 Mikroliter vorbehandelten Speichels wurden dann auf den Probenbereich 24 der Vorrichtung 10 aufgegeben. Der Speichel wurde gemäß dem Benutzerhandbuch von Omni-Sal®, Saliva Diagnostic Systems Inc., Trantdale, OR, USA, vorbehandelt.
Unmittelbar nach dem Transport der Flüssigkeiten zum Reaktionsbereich 26, was durch die Benetzung des Reaktionsbereichs 26 und das Verschwinden der Flüssigkeit aus dem Probenbereich 24 angezeigt wird, wurden etwa 200 Mikroliter eines Affinitäts-gereinigten Kaninchen-Anti-Human IgG, das mit Kohlenstoff Sol Partikeln (Holland Biotechnology Co., Leiden, Niederlande) konjugiert war und in einer Konjugatlösung größerer Viskosität verdünnt wurde, die eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween 20,1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte, unmittelbar auf die benetzte Reaktionszone aufgegeben. Das nicht abreagierte Konjugat wurde durch dreimaliges Aufgeben von 500 Mikrolitern der Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen. Das Auftreten eines farbigen Punkts an der Reaktionszone lieferte den Beweis, der die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV -1 in der Probe andeutete.

BEISPIEL 4

ERFASSUNG VON HELICOBACTER PYLORI

Ein Helicobacter Pylori-Antigen wurde auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Nach der Immobilisierung des Antigens wurde die Reaktionszone blockiert, indem in den Reaktionszonenbereich 150 ul eines Matrix-Blockers hinzugeben wurden, der eine Phosphat-gepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween®20, 1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte. Der Matrix-Blocker wanderte aufgrund der Kapillarwirkung und benetzte beinahe die gesamte Glasfasermatrix.
Etwa 300 Mikroliter eines vorverdünnten Blutserums, das in einer Laufmittellösung aus 1% Gelatine, 0,05% Thimerosal und 0,3% Tween®20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung vorverdünnt worden war, wurden auf den Probenbereich 24 der Vorrichtung 10 aufgegeben.
Unmittelbar nach dem Transport der Fluide zum Reaktionsbereich 26, was durch die Benetzung des Reaktionsbereichs 26 und durch das Verschwinden der Flüssigkeit aus dem Probenbereich 24 angezeigt wurde, wurden 300 Mikroliter eines affinitätsgereinigten Kaninchen Anti-Human IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert war und das in einer Konjugatlösung größerer Viskosität verdünnt worden war, die eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween®20, 1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte, unmittelbar auf die benetzte Reaktionszone aufgegeben. Das nicht abreagierte Enzymkonjugat wurde durch das Auftragen von 600 Mikrolitern Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen. Schließlich wurden 300 Mikroliter eines Substrat-Chromogens BCIP/NBT auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das Auftreten eines gefärbten Produkts in der Reaktionszone lieferte den Beweis für eine Enzymaktivität, die die Anwesenheit von Helicobacter Pylori in der Probe anzeigte.

BEISPIEL 5

NACHWEIS VON HCV

Ein NS-4a-Peptid, rekombinantes NS-3 Protein und das Kern- Struktur-Peptid des HCV-Antigens wurden auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Nach der Immobilisierung des Antigens wurde die Reaktionszone blockiert, indem zum Reaktionszonenbereich 150 ul eines Matrix-Blockers hinzugeben wurden, der eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween®20, 1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte. Der Matrix-Blocker wanderte aufgrund der Kapillarwirkung und benetzte beinahe die gesamte Glasfasermatrix.
Etwa 300 Mikroliter eines vorverdünnten Blutserums, das in einer Laufmittellösung aus 1% Gelatine, 0,05% Thimerosal und 0,3% Tween®20 in einem phosphatgepufferten Salzlösung vorverdünnt worden war, wurde auf den Probenbereich 24 der Vorrichtung 10 aufgegeben.
Unmittelbar nach dem Transport der Flüssigkeiten zum Reaktionsbereich 26, was durch die Benetzung des Reaktionsbereichs 26 und das Verschwinden der Flüssigkeit aus dem Probenbereich 24 angezeigt würde, wurden 300 Mikroliter eines affinitätsgereinigten Kaninchen anti-Human IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, und das in einer Konjugatlösung größerer Viskosität verdünnt worden war, die eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 1% Gelatine, 1% fötales Kälberserum, 0,05% Tween®20, 1% PVP 700.000 und 0,5% Thimerosal umfaßte, unmittelbar auf die benetzte Reaktionszone aufgegeben. Das nicht abreagierte Enzymkonjugat wurde durch das Auftragen von 600 Mikrolitern Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen. Schließlich wurden 300 Mikroliter eines Substrat-Chromogens BCIP/NBT auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das Auftreten eines gefärbten Produkts an der Reaktionszone lieferte den Beweis für eine Enzymaktivität, die die Anwesenheit von HCV in der Probe anzeigte.

BEISPIEL 6

NACHWEIS EINES HB ANTIGENS

Ein Gemisch zweier verschiedener monoklonaler Anti HBS Antikörper in einer phosphatgepufferten Salzlösung, die 0,005% Rinderserumalbumin und 2% Trehalose umfaßte, wurde auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Nach der Immobilisierung des Antigens wurde die Reaktionszone blockiert, indem zum Reaktionszonenbereich 150 ul eines Matrix-Blockers hinzugeben wurden, der eine phosphatgepufferte Salzlösung umfaßte, die ihrerseits 2% Rinderserum und 1% PVP 700.000 umfaßte. Der. Matrix-Blocker wanderte aufgrund von Kapillarwirkung und benetzte beinahe die gesamte Glasfasermatrix.
Etwa 200 Mikroliter eines Blutserums, das in einer phosphatgepufferten Salz-Reaktionslösung größerer Viskosität vorverdünnt worden war, die aus 35% Serumprobe, 0,5% PVP 700.000, 1,0% fötalem Kälberserum, 0,002% Pferdeserum, 4,0% Dextransulfat, 0,04% Tween®20 und zuvor geeichten Mengen an biotinyliertem monoklonalen Anti HE Antikörpern und einem Streptadavin APL-Konjugat besteht, wurden daraufhin unmittelbar auf den Probenbereich 24 der Vorrichtung 10 aufgegeben.
Unmittelbar nach dem Transport der Fluide in den Reaktionsbereich 26, was durch die Benetzung des Reaktionsbereichs 26 und das Verschwinden der Flüssigkeit aus dem Probenbereich 24 angezeigt wurde, wurde das nicht abreagierte Enzymkonjugat durch viermaliges Aufgeben von 500 Mikrolitern Waschlösung auf den Reaktionsbereich 26 aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen. Schließlich wurden 200 Mikroliter eines Substrat-Chromogens BCIP/NBT auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das Erscheinen eines gefärbten Produkts an der Reaktionszone lieferte den Beweis für eine Enzymaktivität, die die Anwesenheit des HBS Antigens in der Probe anzeigte.

BEISPIEL 7

NACHWEIS VON HPV DURCH HYBRIDISIERUNG

HPV-spezifische Oligonukleotide (GTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCC) wurden auf der Reaktionszone einer Glasfasermatrix immobilisiert. Die DNA aus Caski-Zellen würde gemäß der Vorschrift von Hybricombtm, Orgenics Ltd., Yavne, Israel, extrahiert und durch Sulfonieren markiert. Die markierte DNA wurde dann in einer Hybridisierungslösung 1:10 verdünnt, die aus 0,6 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,02% Ficoll®, 0,02% Gelatine, 0,1% Tween®20 und 20,0% Glycerin bestand.
Die Probe wurde daraufhin 20 Minuten lang zum Sieden erhitzt und dann unmittelbar auf Eis gekühlt. 200 ul der Lösung wurden auf den Probenbereich 24 der Vorrichtung 10 aufgegeben. Nach dem Transport der gesamten Hybridisierungslösung wurden dann 100 ul einer affinitätsgereinigten Mäuse anti sulfonierten DNA, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert war und in einer phosphatgepufferten Salzlösung verdünnt worden war, die 1% Gelatine und 0,1% Tween® umfaßte, auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben.
Das nicht abreagierte Enzymkonjugat wurde durch Auftragen auf den Reaktionsbereich 26 von 500 Mikrolitern einer phosphatgepufferten Salz-Waschlösung, die 0,5% Tween umfaßte, aus dem Reaktionsbereich 26 herausgewaschen. Zuletzt wurden 100 Mikroliter eines Substrat-Chromogens BCIP/NBT auf den Reaktionsbereich 26 aufgegeben. Das Auftreten eines gefärbten Produkts an der Reaktionszone lieferte den Beweis für die Enzymaktivität, die die Anwesenheit spezifischer HPV-16- Sequenzen in der Probe anzeigt.
Wenn technische Merkmale in den Ansprüchen mit Bezugszeichen versehen sind, so sind diese Bezugszeichen lediglich zum besseren Verständnis der Ansprüche vorhanden. Dementsprechend stellen solche Bezugszeichen keine Einschränkungen des Schutzumfangs solcher Elemente dar, die nur beispielhaft durch solche Bezugszeichen bezeichnet sind.

Claims

1. Vorrichtung (10) zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe, die Zielmoleküle und Nicht-Zielmoleküle enthält, wobei die Vorrichtung folgendes umfaßt:

wenigstens einen Absorptionsbereich (20);

einen saugfähigen Träger (18), der einen ersten Flüssigkeitstransportpfad in Flüssigkeitskontakt mit dem wenigstens einen Absorptionsbereich (20) definiert, und der folgendes umfaßt:

wenigstens einen Reaktionsbereich (26) stromaufwärts des wenigstens einen Absorptionsbereiches (20), wobei der Reaktionsbereich (26) ein Einfangreagenz umfaßt; und

einen Probenbereich (24) stromaufwärts des Reaktionsbereiches (26), wobei die flüssige Probe, wenn sie auf den Probenbereich (24) aufgegeben wird, mittels Kapillarwirkung bis hinter den Reaktionsbereich (26) transportiert wird, wo wenigstens ein Teil der Zielmoleküle an das Einfangreagenz gebunden werden kann, um den Nachweis der Zielmoleküle zu erlauben, und wonach die flüssige Probe dann mittels Kapillarwirkung zum Absorptionsbereich (20) transportiert wird;

einen zweiten Flüssigkeitstransportpfad in Flüssigkeitsverbindung mit dem Reaktionsbereich (26) des saugfähigen Trägers (18) zum Transport einer Waschlösung, die auf den Reaktionsbereich (26) aufgegeben wird, zu dem wenigstens einen Absorptionsbereich (20) hin, wodurch interferierende Substanzen aus dem Reaktionsbereich (26) entfernt werden; und

Mittel zur Alternativauswahl zwischen dem ersten und zweiten Flüssigkeitstransportpfad während des Kapillartransportes der flüssigen Probe, wobei das Mittel eine flüssigkeitsundurchlässige zersetzbare Wandung (22) zwischen dem saugfähigen Träger (18) und dem Absorptionsbereich (20) umfaßt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Vorrichtung (10) zur Abtrennung, Konzentration und zum Nachweis in einem Gehäuse (12) eingeschlossen ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, worin das Gehäuse (12) einen Probeneinlaß (28) in Flüssigkeitsverbindung mit dem Probenbereich (24) umfaßt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, worin das Gehäuse (12) einen Wascheinlaß (30) in Flüssigkeitsverbindung mit dem Reaktionsbereich (26) umfaßt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin wenigstens der eine Absorptionsbereich (20) einen ersten Absorptionsbereich und einen zweiten Absorptionsbereich umfaßt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, worin der zweite Absorptionsbereich in direkter Flüssigkeitsverbindung mit dem ersten Absorptionsbereich steht, um einem Rückfluß vom ersten Absorptionsbereich zum zweiten Absorptionsbereich durch den saugfähigen Träger (18) vorzubeugen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der saugfähige Träger (18) eine Nitrozellulosemembran ist, in der die Absorptionszentren blockiert worden sind, um den Transport der Zielmoleküle zu erleichtern.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der saugfähige Träger (18) eine Glasfasermatrix ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die zersetzbare Wandung (22) durch die flüssige Probe zersetzt werden kann.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die zersetzbare Wandung (22) durch eine Substanz zersetzt werden kann, die zur flüssigen Probe zugesetzt wird.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die zersetzbare Wandung (22) durch eine Lösung zersetzt werden kann, die auf den Probenbereich (24) aufgegeben wird, nachdem die flüssige Probe aufgegeben worden ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die zersetzbare Wandung (22) durch eine Substanz zersetzt werden kann, die auf den Reaktionsbereich (26) nach der Bindung der Zielmoleküle an den Reaktionsbereich (26) aufgegeben wird.

13. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die zersetzbare Wandung (22) während eines vorbestimmten Zeitraumes zersetzt werden kann.

14. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die zersetzbare Wandung (22) aus einem Netzwerk hergestellt ist, das in eine Verbindung eingebettet ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die wasserlösliche Polymere, pH-labile Substanzen, ionenstärkelabile Substanzen und enzymatisch aufschließbare Substanzen umfaßt.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, worin die wasserlöslichen Polymere wasserlösliche, Polyester umfassen.

16. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Zielmoleküle Zielnukleinsäuresequenzen umfassen.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, worin die Zielnukleinsäuresequenzen DNA-Sequenzen umfassen.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16, worin die Zielnukleinsäuresequenzen RNA-Sequenzen umfassen.

19. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Zielmoleküle Antigene umfassen.

20. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Zielmoleküle Antikörper umfassen.

21. Vorrichtung nach Anspruch 16, worin das Einfangreagenz wenigstens ein Nukleinsäureeinfangreagenz umfaßt, das Nukleinsäuresondensequenzen umfaßt, die zu wenigstens einem Teil der Zielnukleinsäuresequenzen komplementär sind.

22. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Einfangreagenz wenigstens ein Antigen umfaßt.

23. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Einfangreagenz wenigstens einen Antikörper umfaßt.