WO2018155457A1 - Ｓ１００ａ９を標的とする免疫原性組成物 - Google Patents

Ｓ１００ａ９を標的とする免疫原性組成物 Download PDF

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vaccine
acid sequence
seq
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宗尚 島村
友裕 河野
啓徳 中神
森下　竜一
望月　秀樹
昭子 天満
貴子 江原
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国立大学法人大阪大学
株式会社ファンペップ
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4728—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin

Definitions

  • the present invention relates to an immunogenic composition targeting S100A9.
  • Non-patent Document 1 Long-term treatment with anti-platelet drugs such as aspirin, aspirin and sustained-release dipyridamole, and clopidogrel is important for the prevention of secondary stroke in patients with non-cardioembolic stroke and transient ischemic attacks.
  • Non-patent Document 2 a recent Swedish study reported that 26.3% of patients discontinued antiplatelet drugs in 2 years (Non-patent Document 1), and in a US study within 1 year. Reported that 22.5% of patients receiving aspirin treatment, 43.8% of patients receiving aspirin / dipyridamole treatment, and 35.8% of patients receiving clopidogrel treatment were discontinued.
  • Non-Patent Document 2 In Japan, it is reported that about 40% of patients diagnosed with recurrent ischemic stroke had stopped taking antiplatelet drugs (Non-patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a highly safe immunogenic composition that has an antithrombotic effect and does not involve a long-term bleeding risk.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • An immunogenic composition comprising an antigenic peptide that induces production of neutralizing antibodies against S100A9 and a carrier protein.
  • An amino acid sequence in which the antigenic peptide is the same or substantially the same as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence shown in positions 1 to 16 of SEQ ID NO: 2, The same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence shown in the 21st to 33rd positions, or the 95th to 114th positions of SEQ ID NO: 2
  • the composition according to the above [1] which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence.
  • composition according to [1] above, wherein the antigenic peptide has the same or substantially the same amino acid sequence as that shown in SEQ ID NO: 1.
  • composition according to [1] or [2] above, wherein the antigenic peptide has the same or substantially the same amino acid sequence as that shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 20.
  • composition according to any one of [1] to [6] for use as an antithrombotic vaccine.
  • composition according to any one of [1] to [8] above for use in the prevention of cerebral infarction, myocardial infarction, obstructive arteriosclerosis, angina pectoris or thrombocytosis.
  • the composition according to any one of [1] to [6] for use in the prevention or treatment of chronic inflammatory diseases involving S100A9 and CD36.
  • the composition according to [11] wherein the chronic inflammatory disease involving S100A9 and CD36 is arteriosclerosis, nonalcoholic steatohepatitis, nonalcoholic steatohepatitis or Alzheimer's dementia.
  • a highly safe immunogenic composition having an antithrombotic effect and not accompanied by a long-term bleeding risk can be provided.
  • (A) shows the result of ELISA measuring the antibody titer against S100A8 in mouse serum administered with a conjugate (SA8001-K) vaccine of mouse S100A8 antigenic peptide (ASHKDSHKE, SEQ ID NO: 5) and mussel hemocyanin (KLH).
  • (B) shows the antibody titer against S100A9 in the serum of mice administered with a conjugate (SA9001-K) vaccine of mouse S100A9 antigenic peptide (GHSHHGKGCGK, SEQ ID NO: 3) and KLH (ELISA). It is a figure which shows a result.
  • the middle cerebral artery specimen is shown on the right, and the middle cerebral artery specimen is shown on the right. It is a figure which shows the result of having examined the effect with respect to platelet thrombus formation of S100A9 vaccine. It is a figure which shows the result of having examined the effect with respect to the bleeding of S100A9 vaccine.
  • A is a figure which shows the result of having measured the platelet count
  • B is a figure which shows the result of having measured the activated partial thromboplastin time (aPTT)
  • C) has measured the prothrombin time (PT). It is a figure which shows a result. It is a figure which shows the result of having examined the effect with respect to the serum S100A9 level of S100A9 vaccine.
  • FIG. 4 shows the results of stimulating S900A9 antigenic peptide, recombinant S100A9 protein or KLH on spleen cells derived from SA9001-K vaccine-administered mice and evaluating T cell activation by ELISPOT assay.
  • A is a representative of each group
  • B is a figure which shows the result of having measured the number of dyeing
  • FIG. 1 It is a figure which shows the histopathological examination result of the brain of the 147th day from the first vaccine administration, (A) is a result of a KLH administration mouse
  • FIG. 2 is a view showing the results of measuring the antibody titer in serum after administering a KLH-human S100A9 antigenic peptide conjugate (SA9002-K) vaccine to monkeys, (A) is a conjugate of human S100A9 antigenic peptide and BSA (B) is a measurement result of antibody titer against recombinant human S100A9.
  • SA9002-K KLH-human S100A9 antigenic peptide conjugate
  • the present invention provides an immunogenic composition comprising an antigenic peptide that induces production of neutralizing antibodies against S100A9 and a carrier protein.
  • the S100 protein is a calcium-binding protein having two EF-hands that are expressed specifically in cell types, and 20 types of subfamilies have been confirmed so far.
  • S100A9 (also referred to as MRP14) belongs to the low molecular weight calcium binding S100 protein and is usually expressed with S100A8 (also referred to as MRP8), both forming a heterodimer.
  • S100A8 / A9 complex has been found to be associated with various inflammatory diseases.
  • An antigenic peptide that induces the production of neutralizing antibodies against S100A9 can be designed based on the amino acid sequence of S100A9.
  • the amino acid sequence of major mammalian S100A9 can be obtained from a known database (NCBI, etc.).
  • NCBI a known database
  • the accession number of the amino acid sequence of human S100A9 is NP_002956 (NCBI)
  • NCBI accession number of the amino acid sequence of mouse S100A9
  • NCBI accession number of the amino acid sequence of mouse S100A9
  • the antigenic peptide that induces the production of neutralizing antibodies against S100A9 is not particularly limited as long as it is a fragment of human S100A9 and has an antigenicity, but is shown in positions 1 to 16 of SEQ ID NO: 2.
  • a peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence, 7 consecutive amino acids contained in the amino acid sequence shown in the 21st to 33rd positions of SEQ ID NO: 2 The same or substantially the same amino acid sequence of 7 or more amino acids contained in the peptide consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the above, or the amino acid sequence shown in the 95th to 114th positions of SEQ ID NO: 2 or Peptides consisting of substantially the same amino acid sequence are preferred.
  • amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence shown in the 1st to 16th positions of SEQ ID NO: 2 is the 6th to 10th positions of SEQ ID NO: 2. It preferably contains the same amino acid sequence.
  • amino acid sequences include MTCKMSQLER (SEQ ID NO: 6), TCKMSQLERN (SEQ ID NO: 7), CKMSQLERNI (SEQ ID NO: 8), KMSQLERNIIE (SEQ ID NO: 9), MSQLERNIET (SEQ ID NO: 10), SQLLERNIETI (SEQ ID NO: 11).
  • amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence shown in the 21st to 33rd positions of SEQ ID NO: 2 include, for example, QYSVKLGHPD (SEQ ID NO: 12), YSVKLGHPDT (SEQ ID NO: 13), SVKLGHPDTL (SEQ ID NO: 14), VKLGHPDTLN (SEQ ID NO: 15) and the like.
  • the amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence of 7 or more consecutive amino acids contained in the amino acid sequence shown in the 95th to 114th positions of SEQ ID NO: 2 is the 102nd to 106th positions of SEQ ID NO: 2. It preferably contains the same amino acid sequence.
  • Examples of such amino acid sequences include GDEPGGHHHK (SEQ ID NO: 16), DEGPGHHHKP (SEQ ID NO: 17), EPGGHHHKPG (SEQ ID NO: 18), GPGHHHKPGL (SEQ ID NO: 19), PGHHHKPGLG (SEQ ID NO: 20), GHHHKPGLGGE (SEQ ID NO: 1). ) And the like.
  • the antigenic peptide that induces the production of neutralizing antibodies against S100A9 is a peptide consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (GHHHKPGGLGE), more preferably It is a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the antigenic peptide that induces the production of a neutralizing antibody against S100A9 is not limited to a peptide having the same sequence as the partial sequence of the amino acid sequence of human S100A9 (SEQ ID NO: 2), and the amino acid sequence of human S100A9 (SEQ ID NO: 2) It may be a peptide consisting of an amino acid sequence substantially identical to the partial sequence.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence that can induce the production of neutralizing antibodies against S100A9, and 1 or 2 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Amino acid sequences in which are deleted, substituted or added.
  • it is an amino acid sequence capable of inducing production of a neutralizing antibody against S100A9, wherein one amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a specific example is an amino acid sequence in which one amino acid (for example, cysteine) is added to the N-terminus or C-terminus for linking (conjugating) with a carrier protein via a linker.
  • the experiment is performed using the amino acid sequence of the experimental animal corresponding to the antigenic peptide sequence of human S100A9.
  • the amino acid sequence of S100A9 of the experimental animal to be used can be obtained from a known database (NCBI or the like), and the antigenic peptide sequence of the experimental animal to be used can be designed by aligning with the amino acid sequence of human S100A9.
  • the mouse antigenic peptide sequence corresponding to the human antigenic peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is GHSHHGKGCGK (SEQ ID NO: 3).
  • the carrier protein is not particularly limited, and can be appropriately selected from known carrier proteins that can be used for vaccines.
  • Known carrier proteins include, for example, albumin, ovalbumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH), Pseudomonas aeruginosa exotoxin, tetanus toxin, ricin toxin, diphtheria toxin, cholera toxin, heat-labile enterotoxin, epidermal growth factor , Fibroblast growth factor, transferrin, platelet-derived growth factor, poly-L-lysine, poly-L-glutamine, mannose-6-phosphate, hepatitis B virus core protein and the like.
  • mussel hemocyanin (KLH) is preferable.
  • the antigenic peptide and the carrier protein are linked (conjugated).
  • the antigenic peptide and the carrier protein may be directly linked like a fusion protein, or may be linked via a linker (synonymous with spacer).
  • the linker is not particularly limited as long as it can link the antigenic peptide and the carrier protein.
  • aminocarboxylic acids such as ⁇ -aminoalanine, ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ -aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid, 12-aminolauric acid, glutamic acid, and p-aminobenzoic acid can be used.
  • L-amino acids existing in natural proteins and their D-amino acids can also be used.
  • Crosslinkers such as EMCS (N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimide), glutaraldehyde, and sulfo-GMBS (N- ⁇ -maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester) can be used.
  • glutaraldehyde can be preferably used when lysine (Lys; K) is not included in the antigenic peptide. Even when lysine is contained in the antigenic peptide, glutaraldehyde can be preferably used when lysine is contained only at the N-terminus or C-terminus of the antigenic peptide.
  • cysteine Cys; C
  • cysteine can be introduced into the N-terminus or C-terminus of the antigenic peptide and / or linked using EMCS It is preferable to do. Regardless of the sequence of the antigenic peptide, cysteine can be introduced at the C-terminus and ligated using sulfoGMBS.
  • the immunogenic composition of the present invention may further contain one or more adjuvants.
  • the adjuvant can be appropriately selected from known adjuvants. Specifically, for example, aluminum adjuvant (for example, aluminum salt such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate or a combination thereof), Freund's adjuvant (complete or incomplete), TLR ligand (for example, CpG, Poly (I : C), Pam3CSK4, etc.), BAY, DC-chol, pcpp, monophosphoryl lipid A, QS-21, cholera toxin, formylmethionyl peptide and the like.
  • it is an aluminum adjuvant.
  • the immunogenic composition of the present invention can be suitably used as an antithrombotic vaccine.
  • the immunogenic composition of the present invention is suitably used for the prevention of diseases in which thrombosis involving platelet aggregation such as cerebral infarction, myocardial infarction, obstructive arteriosclerosis, angina pectoris, and thrombocytosis is formed. Can do.
  • the immunogenic composition of the present invention can be suitably used for preventing recurrent ischemic stroke.
  • the immunogenic composition of the present invention can be suitably used for the prevention or treatment of chronic inflammatory diseases involving S100A9 and CD36.
  • Chronic inflammatory diseases involving S100A9 and CD36 include arteriosclerosis, nonalcoholic fatty liver disorder (nonalcoholic fatty liver disease: NAFLD), nonalcoholic steatohepatitis (NASH), Alzheimer type dementia, etc. Is mentioned.
  • the immunogenic composition of the present invention is preferably used for prevention or treatment of arteriosclerosis.
  • the immunogenic composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration include intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration, intranasal administration, transdermal administration, transmucosal administration, sublingual administration, and inhalation administration.
  • parenteral administration and more preferred is intradermal administration, subcutaneous administration or intramuscular administration.
  • the immunogenic composition of the present invention can be formulated by appropriately blending an antigenic peptide that induces production of neutralizing antibodies against S100A9, a carrier protein, a pharmaceutically acceptable carrier, and additives.
  • preparations for oral administration such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions; parenterals such as injections, infusions, suppositories, ointments, patches It can be set as the formulation for administration. What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited.
  • various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption
  • Various additives such as an accelerator, a lubricant, a colorant, a corrigent, and a fragrance are included.
  • additives used in solid preparations for oral administration include excipients such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, and corn starch; binders such as hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and magnesium aluminate metasilicate Dispersing agents such as corn starch; disintegrating agents such as calcium calcium glycolate; lubricants such as magnesium stearate; solubilizing agents such as glutamic acid and aspartic acid; stabilizers; hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, methylcellulose, etc.
  • excipients such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, and corn starch
  • binders such as hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and magnesium aluminate metasilicate Dispersing agents such as corn starch
  • disintegrating agents such as calcium calcium glycolate
  • lubricants such as magnesium stearate
  • solubilizing agents such as
  • Water-soluble polymers such as cellulose, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc .; sucrose, powdered sugar, sucrose, fructose, glucose, lactose, reduced maltose water candy, powder returned Maltose water syrup, glucose fructose liquid sugar, fructose glucose liquid sugar, honey, sorbitol, maltitol, mannitol, xylitol, erythritol, aspartame, saccharin, sodium saccharin, etc., white sugar, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc. Coating agents and the like.
  • Liquid preparations for oral administration are prepared by dissolving, suspending or emulsifying in commonly used diluents.
  • the diluent include purified water, ethanol, a mixed solution thereof and the like.
  • this liquid agent may contain a wetting agent, a suspending agent, an emulsifier, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance, a preservative, a buffering agent and the like.
  • additives used for injections for parenteral administration include isotonic agents such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol; phosphate buffer Buffers such as acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer; methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, paraoxybenzoic acid Preservatives such as propyl, butyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax; hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol Thickeners such as sodium hydrogen sulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascor
  • solubilizers for injections, suitable solubilizers, for example, alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, lysolecithin, and pluronic polyol You may mix
  • Liquid preparations such as injections can be stored after removing moisture by freezing or lyophilization. The freeze-dried preparation is used by adding distilled water for injection at the time of use and re-dissolving it.
  • the immunogenic composition of the present invention can be administered to any animal (human or non-human) having an immune system.
  • mammals such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats, guinea pigs, rats and mice; and birds such as chickens, ducks and geese.
  • the immunogenic composition of the present invention is preferably intended for human children and adults.
  • the administration frequency and administration interval of the immunogenic composition of the present invention are not particularly limited.
  • a single dose may be administered, or multiple doses may be administered at intervals of about 2 days to about 8 weeks.
  • the dose of the immunogenic composition varies depending on the administration subject, administration method, etc., but it is preferable that the single dose is about 0.01 ⁇ g to about 10 mg as the antigenic peptide amount, about 0.1 ⁇ g to about 10 mg. More preferably, it is 1 mg, and more preferably about 1 ⁇ g to about 0.1 mg.
  • the immunogenic composition of the present invention has been demonstrated to be able to maintain the production of antibodies against S100A9 for at least 2 months from the final administration in experiments using mice, and to obtain a booster effect by subsequent administration. (See Examples). Therefore, considering the problem that approximately 40% of patients diagnosed with recurrent ischemic stroke had discontinued taking antiplatelet drugs (Non-patent Document 3), this long-term effect and additional
  • the immunogenic composition of the present invention having a booster effect of administration is intended to provide a vaccine or medicament that is very useful for preventing recurrent stroke in patients with non-cardiac embolism stroke or transient ischemic stroke. Conceivable.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for preventing thrombus or preventing or treating a chronic inflammatory disease involving S100A9 and CD36 comprising administering the immunogenic composition of the present invention to an animal.
  • the immunogenic composition of the present invention for use in the prevention of blood clots or the prevention or treatment of chronic inflammatory diseases involving S100A9 and CD36.
  • the immunogenic composition of the present invention can prolong the occlusion time in a dose-dependent manner without affecting the hemostatic parameters and without inducing a harmful autoimmune response. Furthermore, the immunogenic composition of the present invention can sustain the production of anti-S100A9 antibody for at least 2 months after administration, and can exhibit a booster effect by further administration thereafter, further sustaining the effect of extending the occlusion time. it can. Therefore, the immunogenic composition of the present invention is useful for the prevention of thrombosis in diseases such as cerebral infarction, myocardial infarction, obstructive arteriosclerosis, thrombocytosis, and in particular, daily oral antiplatelet drugs can be taken. It is very useful in preventing recurrence in patients with difficult ischemic stroke.
  • mice in the examples were approved by the Animal Experiment Committee of the graduate School of Medicine, Osaka University, and animal experiments using monkeys were approved by the Animal Experiment Review Committee of Simic Pharma Science Co., Ltd. Carried out.
  • Example 1 Production of antibody by vaccine administration
  • the amino acid sequence of the C-terminal region (positions 104 to 113, GHSHHGKGCGK, SEQ ID NO: 3) was selected as the antigenic peptide of mouse S100A9.
  • the amino acid sequence of the C-terminal region (positions 81 to 89, ASHKDSHKE, SEQ ID NO: 5) was selected as the antigenic peptide for mouse S100A8.
  • the crude peptide was purified using a reverse phase HPLC column (ODS) by elution with a gradient of 0.1% TFA-H 2 O / CH 3 CN. Fractions containing the desired product were collected and lyophilized to obtain the desired peptide. The amino acid sequence of the synthesized peptide was confirmed with an amino acid sequencer.
  • the obtained antigenic peptide of mouse S100A9 (SEQ ID NO: 3) and the antigenic peptide of mouse S100A8 (SEQ ID NO: 5) were subjected to KLH (Keyhole limpet hemocyanin) via EMCS (N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimide).
  • SA9001-K a conjugate of mouse S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 3) and KLH is referred to as “SA9001-K”, and a mouse S100A8 antigenic peptide (SEQ ID NO: 5) and KLH conjugate is referred to as “SA8001-K”. ".
  • the SA9001-K vaccine low dose group and the SA9001-K vaccine high dose group received the vaccine three times in total (Days 0, 14, and 28).
  • the SA8001-K vaccine group received the vaccine twice in total (0 and 14 days). Blood was collected from the tail vein 2 weeks after the final administration (SA8001-K vaccine group on day 28, SA9001-K vaccine group (both low dose and high dose) on day 42). Serum was separated and used as a sample of this example.
  • the antibody titer against S100A8 or S100A9 was measured by ELISA. That is, an ELISA plate coated with a BSA-S100A8 conjugate (Peptide Institute) or a BSA-S100A9 conjugate (Peptide Institute) was used.
  • a detection antibody an HRP-labeled anti-mouse IgG sheep antibody (NA931V, GE Healthcare) was used.
  • Anti-S100A8 antibody and anti-S100A9 antibody in sera of SA8001-K vaccine group, SA9001-K vaccine high dose group and KLH group were detected by Western blotting.
  • recombinant mouse S100A8 (Abcam) and recombinant mouse S100A9 (Abcam) were each subjected to SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane (Millipore). The transferred PVDF membrane was incubated with each serum and then incubated with an HRP-labeled anti-mouse IgG sheep antibody (NA931V, GE Healthcare), and a chemiluminescence signal was detected with a LAS1000 camera (Fuji Film). 3.2 Analysis was performed with software (Fuji Film).
  • the PVDF membrane after transfer was incubated with a commercially available anti-mouse S100A8 antibody (R & D® Systems) or anti-mouse S100A9 antibody (LifeSpan® BioScience), and a chemiluminescence signal was detected in the same manner.
  • FIGS. 1 (A) and 1 (B) show the results of the SA8001-K vaccine group, and (B) shows the results of the SA9001-K vaccine low dose group and the SA9001-K vaccine high dose group.
  • Antibody titer against S100A8 in the serum of SA8001-K vaccinated mice was completely increased on day 28.
  • the antibody titer against S100A9 in the serum of SA9001-K vaccinated mice completely increased on day 42 in both the low dose group and the high dose group.
  • Example 2 Examination of effects on middle cerebral artery occlusion
  • the middle cerebral artery occlusion test was conducted 3 weeks after the final administration using the mice of SA8001-K vaccine group, SA9001-K vaccine low dose group, SA9001-K vaccine high dose group and KLH group of Example 1. Carried out. Separately, a clopidogrel low dose group (3 mg / kg) and a clopidogrel high dose group (6 mg / kg) were provided. In the clopidogrel group, mice administered with a mixture of saline and Freund's adjuvant on the same schedule (days 0, 14, and 28) as the SA9001-K vaccine group were used. Clopidogrel (Sanofi) was dissolved in water and orally administered for 2 consecutive days on the day before and after the middle cerebral artery occlusion test.
  • a mouse model of ferric chloride-induced thrombosis was prepared according to the method of Karatas et al. (Karatas, H. et al., J Cereb Blood Flow Metab 31, 1452-1460, 2011) did. Specifically, inhalation anesthesia with 1.4% isoflurane, body temperature was monitored with a rectal probe, and maintained at 37.0 ⁇ 0.5 ° C. during surgery.
  • the mouse fixed on the fixed base is opened using a high-speed drill (Luteter Minipen LP-120, Nippon Seimitsu Machine Co., Ltd.), a laser Doppler blood flow meter (Unique Medical Co., Ltd.) is placed on the skull, and regional cerebral blood flow (Regional cerebral blood flow: rCBF) was monitored.
  • the filter paper soaked in 20% ferric chloride was left on the buffy coat on the right distal middle cerebral artery for 3 minutes and then removed. Local cerebral blood flow was continuously monitored for 30 minutes after injury occurred. The time during which local cerebral blood flow decreased by more than 40% and the decrease was maintained for at least 5 minutes was recorded as the occlusion time.
  • the histological examination of the middle cerebral artery was performed in a non-perfused or fixed perfused brain.
  • the middle cerebral artery was collected while attached to the brain 25 minutes after the application of iron chloride stimulation, fixed overnight with 4% paraformaldehyde, and then embedded in paraffin.
  • 20 ml of 0.1M phosphate buffer was administered from the apex under deep anesthesia 25 minutes after the application of iron chloride stimulation, and then 20 ml of 4% paraformaldehyde was administered from the apex.
  • the middle cerebral artery was collected while attached to the brain and embedded in paraffin.
  • the brain was cut into 3 ⁇ m thick sections and stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 1 The results of histopathological examination are shown in FIG.
  • the left side is a non-perfusion sample
  • the right side is a perfusion fixed sample
  • the upper row is the KLH group
  • the lower row is the SA9001-K vaccine high dose group.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • a fibrin-platelet rich thrombus filling the lumen was observed in the non-perfused specimen of the KLH group (arrow in FIG. 4A), whereas a thrombus filling the lumen was observed in the non-perfused specimen of the SA9001-K vaccine high dose group. There wasn't.
  • the perfusion-fixed specimen of the KLH group the lumen was filled with a thrombus and occluded (arrowhead in FIG.
  • Example 3 Examination of effects on platelet thrombus formation
  • a platelet thrombus formation assay was performed using an automatic microchip type flow chamber system (Fujimori Industrial Co., Ltd.). Specifically, whole blood (350 ⁇ l) anticoagulated with hirudin (25 ⁇ g / ml) was perfused into a collagen-coated microchip at a shear rate of 1000 / sec. Subsequently, the thrombus area was quantified using computer-aided image analysis methods (Image J: version 1.48 and GIMP 2.8).
  • Example 4 Examination of effect on bleeding
  • the clopidogrel high dose group received clopidogrel for 3 consecutive days from the day after the middle cerebral artery occlusion experiment to the day of the tail bleeding assay.
  • the tail bleeding assay was performed according to the method of Liu et al. (Liu, Y. et al., World J Exp Med 2, 30-36, 2012).
  • the mouse was anesthetized by inhalation with 1.4% isoflurane and placed in the prone position, then the tip of the tail was cut with a scalpel and immediately 50 mL of physiological saline preheated to 37 ° C. Immerse in a tube. Each mouse was monitored for 20 minutes and the total bleeding time in 20 minutes was recorded.
  • Example 5 Examination of effects on platelet coagulation
  • the platelet count was collected in a tube containing EDTA, and counted using Vietscan HM2 (Abaxis), an animal blood cell counter.
  • the effect on clotting activity was evaluated by measuring activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time (PT).
  • aPTT activated partial thromboplastin time
  • PT prothrombin time
  • Example 6 Examination of effect on serum S100A9 level
  • Blood collected from mice in the SA9001-K vaccine high-dose group and KLH group in which the middle cerebral artery occlusion experiment was performed in Example 2 was used. Specifically, blood was collected before administration of SA9001-K vaccine (before immunization), 42 days after the first administration (2 weeks after the third administration of vaccine) and 3 days after middle cerebral artery occlusion experiment, and mouse S100A9 DuoSet ELISA was used. Serum S100A9 levels were measured with the Development kit (R & D Systems).
  • Example 7 Evaluation of T cell activation
  • 7-1 Determination of IgG subclass (1) Experimental method Blood collected from the SA9001-K vaccine high-dose group and KLH group of Example 1 on the 42nd day after the first administration (2 weeks after the third administration of the vaccine) was tested. It was used for. The IgG subclass induced by SA9001-K vaccine administration was determined by ELISA using anti-mouse IgG subclass specific HRP labeled antibodies (IgG1, IgG2b and IgG2c).
  • a sterile 96-well ELISPOT plate (Millipore) was coated with anti-mouse IFN- ⁇ capture antibody or anti-mouse IL-4 capture antibody at 4 ° C. overnight. Thereafter, the plate was washed with a PBS (PBS-T) solution containing 0.05% Tween 20, and blocked with PBS containing 1% BSA and 5% (wt / vol) sucrose.
  • PBS-T PBS-T
  • a spleen cell suspension prepared from the excised spleen is added to the plate (10 6 cells / well), 10 ⁇ g / mL of S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 3), KLH or recombinant S100A9 protein is added at 37 ° C. for 48 hours.
  • Example 8 Examination of long-term efficacy of S100A9 vaccine
  • the SA9001-K vaccine low dose group (20 ⁇ g (antigenic peptide) / mouse) administered with SA9001-K vaccine or KLH on days 0, 14 and 28, SA9001-K vaccine high Additional doses of vaccine were administered on day 126 to mice in the dose group (50 ⁇ g (antigenic peptide) / mouse) and KLH (control) group.
  • the dose group 50 ⁇ g (antigenic peptide) / mouse
  • KLH control
  • Example 9 Examination of efficacy and safety of S100A9 vaccine after booster immunization
  • 9-1 Middle Cerebral Artery Infarction Time
  • Example 8 9-3 Histopathological Examination (1) Experimental Method In Example 8, after the additional vaccine administration (booster immunization) was performed on the 126th day, the brain and kidney were removed on the 147th day, and 4% paraformaldehyde was obtained. Fixed overnight and embedded in paraffin. Brain and kidney sections were stained with hematoxylin / eosin. Kidney sections were stained with periodate Schiff (PAS).
  • PAS periodate Schiff
  • Example 10 Examination of effects on S100A9 / CD36 signaling
  • Example 10 Examination of effects on S100A9 / CD36 signaling
  • mice of the SA9001-K vaccine high-dose group and KLH group of Example 1 were used. Two weeks after the final administration (day 42), the mice were decapitated in the same manner as in Example 2, and 20% ferric chloride-containing filter paper was left on the buffy coat on the right distal middle cerebral artery for 4 minutes. Thereafter, blood was collected from the inferior vena cava and platelets were collected. Protein was extracted from platelets and subjected to Western blotting. Anti-JNK antibody (Cell Signaling Technology) and anti-phosphorylated JNK antibody (Cell Signaling Technology) were used as antibodies.
  • Example 11 Examination of effects on common carotid artery occlusion
  • a common carotid artery occlusion test was performed 3 weeks after the final administration.
  • the mouse anesthetized by inhalation with 1.4% isoflurane was fixed in the dorsal position, the skin of the neck was incised to expose the right common carotid artery, and the outer membrane was removed.
  • the filter paper soaked in 7.5% ferric chloride was left on the common carotid artery for 1 minute and then removed.
  • Blood flow was recorded for 30 minutes using a laser speckle blood flow imager (OMEGAZONE OZ-2, Omega Wave Co., Ltd.). The time when blood flow stopped for more than 3 minutes was recorded as the occlusion time.
  • OMEGAZONE OZ-2 Omega Wave Co., Ltd.
  • Example 12 Examination of effects on internal jugular vein thrombosis
  • SA9001-K vaccine high-dose group and KLH group mice of Example 1 an internal jugular vein thrombosis test was performed 3 weeks after the final administration.
  • a mouse anesthetized with 1.4% isoflurane is fixed in the dorsal position, the skin of the neck is incised to expose the internal jugular vein, and a filter paper soaked in 10% ferric chloride is allowed to rest on the common carotid artery for 3 minutes. And then removed.
  • Blood flow was recorded for 30 minutes using a laser speckle blood flow imager (OMEGAZONE OZ-2, Omega Wave Co., Ltd.). The time when blood flow stopped for more than 3 minutes was recorded as the occlusion time.
  • OMEGAZONE OZ-2 Omega Wave Co., Ltd.
  • GHHHKPGLGE-C-NH 2 conjugated with KLH (SA9002-K) was prepared in the following manner.
  • EMC 6-maleimidocaproyl
  • a DMSO solution of N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS 40 mg) was dropped into a phosphate buffer (pH 8.0) solution of KLH (300 mg) for 3 hours.
  • EMCS 40 mg N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide
  • dialysis against the salt solution was repeated three times.
  • the peptide (6 mg) was dissolved in a phosphate buffer (pH 7.0), added dropwise to an EMCized KLH (25 mg) solution, and stirred overnight at room temperature.
  • reaction solution stirred overnight was dialyzed against H 2 O three times, and then the dialysis internal solution was lyophilized to obtain the desired product. Yield was 24 mg. It was confirmed by amino acid analysis that the peptide was introduced into the carrier protein (result: 49-62 nmol peptide / mg conjugate).
  • the antibody titer against the human S100A9 vaccine and the antibody titer against the recombinant human S100A9 protein were measured by ELISA.
  • a human S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 1) and BSA conjugate were diluted to 10 ⁇ g / ml and recombinant human S100A9 protein was diluted to 2 ⁇ g / ml, respectively, using 50 mM carbonate buffer. 50 ⁇ l of each dilution was added to the wells and incubated overnight at 4 ° C. After discarding the solution remaining in the well, 100% goat serum was added and blocked at room temperature for 2 hours.
  • Monkey serum was serially diluted with 100% goat serum, added in 50 ⁇ l aliquots and incubated overnight at 4 ° C. After washing with PBS-T solution, Goat Anti-Monkey IgG H & L (HRP) (abcam) was diluted with 5% skim milk, added to each well, and incubated at room temperature for 3 hours. After washing with PBS-T solution, 50 ⁇ l of TMB solution was added to each well and incubated for 30 minutes at room temperature under light shielding. Thereafter, a reaction stop solution (0.5N H 2 SO 4 ) was added, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader.
  • HRP Goat Anti-Monkey IgG H & L
  • FIG. (A) is a measurement result of antibody titer against a conjugate of human S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 1) and BSA
  • (B) is a measurement result of antibody titer against recombinant human S100A9.
  • the antibody titer was shown by half-maximal antibody titer (OD50%). All antibody titers increased significantly after 6 weeks.
  • Example 14 Production of antibody by administration of conjugate vaccine of mouse S100A9 antigenic peptide other than SA9001-K vaccine and KLH]
  • the amino acid sequence of positions 97 to 106 of mouse S100A9 amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) (ENNPRGGHHS, SEQ ID NO: 21)
  • the amino acid sequence at positions 2-11 (ANKAPSQMER, SEQ ID NO: 22)
  • the amino acid sequence at positions 25-34 RKEGPTDLS, SEQ ID NO: 23
  • peptides were synthesized by the Fmoc method using a fully automatic solid phase synthesizer.
  • ENNPRGGHHS SEQ ID NO: 21
  • ANKAPSQMER SEQ ID NO: 22
  • cysteine was added to the C-terminus
  • C-terminus was amidated
  • conjugated with KLH via EMCS For RKEGPDTLS (SEQ ID NO: 23), it was conjugated with KLH via glutaraldehyde.
  • the conjugate of mouse S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 21) and KLH is referred to as “SA9003-K”
  • the conjugate of mouse S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 22) and KLH is referred to as “SA9004-K”.
  • the conjugate of mouse S100A9 antigenic peptide (SEQ ID NO: 23) and KLH is referred to as “SA9005-K”.
  • a conjugate of ENNPRGGHHS-NH 2 and KLH was prepared by the following method. 5 mg of peptide was dissolved in phosphate buffer (pH 8.0) and mixed with 20 mg of KLH. After adding 30 ⁇ L of 25% glutaraldehyde aqueous solution dropwise, the mixture was stirred (pH 8.0) at room temperature for 5 hours. After 5 hours, 0.5 mL of Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added and stirred overnight. The reaction solution stirred overnight was dialyzed against H 2 O three times, and then the dialysis internal solution was lyophilized to obtain the desired product. Yield was 26 mg. It was confirmed by amino acid analysis that the peptide was introduced into the carrier protein (result: 63-66 nmol peptide / mg conjugate).
  • a conjugate of Ac-ANKAPSQMER-C-NH 2 and KLH was prepared by the following method.
  • EMC 6-maleimidocaproyl
  • EMCS N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide
  • a phosphate buffer (pH 8.0) solution of KLH 300 mg
  • dialysis against the salt solution was repeated three times.
  • the peptide (6 mg) was dissolved in 6M guanidine / phosphate buffer solution (pH 7.0), added dropwise to the EMCized KLH (20 mg) solution, and stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution stirred overnight was dialyzed against H 2 O three times, and then the dialysis internal solution was lyophilized to obtain the desired product.
  • the yield was 21 mg. It was confirmed by amino acid analysis that the peptide was introduced into the carrier protein (result: 102 to 105 nmol peptide / mg conjugate).
  • a conjugate of RKEGPDTLS and KLH was prepared by the following method. 5 mg of peptide was dissolved in phosphate buffer (pH 8.0) and mixed with 25 mg of KLH. After dropwise addition of 50 ⁇ L of 25% glutaraldehyde aqueous solution, the mixture was stirred (pH 8.0) at room temperature for 5 hours. After 5 hours, 0.5 mL of Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added and stirred overnight. The reaction solution stirred overnight was dialyzed against H 2 O three times, and then the dialysis internal solution was lyophilized to obtain the desired product. Yield was 31 mg. It was confirmed by amino acid analysis that the peptide was introduced into the carrier protein (result: 80-90 nmol peptide / mg conjugate).
  • the antibody titer against SA9003-K, SA9004-K or SA9005-K was measured by ELISA. That is, it was performed using an ELISA plate coated with a BSA-SA9003 conjugate (Peptide Institute), a BSA-SA9004 conjugate (Peptide Institute) or a BSA-SA9005 conjugate (Peptide Institute).
  • a detection antibody an HRP-labeled anti-mouse IgG sheep antibody (NA931V, GE Healthcare) was used.
  • Example 15 Effect on arteriosclerosis
  • SA9001-K was used as the S100A9 vaccine.
  • SA9001-K 50 ⁇ g (antigenic peptide) / mouse
  • TiterMax Gold trade name, Titer Max
  • Both groups were allowed to freely ingest a high fat diet for 12 weeks from 8 to 20 weeks of age.
  • perfusion fixation was performed using 4% paraformaldehyde under deep anesthesia, and the artery was removed from the heart to the iliac artery.
  • oil Ored staining was performed and the plaque area was analyzed.

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Abstract

Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。当該免疫原性組成物は、抗血栓効果を有し、かつ長期的な出血リスクを伴わない、安全性の高い抗血栓ワクチンとして使用することができ、血小板凝集が関与する血栓が形成される疾患の予防、特に、再発性虚血性脳卒中の予防に有用である。

Description

Ｓ１００Ａ９を標的とする免疫原性組成物
　本発明は、Ｓ１００Ａ９を標的とする免疫原性組成物に関するものである。
　アスピリン、アスピリンと徐放性ジピリダモールの合剤、クロピドグレルなどの抗血小板薬を用いた長期治療は、非心塞栓性脳卒中や一過性脳虚血発作患者の二次脳卒中予防に重要である。しかし、最近のスウェーデンの研究では、２年間で抗血小板薬の投与を中止した患者が２６．３％であったことを報告しており（非特許文献１）、米国の研究では、１年以内にアスピリン治療を受けている患者の２２．５％、アスピリン／ジピリダモール治療を受けている患者の４３．８％、クロピドグレル治療を受けている患者の３５．８％が投与を中止したことを報告している（非特許文献２）。日本においても、再発性虚血性脳卒中と診断された患者の約４０％が、抗血小板薬の服用を中止していたことが報告されている（非特許文献３）。
　そのため、虚血性脳卒中の再発を予防するために、長期の作用性を有し、かつ費用対効果の高い抗血小板療法の開発が求められている。このような観点から、ワクチンは毎日投与しなくても長期にわたり効果を持続でき、費用対効果が高いので、有望なアプローチの１つである。ワクチンは伝統的に感染症を予防するために使用されてきたが、最近は高血圧や糖尿病などの一般的な成人病にまで適用範囲が拡大している。しかし、抗血栓療法のワクチンは未だ報告されていない。抗血栓ワクチンを開発することが困難な理由の１つは、致命的な頭蓋内出血や胃腸出血を含む出血リスクの長期的増加である。
Glader, E.L., Sjolander, M., Eriksson, M. & Lundberg, M. Persistent use of secondary preventive drugs declines rapidly during the first 2 years after stroke. Stroke 41, 397-401 (2010) Bushnell, C.D., et al. Secondary preventive medication persistence and adherence 1 year after stroke. Neurology 77, 1182-1190 (2011) 伊藤康幸ら、「虚血性脳血管障害発症前の抗血栓薬内服状況の検討」臨床神経学、２０１１年、第５１巻、５２－５８頁
　本発明は、抗血栓効果を有し、かつ長期的な出血リスクを伴わない、安全性の高い免疫原性組成物を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物。
［２］抗原性ペプチドが、配列番号２の第１位～第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号２の第２１位～第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、または、配列番号２の第９５位～第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる前記［１］に記載の組成物。
［３］抗原性ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる前記［１］に記載の組成物。
［４］抗原性ペプチドが、配列番号６～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる前記［１］または［２］に記載の組成物。
［５］キャリアタンパク質が、スカシガイヘモシアニンである前記［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］さらにアジュバントを含む前記［１］～［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］血栓の予防に用いるための前記［１］～［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］抗血栓ワクチンとして使用するための前記［１］～［６］のいずれかに記載の組成物。
［９］脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、狭心症または血小板増多症の予防に用いるための前記［１］～［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］再発性虚血性脳卒中の予防に用いるための前記［１］～［８］のいずれかに記載の組成物。
［１１］Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防または治療に用いるための前記［１］～［６］のいずれかに記載の組成物。
［１２］Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患が、動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎またはアルツハイマー型認知症である前記［１１］に記載の組成物。
　本発明により、抗血栓効果を有し、かつ長期的な出血リスクを伴わない、安全性の高い免疫原性組成物を提供することができる。
（Ａ）はマウスＳ１００Ａ８抗原性ペプチド（ＡＳＨＫＤＳＨＫＥ、配列番号５）とスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）とのコンジュゲート（ＳＡ８００１－Ｋ）ワクチンを投与したマウス血清中のＳ１００Ａ８に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図であり、（Ｂ）はマウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（ＧＨＳＨＧＫＧＣＧＫ、配列番号３）とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００１－Ｋ）ワクチンを投与したマウス血清中のＳ１００Ａ９に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。 ＳＡ８００１－Ｋワクチン投与マウス血清中の抗Ｓ１００Ａ８抗体、および、ＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウス血清中の抗Ｓ１００Ａ９抗体をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。 遠位中大脳動脈閉塞症モデルマウスを用いて、Ｓ１００Ａ８ワクチンおよびＳ１００Ａ９ワクチンの中大脳動脈閉塞に対する効果を検討した結果を示す図である。 中大脳動脈に塩化第二鉄誘発性血栓形成処置を行ったＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウスおよびＫＬＨ投与マウスから摘出した中大脳動脈の病理組織学的検査結果を示す図であり、左は非潅流脳の中大脳動脈標本であり、右は潅流固定脳の中大脳動脈標本である。 Ｓ１００Ａ９ワクチンの血小板血栓形成に対する効果を検討した結果を示す図である。 Ｓ１００Ａ９ワクチンの出血に対する効果を検討した結果を示す図である。 （Ａ）は血小板数を測定した結果を示す図であり、（Ｂ）は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定した結果を示す図であり、（Ｃ）はプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した結果を示す図である。 Ｓ１００Ａ９ワクチンの血清Ｓ１００Ａ９レベルに対する効果を検討した結果を示す図である。 Ｓ１００Ａ９ワクチンにより誘導された抗体のＩｇＧサブクラスごとの力価を測定した結果を示す図である。 ＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウス由来の脾細胞をＳ１００Ａ９抗原性ペプチド、リコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質またはＫＬＨで刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりＴ細胞活性化を評価した結果を示す図であり、（Ａ）は各群の代表的なウェルの顕微鏡画像であり、（Ｂ）は染色スポット数を測定した結果を示す図である。 ＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウスにおけるＳ１００Ａ９に対する抗体価を経時的に測定した結果を示す図である。 追加のＳＡ９００１－Ｋワクチン投与（ブースター免疫）後、中大脳動脈閉塞時間を測定した結果を示す図である。 追加のＳＡ９００１－Ｋワクチン投与（ブースター免疫）後、尾出血時間を測定した結果を示す図である。 初回ワクチン投与から１４７日目の腎臓の病理組織学的検査結果を示す図であり、（Ａ）はＫＬＨ投与マウスの結果、（Ｂ）はＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウスの結果である。 初回ワクチン投与から１４７日目の脳の病理組織学的検査結果を示す図であり、（Ａ）はＫＬＨ投与マウスの結果、（Ｂ）はＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウスの結果である。 Ｓ１００Ａ９ワクチンのＳ１００Ａ９／ＣＤ３６シグナル伝達に及ぼす効果を検討した結果を示す図である。 総頸動脈閉塞モデルマウスを用いて、Ｓ１００Ａ９ワクチンの総頸動脈閉塞に対する効果を検討した結果を示す図である。 内頸静脈血栓症モデルマウスを用いて、Ｓ１００Ａ９ワクチンの総頸動脈閉塞に対する効果を検討した結果を示す図である。 サルにＫＬＨ－ヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチドコンジュゲート（ＳＡ９００２－Ｋ）ワクチンを投与し、血清中の抗体価を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチドとＢＳＡのコンジュゲートに対する抗体価の測定結果であり、（Ｂ）は組換えヒトＳ１００Ａ９に対する抗体価の測定結果である。 マウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ、配列番号６）とＫＬＨコンジュゲート（ＳＡ９００３－Ｋ）ワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ９抗原性ペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。 マウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ、配列番号７）とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００４－Ｋ）ワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ９抗原性ペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。 Ｓ１００Ａ９ワクチンの動脈硬化に対する効果を、高脂肪食を摂取させたＡｐｏＥ欠損マウスの動脈に形成されたプラーク面積により評価した結果を示す図である。
　本発明は、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。
　Ｓ１００タンパク質は、細胞種特異的に発現する２個のＥＦ－ｈａｎｄを持つカルシウム結合性タンパク質であり、現在までに２０種類のサブファミリーが確認されている。Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４とも称される）は低分子量カルシウム結合性Ｓ１００タンパク質に属しており、通常Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８とも称される）と共に発現し、両者はヘテロ二量体を形成する。Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体は、種々の炎症性疾患に関連していることがわかっている。また、巨細胞性動脈炎、嚢胞性線維症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性炎症性腸疾患、慢性気管支炎、いくつかの悪性腫瘍、および自己免疫疾患を含む数多くの炎症性疾患の患者において、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体の血清レベルが亢進することが明らかにされている。
　Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドは、Ｓ１００Ａ９のアミノ酸配列に基づいて設計できる。主要な哺乳動物のＳ１００Ａ９のアミノ酸配列は公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から取得することができる。例えば、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号２）のアクセッション番号はＮＰ＿００２９５６（ＮＣＢＩ）であり、マウスＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号４）のアクセッション番号はＣＡＣ１４２９２（ＮＣＢＩ）である。
　Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドは、ヒトＳ１００Ａ９のフラグメントであって、抗原性を有するフラグメントであれば特に限定されないが、配列番号２の第１位～第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２の第２１位～第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号２の第９５位～第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
　配列番号２の第１位～第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２の第６位～第１０位と同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。このようなアミノ酸配列としては、例えば、ＭＴＣＫＭＳＱＬＥＲ（配列番号６）、ＴＣＫＭＳＱＬＥＲＮ（配列番号７）、ＣＫＭＳＱＬＥＲＮＩ（配列番号８）、ＫＭＳＱＬＥＲＮＩＥ（配列番号９）、ＭＳＱＬＥＲＮＩＥＴ（配列番号１０）、ＳＱＬＥＲＮＩＥＴＩ（配列番号１１）などが挙げられる。
　配列番号２の第２１位～第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、ＱＹＳＶＫＬＧＨＰＤ（配列番号１２）、ＹＳＶＫＬＧＨＰＤＴ（配列番号１３）、ＳＶＫＬＧＨＰＤＴＬ（配列番号１４）、ＶＫＬＧＨＰＤＴＬＮ（配列番号１５）などが挙げられる。
　配列番号２の第９５位～第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２の第１０２位～第１０６位と同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。このようなアミノ酸配列としては、例えば、ＧＤＥＧＰＧＨＨＨＫ（配列番号１６）、ＤＥＧＰＧＨＨＨＫＰ（配列番号１７）、ＥＧＰＧＨＨＨＫＰＧ（配列番号１８）、ＧＰＧＨＨＨＫＰＧＬ（配列番号１９）、ＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧ（配列番号２０）、ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ（配列番号１）などが挙げられる。
　Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとして、より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであり、さらに好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
　Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドは、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号２）の部分配列と同一の配列からなるペプチドに限定されず、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号２）の部分配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導できるアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列が挙げられる。好ましくは、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導できるアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列である。具体例としては、リンカーを介してキャリアタンパク質と連結（コンジュゲート）するためにＮ末端またはＣ末端に１個のアミノ酸（例えば、システイン）が付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の免疫原性組成物の効果を確認するために、実験動物（マウス等）を用いて実験を行う場合、ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド配列に対応する実験動物のアミノ酸配列を用いて実験を行うことが好ましい。用いる実験動物のＳ１００Ａ９のアミノ酸配列は、公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から取得することができ、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列とアライメントすることにより、用いる実験動物の抗原性ペプチド配列を設計することができる。上記配列番号１で示されるヒト抗原性ペプチド配列に対応するマウス抗原性ペプチド配列は、ＧＨＳＨＧＫＧＣＧＫ（配列番号３）である。なお、実験動物としてサルを用いれば、ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドを含む本発明の免疫原性組成物の効果を確認することができる。
　キャリアタンパク質は特に限定されず、ワクチンに使用できる公知のキャリアタンパク質の中から適宜選択して用いることができる。公知のキャリアタンパク質としては、例えばアルブミン、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ：keyhole limpet hemocyanin）、緑膿菌外毒素、破傷風毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、血小板由来増殖因子、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－グルタミン、マンノース－６－ホスフェート、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。なかでも、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
　抗原性ペプチドとキャリアタンパク質は、連結（コンジュゲート）していることが好ましい。抗原性ペプチドとキャリアタンパク質は、融合タンパク質のように直接連結されていてもよく、リンカー（スペーサーと同義）を介して連結されていてもよい。リンカーは抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を連結できるものであれば特に限定されない。例えば、β－アミノアラニン、γ－アミノ酪酸、ε－アミノカプロン酸、７－アミノヘプタン酸、１２－アミノラウリン酸、グルタミン酸、ｐ－アミノ安息香酸等のアミノカルボン酸を用いることができる。また、天然のタンパク質に存在するＬ－アミノ酸やそれらのＤ－アミノ酸も用いることができる。また、ＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）、グルタルアルデヒド、スルホＧＭＢＳ（N-γ-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester）などのクロスリンカーを用いることができる。
　キャリアタンパクとして上記のＫＬＨを用いる場合、抗原性ペプチドにリシン（Ｌｙｓ；Ｋ）が含まれない場合は、グルタルアルデヒドを好ましく用いることができる。抗原性ペプチドにリシンが含まれる場合でも、抗原性ペプチドのＮ末端またはＣ末端にのみリシンが含まれる場合は、グルタルアルデヒドを好ましく用いることができる。抗原性ペプチドがＮ末端またはＣ末端以外の位置にリシンを含む場合には、抗原性ペプチドのＮ末端あるいはＣ末端にシステイン（Ｃｙｓ；Ｃ）を導入すること、および／または、ＥＭＣＳを用いて連結することが好ましい。また、抗原性ペプチドの配列に関わらず、Ｃ末端にシステインを導入し、スルホＧＭＢＳを用いて連結することができる。
　本発明の免疫原性組成物は、さらに１種以上のアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、公知のアジュバントの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ－ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ－２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。好ましくは、アルミニウムアジュバントである。
　本発明の免疫原性組成物を動物に投与することにより、血小板凝集が関与する血栓を有効に予防することができる。それゆえ、本発明の免疫原性組成物は、抗血栓ワクチンとして好適に用いることができる。
　本発明の免疫原性組成物は、脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、狭心症、血小板増多症等の血小板凝集が関与する血栓が形成される疾患の予防に好適に用いることができる。また、本発明の免疫原性組成物は、再発性虚血性脳卒中の予防に好適に用いることができる。
　本発明の免疫原性組成物は、Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防または治療に好適に用いることができる。Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患としては、動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝障害（nonalcoholic fatty liver disease: NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis: NASH）、アルツハイマー型認知症などが挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、動脈硬化症の予防または治療に用いることが好ましい。
　本発明の免疫原性組成物は、経口投与または非経口投与により投与することができる。非経口投与としては、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与、吸入投与などが挙げられる。好ましくは、非経口投与であり、より好ましくは、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与である。
　本発明の免疫原性組成物は、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質と薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口投与用製剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口投与用製剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　経口投与用の固形製剤に用いられる添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等のコーティング剤等が挙げられる。
　経口投与用の液体製剤は、一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁または乳化されて製剤化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール、それらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
　非経口投与用の注射剤に用いられる添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
　本発明の免疫原性組成物は、免疫系を有するあらゆる動物（ヒト、非ヒト）を投与対象とすることができる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等の哺乳動物；ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類が挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、ヒトの小児および成人を対象とすることが好ましい。
　本発明の免疫原性組成物の投与回数および投与間隔は特に限定されない。例えば、単回投与でもよく、約２日～約８週間の間隔で複数回投与してもよい。免疫原性組成物の投与量は、投与対象、投与方法などにより異なるが、１回投与量を、抗原性ペプチド量として約０．０１μｇ～約１０ｍｇとすることが好ましく、約０．１μｇ～約１ｍｇとすることがより好ましく、約１μｇ～約０．１ｍｇとすることがさらに好ましい。
　本発明の免疫原性組成物は、マウスを用いた実験において、最終投与から少なくとも２か月間Ｓ１００Ａ９に対する抗体の産生を維持できること、およびその後の追加投与によりブースター効果が得られることが実証されている（実施例参照）。それゆえ、再発性虚血性脳卒中と診断された患者の約４０％が、抗血小板薬の服用を中止していた問題（非特許文献３）を考慮すれば、このように長期の作用性と追加投与のブースター効果を有する本発明の免疫原性組成物は、非心塞栓性脳卒中や一過性脳虚血発作患者の再発性脳卒中予防に非常に有用なワクチンまたは医薬を提供するものであると考えられる。
　本発明には、以下の各発明が含まれる。
　本発明の免疫原性組成物を動物に投与することを含む、血栓の予防、またはＳ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防もしくは治療方法。
　血栓の予防、またはＳ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防もしくは治療に使用するための、本発明の免疫原性組成物。
　血栓の予防用、またはＳ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防もしくは治療用ワクチンまたは医薬を製造するための、本発明の免疫原性組成物の使用。
　本発明の免疫原性組成物は、止血パラメータに影響を及ぼさず、有害な自己免疫応答を誘発することなく、用量依存的に閉塞時間を延長することができる。さらに、本発明の免疫原性組成物は、投与後少なくとも２か月間は抗Ｓ１００Ａ９抗体の産生を持続でき、その後の追加投与によりブースター効果を発現し、閉塞時間の延長効果をさらに持続させることができる。したがって、本発明の免疫原性組成物は、脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、血小板増多症等の疾患における血栓予防に有用であり、特に、毎日の経口抗血小板薬の服用が困難な虚血性脳卒中患者における再発予防に非常に有用である。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるマウスを用いた動物実験は、大阪大学大学院医学系研究科動物実験委員会の承認を受け、サルを用いた動物実験はシミックファーマサイエンス株式会社動物実験審査委員会の承認を受けて実施した。
［実施例１：ワクチン投与による抗体の産生］
（１）ワクチンの設計および合成
　マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドとしてＣ末端領域（第１０４～１１３位、ＧＨＳＨＧＫＧＣＧＫ、配列番号３）のアミノ酸配列を選択した。マウスＳ１００Ａ８の抗原性ペプチドとしてＣ末端領域（第８１～８９位、ＡＳＨＫＤＳＨＫＥ、配列番号５）のアミノ酸配列を選択した。文献「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ（１９８４）、Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）」および「第５版　実験化学講座１６　有機化合物の合成ＩＶ」等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用いて、０．１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーで確認した。
　得られたマウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号３）およびマウスＳ１００Ａ８の抗原性ペプチド（配列番号５）を、ＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）を介してＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin：スカシガイヘモシアニン、株式会社ペプチド研究所）と連結（コンジュゲート）した。以下、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号３）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００１－Ｋ」と称し、マウスＳ１００Ａ８の抗原性ペプチド（配列番号５）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ８００１－Ｋ」と称する。
（２）実験方法
　７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを日本クレアから購入した。ＳＡ８００１－Ｋワクチン群（20μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群（20μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）およびコントロールとしてＫＬＨ群を設けた。ＫＬＨ群のマウスには、コンジュゲートに含まれるＫＬＨと等量のＫＬＨを投与した。投与前にＳＡ８００１－Ｋ、ＳＡ９００１－ＫまたはＫＬＨ単独を等容積のフロイントアジュバント（和光純薬）と混合し、皮下投与した。初回はフロイント完全アジュバントを使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバントを使用した。ＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群およびＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群には、合計３回（０、１４および２８日目）ワクチンを投与した。ＳＡ８００１－Ｋワクチン群には、合計２回（０および１４日目）ワクチンを投与した。最終投与の２週間後（ＳＡ８００１－Ｋワクチン群は２８日目、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群（低用量、高用量とも）は４２日目）に尾静脈から採血した。血清を分離し、本実施例の試料とした。
　Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９に対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、ＢＳＡ－Ｓ１００Ａ８コンジュゲート（ペプチド研究所）またはＢＳＡ－Ｓ１００Ａ９コンジュゲート（ペプチド研究所）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて行った。検出抗体には、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（NA931V、GEヘルスケア）を使用した。
　ＳＡ８００１－Ｋワクチン群、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群の血清中の抗Ｓ１００Ａ８抗体および抗Ｓ１００Ａ９抗体をウエスタンブロッティングにより検出した。すなわち、リコンビナントマウスＳ１００Ａ８（アブカム）およびリコンビナントマウスＳ１００Ａ９（アブカム）をそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を各血清とインキュベートした後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（NA931V、ＧＥヘルスケア）とインキュベートし、化学発光シグナルをＬＡＳ１０００カメラ（富士フィルム）で検出し、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ ｖｅｒ．３．２ソフトウェア（富士フィルム）で解析した。陽性対照として、転写後のＰＶＤＦ膜を市販の抗マウスＳ１００Ａ８抗体（R＆D Systems）または抗マウスＳ１００Ａ９抗体（LifeSpan BioScience）とインキュベーションし、同様に化学発光シグナルを検出した。
（３）結果
　ＥＬＩＳＡによる抗体価の測定結果を図１（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＳＡ８００１－Ｋワクチン群の結果、（Ｂ）はＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群およびＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群の結果である。ＳＡ８００１－Ｋワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ８に対する抗体価は２８日目に完全に増加した。また、ＳＡ９００１－Ｋワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ９に対する抗体価は、低用量群および高用量群とも４２日目に完全に増加した。
　ウエスタンブロッティングの結果を図２に示した。ＳＡ８００１－Ｋワクチン群（図中、S100A8 vaccine group）の血清中にはＳ１００Ａ８と反応する抗体が検出され、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群（図中、S100A9 vaccine group）の血清中にはＳ１００Ａ９と反応する抗体が検出された。
［実施例２：中大脳動脈閉塞に対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ８００１－Ｋワクチン群、ＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用い、最終投与の３週間後に中大脳動脈閉塞試験を実施した。別途、クロピドグレル（Clopidogrel）低用量群（3mg/kg）およびクロピドグレル高用量群（6mg/kg）を設けた。クロピドグレル群には、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群と同じスケジュール（０、１４および２８日目）で生理食塩水とフロイントアジュバントの混合物を投与したマウスを用いた。クロピドグレル（サノフィ）を水に溶解し、中大脳動脈閉塞試験実施の前日と当日に２日間連続で経口投与した。
　遠位中大脳動脈閉塞症モデルとして、Ｋａｒａｔａｓらの方法（Karatas, H. et al., J Cereb Blood Flow Metab 31, 1452-1460, 2011）に従い、塩化第二鉄誘発性血栓症マウスモデルを作製した。具体的には、１．４％イソフルレンで吸入麻酔し、体温を直腸プローブでモニターし、手術中は３７．０±０．５℃に維持した。固定台に固定したマウスを高速ドリル（リューターミニペンＬＰ－１２０、日本精密機械工作株式会社）を用いて開頭し、レーザードップラー血流計（株式会社ユニークメディカル）を頭蓋骨に設置し、局所脳血流（regional cerebral blood flow：rCBF）をモニターした。２０％塩化第二鉄に浸した濾紙を右遠位中大脳動脈上の軟膜に３分間静置した後、取り除いた。局所脳血流を損傷発生後３０分間継続的にモニターした。局所脳血流が４０％以上減少し、その減少が少なくとも５分間維持される時間を閉塞時間として記録した。
　中大脳動脈の組織学的検査は、非灌流または灌流固定の脳で行った。非灌流の場合は、塩化鉄刺激を加えた２５分後に脳に付着した状態で中大脳動脈を回収し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、パラフィンに包埋した。灌流固定の場合は、塩化鉄刺激を加えた２５分後に深麻酔下で０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍｌを心尖部より投与し、続いて４％パラホルムアルデヒド２０ｍｌを心尖部より投与した。その後脳に付着した状態で中大脳動脈を回収し、パラフィンに包埋した。脳を厚さ３μｍの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
（２）結果
　中大脳動脈閉塞時間の結果を図３に示した。ＫＬＨ群と比較して、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群は、中大脳動脈閉塞時間を有意に延長した（ＫＬＨ群：6.4±0.6（分）、ＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群：15.8±3.9（分）p<0.05、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群：23.3±4.3（分）p<0.01）。ＫＬＨ群と比較して、クロピドグレル低用量群には有意差が認められなかったが、クロピドグレル高用量群は、中大脳動脈閉塞時間を有意に延長した（18.6±3.4（分）p<0.01）。ＳＡ８００１－Ｋワクチン群は、中大脳動脈閉塞時間に影響を及ぼさなかった。
　病理組織学的検査の結果を図４に示した。図中左側は非潅流標本、右側は潅流固定標本であり、上段はＫＬＨ群、下段はＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群である。スケールバーは５０μｍを示す。ＫＬＨ群の非潅流標本では管腔を満たすフィブリン－血小板が豊富な血栓が観察されたが（図４Ａの矢印）、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群の非潅流標本では管腔を満たす血栓は観察されなかった。ＫＬＨ群の潅流固定標本では管腔は血栓で充満し閉塞していた（図４Ｂの矢頭）。一方、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群の潅流固定標本では血管壁に沿って小さな血栓が観察されたが、内腔は開存していた。
　これらの結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチン投与により、血栓はほとんど形成されず、形成されても脆い血栓であることが示された。
［実施例３：血小板血栓形成に対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群から採血した血液を用いて血小板血栓形成に対するＳ１００Ａ９ワクチンの効果を評価した。陰性対照として、生理食塩水群を設けた。生理食塩水群には、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群と同じスケジュール（０、１４および２８日目）で生理食塩水とフロイントアジュバントの混合物を投与し、最終投与の２週間後に採血した。
　Ｈｏｓｏｋａｗａらの方法（Hosokawa, K. et al., Microvasc Res 83, 154-161, 2012）に従い、自動マイクロチップ型フローチャンバーシステム（藤森工業株式会社）を用いて、血小板血栓形成アッセイを行った。具体的には、ヒルジン（25μg/ml）により抗凝固処理した全血（350μl）をコラーゲンコートマイクロチップ内に、ずり速度１０００／秒でかん流させた。その後、コンピュータ支援画像解析法（Image J:version 1.48 および GIMP 2.8）を用いて、血栓領域を定量化した。
（２）結果
　結果を図５に示した。ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群では、生理食塩水群およびＫＬＨ群と比較して、マイクロチップ型フローチャンバーシステムにおける血小板血栓形成が有意に減少した（p<0.05）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンが血小板機能を阻害することで、血小板血栓形成を防いでいることが明らかになった。
［実施例４：出血に対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例２で中大脳動脈閉塞モデルを作製したＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群、ＫＬＨ群およびクロピドグレル高用量群のマウスを用い、中大脳動脈閉塞実験の３日後に尾出血アッセイを行った。クロピドグレル高用量群には、中大脳動脈閉塞実験の翌日から尾出血アッセイの当日まで、さらに３日間連続でクロピドグレルを投与した。
　尾出血アッセイは、Ｌｉｕらの方法（Liu, Y. et al., World J Exp Med 2, 30-36, 2012）に従って行った。具体的には、マウスを１．４％イソフルレンで吸入麻酔し、腹臥位に置いた後、尾の先端１ｃｍを外科用メスで切断し、直ちに３７℃に予熱した生理食塩水の入った５０ｍＬチューブに浸した。各マウスを２０分間モニターし、２０分間のうちの出血時間の合計を記録した。
（２）結果
　結果を図６に示した。ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群とＫＬＨ群の尾出血時間に有意差は認められなかった。一方、クロピドグレル（3mg/kg）群およびクロピドグレル（6mg/kg）群は、ＫＬＨ群と比較して、尾出血時間が有意に長かった（いずれもp<0.01）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンが出血に影響を及ぼさないことが明らかになった。
［実施例５：血小板凝固に対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群から採血した血液を用いて血小板凝固に対するＳ１００Ａ９ワクチンの効果を評価した。
　血小板数は、ＥＤＴＡを含むチューブに採血し、動物用血球計数装置のベトスキャンＨＭ２(Ａｂａｘｉｓ)を用いて計数した。凝固活性への影響は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定して評価した。具体的には、クエン酸ナトリウムを含むチューブに採血し、４℃で１５分間遠心分離（1500rpm）した。ａＰＴＴおよびＰＴの測定はＫＡＣ株式会社に委託した。
（２）結果
　結果を図７（Ａ）～（Ｃ）に示した。（Ａ）は血小板数の結果、（Ｂ）はａＰＴＴの結果、（Ｃ）はＰＴの結果である。血小板数は、ＫＬＨ群（207±49×109個/L）とＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群（180±49×109個/L）で同様であった（p=0.711）。ａＰＴＴおよびＰＴについても、ＫＬＨ群とＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群の間に有意差は認められなかった（それぞれ、p=0.403、p=0.149）。これらの結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンは恒常性に影響を及ぼさないことが明らかになった。
［実施例６：血清Ｓ１００Ａ９レベルに対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例２で中大脳動脈閉塞実験を実施したＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスから採血した血液を用いた。具体的には、ＳＡ９００１－Ｋワクチンの投与前（免疫前）、初回投与後４２日目（ワクチン３回目投与の２週間後）および中大脳動脈閉塞実験の３日後に採血し、マウスＳ１００Ａ９ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（R＆D Systems）により血清Ｓ１００Ａ９レベルを測定した。
（２）結果
　結果を図８に示した。免疫前および初回免疫の４２日後では、ＫＬＨ群およびＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群間で血清Ｓ１００Ａ９レベルに有意差は認められなかった。実験的脳卒中の３日後では、ＫＬＨ群の血清Ｓ１００Ａ９レベルは上昇しており、統計的有意差は認められなかったが、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群では血清Ｓ１００Ａ９レベルの上昇が抑制される傾向にあった（p=0.053）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンは血清中のＳ１００Ａ９レベルを低下させ、Ｓ１００Ａ９による血小板凝固シグナルを抑制できることが示唆された。
［実施例７：Ｔ細胞活性化の評価］
７－１　ＩｇＧサブクラスの決定
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群から、初回投与後４２日目（ワクチン３回目投与の２週間後）に採血した血液を試験に供した。ＳＡ９００１－Ｋワクチン投与により誘導されるＩｇＧサブクラスは、抗マウスＩｇＧサブクラス特異的ＨＲＰ標識抗体（IgG1、IgG2bおよびIgG2c）を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。
（２）結果
　結果を図９に示した。抗Ｓ１００Ａ９抗体プールにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ｂの比率は、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群（希釈１：２５０）において１．０よりも大きかった。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンは、Ｔｈ２型応答（ＩｇＧ１）を誘導することが示された。
７－２　Ｓ１００Ａ９ワクチン投与によるＴ細胞活性化
（１）実験方法
　Ｓ１００Ａ９ワクチン投与マウスの脾細胞を用いて、Ｔｈ１およびＴｈ２応答にそれぞれ関連するサイトカインであるＩＦＮ－γおよびＩＬ－４の産生を調べた。実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群のマウスから、最終ワクチン投与の２～３週間後に脾臓を摘出し、ＥＬＩＳＰＯＴ（enzyme-linked immunosorbent spot）アッセイに供した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｐａｎｇらの方法（Pang, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111, E1256-1263, 2014）に従って実施した。具体的には、無菌９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（Millipore）に、抗マウスＩＦＮ－γキャプチャー抗体または抗マウスＩＬ－４キャプチャー抗体を、４℃で一晩コーティングした。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）溶液でプレートを洗浄し、１％ＢＳＡおよび５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースを含むＰＢＳでブロッキングした。摘出した脾臓から調製した脾細胞懸濁液をプレートに加え（106細胞/ウェル）、１０μｇ／ｍＬのＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号３）、ＫＬＨまたはリコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質を加えて３７℃で４８時間刺激した。陽性対照として、イオノマイシン／ＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）を用い、同様に３７℃で４８時間刺激した。ＰＢＳ－Ｔ溶液でプレートを洗浄した後、ビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ抗体またはビオチン化抗マウスＩＬ－４抗体を、４℃で一晩、反応させた。プレートを洗浄後、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼを各ウェルに加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔ溶液で洗浄後、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェートＰ－トルイジン塩およびニトロブルーテトラゾリウム溶液と室温で３０分間反応させた。プレートを水で洗浄し、室温で風乾させた後、解剖顕微鏡（Zeiss Stemi 305）を用いて、染色スポットを計測した。
（２）結果
　結果を図１０（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は各群の代表的なウェルの顕微鏡画像、（Ｂ）は染色スポット数を測定した結果である。ＫＬＨの刺激によりＩＦＮ－γおよびＩＬ－４の産生が誘導され、陽性対照のイオノマイシン／ＰＭＡで処理した脾細胞と同様の両サイトカインを産生する脾細胞を有意に多数生成した。しかし、Ｓ１００Ａ９の抗原性ペプチド（図中、S100A9-epitope peptide）およびリコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質は、無刺激およびＫＬＨ対照群と比較して有意な応答を誘発しなかった。この結果から、ＫＬＨはＳ１００Ａ９ワクチン投与マウスにおいてＴ細胞の活性化を誘導するのに十分なＴ細胞抗原決定基を含むことが明らかになった。一方、Ｓ１００Ａ９の抗原性ペプチドおよびリコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質の刺激ではＩＦＮ－γおよびＩＬ－４の産生上昇を認めなかったことから、自己タンパク質であるＳ１００Ａ９に対する細胞障害性Ｔ細胞の活性化は回避できていると考えられた。つまり、Ｓ１００Ａ９ワクチン投与マウスではＴｈ細胞は抗体産生を誘導するＴｈ２型を有意に分化したと考えられる。
［実施例８：Ｓ１００Ａ９ワクチンの長期有効性の検討］
（１）実験方法
　実施例１において、０、１４および２８日目にＳＡ９００１－ＫワクチンまたはＫＬＨを投与したＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群（20μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）およびＫＬＨ（コントロール）群のマウスに対し、１２６日目に追加のワクチン投与を行った。１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６および１４０日目に尾静脈から採血し、実施例１と同じ方法で、ＥＬＩＳＡによりＳ１００Ａ９に対する抗体価を測定した。
（２）結果
　結果を図１１に示した。Ｓ１００Ａ９に対する抗体価は、４２、５６および７０日目に用量依存的に増加したが、９８日目まで徐々に減少した。４２日目において、ＳＡ９００１－Ｋワクチン低用量群よりＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群の抗体価が約６倍高かった。１２６日目に追加のワクチン投与を行った結果、追加ワクチン投与の１４日後（１４０日目）のＳ１００Ａ９に対する抗体価は、低用量群および高用量群とも顕著に増加した。この結果から、最後のＳ１００Ａ９ワクチン投与から少なくとも２か月間Ｓ１００Ａ９に対する抗体の産生を維持できること、および追加ワクチン投与によりブースター効果が得られることが実証された。
［実施例９：ブースター免疫後のＳ１００Ａ９ワクチンの有効性および安全性の検討］
９－１　中大脳動脈梗塞時間
（１）実験方法
　実施例８で追加のワクチン投与（ブースター免疫）を行った３週間後に、実施例２と同じ方法でＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスに対して中大脳動脈閉塞試験を実施し、梗塞時間を測定した。
（２）結果
　結果を図１２に示した。中大脳動脈閉塞時間は、ＫＬＨ群と比較して、ＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群で有意に遅延した（p<0.01）。
９－２　尾出血時間
（１）実験方法
　９－１で中大脳動脈閉塞試験を実施したマウスを用いて、同日に実施例４と同じ方法で尾出血時間を測定した。
（２）結果
　結果を図１３に示した。尾出血時間はＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群とＫＬＨ群の間に有意差は認められなかった。
９－３　病理組織学的検査
（１）実験方法
　実施例８で、１２６日目に追加のワクチン投与（ブースター免疫）を行った後、１４７日目に脳および腎臓を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。脳および腎臓の切片をヘマトキシリン／エオジンで染色した。また、腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。
（２）結果
　腎臓の結果を図１４に、脳の結果を図１５にそれぞれ示した。スケールバーは１００μｍを示す。腎臓、脳ともに、明らかな病理学的変化は認められず、Ｔ細胞またはマクロファージの浸潤も観察されなかった。
［実施例１０：Ｓ１００Ａ９／ＣＤ３６シグナル伝達に及ぼす効果の検討］
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用いた。最終投与の２週間後（４２日目）に、実施例２と同じ方法でマウスを開頭し、２０％塩化第二鉄含有濾紙を右遠位中大脳動脈上の軟膜に４分間静置した。その後下大静脈より採血し、血小板を回収した。血小板からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングに供した。抗体には、抗ＪＮＫ抗体（Cell Signaling Technology）および抗リン酸化ＪＮＫ抗体（Cell Signaling Technology）を用いた。
（２）結果
　結果を図１６に示した。ＳＡ９００１－Ｋワクチン投与群では、血小板凝集のＳ１００Ａ９／ＣＤ３６シグナルの下流であるＪＮＫのリン酸化が抑制されていることが明らかになった。
［実施例１１：総頸動脈閉塞に対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用い、最終投与の３週間後に総頸動脈閉塞試験を実施した。１．４％イソフルレンで吸入麻酔したマウスを背位固定し、頸部の皮膚を切開して右総頸動脈を露出させ、外膜を除去した。７．５％塩化第二鉄に浸した濾紙を総頸動脈上に１分間静置した後、取り除いた。レーザースペックル血流イメージャー（OMEGAZONE OZ-2、オメガウェーブ株式会社）を用いて、３０分間血流を記録した。血流が３分超停止した時間を閉塞時間として記録した。
（２）結果
　結果を図１７に示した。ＫＬＨ群と比較して、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群は、総頸動脈閉塞時間を有意に延長した（p<0.05）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチン投与は、中大脳動脈の閉塞だけでなく、総頸動脈の閉塞に対しても有効であることが示された。
［実施例１２：内頸静脈血栓症に対する効果の検討］
（１）実験方法
　実施例１のＳＡ９００１－Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用い、最終投与の３週間後に内頸静脈血栓症試験を実施した。１．４％イソフルレンで吸入麻酔したマウスを背位固定し、頸部の皮膚を切開して内頸静脈を露出させ、１０％塩化第二鉄に浸した濾紙を総頸動脈上に３分間静置した後、取り除いた。レーザースペックル血流イメージャー（OMEGAZONE OZ-2、オメガウェーブ株式会社）を用いて、３０分間血流を記録した。血流が３分超停止した時間を閉塞時間として記録した。
（２）結果
　結果を図１８に示した。ＫＬＨ群とＳＡ９００１－Ｋワクチン群の間に有意差は認められなかったが（P=0.062）、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群は、ＫＬＨ群と比較して、内頸静脈閉塞時間の遅延傾向が認められた。
［実施例１３：サルに対するヒトＳ１００Ａ９ワクチン投与による抗体の産生］
（１）ＫＬＨ－ヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチドコンジュゲートワクチンの調製
　配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ）からなるペプチドを、全自動固相合成機を用いてＦｍｏｃ法で合成した。Ｃ末端にシステインを付加し、ついでＣ末端をアミド化した。得られたペプチドをＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）を用いてＫＬＨとコンジュゲートした。以下、ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号１）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００２－Ｋ」と称する。
　ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ－Ｃ－ＮＨ２とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００２－Ｋ）は以下の方法で作製した。
　ＥＭＣ（6-maleimidocaproyl）化ＫＬＨは、ＫＬＨ（300 mg）のリン酸緩衝液（pH8.0）溶液に、N-(6-maleimidocaproyloxy) succinimide（EMCS 40 mg）のＤＭＳＯ溶液を滴下し、３時間攪拌後、塩溶液に対する透析を三回繰り返して調製した。続いて、ペプチド（6 mg）をリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、ＥＭＣ化ＫＬＨ（25 mg）溶液に滴下後、室温で終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は２４ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：49～62 nmol peptide/mg conjugate）。
（２）実験方法
　実験は、シミックファーマサイエンス株式会社にて行った。３～４年齢の雄カニクイザル２匹をハムリー株式会社から購入した。ＳＡ９００２－Ｋを、生理食塩水を用いて抗原性ペプチド濃度が０．４ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、等量のアラムと混合して０．２ｍｇ／ｍｌのヒトＳ１００Ａ９ワクチンを調製した。０、１４および２８日目に、このヒトＳ１００Ａ９ワクチンを、１匹あたり１０か所に０．１ｍｌずつ皮下投与した。４２日目に採血して血清を分離し、抗体価測定に供した。
（３）抗体価の測定
　ヒトＳ１００Ａ９ワクチンに対する抗体価および組換えヒトＳ１００Ａ９タンパク質に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。
　ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号１）とＢＳＡとのコンジュゲートを１０μｇ／ｍｌに、組換えヒトＳ１００Ａ９タンパク質を２μｇ／ｍｌに、それぞれ５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いて希釈した。各希釈液を５０μｌずつウェルに添加して４℃で一晩インキュベートした。ウェルに残存した溶液を廃棄後、１００％ヤギ血清を添加し室温で２時間ブロッキングした。サル血清を１００％ヤギ血清で段階希釈し、５０μｌずつウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ溶液で洗浄後、Goat Anti-Monkey IgG H&L (HRP)（abcam）を、５％スキムミルクで希釈して各ウェルに添加し、室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ溶液で洗浄後、ＴＭＢ溶液を５０μｌずつウェルに添加し、遮光下室温で３０分間インキュベートした。その後、反応停止液（0.5N H2SO4）を加え、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４）結果
　結果を図１９に示した。（Ａ）はヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（配列番号１）とＢＳＡとのコンジュゲートに対する抗体価の測定結果、（Ｂ）は組換えヒトＳ１００Ａ９に対する抗体価の測定結果である。抗体価は、half-maximal antibody titer（OD50 %）で示した。いずれの抗体価も、６週間後に顕著に増加していた。
［実施例１４：ＳＡ９００１－Ｋワクチン以外のマウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチドとＫＬＨとのコンジュゲートワクチン投与による抗体の産生］
（１）マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート調製
　マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドとして、マウスＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号４）の第９７～１０６位のアミノ酸配列（ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ、配列番号２１）、第２～１１位のアミノ酸配列（ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ、配列番号２２）および第２５～３４位のアミノ酸配列（ＲＫＥＧＨＰＤＴＬＳ、配列番号２３）を選択した。３種類のペプチドを、全自動固相合成機を用いてＦｍｏｃ法で合成した。ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ（配列番号２１）についてはＣ末端をアミド化し、グルタルアルデヒドを介してＫＬＨとコンジュゲートした。ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ（配列番号２２）についてはＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端にシステインを付加した後Ｃ末端をアミド化し、ＥＭＣＳを介してＫＬＨとコンジュゲートした。ＲＫＥＧＨＰＤＴＬＳ（配列番号２３）については、グルタルアルデヒドを介してＫＬＨとコンジュゲートした。以下、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号２１）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００３－Ｋ」と称し、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号２２）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００４－Ｋ」と称し、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号２３）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００５－Ｋ」と称する。
　ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ－ＮＨ２とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００３－Ｋ）は以下の方法で作製した。
　５ｍｇのペプチドをリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、２０ｍｇのＫＬＨと混合した。２５％グルタルアルデヒド水溶液３０μＬを滴下後、室温で５時間攪拌（pH8.0）した。５時間後、０．５ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（pH7.5）を添加し、終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は２６ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：63～66 nmol peptide/mg conjugate）。
　Ａｃ－ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ－Ｃ－ＮＨ２とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００４－Ｋ）は以下の方法で作製した。
　ＥＭＣ（6-maleimidocaproyl）化ＫＬＨは、ＫＬＨ（300 mg）のリン酸緩衝液（pH8.0）溶液に、N-(6-maleimidocaproyloxy) succinimide（EMCS 40 mg）のＤＭＳＯ溶液を滴下し、３時間攪拌後、塩溶液に対する透析を三回繰り返して調製した。続いて、ペプチド（6 mg）を６Ｍグアニジン／リン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、ＥＭＣ化ＫＬＨ（20 mg）溶液に滴下後、室温で終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は２１ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：102～105 nmol peptide/mg conjugate）。
　ＲＫＥＧＨＰＤＴＬＳとＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００５－Ｋ）は以下の方法で作製した。
　５ｍｇのペプチドをリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、２５ｍｇのＫＬＨと混合した。２５％グルタルアルデヒド水溶液５０μＬを滴下後、室温で５時間攪拌（pH8.0）した。５時間後、０．５ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（pH7.5）を添加し、終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は３１ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：80～90 nmol peptide/mg conjugate）。
（２）実験方法
　７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを日本クレアから購入した。ＳＡ９００３－Ｋワクチン群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００４－Ｋワクチン群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）およびＳＡ９００５－Ｋワクチン群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）を設けた。各コンジュゲートを等容積のＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（商品名、Titer Max 社）と混合し、８週齢時および１０週齢時に皮下投与した。投与前、初回投与後２、４、６、８および１０週に尾静脈から採血した。血清を分離し、抗体価を測定した。
　ＳＡ９００３－Ｋ、ＳＡ９００４－ＫまたはＳＡ９００５－Ｋに対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、ＢＳＡ－ＳＡ９００３コンジュゲート（ペプチド研究所）、ＢＳＡ－ＳＡ９００４コンジュゲート（ペプチド研究所）またはＢＳＡ－ＳＡ９００５コンジュゲート（ペプチド研究所）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて行った。検出抗体には、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（NA931V、GEヘルスケア）を使用した。
（３）結果
　ＳＡ９００３－Ｋの結果を図２０に、ＳＡ９００４－Ｋの結果を図２１にそれぞれ示した。どちらのワクチンも１０週目まで経時的に抗体価が増加した。ＳＡ９００５－Ｋも同様に１０週目まで経時的に抗体価が増加した。
［実施例１５：動脈硬化に対する効果］
（１）実験方法
　実験には、ＡｐｏＥ欠損マウス（Kawakami R et al., 2018, PLoS ONE 13(2): e0191895 参照）を使用した。ＡｐｏＥ欠損マウスの作製は株式会社ケー・エー・シーに委託した。Ｓ１００Ａ９ワクチンとして、ＳＡ９００１－Ｋを使用した。
　８週齢の雄性ＡｐｏＥ欠損マウスを、ＳＡ９００１－Ｋワクチン群（n=5）および対照群（n=3）の２群に群分けした。Ｓ１００Ａ９群には、８週齢時と１０週齢時にＳＡ９００１－Ｋ（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）を、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（商品名、Titer Max 社）と混合して皮下投与した。両群に８週齢から２０週齢までの１２週間、高脂肪食を自由摂取させた。２０週齢時に、深麻酔下で４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流固定し、心臓から腸骨動脈にかけて動脈を摘出した。動脈硬化病変の評価のため、ｏｉｌ Ｏ ｒｅｄ染色を施しプラーク面積を解析した。
（２）結果
　ＳＡ９００１－Ｋワクチン群は５匹中２匹に、対照群は３匹中３匹に動脈硬化病変が観察された。動脈硬化病変はいずれも大動脈弓部に観察された。プラーク面積（ｏｉｌ Ｏ ｒｅｄ染色陽性部位の面積）を解析した結果を図２２に示した。ＳＡ９００１－Ｋワクチン群（図中A9）のプラーク面積は、対照群（図中CTRL）と比較して有意に低値であった（mean ± SD, 0.04 ± 0.068 (mm2) vs 0.42 ± 0.28 (mm2)、p=0.022）。この結果により、Ｓ１００Ａ９ワクチンは動脈硬化を抑制することが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (12)

  1. 　Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物。
  2. 　抗原性ペプチドが、配列番号２の第１位～第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号２の第２１位～第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、または、配列番号２の第９５位～第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の組成物。
  3. 　抗原性ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の組成物。
  4. 　抗原性ペプチドが、配列番号６～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１または２に記載の組成物。
  5. 　キャリアタンパク質が、スカシガイヘモシアニンである請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　さらにアジュバントを含む請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　血栓の予防に用いるための請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  8. 　抗血栓ワクチンとして使用するための請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  9. 　脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、狭心症または血小板増多症の予防に用いるための請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
  10. 　再発性虚血性脳卒中の予防に用いるための請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
  11. 　Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防または治療に用いるための請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  12. 　Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患が、動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎またはアルツハイマー型認知症である請求項１１に記載の組成物。
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