DE102020115332A1 - Biomarkersensorbasierende detektion krankheitsspezifischer biomarker - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Biomarker-Detektionssensoren zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern, Kits aufbauend auf diesen, Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten und Verwendungen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Biomarker-Detektionssensoren zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern, Kits aufbauend auf diesen Sensoren, Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten und Verwendungen.
  • Fluoreszenz-basierte Techniken gehören in den Bereichen der Biotechnologie, Life-Sciences und der (bio-)medizinischen Forschung zu den am weitesten verbreiteten Methoden. Fluoreszenzproben und Fluoroeszenz-gelabelte Biorezeptoren werden umfangreich eingesetzt in optogenetischen Studien, bei zytogenetischen Assays, bei Vielfarbfluroreszenz-in situ Hybridisierung (multicolor fluorescent in situ hybridization - mFISH), bei biobildgebender Analyse, für die Beobachtung von sowohl des Orts als auch der Bewegung von Zellen oder subzellularen Elementen, bei der Erforschung von molekularen Dynamiken, wie auch in Fluoroimmunoassays zur Detektion von molekularen Biomarkern, als Enzyme-Linked Immunosorbet Assay (ELISA). Allerdings wird die Anwendung von Fluoreszenz-Verfahren für das sensorische Verfahren durch die geringen Ausbeuten vieler Fluoreszenzfarbstoffe und das Auftreten von Signalinterferenzen stark eingeschränkt. Insbesondere ist die Detektion von sehr geringen Analytkonzentrationen immer noch eines der Hauptprobleme. Viele Versuche wurden unternommen, die Fluoreszenzsignale zu verstärken, um deren Anwendbarkeit für ultrasensitive Fluoroimmunoassays zu ermöglichen.
  • Um diese Herausforderung zu meistern - ohne die Verwendung von teurer Ausrüstung, spezifischen oder toxischen Reagenzien oder signifikante Änderungen an gute etablierten fluoreszenzbasierten Assays vornehmen zu müssen - haben in den letzten Jahren plasmonische Nanostrukturen Beachtung gefunden. Dieses aufgrund der Fähigkeit von plasmonischen Nanostrukturen die spektralen Eigenschaften von in der Nähe befindlichen Fluoreszenzfarbstoffen zu beeinflussen. Diese Beeinflussung häng stark von der spektralen Überlappung zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und der plasmonischen Absorption ab, sowie von der Distanz z zwischen Fluorophor und Nanostruktur. Insbesondere wird, aufgrund des Förster-Resonanzenergietransfer-Mechanismus (FRET) (d.h. Dipol-Dipol Wechselwirkungen zwischen dem Oberflächenplasmon und dem Fluorophor), eine starke Fluoreszenzverstärkung (FE) für kleine z(<10 nm) erreicht, wenn die plasmonische Absorption den Abregungspeak des Fluorophors überlagert (excitation coupling). Hingegen führt bei großen z die schwache Kopplung zu verschwindend geringer Fluoreszenzverstärkung. Im Gegensatz dazu führt die Überlappung mit dem Fluorophor-Emission-Peak (emission coupling) zu einer starken Fluoreszenzverstärkung bei großen z (>10 nm), aufgrund der Verstärkung der Fluorophor-Strahlungsrate durch den Purcell-Effekt, wohingegen eine fortschreitende Abnahme der Fluoreszenzverstärkung bei kleineren z auftritt aufgrund der steigenden Fluoreszenzlöschung via nicht-strahlender Verluste in der metallischen Nanostruktur. In dem Fall, dass die Plasmonabsorption sowohl den Anregungs- als auch den Emissionspeak des Fluorophors überlagert (kombinierter Modus), entsteht eine sehr große Fluoreszenzverstärkung bei einem optimalen z von ca. 10-15 nm; eine starke Löschung tritt bei kurzen z auf, wohingegen eine Wiederherstellung der normalen Fluoreszenzbedingungen (d.h. in Abwesenheit einer plasmonischen Struktur) bei längeren Distanzen aufgrund der schwächeren Plasmon-Fluorophor-Kopplung auftritt.
  • Zweidimensionale (2D) Arrays von metallischen Nanostrukturen sind besonders geeignet als plasmonverstärkte Fluoreszenz (PEF - plasmon-enhanced fluorescence)-basierte Biosensing Plattformen. Bisher wurden verschiedene Fluoreszenzverstärker wie Gold-Mikroinseln oder Arrays von metallischen Nanoobjekten (z.B. Nanopartikel, Nanoröhren, Nanotriangeln, Nanokristalle, Nanoantennen und resonante Nanokavitäten) ausprobiert, um das Detektionslimit in Fluoreszenz-basierten Assays weiter nach unten zu verschieben. Trotz der großen Verbesserungen im Hinblick auf die erreichbaren Detektionslimits (LOD - limit of detection), die bis hinunter zum femto-molaren-Level reichen, repräsentieren die Notwendigkeit von geschultem Personal, teure Technologien, zeitaufwändigen Prozeduren, geringe Versatilität, schlechte Skalierbarkeit und niedriges Signal-zu-Rausch-Verhältnis limitierende Faktoren für routinemäßiges Testen, Point-of-Care-Analyse und großflächige Verwendung von PEF-basierenden Fluoroassays.
  • Die Entwicklung von plasmonischen Biosensoren, die Verlässlichkeit und Einfachheit in der Handhabung kombinieren, ist immer noch eine Herausforderung.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Möglichkeiten für die hochsensitive Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern zur Verfügung zu stellen, welche die Probleme des Standes der Technik nicht mehr aufweisen.
  • Weitere Aufgabenstellungen ergeben sich für den Fachmann bei Betrachtung der nachfolgenden Beschreibung und der Ansprüche.
  • Diese und weitere Aufgaben, die sich dem Fachmann bei Betrachtung der vorliegenden Beschreibung erschließen, werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen dargestellten Gegenstände gelöst.
  • Besonders vorteilhafte und bevorzugte Gegenstände ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass 2D-Gerüste von geordneten und periodischen Gold-Nanopartikeln (AuNPs), hergestellt über selbstorganisierte Diblockcopolymer-Nanolithographie einen effektiven Weg darstellen, die meisten der aufgezeigten Probleme des Standes der Technik zu beseitigen. Die günstige und skalierbare Herstellung und die einfache Einstellbarkeit von deren plasmonischen Eigenschaften, durch Anpassen der AuNP-Größe und der Zwischenteilchendistanz durch einfache Variation der Längen von hydrophilem bzw. hydrophobem Teil der Copolymere, sind die wesentlichen Stärken einer solchen PEF-Plattform. Das plasmonische Verhalten eines 2D-Gerüsts aus gut-geordneten AuNPs steht in enger Relation zu dem Verhältnis R zwischen dem Nanopartikeldurchmesser D und der Zwischenteilchendistanz d. Wenn jeder Nanopartikel in enger Nähe zu seinen Nachbarn steht (d.h. wenn R>2/3 wird), wird durch die Wechselwirkung zwischen den lokalisierten Oberflächenplasmonen (LSPs - localized surface plasmons) eine langreichweitige, kollektive Oszillation, delokalisiertes Oberflächenplasmon (DSP - delocalized surface plasmon) genannt, erhalten. Solch ein kollektiver Effekt wird vernachlässigbar je mehr R<2/3 wird; in diesem Fall ist die plasmonische Reaktion des 2D-Gerüsts gut durch ein System von entkoppelten LSPs beschrieben.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet Raumtemperatur eine Temperatur von 293,15 Kelvin, d.h. 20°C.
  • Soweit nicht weiter ausgeführt herrscht bei allen Reaktionen und Vorgehensweisen Atmosphärendruck (1013 mbarabsolut) und Raumtemperatur.
  • In der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein Plasmon-verstärkter Fluoroszenz-Immunosensor für die Bestimmung und Detektion von Plasmodium falciparum Lactatdehydrogenase (PfLDH) - einem Malariamarker - in Ganzblutproben beschrieben.
  • Die Analyt-Bestimmung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erreicht durch orientierte Antikörper, die in einer dichtgepackten Konfiguration mittels photochemischer Immobilisationstechnik (PIT) immobilisiert werden. Die Kombination von BCMN und PIT ermöglicht maximale Kontrolle über die Nanopartikelgröße und Gitterkonstante, sowie die Distanz des Fluorophors von der Sensoroberfläche. Aufgrund dieser Charakteristiken erreicht die Anordnung der vorliegenden Erfindung ein Detektionslimit von weniger als 1 pg/ml (<30 fM) mit sehr hoher Spezifizität ohne eine Vorbehandlung der Proben. Dieses Detektionslimit ist mehrere Größenordnungen niedriger als das, was in Malaria-Schnelltests oder sogar kommerziellen ELISA-Kits erreicht wird. Aufgrund seiner Gesamtdimensionen, der Einfachheit in der Anwendung und der hohen Analysedurchsätze, können die Anordnungen der vorliegenden Erfindung, d.h. die Biomarker-Detektionssensoren als Substrat in Multititerplatten eingesetzt werden. Die Effizienz ist gegenüber konventionellen Fluoreszenz-Immunoassays erheblich verbessert.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biomarker-Detektionssensor zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern umfassend oder bestehend aus einem Substrat mit darauf gebundenen in einem zweidimensionalen Gitter angeordneten Metall-Nanopartikeln, insbesondere Gold-Nanopartikeln, und an die Metall-Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, gebundenen Anti-Biomarker-Rezeptoren.
  • In breiten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind verschiedene Möglichkeiten denkbar, mittels derer die Detektion der spezifischen Biomarker angezeigt werden kann. Beispielsweise ist dies möglich durch Ausgestaltung der Detektionssensoren als Mikrowaagen, mittels derer dann spezifisch gebundene Biomarker ausgewogen werden können, d.h. die Detektion erfolgt über eine Gewichtszunahme des Sensors.
  • In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Detektion jedoch über Fluoreszenzanalysen, da diese im kontinuierlichen Betrieb besonders gut zu verwirklichen sind.
  • Dazu wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Ausgestaltungsformen die elektronische Struktur der Biomarker-Detektionssensoren durch die Anlagerung der krankheitsspezifischen Biomarker derart geändert, dass diese in ihrem Fluoreszenzemissions- oder -extinktionsspektrum messbar sind.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können aufbauend auf dem erfindungsgemäßen Prinzip quasi beliebige krankheitsspezifische Biomarker detektiert werden, es ist dafür lediglich notwendig, dass die an die Gold-Nanopartikel gebundenen Antibiomarker-Rezeptoren ausreichend spezifisch für diese entsprechenden Biomarker sind.
  • Die Substrate der Biomarker-Detektionssensoren gemäß vorliegender Erfindung können beliebige Substrate sein, auf denen sich die Nanopartikel abscheiden lassen. In Ausführungsformen sind dies bekannte Assay-Wells, Oberflächen auf Basis von Polyacrylaten (z.B. Plexiglas®), Polystyren oder Glasoberflächen. Geeignet sind im Übrigen im Prinzip alle Substrate, die unter den experimentellen Bedingungen (unter anderem der Herstellung) stabil sind, im jeweils untersuchten/angewandten Wellenlängenbereich für Anregung und Fluoreszenz transparent sind und keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
  • Die auf den Substraten abzuscheidenden Metall-Nanopartikel können im Prinzip auf allen unter Herstellungs- und Untersuchungsbedingungen nicht korrosiven Materialien ausgewählt werden. In Varianten der vorliegenden Erfindung können die Materialien ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Edelmetallen, insbesondere Gold, Silber, Platin, Kupfer, Chrom, Legierungen davon und Janus-Partikel dieser Metalle. Besonders vorteilhaft und bevorzugt ist es, wenn die Metall-Nanopartikel Gold-Nanopartikel sind.
  • Bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die zu detektierende Krankheit Malaria ist. Insbesondere handelt es sich dann um den bei dem krankheitsspezifischen Biomarker um Plasmodium falciparum L-Laktat Dehydrogenase (PfLDH).
  • Entsprechend sind die an die Gold-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker-Rezeptoren in bevorzugten Ausgestaltungsformen der vorliegenden Erfindung anti-pLDH-Antikörper.
  • Diese anti-pLDH-Antikörper werden erfindungsgemäß auf den Gold-Nanopartikeln fixiert, d.h. daran gebunden. Mithin sind von der vorliegenden Erfindung Biomarker-Detektionssensoren der vorgenannten Art umfasst, bei denen die Anti-Biomarker-Rezeptoren anti-pLDH-Antikörper sind, die über Thiolgruppen an die Gold-Nanopartikel gebunden sind.
  • In besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind diese anti-pLDH-Antikörper mit UV-Strahlung vorbehandelte anti-pLDH-Antikörper.
  • Mittels einer UV-Strahlung als Vorbehandlung ist es möglich, die anti-pLDH-Antikörper derart zu modifizieren, dass Thiolgruppen verfügbar werden durch Spaltung von Disulfidbrücken.
  • Im Falle von in anti-pLDH-Antikörpern erfolgt durch die UV-Bestrahlung eine selektive Photoreduktion der Disulfidbrücken in spezifischen Cystein-Cystein/Tryptophan Triaden (bei denen die Gegenwart des Tryptophans die Disulfidbrücke in dieser Triade sozusagen aktiviert). Die Spaltung dieser Cys-Cys-Bindungen in beiden Antikörperfragmenten führt zu insgesamt vier freien Thiolgruppen, von denen zwei mit der Oberfläche der Gold-Nanopartikel interagieren können, um eine kovalente Bindung auszubilden.
  • Zusätzlich wird durch diese Art der Bindung erreicht, dass das spezifische Gebiet der anti-pLDH-Antikörper, an das das PfLDH bindet, von den Gold-Nanopartikeln weg in den Raum hinein orientiert angeordnet und mithin für die PfLDH gut zugänglich wird.
  • In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die UV-Behandlung für 30 Sekunden mit einer Strahlungsleistung von 1 Watt/cm2 und bei einer Wellenlänge von 254 nm.
  • Obwohl im Rahmen der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen auf Gold-Nanopartikel abgestellt wird, bleibt darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung im Prinzip auch mit anderen Metall-Atomen denkbar ist.
  • Weiterhin von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Biomarker-Detektionssensoren, bei denen das Verhältnis R von Durchmesser D der Nanopartikel zum Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln (Rand-zu-Rand-Abstand) in dem zweidimensionalen Gitter >2,3 beträgt. Bevorzugt liegt dieses Verhältnis zwischen 2,3 und 3,0, und insbesondere bevorzugt bei 2,5.
  • Besonders bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn die Gold-Nanopartikel ein zweidimensionales Gitter in Form von Waben ausbilden, d.h. die Gold-Nanopartikel sind bevorzugt hexagonal oder hexagonal dicht angeordnet.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beträgt der Durchmesser D der Nanopartikel zwischen 40 und 60 nm, bevorzugt zwischen 44 und 55 nm, besonders bevorzugt zwischen 46 und 52 nm und insbesondere bevorzugt etwa 48 oder etwa 50 nm.
  • Der Abstand dzwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln (den Rändern der einzelnen Partikel) liegt bevorzugt zwischen 16 und 24 nm, mehr bevorzugt zwischen 17 und 22 nm, besonders bevorzugt zwischen 18 und 21 nm und insbesondere bevorzugt bei 19 oder 20 nm.
  • Die Größenangaben wurden bestimmt mittels Rasterelektronenmikroskopie. Ein Beispiel für ein verwendbares Mikroskop ist ein Zeiss® Leo 1550 VP.
  • Im Hinblick auf den Durchmesser D der Nanopartikel ist darauf hinzuweisen, dass mit den entsprechenden Angaben mittlere Durchmesser bezeichnet werden; naturgemäß streuen die effektiven Durchmesser in diesen Größenordnungen ein wenig um den entsprechend genannten spezifischen Wert. Dies wiederum bedeutet auch, dass der Abstand d zwischen den Partikeln um einen zentralwert streut. Dies ist dem Fachmann bekannt.
  • Bei einem Durchmesser D von 47,67 nm etwa beträgt die Abweichung in Ausführungsformen plus/minus 0,14 nm.
  • Bei einem Zwischenteilchenabstand (gemessen Mitte bis Mitte) von 68,47 nm etwa beträgt die Abweichung in Ausführungsformen plus/minus 0,19 nm.
  • Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Biomarker-Detektionssensor-Kits (Sensorkits) umfassend oder bestehend aus
    1. A) mindestens einem Biomarker-Detektionssensor wie oben dargelegt,
    2. B) einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor,
    3. C) optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Küvetten, Pipetten, Lichtquelle(n), Fluoreszenzdetektor, insbesondere Fluoreszenzspektrometer.
  • Im Zusammenhang mit dem Begriff „Kit“ sei drauf hingewiesen, dass dieses Kit nicht zwangsweise für die „Hosentasche“ geeignet sein muss. Vielmehr soll dadurch ausgedrückt werden, dass vor der Analyse sowohl der Biomarker-Detektionssensor wie oben beschrieben als auch die Zubereitung umfassend das Biomarker-spezifische Aptamer getrennt voneinander vorliegen, obwohl sie aufeinander abgestimmt und zugehörig sind. Zudem soll das Kit auch mehrere Detektionssensoren und mehrere Aptamerzubereitungen, die auch für verschiedene Biomarker ausgeführt sind, umfassen können.
  • Dem Fachmann ist in diesem Zusammenhang auch ohne weiteres klar, dass das weitere Analysenmaterial nicht zwangsweise auf die eben genannten Küvetten, Pipetten, Fluoreszenzlichtquelle und Fluoreszenz-Detektor beschränkt ist, sondern im Rahmen des Üblichen weiteres Material umfassen kann.
  • In Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass das Biomarker-Detektionssensor-Kit als transportables Kit ausgestaltet ist. In diesem Zusammenhang ist dann eine transportable Lichtquelle beispielsweise in Form einer Taschenlampe ausgestaltet und der Fluoreszenzdetektor entsprechend auch in einer vergleichsweise handlichen Form ausgestaltet. Für diesen Zweck kann es in Varianten ausreichend sein, wenn der Fluoreszenzdetektor lediglich ein Fluoreszenzsignal anzeigt, aber nicht zwangsweise dessen Intensität quantitativ darstellen kann. Dies wäre ein Beispiel für einen Schnelltest-Kit. Genauso ist es aber auch möglich, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Biomarker-Detektionssensor-Kit im Labormaßstab ausgestaltet ist, d.h. insbesondere sowohl die Fluoreszenzlichtquelle als auch der Fluoreszenzdetektor für dauerhaften Laborbetrieb geeignet und ausgestaltet sind.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass das Biomarker-spezifische Aptamer im Prinzip für beliebige krankheitsspezifische Biomarker passend ausgewählt wird.
  • Wesentlich ist dabei jedoch, dass das Biomarker-spezifische Aptamer in Übereinstimmung mit dem an die Gold-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker-Rezeptor übereinstimmend auf den gleichen Biomarker gerichtet ist, wobei Aptamer und Antikörper auf verschiedene Epitope des Biomarkers gerichtet sind (für den Fall, dass Aptamer und Antikörper auf das gleiche Epitop gerichtet wären, würden sie in Konkurrenz zu einander stehen und das Ergebnis verschlechtern).
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem Biomarker-spezifische Aptamer um ein Malaria-spezifisches Aptamer handelt. Insbesondere bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Biomarker-spezifische Aptamer das Malaria-2008-Aptamer.
  • Weiterhin ist im Prinzip jedes Fluorophor, das chemisch an diesen Biomarker gebunden werden kann, geeignet. Beispiele für einsetzbare Fluorophore sind 5-FAM (5-Carboxyfluorescein), Cyanin 7, Cyanin 5, Cyanin 3b oder auch Quantenpunkte.
  • In der Praxis hat sich als Fluorophor für solche oder ähnliche Untersuchungen Cyanin 5 als Fluorophor gut bewährt.
  • Entsprechend ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn Cyanin 5 als Fluorophor an das Biomarker-spezifische Aptamer gebunden wird.
  • Das höchst bevorzugte Biomarker-spezifische Aptamer im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist mithin das Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Cyanin 5.
  • Diese Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor kann dieses Aptamer an sich sein, kann aber auch neben dem Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor noch weitere Stoffe enthalten, wie diese für die Verwendung von solchen Aptameren mit daran gebundenen Fluorophoren in der Fachwelt bekannt sind. Beispielsweise kann das Fluorophorgelabelte Aptamer in wässrigen Lösungen vorliegen, wobei diese wässrigen Lösungen beispielsweise noch gepuffert sein können oder auch Konservierungsmittel oder ähnliches enthalten können. In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gut geeignet sind beispielsweise 10 millimolare phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS).
  • Wesentlich ist es bei diesen Biomarker-Detektionssensor-Kits auch, dass die Biomarker-Detektionssensoren wie oben beschrieben ausgestaltet sind.
  • Denn durch die Kombinationen der Biomarker-Detektionssensoren wie oben beschrieben mit den Zubereitungen umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer wird eine hohe Selektivität ermöglicht.
  • Die Selektivität für das erfindungsgemäß bevorzugt zu bestimmende PfLDH wird insbesondere durch die Kombination des anti-pLDH-Antikörpers, der über Thiolgruppen an die Gold-Nanopartikel gebunden ist, und dem Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Cyanin 5 als Fluorophor erreicht.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass bei einem Durchmesser D der Nanopartikel von 48 oder 50 nm und einem Zwischenpartikelabstand (Rand-zu-Rand) d in dem zweidimensionalen Gitter von 19 oder 20 nm zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln, welche über Thiolgruppen daran gebundene anti-pLDH-Antikörper aufweisen, in Kombination mit dem Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor Cyanin 5 eine besonders starke Fluoreszenzerhöhung erreicht werden konnte.
  • Entsprechend kann mit dieser besonders bevorzugten Ausgestaltungsform eine besonders hohe Spezifizität und Empfindlichkeit erreicht werden.
  • Die Fluoreszenzintensität ist dabei von der Konzentration des Biomarkers abhängig. Die Intensität steigt mit zunehmender Konzentration des Biomarkers an und näher sich asymptotisch einem Grenzwert an. Dieser Grenzwert wird erreicht, wenn alle Antikörper durch daran gebundene Biomarker belegt sind.
  • Bis zur Vollbelegung aller Antiköper ist eine quantitative Bestimmung der Biomarkerkonzentration möglich, indem die Fluoreszenzintensität bestimmt wird.
  • Ab dem Zeitpunkt der vollständigen Belegung aller Antikörper mit Biomarkern erfolgt keine Quantifizierung mehr, sondern lediglich eine qualitative Anzeige (wie vorher natürlich zusätzlich auch schon).
  • Im Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Biomarker-Konzentrationen zwischen 0,001 Femtomol und 100 Nanomol, insbesondere zwischen 0,01 Femtomol und 10 Nanomol, quantitativ bestimmt werden. Höhere Konzentrationen sind Qualitativ bestimmbar.
  • Qualitative Bestimmung bedeutet dabei, dass die Gegenwart des Biomarkers durch Fluoreszenz angezeigt wird, aber die genaue Menge nicht bestimmt wird oder, für den Fall der vollständigen Belegung aller Antiköper, nicht bestimmt werden kann.
  • Für den Einsatz der vorliegenden Erfindung als Schnelltest bzw. Point-of-Care-Analyse ist die Qualitative Bestimmung in der Regel ausreichend. Die quantitative Bestimmung kommt in der Regel bei genaueren klinischen Untersuchungen zum Einsatz.
  • Es ist ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass dies beides möglich ist.
  • In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass für andere Fluorophore andere Dimensionen im Hinblick auf die Durchmesser D und Abstand d vorteilhafter sein können. Dies kann im Einzelfall genau abgestimmt werden.
  • Gleichsam ist darauf hinzuweisen, dass die Ordnungssymmetrie des zweidimensionalen Gitters der Gold-Nanopartikel einen Einfluss auf die Plasmonenresonanz nehmen kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde mit hexagonal oder hexagonal dicht gepackten Gold-Nanopartikeln eine besonders gute Plasmonenresonanz erzielt; gleichsam sind von der vorliegenden Erfindung aber auch kubisch dicht gepackte, oder auch andere, Ordnungssymmetrien umfasst.
  • Für die besonders bevorzugten Ausgestaltungsformen der vorliegenden Erfindung mit einer hexagonalen oder hexagonal dichten Packung der Gold-Nanopartikel, anti-pLDH-Antikörpern und Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Cyanin 5 und den genannten Bereichen für D und d wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine besonders hohe Verstärkung der Fluoreszenz beobachtet und gefunden, da sich die erzeugte Plasmonenresonanz mit der Fluorophor-Absorption und Fluorophor-Emission überlagert; dies wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als duale Verstärkung bezeichnet, weil beide Prozesse gleichsam verstärkt werden.
  • In diesem Zusammenhang sei auch darauf hingewiesen, dass die duale Verstärkung durch die Plasmonenresonanz ihr Maximum bei etwa 10 nm Abstand von der Partikeloberfläche erreicht. Durch die eben beschriebene Kombination von Antikörper/PfLDH/Aptamer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung genau dieser Abstand erreicht.
  • Entsprechend wird durch die besonders bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung eine besonders starke duale Verstärkung erzielt und besonders hohe Selektivität und Effizienz erreicht.
  • Dies ist ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber einem Sandwich-Assay, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, da bei solchen Sandwich-Assays zwei Antikörper verwendet werden. Diese zwei Antikörper würden aber dazu führen, dass der Abstand zwischen dem Fluorophor und der Partikeloberfläche zu groß wird und die entsprechende Verstärkung geringer. Dies würde dann zu schlechteren Detektionsgrenzen und geringerer Effizienz führen.
  • Insofern ist die vorliegende Erfindung im Hinblick auf aus dem Stand der Technik bekannte Sandwich-Assays stark verbessert.
  • Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten. Dieses Verfahren umfasst die im Folgenden genannten Schritte oder besteht aus diesen Schritten:
    • Schritt i) besteht in der Bereitstellung eines Biomarker-Detektionssensors wie oben beschrieben.
  • Als Schritt ii) wird dann eine Körperflüssigkeitsprobe auf den Sensor aufgebracht und mit dem Biomarker-spezifischen Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor versetzt. Dies kann derart passieren, dass die Körperflüssigkeitsprobe und der Biomarker-spezifische Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor gleichzeitig auf den Sensor aufgebracht werden, oder dass das Biomarker-spezifische Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor vorher oder nachher zugefügt wird. Genauso ist es möglich, direkt schon eine vorher angefertigte Mischung aus Körperflüssigkeitsprobe und Biomarker-spezifischem Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor auf den Sensor aufzubringen.
  • Die auf den Sensor aufgebrachte Probe wird dann in Schritt iii) mittels einer Lichtquelle bestrahlt. Die Lichtquelle wird dabei derart ausgesucht, dass das verwendete Fluorophor besonders gut angeregt wird. In bevorzugten Ausgestaltungen ist diese Lichtquelle eine Lichtquelle, die im roten Bereich des sichtbaren Spektrums emittiert; besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn die Lichtquelle in einem Wellenlängenbereich zwischen 610 und 670 nm, bevorzugt zwischen 625 und 655 nm, insbesondere, im Fall von Cyanin 5 als Fluorophor, bei 625 nm emittiert.
  • Als Nächstes wird als Schritt iv) die Fluoreszenzemission der Probe detektiert.
  • Diese Detektion kann im Prinzip mit allen in der Fachwelt bekannten Methoden erfolgen. Sofern das erfindungsgemäße Verfahren mit einem der erfindungsgemäßen Biomarker-Detektionssensor-Kits ausgeführt wird, kann dies auch eine rein visuelle Erfassung durch die das Verfahren ausführende Person sein, die Detektion würde in diesem Falle einfach über den optischen Eindruck, den der das Verfahren Durchführende erhält, erfolgen.
  • Bevorzugt erfolgt die Detektion aber mit dedizierten Fluoreszenzspektrometern, beispielsweise solchen basierend auf CMOS oder sCMOS-Photodetektoren.
  • Bei Anregungen durch eine Lichtquelle mit Wellenlängen von 625 bis 655 nm werden beispielsweise für den Fall anti-pLDH-Antikörper/PfLDH/Malaria2008-Aptamer-Cy5 Emissionen von 665 bis 715 nm erhalten.
  • Das mit der Körperflüssigkeitsprobe zu vermischende Biomarker spezifische Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor ist wie oben beschrieben und kann auch in Form der für das Biomarker-Detektionssensor-Kit beschriebenen Zubereitung vorliegen, die dieses Biomarker spezifische Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor enthält.
  • Als optionaler Schritt v) kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Analyse der Fluoreszenzemission erfolgen. Diese Analyse kann sowohl quantitativ als auch qualitativ oder beides sein. Zweckmäßigerweise erfolgt diese Analyse mittels handelsüblicher Computer und dem Fachmann bekannten Fluoreszenz-Datenverarbeitungsprogrammen.
  • Weiterhin optional als Schritt vi) im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das ermittelte Ergebnis der Fluoreszenzemissionsanalyse gespeichert werden oder angezeigt werden oder beides.
  • Obwohl bei dem Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern gemäß vorliegender Erfindung die Körperflüssigkeit nicht auf eine spezielle Körperflüssigkeit beschränkt ist, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass er die Körperflüssigkeit danach auswählt, ob die von ihm gesuchten krankheitsspezifischen Biomarker in der jeweiligen Körperflüssigkeit vorkommen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Blutproben.
  • Die Körperflüssigkeiten können vor Einsatz in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung entsprechend den in der Fachwelt üblichen Verfahren aufgearbeitet bzw. vorbereitet werden.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung insbesondere dafür geeignet und dazu gedacht ist, Körperflüssigkeitsproben zu untersuchen, die bereits als solche vorliegen, d.h. die Entnahme von Körperflüssigkeiten ist nicht Teil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • Bevorzugt bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass es sich bei den Anti-Biomarker-Rezeptoren um anti-pLDH-Antikörper handelt, und bei den Biomarker-spezifischen Aptameren um Malaria-2008-Aptamere, an die bevorzugt Cyanin 5 als Fluorophor gebunden ist; in Übereinstimmung mit der den obigen Ausführungen zum Biomarker Detektionssensor bzw. der Biomarker-Detektionssensor-Kit der vorliegenden Erfindung.
  • Durch die Vorbehandlung der anti-pLDH-Antikörper mittels UV-Strahlung werden diese aktiviert. Im Rahmen dieser Aktivierung werden die Antikörper in eine Konformation überführt, so dass sie an die Gold-Nanopartikel in einer Art und Weise binden, welche die Bindungsepitope des Antikörpers leicht zugänglich für den zu untersuchenden Biomarker machen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Verwendungen der Biomarker-Detektionssensoren, der Biomarker-Detektionssensor-Kits oder des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern.
  • Insbesondere ist diese Verwendung umfasst für die Bestimmung von Malaria-Biomarkern und insbesondere in Körperflüssigkeitsproben, höchst bevorzugt in Blutproben.
  • Eine weitere bevorzugte Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist die Verwendung der Biomarker-Detektionssensoren als Substrat in automatisierten Multititerplatten.
  • Die Biomarker-Detektionssensoren gemäß vorliegende Erfindung kann analog zu Lohmüller, T., Aydin, D., Schwieder, M. et al., „Nanopatterning by block copolymer micelle nanolithography and bioinspired applications“, Biointerphases 6, MR1-MR12 (2011), https://doi.org/10.1116/1.3536839 erfolgen.
  • Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Die Figuren sind dabei nicht unbedingt maßstabsgetreu und vereinfacht. So sind übliche, dem Fachmann geläufige Maßnahmen etc. nicht unbedingt dargestellt (Schrauben, Ventile, Reaktionsgefäße, genaue Molekülstruktur etc.), um die Lesbarkeit der Figuren zu erleichtern.
  • Figurenbeschreibung:
    • 1 ist eine schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Herstellung eines Biomarker-Detektionssensors gemäß vorliegender Erfindung.
  • Die Herstellung dieser Arrays von Gold-Nanopartikeln erfolgte dabei, wie in Abschnitt A) illustriert ist, zunächst über Nanolithographie basierend auf der Selbstanordnung von Blockcopolymeren. Dazu werden Blockcopolymere 7 verwendet, die eine hydrophile Kette (dargestellt durch Strich) und eine hydrophobe Kette (dargestellt durch Block) haben. Durch Vermischen mit einem unpolaren Lösungsmittel, insbesondere Toluen T, entstehen inverse Mizellen 8, d.h. Mizellen, bei denen der Kern hydrophil und die äußere Schale hydrophob ist. Zu dieser Mischung enthaltend die inversen Mizellen wird dann ein Gold-Salz Au-S (beispielsweise HAuCl4) hinzugegeben, was dazu führt, dass die inversen Mizellen Gold-Precursoren 9 in ihrem Zentrum, dem hydrophilen Kern, aufnehmen. Diese Mizellen können dann auf einem Substrat 1, beispielweise mittels Tauch-Beschichter, abgeschieden werden. Aufgrund ihrer Struktur ordnen sich die Mizellen dann auf der Oberfläche des Substrats in regelmäßigen Strukturen an. Anschließend werden dann die Mizellen um die Gold-Precursoren herum entfernt, beispielsweise mittels Plasmaofenbehandlung. Dabei werden auch die Gold-Precursoren 9 zu den Gold-Nanopartikeln 2 reduziert. Auf der Oberfläche verbleibt dann ein zweidimensionales Gitter von Gold-Nanopartikeln 2 (ungefüllte Kreise).
  • In Abschnitt B) ist illustriert, wie eine Lösung von anti-pLDH-Antikörpern 10 mittels UV-Strahlung (dargestellt als Blitz) vorbehandelt und dann anschließend diese behandelte wässrige Lösung 10a auf das in Abschnitt A) hergestellte Substrat mit darauf befindlichen Gold-Nanopartikeln gegossen wird, wobei sich die Antikörper an die Gold Nanopartikel binden.
  • Im Ergebnis erhält man dann das in Abschnitt C) illustrierte Substrat 1 mit darauf befindlichen Gold-Nanopartikeln 2, an die die Anti-Biomarker-Rezeptoren gebunden sind, was hier durch gefüllte Kreise dargestellt wird. Diese Herstellungsweise ist beispielsweise auch in Lohmüller, T., Aydin, D., Schwieder, M. et al., „Nanopatterning by block copolymer micelle nanolithography and bioinspired applications“, Biointerphases 6, MR1-MR12 (2011), https://doi.org/10.1116/1.3536839 beschrieben.
  • 2 ist eine SEM-Fotografie eines mit geordneten Gold-Nanopartikeln versehenen Substrats. Aus dieser Fotografie ist zu ersehen, dass bei der Herstellung der Sensoren durchaus Fehlstellen vorkommen können. Allerdings sind diese Fehlstellen für die Gesamt-Performance des Biomarkers-Detektionssensors nicht schädlich, da diese im Rahmen der Plasmonenresonanz bzw. der dualen Verstärkung sozusagen herausgemittelt werden.
  • 3 ist ein Diagramm, in welchem die beiden schmaleren Kurven das Anregungsspektrum (links, gestrichelte Kurve) und das Emissionsspektrum (rechts, gepunktete Kurve) von Cyanin 5 (Cy5) darstellen und die breite Kurve das experimentell bestimmte Extinktionsspektrum eines Malaria-Biomarker Detektionssensors. Es ist ersichtlich, dass das breite Extinktionsspektrum die Überlagerung der plasmonischen Resonanz über sowohl Extinktions- als auch Emissionsspektrum von Cyanin 5 erlaubt. Die Wellenlänge in nm ist auf der x-Achse aufgetragen und die Extinktion (links) und die normalisierte Anregung (Excitation) / Emission (rechts) auf der y-Achse.
  • 4 ist eine diagrammatische Darstellung der Teilchengrößenverteilung von Goldnanopartikel, die gemäß den nachfolgend beschriebenen Beispielen hergestellt wurden. Der mittlere Durchmesser D der Gold-Nanopartikel bei diesem Beispiel liegt bei etwa 48 nm (47,67 ± 0,14 nm).
  • 5 ist eine diagrammatische Darstellung der Zwischenpartikelabstände in Nanometern bezogen auf die jeweiligen Mitten der Nanometer. Der mittlere Zwischenteilchenabstand, gemessen Mitte zu Mitte, liegt bei etwa 68 nm (68,47 ± 0,19 nm)), woraus sich ein Zwischenpartikelabstand, gemessen Teilchenrand zu Teilchenrand, von etwa 20 nm ergibt.
  • 6 zeigt schematisch die Funktionsweise der vorliegenden Erfindung an einem einzigen Goldnanoteilchen (AuNP). Basis ist ein auf einem Substrat 1 angeordnetes Goldnanoteilchen 2, an das Antikörper 3 (hier als Y dargestellt) gebunden sind. In dieser Figur wird durch die Darstellungsweise der Antikörper 3 klar, dass diese in einer Konformation an die Gold-Nanopartikel 2 gebunden sind, welche die Bindungsepitope der Antikörper leicht für den jeweiligen Biomarker zugänglich machen. Dies ist dadurch illustriert, dass jeweils ein „Arm“ der Antikörper 3 vom Gold-Nanopartikel 2 fort orientiert ist. Ferner ist der zu untersuchende Biomarker 4 (PfLDH) dargestellt (nur einer, der Übersichtlichkeit halber, in Form einer Wolke), welcher hier als an das Bindungsepitop des mittleren Antikörpers 3 bindend dargestellt ist. Auf der anderen Seite des Biomarkers 4 ist dann ein Aptamer 5 dargestellt, welches somit den Biomarker 4 zusammen mit dem Antikörper 3 sozusagen in die Zange nimmt (Sandwich). An der dem Biomarker 4 abgewandten Seite des Aptamers 5 ist das Fluorophor 6 als Stern dargestellt, der dessen Fluoreszenz-Emission darstellen soll. Der Abstand zwischen dem Fluorophor 6 und der Oberfläche 1 beträgt hier ungefähr 10 nm, wodurch mit dieser Anordnung sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Selektivität erreicht wird.
  • Bezugszeichenliste
  • In den Figuren bedeuten gleiche Bezugszeichen gleiche Materialien, Stoffe etc.
    • 1
    Substrat
    2
    Gold-Nanopartikel
    2a
    Gold-Nanopartikel mit gebundenen Antikörpern
    3
    Antikörper
    4
    Biomarker
    5
    Aptamer
    6
    Fluorophor
    7
    Blockcopolymer
    8
    inverse Micelle
    9
    Gold-Nanopartikel-Precursor
    10
    Lösung von anti-pLDH-Antikörpern (unbehandelt)
    10a
    Lösung von anti-pLDH-Antikörpern (nach UV-Behandlung)
    T
    Toluen
    Au-S
    Goldsalz, insbesondere HAuCl4
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Heranziehung der folgenden nicht-limitierenden Beispiele näher erläutert. Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele dienen dazu die darin ausgeführten Ausgestaltungen darzulegen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Variationen dieser Beispiele im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich sind.
  • Beispiele:
  • 0. Materialien und Chemikalien
  • Diblockcopolymere (P18226-S2VP) wurden von Polymer Source Inc. (Dorval, Canada) gekauft und wurden hergestellt aus Polystyren(x)-b-2-polyvinylpyridin(y) (PS(x)-bP2VP(y)), worin x = 30000 und y = 8500 das jeweilige Molekulargewicht von Polystyren (PS) und Poly(2-vinylpyridin) (P2VP) angeben (Angegeben ist jeweils das Zahlenmittel (MN) der Verteilung. Das Verhältnis von MW:MN liegt bei 1,06 und indiziert eine sehr monodisperse Verteilung). Toluen (99,8%), Gold(III)chlorid-Trihydrat (HAuCl4*3H2O), Silbernitrat (AgNO3) und Ascorbinsäure wurden von Sigma-Aldrich gekauft; Aceton (≥99,0%), 2-Propanol (≥99,5%) und Ethanol (≥99,5%) wurden von Merck Millipore gekauft; Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (≥99,0%) wurde von Fluka gekauft; Bovinserumalbumin (BSA) (Fraktion V IgG-frei, arm an Fettsäuren) kam von Gibco. Hochreines entionisiertes Wasser, dass für alle wässrigen Lösungen verwendet wurde, wurde aus einem Milli-Q®-System (18,2 Megaohm spezifischer Widerstand) dosiert.
  • 10 mM Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (NaCl 10 mM, NaH2PO4 10 mM, Na2HPO4 10 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,1) und 25 mM Tris-HCI-Puffer (NaCl 100mM, Imidazol 20 mM, Tris (=Tris(hydroxymethyl)aminomethan) 25 mM, HCl 25 mM, pH 7,5) wurden durch lösen der Reagenzien (gekauft von Sigma-Aldrich) in hochreinem Wasser hergestellt. Pan-Malaria-Antikörper (monoklonaler anti-pLDH Antikörperklon 19g7) wurde von Vista Laboratory Services (Langley, USA) hergestellt. Die rekombinante Plasmodium falciparum-Laktatdehydrogenase (PfLDH) wurde durch bakterielle Expression erhalten. Das Malaria 2008s-Aptamer gelabelt mit Cyanin-5-Tag (5'-Cy5-CTG GGC GGT AGA ACC ATA GTG ACC CAG CCG TCT AC-3') wurde durch Friz Biochem GmbH (Neuried, Deutschland) hergestellt. Millex@ Spritzenfilter (Porengröße 0,20 µm) mit hydrophober Polytetrafluorethylenmembran wurden von Merck Millipore gekauft; Superslip@ Deckgläser (Borosilikatglas, Dicke 0,13 - 0,17 mm) wurde von Thermo Fisher Scientific gekauft und durch einen Glasschneider mit Diamantspitze geschnitten.
  • 1. Herstellung eines geordneten Arrays von AuNPs zur Detektion von PfLDH in Blut
  • Nanolithographie basierend auf der Selbstanordnung von Blockcopolymeren wurde eingesetzt, um Arrays von geordneten AuNPs mit einstellbarer Dichte, Größe und Zwischenpartikelabstand herzustellen. 29,2 mg der Diblockcopolymere P18226-S2VP wurden unter starkem Rühren und unter kontrollierten Bedingungen (Argoninertgas, O2< 1 ppm, H2O<0,1 ppm) zu 15 ml Toluen gegeben und für 72 Stunden gehalten, um ein homogen dispergierte, umgekehrte Micellen mit hydrophilem Kern und äußerer hydrophober Schale (kugelförmig) zu erhalten. Dann wurden 15,7 mg HAuCl*3H2O während 72 Stunden in die Lösung gegeben, um den Goldprekursor in dem hydrophilen Kern der Micellen aufzunehmen, was zu der Bildung von AuNPs, die von einer hydrophoben Schale umhüllt waren, führte. Nachdem das Goldpulver vollständig dispergiert war, wurde die gelbliche Lösung filtriert, um Micellenaggregate und Verunreinigungen zu entfernen. Unter Beibehaltung des Rührens konnte diese Lösung für mindestens sechs Monate gelagert werden.
  • Bevor die PS-AuNPs auf den Glasdeckgläsern (die eine Größe von 10 × 8 mm2 hatten) abgeschieden wurden, wurden die Substrate mittels Ultraschall für fünf Minuten nacheinander in Aceton, 2-Propanol und reinem Ethanol gereinigt und in Toluen getaucht werden, um die Oberfläche nicht-polar „zu machen“, so dass die hydrophoben Hüllen an dieser anhaften konnten. Anschließend wurden die Substrate mittels eines Tauchbeschichters bei sorgfältiger Einstellung der Eintauchgeschwindigkeit in die PS-AuNPs enthaltende Lösung getaucht. Es stellte sich dabei heraus, dass eine Eintauchgeschwindigkeit von 0,6 mm/s eine besonders gute Beschichtung der Glasoberfläche sowohl im Hinblick auf die Dichte der Anordnung der AuNPs als auch im Hinblick auf die großflächige Gleichmäßigkeit der Abscheidung ermöglichte. Die PS-AuNPs wurden auf der nicht-polaren Glasoberfläche durch hydrophobe Interaktion transferiert, wodurch eine hexagonale Anordnung mittels Selbstorganisation erfolgte. Ein entsprechender Vorgang ist auch in 1 illustriert. Danach wurden die Copolymere mittels Sauerstoffplasmabehandlung geätzt (0,8 mbar Druck, 200 W, 30 Minuten), wodurch die AuNPs an präfixierten Positionen auf der Glasoberfläche immobilisiert wurden.
  • Weil die plasmonische Resonanz stark von dem Verhältnis R zwischen dem AuNP-Durchmesser D und dem Zwischenpartikelabstand d abhängt, garantieren höhere Werte von R eine größere Kopplung zwischen den AuNPs. Für R>2/3 wird die plasmonische Resonanz durch das kollektive Verhalten der AuNPs dominiert, und mehrere Vorteile für die Metallverstärkte Fluoreszenz (MEF) resultieren. Um R zu erhöhen, wurden die Substrate für 2 Stunden unter Lichtausschluss mit 2 ml einer Au-Depositionslösung (CTAB 190 mM, HAuCl4*3H2O 42 mM, AgNO3 8 mM, Ascorbinsäure 100 mM) inkubiert. Danach wurden die Substrate reichlich mit hochreinem Wasser gespült und bis zur Verwendung unter Lichtausschluss gelagert. Die Charakterisierung der nanostrukturierten Substrate erfolgte mittels UV-VIS-Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
  • Darstellungen der Messergebnisse finden sich in 2 bis 5.
  • 2. Funktionalisierung
  • Die Funktionalisierung der AuNPs mit Pan-Malaria-Antikörpern wurde mittels photochemischer Immobilisierungstechnik (PIT) vorgenommen. Dazu wurde 1 ml wässrige Lösung von anti-pLDH (25 µg/ml) mittels einer UV-Lampe für 30 Sekunden bestrahlt und dann auf das Substrat gegossen. Die UV-Quelle bestand aus zwei U-förmigen Niederdruckquecksilberlampen (2 W bei 254 nm) in die eine Standardquarzküvette eingesetzt werden konnte. Unter Berücksichtigung der Geometrie der Lampen und der Nähe zu der Küvette, lag die Strahlungsintensität, die zur Generierung der Thiolgruppen verwendet wurde, bei ungefähr 1 W/cm2. Diese Intensität war so schwach, dass eine direkte Photolyse der Disulfidbrücken, die bei 254 nm nur schwach absorbieren, vermieden wird. Lediglich die Disulfidbrücke der Cys-Cys-Trp-Triade (bei der das Tryptophan die Disulfidbrücke „aktiviert“) wurde dadurch gespalten. Funktionalisierung mittels PIT stellte sicher, dass die Antikörper (Abs) kovalent auf die Goldoberfläche geknüpft und ihre Bindungsstellen für die Umgebung zugänglich wurden.
  • 3. Waschen
  • Die Proben wurden mit hochreinem Wasser (dosiert mittels eines Milli-Q®-systems) gespült, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen.
  • 4. Blockieren
  • 1 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung (50 µg/ml) wurde aufgetragen, um die freie Goldoberfläche zu bedecken und vor nicht-spezifischer Adsorption zu schützen.
  • 5. Waschen
  • Die Proben wurden reichlich mit hochreinem Wasser gespült. Die Lagerung bis zur Verwendung erfolgte in PBS-Lösung (10 mM) bei Raumtemperatur.
  • 6. Analyt-Detektion (PfLDH-Fixierung durch immobilisierte Abs)
  • Die gewünschte Menge von Plasmodium falciparum Laktat-Dehydrogenase (PfLDH) wurde zu 1 ml einer verdünnten Lösung von nicht infiziertem menschlichen Blut gegeben (Verdünnung 1:100 in 25 mM Tris-Puffer). Die funktionalisierten Substrate wurden mit 1 ml kontaminierter Blutlösung gleicher Verdünnung für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Wippschüttler wurde verwendet, um die Bindungskinetik zu beschleunigen und die Analyt-Diffusion zu verbessern. Es wurden Konzentrationen zwischen 0,01 femtomol und 10 nanomol gemessen.
  • 7. Waschen
  • Die Proben wurden reichlich mit Tris-Puffer (25 mM) und mit hochreinem Wasser gespült, um ungebundene Proteine zu entfernen.
  • 8. Fluoreszenz-Aptamer-basierendes Assay
  • Die Proben wurden in 1 ml 10 mM phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) überführt, wobei hier die PBS noch 0,1 µM Malaria 2008s-Aptamere gelabelt mit Cy5-Tag (5'-Cy5-CTG GGC GGT AGA ACC ATA GTG ACC CAG CCG TCT AC-3') enthält (d.h. das MAlaroa2008-Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor. Die Lösung wurde unter Lichtausschluss für 2 Stunden mittels eines Wippschüttlers sanft geschüttelt. Als Ergebnis erhielt man eine Sandwich-Anordnung. Eine solche Anordnung ist exemplarisch auch in 6 dargestellt.
  • 9. Waschen
  • Die Proben wurden reichlich mit PBS und hochreinem Wasser gespült, um ungebundene Aptamere zu entfernen.
  • 10. Messung des Fluoreszenz-Signals
  • Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 phaseninvertiertem Kontrastfluoreszenzmikroskop, ausgerüstet mit Zeiss Colibri.2 LED Lichtquelle (Module 625 nm), Zeiss Plan-Apochromat-Objektiv 10x/0,45 Ph 1 M27 (FWD = 2,1 mm), Kubus 50 Cy5 Filter (Anregung 625 - 655 nm/Emission 665 - 715 nm) und pco.edge 5.5 sCMOS Photodetektor (Skalierung 0,650 µm × 0,650 µm pro Pixel, Bildgröße 2560 × 2160 Pixel, skalierte Bildgröße 1,66 mm × 1,40 mm, 16 Bit Dynamikumfang, 2 Sekunden Belichtungszeit jeweils für jedes Bild). Die aufgezeichneten Fluoreszenzbilder wurden mit ImageJ-Software verarbeitet. Der „rolling ball“-Algorithmus wurde verwendet, um den durch die Optik bedingten Helligkeitsunterschied zwischen Bildzentrum und Bildrand herauszurechnen. Der Hintergrund wurde lokal für jeden Pixel mittels Durchschnittsbildung über einen Kreis um den Pixel herum vermessen. Solch ein Wert wird dann von dem Originalbild abgezogen, wodurch räumliche Variationen des Hintergrunds geglättet werden. Der „rolling ball“-Radius war auf 10 Pixel gesetzt, eine Größe, die ausreichend größer war als die Größe der größten Objekte, die nicht Teil des Hintergrunds waren. Ein Schwellenwert, der geringfügig höher als der geglättete Hintergrund war, wurde eingestellt, um das Bild zu segmentieren, dessen Gesamtintensität durch Aufsummierung der Signalanteile von allen Spots gemessen wurde. Um eine gute und verlässliche Analyse der Fluoreszenzsignale zu erhalten, wurden zehn Bilder zufällig von jeder Probe gemacht und deren Intensitätsdurchschnitt ermittelt.
  • 11. Simulation des E-Felds um die Goldnanopartikel herum
  • Die optische Antwort der 2D-AuNP-Gerüste wurde durch das „FDTD Solutions“-Tool, das in Lumerical Software implementiert war, simuliert. Eine linear polarisierte elektromagnetische Strahlung, die entlang der z-Richtung lief, wurde verwendet, um das System zu untersuchen. Virtuelle (simulierte) Photo-Detektoren (PDs), sinnvoll in dem Arbeitsraum angeordnet, konnten die Intensität des elektromagnetischen Feldes in Abhängigkeit der Zeit messen. Ein Photo-Detektor war dazu bestimmt, das Excitationsspektrum der Nanostruktur zu messen. Symmetrische/antisymmetrische Randbedingungen (BCs - boundary conditions), eingestellt entlang der x- und y-Richtung, erstrecken die plasmonische Anregung über ein unendliches 2D-Gerüst und reduzieren gleichzeitig die Simulationszeit um einen Faktor 8, ohne dabei die Genauigkeit der Resultate zu verschlechtern. Bloch BCs (periodische Randbedingungen) wurden nur für Polarisationsstudien verwendet, um die Phasenverschiebung zu kompensieren, die entsteht, wenn eine elektromagnetische Störung mit einem nicht-Null-Winkel auf der gegenüberliegenden Seite des Arbeitsraums wiedereingeführt. Perfekt eingestellte Schicht-BCs in z-Richtung stellen perfekte Absorption der elektromagnetischen Wellen, die durch die Ebene, enthaltend die Lichtquelle, zurückgestreut werden und durch die gegenüberliegende Seite der Arbeitsumgebung einfallen, sicher. Die Arbeitsumgebung wurde über ein Gitter mit einer räumlichen Auflösung von 0,5 nm aufgelöst, wodurch eine hohe Genauigkeit sichergestellt und gleichzeitig die Simulationszeit innerhalb weniger Stunden gehalten wurde. Die AuNPs wurden als homogene Goldhalbkugeln modelliert, wohingegen das Substrat als dicke dielektrische Schicht von Siliziumdioxid (SiO2) repräsentiert wurde.

Claims (12)

  1. Biomarker-Detektionssensor zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern umfassend oder bestehend aus einem Substrat mit darauf gebundenen in einem zweidimensionalen Gitter angeordneten Metall-Nanopartikeln und an die Metall-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker-Rezeptoren.
  2. Biomarker-Detektionssensor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metall-Nanopartikel Gold-Nanopartikel sind.
  3. Biomarker-Detektionssensor gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem krankheitsspezifischen Biomarker um PfLDH handelt und die an die Gold-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker-Rezeptoren mit UV-Strahlung vorbehandelte anti-pLDH-Antikörper sind.
  4. Biomarker-Detektionssensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis R von Durchmesser D der Nanopartikel zum Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln in dem zweidimensionalen Gitter >2,3 beträgt, bevorzugt zwischen 2,3 und 3,0 liegt, insbesondere bevorzugt bei 2,5 liegt.
  5. Biomarker-Detektionssensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Gold-Nanopartikel hexagonal oder hexagonal dicht gepackt sind, b) der Durchmesser D der Nanopartikel zwischen 40 und 60 nm, bevorzugt zwischen 44 und 55 nm, besonders bevorzugt zwischen 46 und 52 nm, insbesondere bevorzugt 48 oder 50 nm, beträgt, und c) der Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln zwischen 16 und 24 nm, bevorzugt zwischen 17 und 22 nm, besonders bevorzugt zwischen 18 und 21 nm, insbesondere bevorzugt 19 oder 20 nm, beträgt.
  6. Biomarker-Detektionssensor-Kit umfassend oder bestehend aus A) mindestens einen Biomarker-Detektionssensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, B) einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor, C) optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Küvetten, Pipetten, Lichtquelle, Fluoreszenzdetektor, insbesondere Fluoreszenzspektrometer.
  7. Biomarker-Detektionssensor-Kit gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Biomarker-spezifischen Aptamer um Malaria-2008-Aptamer handelt, an das bevorzugt Cyanin 5 als Fluorophor gebunden ist.
  8. Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten umfassend die folgenden Schritte oder bestehend aus den folgenden Schritten i) Bereitstellen eines Biomarker-Detektionssensors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, ii) Aufbringen auf den Sensor von iia1) einer Körperflüssigkeitsprobe, und iia2) Biomarker-spezifischem Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor entweder nach iia1) oder gleichzeitig mit iia1), oder iib) einer Mischung aus Körperflüssigkeitsprobe und Biomarker-spezifischem Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor, iii) Bestrahlen der auf den Sensor aufgebrachten Probe mit Lichtquelle, iv) Detektion der Fluoreszenzemission der Probe, v) optional Analyse der Fluoreszenzemission, bevorzugt mittels Computern, und vi) optional Speichern und/oder Anzeigen der analysierten Fluoreszenzemission.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Körperflüssigkeit um Blutproben handelt.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Anti-Biomarker-Rezeptoren um anti-pLDH-Antikörper und bei dem Biomarker-spezifischen Aptamer um Malaria-2008-Aptamer handelt, an das bevorzugt Cyanin 5 als Fluorophor gebunden ist.
  11. Verwendung der Biomarker-Detektionssensoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, der Biomarker-Detektionssensor-Kits gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 oder des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern, insbesondere Malaria-Biomarkern, bevorzugt in Körperflüssigkeitsproben, insbesondere in Blutproben.
  12. Verwendung der Biomarker-Detektionssensoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als Substrat in automatisierten Multititerplatten.
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