JP7104399B2 - 光反応性人工アミノ酸、及び光架橋性人工ポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、光反応性人工アミノ酸、及び該光反応性人工アミノ酸が導入されてなる、光架橋性人工ポリペプチドに関する。
分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の連結及び核酸の架橋がある。核酸の連結や架橋は、例えば、ハイブリダイゼーションと組みあわせて、遺伝子の導入や、塩基配列の検出のために使用され、あるいは、例えば、遺伝子発現の阻害に使用される。そのために、核酸の連結及び架橋の技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。
核酸の光反応技術として、５－シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３－ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号）がある。さらに、３－ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドのいわゆる糖部の構造を、鎖状アルキルアミドに置換した化合物を使用した光架橋技術がある（特許文献５：特許第５９２５３８３号）。
核酸と核酸の間の架橋については、光架橋を形成する技術が、上記のように蓄積されつつある。もし、このような光架橋形成が、ポリペプチドと核酸の間の架橋についても可能となれば、分子生物学において、重要な基盤技術が提供されることとなる。
したがって、本発明の目的は、核酸とポリペプチドの間の光架橋形成のために使用可能な、新規な光反応性化合物を提供することにある。
本発明者は、ポリペプチドと核酸の間の光架橋技術を鋭意研究してきたところ、アミノ酸の側鎖部分としてビニルカルバゾール構造を備えた修飾アミノ酸化合物（人工アミノ酸）をポリペプチド鎖中へ導入して人工ポリペプチドを製造すると、該人工ポリペプチドが、核酸との間に光架橋を形成できることを見いだして、本発明に到達した。
なお、本発明の光反応性化合物は、光照射によって光反応を開始するものであるが、それまで安定していた化合物が、光照射というシグナルに応答して反応を開始するという意味を強調して、光反応性を光応答性ということがある。
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
次の式Ｉ：
（ただし、式Ｉ中、
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｌは、リンカー部、又は単結合であり、
Ｒ２１は、アミノ基の保護基、又は水素原子である）
で表される光反応性人工アミノ酸。
（２）
Ｌが、Ｃ１～Ｃ３のアルカンジイル基、又は単結合である、（１）に記載の光反応性人工アミノ酸。
（３）
Ｒ２１が、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、及びアリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択された保護基、又は水素原子である、（１）～（２）のいずれかに記載の光反応性人工アミノ酸。
（４）
（１）～（３）のいずれかに記載された光反応性人工アミノ酸が、ペプチド結合によって結合して含まれる、光反応性人工ポリペプチド。
（５）
核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖、及び核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖に対する結合性ドメインを有するポリペプチド鎖からなる群から選択されたポリペプチド鎖のアミノ酸配列中へ、
（１）～（３）のいずれかに記載された光反応性人工アミノ酸が、ペプチド結合によって導入されてなる、光反応性人工ポリペプチド。
（６）
（４）に記載された光反応性人工ポリペプチド、又は（５）に記載された光反応性人工ポリペプチドからなる、光反応性架橋剤。
（７）
ポリペプチドと核酸の間に光架橋形成する方法であって、
（４）～（５）のいずれかに記載された光反応性人工ポリペプチドと、核酸に光照射して、光反応性人工ポリペプチド中の光反応性人工アミノ酸と、核酸の塩基配列中のピリミジン塩基との間に、光架橋を形成する方法。
（８）
（１）～（３）のいずれかに記載された光反応性人工アミノ酸を、ペプチド結合によってアミノ酸配列中へ導入して、光反応性人工ポリペプチドを製造する方法。
（１）
次の式Ｉ：
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｌは、リンカー部、又は単結合であり、
Ｒ２１は、アミノ基の保護基、又は水素原子である）
で表される光反応性人工アミノ酸。
（２）
Ｌが、Ｃ１～Ｃ３のアルカンジイル基、又は単結合である、（１）に記載の光反応性人工アミノ酸。
（３）
Ｒ２１が、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、及びアリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択された保護基、又は水素原子である、（１）～（２）のいずれかに記載の光反応性人工アミノ酸。
（４）
（１）～（３）のいずれかに記載された光反応性人工アミノ酸が、ペプチド結合によって結合して含まれる、光反応性人工ポリペプチド。
（５）
核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖、及び核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖に対する結合性ドメインを有するポリペプチド鎖からなる群から選択されたポリペプチド鎖のアミノ酸配列中へ、
（１）～（３）のいずれかに記載された光反応性人工アミノ酸が、ペプチド結合によって導入されてなる、光反応性人工ポリペプチド。
（６）
（４）に記載された光反応性人工ポリペプチド、又は（５）に記載された光反応性人工ポリペプチドからなる、光反応性架橋剤。
（７）
ポリペプチドと核酸の間に光架橋形成する方法であって、
（４）～（５）のいずれかに記載された光反応性人工ポリペプチドと、核酸に光照射して、光反応性人工ポリペプチド中の光反応性人工アミノ酸と、核酸の塩基配列中のピリミジン塩基との間に、光架橋を形成する方法。
（８）
（１）～（３）のいずれかに記載された光反応性人工アミノ酸を、ペプチド結合によってアミノ酸配列中へ導入して、光反応性人工ポリペプチドを製造する方法。
本発明の光反応性人工アミノ酸を用いれば、光反応性人工ポリペプチドを得ることができる。本発明の光反応性人工ポリペプチドは、光照射によって、核酸との間に光架橋を形成することができる。本発明は、核酸とポリペプチドとの間に光架橋を形成するための基盤技術を提供する。
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［光反応性人工アミノ酸の構造］
本発明に係る光反応性人工アミノ酸は、次の式Ｉで表される：
本発明に係る光反応性人工アミノ酸は、次の式Ｉで表される：
式Ｉ中において、
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｌは、リンカー部、又は単結合であり、
Ｒ２１は、アミノ基の保護基、又は水素原子である。
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｌは、リンカー部、又は単結合であり、
Ｒ２１は、アミノ基の保護基、又は水素原子である。
アルコキシカルボニル基としては、例えばＣ２～Ｃ７、好ましくはＣ２～Ｃ６、Ｃ２～Ｃ５、Ｃ２～Ｃ４、さらに好ましくはＣ２～Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用できる。
好適な実施の態様において、Ｒ１１を、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はＣ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基とすることができ、Ｒ１２及びＲ１３を水素原子とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｌのリンカー部として、アルカンジイル基を使用することができる。アルカンジイル基としては、例えばＣ１～Ｃ３、好ましくはＣ１～Ｃ２のものを使用でき、特に好ましくはメチレン基、エチレン基とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｌは、メチレン基、エチレン基又は単結合とすることができる。Ｌが単結合である場合とは、Ｌと結合するＮとＣとが単結合で結合している状態を言う。
アミノ基の保護基としては、アミノ基の保護基として公知の保護基をあげることができる。好適な実施の態様において、アミノ基の保護基として、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、及びアリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択された保護基を使用することができる。
好適な実施に態様において、Ｒ２１は、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、又は水素原子とすることができる。Ｒ２１が水素原子である場合には、式Ｉは、次の式ＩＩで表される構造となる：
［ポリペプチド鎖中への導入］
光反応性人工アミノ酸は、その側鎖が上記構造式で示されるビニルカルバゾール構造がリンカー部によってアミノ酸のα炭素へと結合した構造となっているから、天然のアミノ酸と同様にペプチド結合によって、ポリペプチド鎖中へ導入することができる。
光反応性人工アミノ酸は、その側鎖が上記構造式で示されるビニルカルバゾール構造がリンカー部によってアミノ酸のα炭素へと結合した構造となっているから、天然のアミノ酸と同様にペプチド結合によって、ポリペプチド鎖中へ導入することができる。
光反応性人工アミノ酸は、側鎖のビニルカルバゾール構造に由来して、光反応性を備えており、光照射によって光反応が開始して、核酸塩基と光架橋を形成することができる。好適な実施の態様において、上記ビニルカルバゾール構造が光架橋を形成できる核酸塩基は、光架橋可能な位置に配置されたピリミジン塩基である。ピリミジン塩基としては、例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンをあげることができ、好ましくはチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）をあげることができる。この光反応性は、光反応性人工アミノ酸が、ポリペプチド鎖中へ導入されても、維持されている。
［光応答性人工ポリペプチド］
本発明の光応答性人工ポリペプチドは、光応答性人工アミノ酸が上述のように、ペプチド結合によってポリペプチド鎖のアミノ酸配列中へ導入されたポリペプチドである。
本発明の光応答性人工ポリペプチドは、光応答性人工アミノ酸が上述のように、ペプチド結合によってポリペプチド鎖のアミノ酸配列中へ導入されたポリペプチドである。
光応答性人工アミノ酸のポリペプチド鎖中への導入は、公知の手段によって行うことができる。すなわち、公知のポリペプチド鎖の合成手段において、天然のアミノ酸等に代えて、光応答性人工アミノ酸を使用して、ペプチド合成を行えばよい。光応答性人工アミノ酸は、所望により、公知の保護基によって保護して、ペプチド合成することができる。このようなペプチド合成手段として、例えば、Ｆｍｏｃペプチド固相合成法、及びＢｏｃペプチド固相合成法等をあげることができる。
光応答性人工ポリペプチドに導入される光応答性人工アミノ酸の数は、ポリペプチド鎖に必要な特性が維持される範囲内であれば特に制約はなく、ポリペプチド鎖中に１個としてもよいが、所望により、２個以上とすることもできる。これは光架橋を所望するピリミジン塩基の数に依存して、適宜決定することができる。
［核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖］
光反応性人工アミノ酸の光応答性は、ポリペプチド鎖中へ導入されても維持されるから、光反応性人工アミノ酸がどのようなアミノ酸配列のポリペプチド鎖へ導入されても、得られるポリペプチドは、光応答性人工ポリペプチドとなる。
光反応性人工アミノ酸の光応答性は、ポリペプチド鎖中へ導入されても維持されるから、光反応性人工アミノ酸がどのようなアミノ酸配列のポリペプチド鎖へ導入されても、得られるポリペプチドは、光応答性人工ポリペプチドとなる。
しかしながら、好適な実施の態様において、光反応性人工アミノ酸を、核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖中へ導入することが、好ましい。このように、核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へ、光反応性人工アミノ酸を導入すると、核酸結合性ドメインの特性に応じて、選択的に核酸へと結合させることができ、核酸塩基配列中の所望の位置のピリミジン塩基を、光反応性人工アミノ酸側鎖によって光架橋可能な位置に配置することができる。逆に、ポリペプチド鎖中において、光反応性人工アミノ酸を導入するべき好適な位置は、光架橋形成を所望するピリミジン塩基の位置に応じて、選択することができる。
核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖には、ペプチド、ポリペプチドあるいはタンパク質として称されるものも含む。核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖としては、例えば、ＧＣＮ４（Ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｏｎｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ４）、ＳＲＤペプチド、ＫＥＫペプチド（リジン－グルタミン酸－リジンペプチド）等をあげることができ、核酸結合性ドメインとしては、例えば、ＨＴＨドメイン（ヘリックスターンヘリックスドメイン）、ホメオドメイン、ｂＺｉｐドメイン（ロイシンジッパードメイン）等をあげることができる。核酸結合性ドメインを有するポリペプチド又はタンパク質が、二量体、あるいは多量体を形成する場合には、所望により、その単量体の全て又は一部に対して、光反応性人工アミノ酸を導入して、光応答性人工ポリペプチドとすることができる。
核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖の結合する核酸としては、その核酸結合性に応じて、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、それ以外の核酸構造となっていてもよい。核酸としては、例えばＲＮＡ、ＤＮＡをあげることができる。
［核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖に対する結合性ドメインを有するポリペプチド鎖］
核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へ、光反応性人工アミノ酸を導入することの利点は、核酸結合性ドメインの特性に応じて核酸へと結合できることであるから、核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へと結合できるポリペプチド鎖であっても、間接的に核酸への結合を実現できることから、その特性に応じて採用できることを、当業者は理解するものである。このような実施態様とすることによって、例えば、核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖に対する結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へと、光反応性人工アミノ酸を導入して調製した光反応性人工ポリペプチドをいったん用意すれば、これを多種類の核酸結合性ドメインにおいて共通して使用することができて、核酸結合性ドメインごとにそれぞれ光反応性人工ポリペプチドを調製する必要がないという利点を生じる。
核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へ、光反応性人工アミノ酸を導入することの利点は、核酸結合性ドメインの特性に応じて核酸へと結合できることであるから、核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へと結合できるポリペプチド鎖であっても、間接的に核酸への結合を実現できることから、その特性に応じて採用できることを、当業者は理解するものである。このような実施態様とすることによって、例えば、核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖に対する結合性ドメインを有するポリペプチド鎖へと、光反応性人工アミノ酸を導入して調製した光反応性人工ポリペプチドをいったん用意すれば、これを多種類の核酸結合性ドメインにおいて共通して使用することができて、核酸結合性ドメインごとにそれぞれ光反応性人工ポリペプチドを調製する必要がないという利点を生じる。
［光反応性架橋剤］
光反応性人工アミノ酸、及び光反応性人工ポリペプチドは、上記のように、光反応によって、核酸のピリミジン塩基との間に光架橋を形成することができるから、光反応性架橋剤として使用することができる。すなわち、本発明は、光反応性架橋剤にもあり、光反応性ポリペプチド－核酸架橋剤にもあり、ポリペプチドと核酸の間に光架橋形成する方法にもある。
光反応性人工アミノ酸、及び光反応性人工ポリペプチドは、上記のように、光反応によって、核酸のピリミジン塩基との間に光架橋を形成することができるから、光反応性架橋剤として使用することができる。すなわち、本発明は、光反応性架橋剤にもあり、光反応性ポリペプチド－核酸架橋剤にもあり、ポリペプチドと核酸の間に光架橋形成する方法にもある。
［光照射］
光照射による光架橋の形成は、光化学反応であるために、温度、溶媒、塩濃度、ｐＨ等について、広範な条件下で実施することができる。このため、生理的な条件下でも実施することができて、例えば遺伝子の発現抑制等のために好適に使用することができる。好適な実施の態様において、光照射は、核酸結合性ドメインによる核酸への結合の条件と、同条件下で行うことができる。光照射は、例えば、３４０ｎｍ～３９０ｎｍの範囲、３６０ｎｍ～３９０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば３８５ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。光照射は、例えば、１分～３００分の範囲、１０分～１２０分の範囲、３０分～１２０分の範囲の照射時間によって行うことができる。光照射は、例えば０℃～４０℃、０℃～３０℃、０℃～２０℃、０℃～１０℃の範囲の温度で行うことができ、例えば氷冷下の温度で、例えば室温で、あるいは例えば３７℃で、行うことができる。
光照射による光架橋の形成は、光化学反応であるために、温度、溶媒、塩濃度、ｐＨ等について、広範な条件下で実施することができる。このため、生理的な条件下でも実施することができて、例えば遺伝子の発現抑制等のために好適に使用することができる。好適な実施の態様において、光照射は、核酸結合性ドメインによる核酸への結合の条件と、同条件下で行うことができる。光照射は、例えば、３４０ｎｍ～３９０ｎｍの範囲、３６０ｎｍ～３９０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば３８５ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。光照射は、例えば、１分～３００分の範囲、１０分～１２０分の範囲、３０分～１２０分の範囲の照射時間によって行うことができる。光照射は、例えば０℃～４０℃、０℃～３０℃、０℃～２０℃、０℃～１０℃の範囲の温度で行うことができ、例えば氷冷下の温度で、例えば室温で、あるいは例えば３７℃で、行うことができる。
［光開裂］
光反応によって得られた光架橋は、さらに光照射することによって、再び開裂させることができる。すなわち、光架橋は、共有結合による架橋であって化学的に安定した架橋である一方で、光照射によって開裂できるので、ポリペプチドと核酸との間の架橋を、所望により形成し、所望により開裂することができる。本発明は、この特性によって広範に利用可能な基盤技術を提供する。光開裂のための光照射は、例えば、３００ｎｍ～３３０ｎｍの範囲、３０５ｎｍ～３２０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば３１２ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。
光反応によって得られた光架橋は、さらに光照射することによって、再び開裂させることができる。すなわち、光架橋は、共有結合による架橋であって化学的に安定した架橋である一方で、光照射によって開裂できるので、ポリペプチドと核酸との間の架橋を、所望により形成し、所望により開裂することができる。本発明は、この特性によって広範に利用可能な基盤技術を提供する。光開裂のための光照射は、例えば、３００ｎｍ～３３０ｎｍの範囲、３０５ｎｍ～３２０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば３１２ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［CNVＡ含有ＧＣＮ４ペプチドの合成］
スキーム１（Ｓｃｈｅｍｅ １）の流れにしたがって、シアノビニルカルバゾール基を有するアミノ酸CNVＡ（スキーム１における化合物７）を合成した。図１に、CNVＡの合成スキーム（Ｓｃｈｅｍｅ １）を示す。
スキーム１（Ｓｃｈｅｍｅ １）の流れにしたがって、シアノビニルカルバゾール基を有するアミノ酸CNVＡ（スキーム１における化合物７）を合成した。図１に、CNVＡの合成スキーム（Ｓｃｈｅｍｅ １）を示す。
［化合物２の合成］
エタノール（７００ｍｌ）にｃａｒｂａｚｏｌｅ（４．０ｇ，２３．９ｍｍｏｌ）を６５℃で溶解させる。ＮａＩＯ4（１．２８ｇ，６．０ｍｍｏｌ）とＩ2（３．０２ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）を順に加えた後、Ｈ2ＳＯ4（２．５６ｍＬ，４８．０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２００ｍＬ）を加え、ｏｉｌ ｂａｔｈで反応溶液を６５℃に暖め２時間攪拌させた。ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）で原料の消失を確認し、ＮａＯＨ（２．２４ｇ，５６．０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）で中和した。エタノールを除去した後、反応溶液をクロロホルム（１．０ｍＬ）で抽出し、水で３回洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）で精製し、クロロホルムで洗浄した後、白色粉末として５（４．４７ｇ，１５．３ｍｍｏｌ，６４％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１１．３９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｈ－４），８．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－５），７，６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，２．７Ｈｚ，Ｈ－２），７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－１），７．４０（ｍ，１Ｈ，Ｈ－７），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－１），７．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ－６）
エタノール（７００ｍｌ）にｃａｒｂａｚｏｌｅ（４．０ｇ，２３．９ｍｍｏｌ）を６５℃で溶解させる。ＮａＩＯ4（１．２８ｇ，６．０ｍｍｏｌ）とＩ2（３．０２ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）を順に加えた後、Ｈ2ＳＯ4（２．５６ｍＬ，４８．０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２００ｍＬ）を加え、ｏｉｌ ｂａｔｈで反応溶液を６５℃に暖め２時間攪拌させた。ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）で原料の消失を確認し、ＮａＯＨ（２．２４ｇ，５６．０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）で中和した。エタノールを除去した後、反応溶液をクロロホルム（１．０ｍＬ）で抽出し、水で３回洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）で精製し、クロロホルムで洗浄した後、白色粉末として５（４．４７ｇ，１５．３ｍｍｏｌ，６４％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１１．３９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｈ－４），８．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－５），７，６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，２．７Ｈｚ，Ｈ－２），７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－１），７．４０（ｍ，１Ｈ，Ｈ－７），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－１），７．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ－６）
［化合物３の合成］
マイクロウエーブチューブ中でＤＭＦ（５．０ｍＬ）にＩｏｄｏｃａｒｂａｚｏｌｅ（４．０５ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）を溶解させる。その後、Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（３．３０ｍＬ，１３．８ｍｍｏｌ）、Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ（２．２５ｍＬ，３４．５ｍｍｏｌ）とＰａｌｌａｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（３０９ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を順に加えて、マイクロウェーブを用いて反応液を１６０℃で３０分間反応させた。ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）で原料の消失を確認した。桐山ろ過によって沈殿物を除去した後、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）で精製し、白色粉末として６（２．５９ｇ，１１．９ｍｍｏｌ，８６％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１１．６（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），７．６９－７．７２（ｍ，１Ｈ），７．４０－７．５２（ｍ，３Ｈ），７．１９－７．２４（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ）
マイクロウエーブチューブ中でＤＭＦ（５．０ｍＬ）にＩｏｄｏｃａｒｂａｚｏｌｅ（４．０５ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）を溶解させる。その後、Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（３．３０ｍＬ，１３．８ｍｍｏｌ）、Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ（２．２５ｍＬ，３４．５ｍｍｏｌ）とＰａｌｌａｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（３０９ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を順に加えて、マイクロウェーブを用いて反応液を１６０℃で３０分間反応させた。ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）で原料の消失を確認した。桐山ろ過によって沈殿物を除去した後、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）で精製し、白色粉末として６（２．５９ｇ，１１．９ｍｍｏｌ，８６％）を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１１．６（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），７．６９－７．７２（ｍ，１Ｈ），７．４０－７．５２（ｍ，３Ｈ），７．１９－７．２４（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ）
［化合物４の合成］
３－ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（３．２０ｇ，１４．７４ｍｍｏｌ）とＮａＨ（０．６８ｇ，２８ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに入れ窒素置換した後、ＤＭＦ（１００ｍＬ）で溶解させた。３０分間攪拌させた後、反応溶液にジブロモ酢酸（２．５６ｍＬ，２８ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で８時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3）で原料の消失を確認した。酢酸を用いて反応液を中和した後、桐山ろ過により沈殿物を取り除いた。溶媒を取り除いた後、ＣＨＣｌ3に溶解させ、ＮａＣｌ水溶液、ＮａＨＣＯ3水溶液と分液操作を行い、Ｎａ2ＳＯ4を用いて脱水操作を行い、有機溶媒を除去した。その後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９９：１）で精製し、黄色オイル状の目的物を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２２（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，９．２Ｈｚ），７．３２－７．３８（ｍ，２Ｈ），６．８７（ｓ．１Ｈ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）
３－ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（３．２０ｇ，１４．７４ｍｍｏｌ）とＮａＨ（０．６８ｇ，２８ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに入れ窒素置換した後、ＤＭＦ（１００ｍＬ）で溶解させた。３０分間攪拌させた後、反応溶液にジブロモ酢酸（２．５６ｍＬ，２８ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で８時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3）で原料の消失を確認した。酢酸を用いて反応液を中和した後、桐山ろ過により沈殿物を取り除いた。溶媒を取り除いた後、ＣＨＣｌ3に溶解させ、ＮａＣｌ水溶液、ＮａＨＣＯ3水溶液と分液操作を行い、Ｎａ2ＳＯ4を用いて脱水操作を行い、有機溶媒を除去した。その後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９９：１）で精製し、黄色オイル状の目的物を得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２２（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，９．２Ｈｚ），７．３２－７．３８（ｍ，２Ｈ），６．８７（ｓ．１Ｈ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）
［化合物５の合成］
化合物４（０．８６ｇ，２．４ｍｍｏｌ）に対して２８％アンモニア水溶液１０ｍＬを氷上で加え、１０分間撹拌した後、室温で５時間撹拌した。その後、ろ過により沈殿物を取り除き、１ｍＬの水で洗浄を２回行い、減圧下で乾燥させ、黄色固体の目的物（０．３０ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を収率４４％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２２（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，９．２Ｈｚ），７．３２－７．３８（ｍ，２Ｈ），６．８７（ｓ．１Ｈ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）
化合物４（０．８６ｇ，２．４ｍｍｏｌ）に対して２８％アンモニア水溶液１０ｍＬを氷上で加え、１０分間撹拌した後、室温で５時間撹拌した。その後、ろ過により沈殿物を取り除き、１ｍＬの水で洗浄を２回行い、減圧下で乾燥させ、黄色固体の目的物（０．３０ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を収率４４％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２２（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，９．２Ｈｚ），７．３２－７．３８（ｍ，２Ｈ），６．８７（ｓ．１Ｈ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）
［化合物６の合成］
シアノビニルカルバゾールアミノ酸（６２０ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ）をトルエン０．５ｍＬに溶解させた後、ピリジン１ｍＬとＤＭＡＰ（０．２ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。その後、無水酢酸（１００μＬ）をゆっくり滴下した。その後、５５℃に加熱し、６時間撹拌した。その後、ろ過により沈殿物を回収し、０．５ｍＬのトルエンと０．５ｍＬの水で洗浄し、乾燥させることにより、黄色固体の目的物（５７３ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）を収率８２％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２４（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）７．２８－７．３３（ｍ，２Ｈ）５．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）５．７４（ｓ、１Ｈ）
シアノビニルカルバゾールアミノ酸（６２０ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ）をトルエン０．５ｍＬに溶解させた後、ピリジン１ｍＬとＤＭＡＰ（０．２ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。その後、無水酢酸（１００μＬ）をゆっくり滴下した。その後、５５℃に加熱し、６時間撹拌した。その後、ろ過により沈殿物を回収し、０．５ｍＬのトルエンと０．５ｍＬの水で洗浄し、乾燥させることにより、黄色固体の目的物（５７３ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）を収率８２％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２４（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）７．２８－７．３３（ｍ，２Ｈ）５．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）５．７４（ｓ、１Ｈ）
［化合物７の合成］
シアノビニルカルバゾールアミノ酸のアセチル保護体（６００ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶かした後、１Ｍ ＨＣｌを用いて中和した後、アクリラーゼ１００ｍｇと１０ｍｇ六水和塩化コバルトを加えた。３７℃で３日間インキュベートした後、沈殿物を回収し、水とエタノールで洗浄した後、乾燥させた。黄色オイル状の目的物（１７０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を収率３２％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２２（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．３２－７．４４（ｍ，３Ｈ），６．８７（ｓ．１Ｈ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）
シアノビニルカルバゾールアミノ酸のアセチル保護体（６００ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶かした後、１Ｍ ＨＣｌを用いて中和した後、アクリラーゼ１００ｍｇと１０ｍｇ六水和塩化コバルトを加えた。３７℃で３日間インキュベートした後、沈殿物を回収し、水とエタノールで洗浄した後、乾燥させた。黄色オイル状の目的物（１７０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を収率３２％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２２（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６．８Ｈｚ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．３２－７．４４（ｍ，３Ｈ），６．８７（ｓ．１Ｈ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）
［化合物８の合成］
１．８ｍＬジオキサン、０．６ｍＬ ＤＭＦの混合溶媒にＬ－シアノビニルカルバゾールアミノ酸（３００ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）を溶解させた後、氷上に移しｄｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｄｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（３００ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、２時間撹拌した。その後、室温に戻し、さらに１６時間撹拌した。ＫＨＳＯ4を用いてｐＨ３に参加した後、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。有機相をＭｇＳＯ4を用いて脱水を行い有機溶媒を除去した。その後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製し、オイル状の目的物（２１３ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）を収率５３％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２５（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），７．６５－７．６０（ｍ，３Ｈ），７．４４（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），１．４２（ｓ，３Ｈ）
１．８ｍＬジオキサン、０．６ｍＬ ＤＭＦの混合溶媒にＬ－シアノビニルカルバゾールアミノ酸（３００ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）を溶解させた後、氷上に移しｄｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｄｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（３００ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、２時間撹拌した。その後、室温に戻し、さらに１６時間撹拌した。ＫＨＳＯ4を用いてｐＨ３に参加した後、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。有機相をＭｇＳＯ4を用いて脱水を行い有機溶媒を除去した。その後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製し、オイル状の目的物（２１３ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）を収率５３％で得た。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ6）： δ１２．２５（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），７．６５－７．６０（ｍ，３Ｈ），７．４４（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），１．４２（ｓ，３Ｈ）
［ペプチド合成］
合成したアミノ酸はＢｏｃ保護体は委託合成により下記ＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢの配列を合成した。
このＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢの配列は、ＧＣＮ４－ｂＺＩＰ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列の配列の一部分（核酸と相互作用している周辺）を取り出してそのうちの１アミノ酸を光架橋性アミノ酸（CNVＡ）で置換した配列である。ＧＣＮ４－ｂＺＩＰ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列を、次に示す。
ＧＣＮ４－ｂＺＩＰ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列：
MIVPESSDPAALKRARNTEAARRSRARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER
合成したアミノ酸はＢｏｃ保護体は委託合成により下記ＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢの配列を合成した。
このＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢの配列は、ＧＣＮ４－ｂＺＩＰ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列の配列の一部分（核酸と相互作用している周辺）を取り出してそのうちの１アミノ酸を光架橋性アミノ酸（CNVＡ）で置換した配列である。ＧＣＮ４－ｂＺＩＰ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列を、次に示す。
ＧＣＮ４－ｂＺＩＰ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列：
MIVPESSDPAALKRARNTEAARRSRARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER
合成したＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢは水に溶解させ、各ペプチドの二量体を下記手順で作製した。１００μＬの５ｍＭ Ｐｅｐｔｉｄｅと１０μＬの１０ｘＰＢＳ、２．５μＬの４ｍＭ Ｃｕ（ＩＩ）水溶液を混合し、室温で１週間撹拌した。その後、ＨＰＬＣを用いて二量化したペプチドを分取した。
ペプチド二量体を凍結乾燥後、分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで測定した。
ＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢの配列を、表１にまとめて示す。配列中、Ｘは光架橋性アミノ酸（CNVＡ）を示す。
ペプチド二量体を凍結乾燥後、分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで測定した。
ＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢの配列を、表１にまとめて示す。配列中、Ｘは光架橋性アミノ酸（CNVＡ）を示す。
［光架橋試験］
上記得られたＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢを用いて、スキーム２（Ｓｃｈｅｍｅ ２）の流れにしたがって、光架橋試験を行った。図２に、ＤＮＡとペプチドの光架橋反応のスキーム（Ｓｃｈｅｍｅ ２）を示す。スキーム２に示すように、合成したペプチドを二量体化した後、ＤＮＡと混合し、光照射を行った。光架橋反応の解析は変性ＰＡＧＥにより行った。
上記得られたＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢを用いて、スキーム２（Ｓｃｈｅｍｅ ２）の流れにしたがって、光架橋試験を行った。図２に、ＤＮＡとペプチドの光架橋反応のスキーム（Ｓｃｈｅｍｅ ２）を示す。スキーム２に示すように、合成したペプチドを二量体化した後、ＤＮＡと混合し、光照射を行った。光架橋反応の解析は変性ＰＡＧＥにより行った。
ＧＣＮ４ペプチドは二量体を形成した際に、ＤＮＡ二重螺旋とスキーム２のように相互作用することが報告されている。そこで、まずＧＣＮ４ペプチドの二量体の作成を行った。５００μＭペプチド水溶液１００μＬ対して、ヨウ化銅（ＣｕＩ）を加え、室温で１週間酸化反応を行った。
このようにして、ペプチドと酸化剤（ＣｕＩ）を混合し、室温で１週間撹拌した後、ＨＰＬＣによる精製を行い、ヘプチド二量体の合成を行った。その後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる同定を行った。
その後、ペプチド１０μＭ、ＤＮＡ ０．５μＭをｂｕｆｆｅｒ中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でＤＮＡ（５’－Ｃｙ３－ＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＣＣ－３’）と混合し、アニーリング後、３８５ｎｍの光照射を４℃で行った。その後、変性ＰＡＧＥで解析した。
このようにして、ペプチドと酸化剤（ＣｕＩ）を混合し、室温で１週間撹拌した後、ＨＰＬＣによる精製を行い、ヘプチド二量体の合成を行った。その後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる同定を行った。
その後、ペプチド１０μＭ、ＤＮＡ ０．５μＭをｂｕｆｆｅｒ中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でＤＮＡ（５’－Ｃｙ３－ＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＣＣ－３’）と混合し、アニーリング後、３８５ｎｍの光照射を４℃で行った。その後、変性ＰＡＧＥで解析した。
上記のＰｅｐｔｉｄｅＡ及びＰｅｐｔｉｄｅＢの架橋形成を確認する試験は詳細には次のように行った。
CNVＡを含むＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢとＤＮＡとの光クロスリンク反応を行った。１μＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ、０．５μＭ ｄｓＤＮＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）水溶液を調整し、３７℃で１６時間インキュベートし、さらに４℃で３０分インキュベートした後、３８５ｎｍの光照射を１０分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。用いたｄｓＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）の塩基配列を表２に示す。この塩基配列はそれ自身によって二重鎖ＤＮＡを形成する。
得られた変成ＰＡＧＥでの解析の結果、ＰｅｐｔｉｄｅＡ及びＰｅｐｔｉｄｅＢはいずれも、架橋体に相当する分子量のバンドが得られており、すなわち、二重鎖ＤＮＡとの間に、光架橋体が形成されることがわかった。
CNVＡを含むＰｅｐｔｉｄｅＡ、ＰｅｐｔｉｄｅＢとＤＮＡとの光クロスリンク反応を行った。１μＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ、０．５μＭ ｄｓＤＮＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）水溶液を調整し、３７℃で１６時間インキュベートし、さらに４℃で３０分インキュベートした後、３８５ｎｍの光照射を１０分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。用いたｄｓＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）の塩基配列を表２に示す。この塩基配列はそれ自身によって二重鎖ＤＮＡを形成する。
得られた変成ＰＡＧＥでの解析の結果、ＰｅｐｔｉｄｅＡ及びＰｅｐｔｉｄｅＢはいずれも、架橋体に相当する分子量のバンドが得られており、すなわち、二重鎖ＤＮＡとの間に、光架橋体が形成されることがわかった。
［光照射時間の検討］
上記のＰｅｐｔｉｄｅＡ及びＰｅｐｔｉｄｅＢの架橋形成について、光照射時間の変化に対する応答を、以下のように検討した。
CNVＡを含むＰｅｐｔｉｄｅＡとＰｅｐｔｉｄｅＢとＤＮＡとの光クロスリンク反応を行った。１μＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ、０．５μＭ ｄｓＤＮＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）水溶液を調整し、３７℃で１６時間インキュベートし、さらに４℃で３０分インキュベートした後、３８５ｎｍの光照射を０，１，５，３０，６０分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。得られた画像を図３として示す。用いたｄｓＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）の塩基配列を表２に示す。
上記のＰｅｐｔｉｄｅＡ及びＰｅｐｔｉｄｅＢの架橋形成について、光照射時間の変化に対する応答を、以下のように検討した。
CNVＡを含むＰｅｐｔｉｄｅＡとＰｅｐｔｉｄｅＢとＤＮＡとの光クロスリンク反応を行った。１μＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ、０．５μＭ ｄｓＤＮＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）水溶液を調整し、３７℃で１６時間インキュベートし、さらに４℃で３０分インキュベートした後、３８５ｎｍの光照射を０，１，５，３０，６０分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。得られた画像を図３として示す。用いたｄｓＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）の塩基配列を表２に示す。
［光照射時間の検討］
ＰｅｐｔｉｄｅＡの架橋形成について、さらに長時間にわたって、光照射時間の変化に対する応答を、以下のように検討した。
ＰｅｐｔｉｄｅＡとＤＮＡとの光クロスリンク反応を行った。用いたペプチドの配列と、ＤＮＡの配列を、次の表２に示す。
ＰｅｐｔｉｄｅＡの架橋形成について、さらに長時間にわたって、光照射時間の変化に対する応答を、以下のように検討した。
ＰｅｐｔｉｄｅＡとＤＮＡとの光クロスリンク反応を行った。用いたペプチドの配列と、ＤＮＡの配列を、次の表２に示す。
１μＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ、０．５μＭ ｄｓＤＮＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）水溶液を調整し、３７℃で１６時間インキュベートし、さらに４℃で３０分インキュベートした後、３８５ｎｍの光照射を０，３０，６０，９０，１２０，１８０，３００分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。また、ゲル画像からＩｍａｇｅＪを用い各バンドを定量し、架橋率（Cross-linkage ratio[%]）を算出した。この結果を、図４にまとめて示す。この結果から、１２０分の光照射時間（Photoradiation time）により光架橋反応が完了していることがわかった。
［架橋体の光開裂］
架橋体の光開裂を、以下のように検討した。
上記作成した表２の配列のＤＮＡ－ｐｅｐｔｉｄｅＡの光架橋体１μＭを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に対して６０℃加熱条件下でｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒを用いて３１２ｎｍの光照射を１０分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを、２５％の８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５％アクリルアミドゲルにキャストし、ＴＢＥバッファ中で、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。この結果を、図５に示す。図５において、＋と記載されたレーンは光照射ありのレーンであり、－と記載されたレーンは光照射なしの対照レーンである。
架橋体の光開裂を、以下のように検討した。
上記作成した表２の配列のＤＮＡ－ｐｅｐｔｉｄｅＡの光架橋体１μＭを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に対して６０℃加熱条件下でｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒを用いて３１２ｎｍの光照射を１０分行った。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル２μＬを混合した後、その混合液２μＬと６ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを、２５％の８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５％アクリルアミドゲルにキャストし、ＴＢＥバッファ中で、１５０Ｖで５０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。この結果を、図５に示す。図５において、＋と記載されたレーンは光照射ありのレーンであり、－と記載されたレーンは光照射なしの対照レーンである。
この結果によって、光架橋性ペプチドと二重鎖ＤＮＡとの間に形成された光架橋は、さらに光照射を行うことによって、光開裂できることがわかった。
［被架橋塩基の特定］
光応答性ペプチドがＤＮＡ中のどの塩基と光架橋しているかを調べるために以下の実験を行った。
ＤＮＡ－ｐｅｐｔｉｄｅの光架橋体を分取し、ピペリジン処理などによりＤＮＡを切断した。サンプルを凍結乾燥させた後、１Ｍのｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（９９．８％）５０μＬに溶解させ、９０℃で３０分間加熱した後、減圧下でｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅをとり除いた。その後、１０μＬの水を加え、複数回凍結乾燥を繰り返し、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅを完全に取り除いた。その後６０℃で３１２ｎｍの光照射を１０分間行った後光開裂させた。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル４μＬを混合した後、その混合液４μＬと６ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、３００Ｖで３０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。この結果を、図６Ａ及び図６Ｂにまとめて示す。図６Ａは、この実験によって決定された、光架橋形成される塩基のＤＮＡ配列中の位置を示す説明図である。図６Ｂは、この実験によって得られたゲル画像であり、Ｍ１がピリミジン塩基で選択的に切断されるように処理した試料のレーンであり、Ｍ２がチミン塩基で選択的に切断されるよう処理した試料のレーンであり、このＭ１、Ｍ２のレーンのバンドの位置の対比によって、光架橋形成される塩基のＤＮＡ配列中の位置が決定された。
光応答性ペプチドがＤＮＡ中のどの塩基と光架橋しているかを調べるために以下の実験を行った。
ＤＮＡ－ｐｅｐｔｉｄｅの光架橋体を分取し、ピペリジン処理などによりＤＮＡを切断した。サンプルを凍結乾燥させた後、１Ｍのｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（９９．８％）５０μＬに溶解させ、９０℃で３０分間加熱した後、減圧下でｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅをとり除いた。その後、１０μＬの水を加え、複数回凍結乾燥を繰り返し、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅを完全に取り除いた。その後６０℃で３１２ｎｍの光照射を１０分間行った後光開裂させた。その後、ホルムアミド溶液２μＬとサンプル４μＬを混合した後、その混合液４μＬと６ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １μＬを８Ｍ Ｕｒｅａを含む１５Ａアクリルアミドゲルにキャストし、３００Ｖで３０分間電気泳動を行った後、ＬＡＳ３０００を用いてゲル画像を取得した。この結果を、図６Ａ及び図６Ｂにまとめて示す。図６Ａは、この実験によって決定された、光架橋形成される塩基のＤＮＡ配列中の位置を示す説明図である。図６Ｂは、この実験によって得られたゲル画像であり、Ｍ１がピリミジン塩基で選択的に切断されるように処理した試料のレーンであり、Ｍ２がチミン塩基で選択的に切断されるよう処理した試料のレーンであり、このＭ１、Ｍ２のレーンのバンドの位置の対比によって、光架橋形成される塩基のＤＮＡ配列中の位置が決定された。
図６Ａに示されるように、Ｐｅｐｔｉｄｅ ＡのＸ（光架橋性アミノ酸）は、ＤＮＡの３’末端から５番目の塩基であるＣと架橋しており、Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢのＸ（光架橋性アミノ酸）は、ＤＮＡの３’末端から３番目の塩基であるＴと架橋していた。すなわち、光架橋性アミノ酸は、チミン及びシトシンと光架橋できること（チミン及びシトシンが被光架橋塩基とできること）、ペプチド中の光架橋性アミノ酸の位置を変更することによって、ＤＮＡ二重鎖中における架橋相手となる塩基（被架橋塩基）を選択できることがわかった。
［リンカー部の鎖長の検討］
リンカーの鎖長を変えた下記化合物（CNV(L1)Ａ）をペプチドに導入して、ＤＮＡ－Ｐｅｐｔｉｄｅ間の光架橋反応が鎖長によってどのような影響を受けるかを検討した。
リンカーの鎖長を変えた下記化合物（CNV(L1)Ａ）をペプチドに導入して、ＤＮＡ－Ｐｅｐｔｉｄｅ間の光架橋反応が鎖長によってどのような影響を受けるかを検討した。
それぞれペプチド二量体を作製後、ペプチド１０μＭ、ＤＮＡ ０．５μＭをｂｕｆｆｅｒ中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でＤＮＡ（５’－Ｃｙ３－ＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＣＣ－３’）と混合し、アニーリング後、３８５ｎｍの光照射を４℃で行った。その後、変性ＰＡＧＥで解析した。この結果を、図７にまとめて示す。図７において、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ（Ｌ１）及びＰｅｐｔｉｄｅ Ｂ（Ｌ１）は、表１の配列中のＸ部分の光架橋性アミノ酸として、リンカー部分を設けた光架橋性アミノ酸（CNV(L1)Ａ）を備えたペプチドである。
この結果から、光架橋性アミノ酸において、ビニルカルバゾール構造のＮと、アミノ酸構造のα炭素との接続に、－ＣＨ2－によってリンカー部分を設けた場合でも、リンカー部分を設けない場合と同様に、光架橋できることがわかった。
本発明は、光反応性人工アミノ酸及び光反応性人工ポリペプチドを提供する。本発明は産業上有用な発明である。
Claims (6)
- 次の式Ｉ：
（ただし、式Ｉ中、
Ｒ１１は、シアノ基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｌは、Ｃ１～Ｃ３のアルカンジイル基、又は単結合であり、
Ｒ２１は、アミノ基の保護基、又は水素原子であり、保護基がフルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、及びアリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択された保護基である）
で表される光反応性人工アミノ酸。 - 請求項１ に記載された光反応性人工アミノ酸が、ペプチド結合によって結合して含まれる、光反応性人工ポリペプチドであって、
ペプチド結合が、式ＩのＬより下部に記載のアミノ酸構造部が反応して形成されたペプチド結合である、光反応性人工ポリペプチド。 - 核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖、及び核酸結合性ドメインを有するポリペプチド鎖に対する結合性ドメインを有するポリペプチド鎖からなる群から選択されたポリペプチド鎖のアミノ酸配列中へ、
請求項１ に記載された光反応性人工アミノ酸が、ペプチド結合によって導入されてなる、光反応性人工ポリペプチドであって、
ペプチド結合が、式ＩのＬより下部に記載のアミノ酸構造部が反応して形成されたペプチド結合である、光反応性人工ポリペプチド。 - 請求項２ に記載された光反応性人工ポリペプチド、又は請求項３に記載された光反応性人工ポリペプチドからなる、光反応性架橋剤。
- ポリペプチドと核酸の間に光架橋形成する方法であって、
請求項２～３ のいずれかに記載された光反応性人工ポリペプチドと、核酸に光照射して、光反応性人工ポリペプチド中の光反応性人工アミノ酸と、核酸の塩基配列中のピリミジン塩基との間に、光架橋を形成する方法。 - 請求項１ に記載された光反応性人工アミノ酸を、ペプチド結合によってアミノ酸配列中へ導入して、光反応性人工ポリペプチドを製造する方法であって、
ペプチド結合が、式ＩのＬより下部に記載のアミノ酸構造部が反応して形成されたペプチド結合である、製造方法。
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