JP2009254279A - 核酸類の配列選択的な精製方法 - Google Patents
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Abstract
ごく短時間で行うことができ、高い配列選択性と回収率を両立させた、特定の塩基配列を備えた核酸類の精製及び回収の方法を提供すること。
【解決手段】
塩基部分として式Iで表される基を有する光連結性核酸類と、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法。
【選択図】 なし
Description
Lambert, K. N.; Williamson, V. M. Nucleic Acids Res. 1993, 21, pp775-776.
[1]
塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である。)
で表される基を有する、光連結性核酸類(ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる)と、
核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、
を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法。
[2]
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程が、相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって行われる、[1]に記載の方法。
[3]
光連結性核酸類が、標識部位を備えている、[1]〜[2]の何れかに記載の方法。
[4]
光連結性核酸類が、担体に固定化されている、[1]〜[2]の何れかに記載の方法。
[5]
光連結させる工程の光照射が、350〜380nmの範囲の波長の光照射によって行われる、[1]〜[4]の何れかに記載の方法。
[6]
光開裂させる工程の光照射が、310〜345nmの範囲の波長の光照射によって行われる、[1]〜[5]の何れかに記載の方法。
[7]
光連結させる工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行われる、[1]〜[6]の何れかに記載の方法。
[8]
塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である。)
で表される基を有し、標識部位を備えている、光連結性核酸類(ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる)。
[9]
塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である。)
で表される基を有し、担体に固定された、光連結性核酸類(ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる)。
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である。)
で表される基を有する、光連結性核酸類(ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる)と、
核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、
を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法にある。
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である。)
で表される基を有する、光連結性核酸類である。
次の式II:
で表されるヌクレオシド(リボヌクレオシド)が組み込まれてなる、核酸が含まれ、
さらに、次の式III:
で表されるヌクレオシド(デオキシリボヌクレオシド)が組み込まれてなる、核酸が含まれる。
光応答性核酸である3-cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (CNVK)の構造式を図1に示す。
ODN(ACNVK-GT) (20 μM)の水溶液で光開裂反応を行った(total volume: 30 μL)。トランスイルミネーターを用いて312 nm光を70 °Cで、30分間照射した(Scheme 3)。その光反応物のHPLCの分析結果を図5に示す。その経時変化を図6に示す。水溶液での光開裂反応を行ったところ、Tをクロスリンク部位に持つクロスリンク体は30分で完全に反応が進行した。
DNAの配列選択的精製の一例の概略を図7に示す。
ODN2(CNVK)-PS: 5’-GTAACNVKTTCC-SSS-PS-3’
ODN1(CNVK)-PSを用いた際に目的とするODN(20)を回収することができた。
ODN2(CNVK)-PSを用いた際に目的とするODN(25)を回収することができた。
CNVKを含むODNを用いて光照射時間1秒での光クロスリンク反応を行った。ODN(ACNVK) (20 μM)とRNA(GU) (20 μM)の光クロスリンク反応を行った(sodium cacodylate 50 mM, NaCl 100 mM, total volume: 30 μL)。UV-LEDを用いて366 nm光を0 °Cで、1秒間照射した(Scheme 6)。その光反応物のHPLCの分析結果を図10に示す。RNA(GU)を用いて1秒での光クロスリンク反応を行ったところ、収率86%で効率よく反応が進行し、1秒でのRNA光操作が可能であることがわかった。
CNVKを含むODNを用いて光クロスリンク反応を行った。ODN(ACNVK) (10 μM)とRNA(XU) (X = A, G, C, U, 10 μM)の光クロスリンク反応を行った(sodium cacodylate 50 mM, NaCl 100 mM, total volume: 200 μL)。UV-LEDを用いて366 nm光を0 °Cで、20秒間照射してUPLCを用いて分析した。その結果を図11(a)に示す。同様にして、Cが光クロスリンク部位となるCNVKを含むODNを用いて光クロスリンク反応を行った。ODN(GCNVK) (10 μM)とRNA(XC) (X = A, G, C, U, 10 μM)の光クロスリンク反応を行った(sodium cacodylate 50 mM, NaCl 100 mM, total volume: 200 μL)。UV-LEDを用いて366 nm光を0 °Cで、20秒間照射してUPLCを用いて分析した。その結果を図11(b)に示す。これらの結果から、RNAとの光クロスリンク反応はクロスリンク相手がUとCである時に効率よく進行することがわかった。
UまたはCが光クロスリンク部位である光クロスリンク体ODN(ACNVK)<>RNA(GU)あるいはODN(GCNVK)<>RNA(GC)を光反応によって調製してHPLCで分取した。そして、得られた光クロスリンク体と質量を測定した。
calcd. for ODN(ACNVK)<>RNA(GU): [(M + H)+] 5675.74, found 5675.25.
calcd. for ODN(GCNVK)<>RNA(GC): [(M + H)+] 5690.75, found 5690.68.
次のScheme 9 に従い合成を進めた。以下の説明において、化合物に付した番号で化合物を表す場合がある。
carbazole (2.50 g, 15.0 mmol)のエタノール溶液(500 mL)にNaIO4 (0.80 g, 3.75 mmol)とI2 (1.89 g, 7.45 mmol)を順に加えた後、H2SO4 (1.60 mL, 30.0 mmol)のエタノール溶液(100 mL)を加えて、反応溶液を65 °C で1 時間環流した。TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1) で原料の消失を確認し、NaOH (1.4 g) のエタノール溶液(100 mL)を加えて中和した。エタノールを除去した後、反応溶液をクロロホルムで2 回抽出し、水で2 回洗浄した。有機相をNa2SO4 で乾燥し、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 4 : 1) で精製し、白色粉末として1 (3.06 g, 70%)を得て、白色粉末として3,6-diiodocarbazole (0.47 g, 7.5%)を得た。
1: 1H NMR (DMSO-d6) δ 11.4 (s, 1H), 8.49 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.62 (dd, 1H, J = 8.4, 1.7 Hz), 7.48 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.40 (m, 1H), 7.33 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.16 (m, 1H).
3,6-Diiodocarbazole: 1H NMR (DMSO-d6) δ 11.5 (s, 1H), 8.56 (d, 2H, J = 1.7 Hz), 7.65 (dd, 2H, J = 8.5, 1.7 Hz), 7.34 (d, 2H, J = 8.5 Hz).
Triphenylphosphine (139 mg, 0.53 μmol)のジオキサン溶液(10 mL)にPalladium acetate (40.0 mg, 0.18 μmol)とTriethylamine (0.59 μL, 4.23 mmol)を順に加えて、75°C で5 分間撹拌した。1 (1.03 g, 3.52 mmol)のジオキサン溶液(15 mL)とAcrylonitrile (0.46 μL, 7.04 mmol)を加えて、反応溶液を11.5 時間環流した。TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1) で生成物を確認した後、綿ろ過でPalladium 粉末を取り除いた。カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 4 : 1) で精製し、白色粉末として2 (0.14 g, 18%, trans : cis = 97 : 3) を得て、白色粉末として1 (0.37 g, 回収率37%) を回収した。
2: 1H NMR (DMSO-d6) δ 11.6 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.75 (d, 1H, J = 16.7 Hz), 7.69-7.72 (m, 1H), 7.40-7.52 (m, 3H), 7.19-7.24 (m, 1H), 6.36 (d, 1H, J = 16.7 Hz).
KOH (0.22 g, 3.87 mmol)とTDA-1 (11 mg, 34 μmol)のアセトニトリル溶液(20 mL)に室温で2 (0.26 g, 1.20 mmol)を加えて20 分間撹拌した。反応溶液にChlorosugar (0.53 g, 1.24 mmol)を加えて室温で20 分間撹拌し、TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1)で原料の消失を確認した。沈殿物を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3)で精製し、黄色オイルとして3 (0.23 g, 33%)を得た。
3: 1H NMR (CDCl3) δ 8.09 (s, 1H), 8.02 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.98 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.62-7.65 (m, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.49 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 7.25-7.31 (m, 7H), 7.17-7.20 (m, 1H), 6.68 (dd, 1H, J = 9.3, 5.8 Hz), 5.78 (m, 1H), 5.76 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 4.91 (dd, 1H, J = 12.4, 2.7 Hz), 4.78 (dd, 1H, J = 12.4, 3.3 Hz), 4.55-4.57 (m, 1H), 3.09-3.20 (m, 1H), 2.45-2.52 (m, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), HRMS (MALDI): calcd. for C36H30N2O5Na [(M+ Na)+] 593.2053, found 593.2018.
3 (0.22 g, 0.39 mmol)のメタノール溶液(20 mL)に0.5 M methanolic NaOMe (2.3 mL, 1.2 mmol)とクロロホルム(5.0 mL)を加えて、反応溶液を室温で3.5 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で精製し、白色粉末として4 (0.11 g, 81%)を得た。
4: 1H NMR (CDCl3) δ 8.12 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 8.06 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.59 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 7.43-7.57 (m, 4H), 7.26-7.31 (m, 1H), 6.64 (dd, 1H, J = 8.2, 6.9 Hz), 5.87 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 4.77-4.82 (m, 1H), 3.95-4.06 (m, 3H), 2.95 (dt, 1H, J = 14.0, 8.2 Hz), 2.30 (ddd, 1H, J = 14.0, 6.9, 3.3 Hz), HRMS (MALDI): calcd. for C20H18N2O3Na [(M+ Na)+] 357.1215, found 357.1265.
ピリジン(1.0 mL × 2)で共沸した4 (97 mg, 0.29 mmol)にピリジン(0.5 mL)を加えた。反応溶液に4,4’-dimethoxytritylchloride (118 mg, 0.35 mmol) と4-(dimethylamino)pyridine (7.0 mg, 58 μmol)のピリジン溶液(1.0 mL)を加えて、反応溶液を室温で18 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 95 : 5) で生成物を確認した後、ピリジンを除去した。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2) で精製し、黄色粉末として5 (113 mg, 61%)を得た。
5: 1H NMR (CDCl3) δ 8.07 (d, 1H, J = 1.7 Hz, 8.02-8.05 (m, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.62-7.65 (m, 1H), 7.45-7.52 (m, 3H), 7.33-7.37 (m, 4H), 7.25-7.28 (m, 4H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.81 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.61 (dd, 1H, J = 8.2, 6.3 Hz), 5.77 (d, 1H, J = 16.7 Hz), 4.80-4.82 (m, 1H), 4.05-4.07 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.89 (dt, 1H, J = 13.8, 8.2 Hz), 2.23 (ddd, 1H, J = 13.8, 6.3, 2.7 Hz), 1.98 (d, 1H, J = 3.6 Hz), HRMS (MALDI): calcd. for C41H36N2O5Na [(M+ Na)+] 659.2522, found 659.2485.
アセトニトリル(1.5 mL)で共沸した5 (0.11 g, 0.17 mol)にアセトニトリル(1.5 mL)を加えた。反応溶液に2-cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphorodiamidite (52 μL, 0.17 mol)と0.45 M tetrazole のアセトニトリル溶液(0.37 mL, 0.17 mol) を加えて、反応溶液を室温で1.0 時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで2 回抽出し、Sat. NaHCO3 aq. とH2O で洗浄した。有機相をMgSO4 で乾燥し、溶媒を除去した。黄色オイルの粗生成物である6 (0.12 g) をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3 回共沸した後、さらなる精製をせずにDNA 合成に使用した。
下記に示すCNVK を含むODN を合成した。
ODN(ACNVK): 5’-TGCACNVKCCGT-3’
ODN(GCNVK): 5’-TGCGCNVKCCGT-3’
ODN(CCNVK): 5’-TGCCCNVKCCGT-3’
ODN(TCNVK): 5’-TGCTCNVKCCGT-3’
Palladium acetate (38.0 mg, 0.17 μmol)のDMF 溶液(0.25 mL)に1 (0.50 g, 1.71 mmol)とTributylamine (0.41 μL, 1.71 mmol) とMethyl acrylate (0.38 L, 4.27 mmol)とH2O(1.0 mL)を順に加えて、マイクロウェーブを用いて反応溶液を160 °C で10 分間反応してTLC で反応追跡したところ、1 の消失を確認した。桐山ろ過でPalladium 粉末を取り除いた後、カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 3 : 1) で精製し、白色粉末として7 (0.26 g, 62%)を得た。
7: 1H NMR (CDCl3) δ 8.26 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.07 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.89 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.61 (dd, 1H, J = 1.7, 8.5 Hz), 7.39-7.44 (m, 3H), 7.23-7.29 (m, 1H), 6.47 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 3.81 (s, 3H).
7 (0.55 g, 2.22 mmol)のアセトニトリル溶液(49 mL)に室温でNaH (92.0 mg, 2.31 mmol)を加えて10 分間撹拌した。反応溶液にChlorosugar (1.14 g, 2.66 mmol) を加えて室温で60 分間撹拌し、TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1) で原料の消失を確認した。沈殿物を除去した後、カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 4 : 1) で精製し、白色粉末として8 (0.98 g, 71%)を得た。
8 (0.96 g, 1.59 mmol)のメタノール溶液(46 mL)に0.5 M methanolic NaOMe (9.6 mL, 4.8 mmol)とジクロロメタン(12 mL)を加えて、反応溶液を室温で1 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で精製し、白色粉末として9 (0.28 g, 48%)を得た。
9: 1H NMR (CDCl3) δ 8.20 (s, 1H), 8.06 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.86 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.53-7.61 (m, 3H), 7.44 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 7.24-7.27 (m, 1H), 6.63 (dd, 1H, J = 8.2, 7.0 Hz), 6.46 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 4.75-4.80 (m, 1H), 3.95-4.04 (m, 3H), 3.81 (s, 1H), 2.95 (dt, 1H, J = 14.0, 8.2 Hz), 2.28 (ddd, 1H, J = 14.0, 7.0, 3.6 Hz).
ピリジン(1.0 mL × 2)で共沸した9 (0.23 g, 0.63 mmol)にピリジン(0.5 mL)を加えた。反応溶液に4,4’-dimethoxytritylchloride (0.26 g, 0.75 mmol) と4-(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 0.13 μmol)のピリジン溶液(2.2 mL)を加えて、反応溶液を室温で16 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 95 : 5)で生成物を確認した後、ピリジンを除去した。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 99 : 1) で精製し、黄色粉末として10 (0.21 g, 51%)を得た。
10: 1H NMR (CDCl3) δ 8.17 (s, 1H), 8.02-8.05 (m, 1H), 7.83 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.62-7.66 (m, 3H), 7.46-7.49 (m, 2H), 7.34-7.38 (m, 4H), 7.25-7.28 (m, 4H), 7.15 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.81 (dd, 4H, J = 8.8, 1.4 Hz), 6.61 (dd, 1H, J = 8.5, 6.3 Hz), 6.40 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 4.76-4.80 (m, 1H), 4.05-4.09 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.56-3.57 (m, 2H), 2.89 (dt, 1H, J = 14.0, 8.5 Hz), 2.18 (m, 1H), 2.17 (d, 1H, J = 3.8 Hz).
アセトニトリル(1.0 mL)で共沸した10 (0.20 g, 0.29 μmol)にアセトニトリル(1.3 mL)を加えた。反応溶液に2-cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphorodiamidite (92 μL, 0.29 μmol)と0.45 M tetrazole のアセトニトリル溶液(0.65 mL, 0.29 μmol) を加えて、反応溶液を室温で2 時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで2 回抽出し、Sat. NaHCO3 aq. とH2O で洗浄した。有機相をMgSO4 で乾燥し、溶媒を除去した。黄色オイルの粗生成物である11 (0.25 g) をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3 回共沸した後、さらなる精製をせずにDNA 合成に使用した。
ODN(AX) (5’-TGCAXCCGT-3’, X = 9)とODN(GX) (5’-TGCGXCCGT-3’, X = 9) はABI 3400 DNA 合成機を用いて合成した。それぞれ得られた反応混合物のCPG を二つに分けて、ひとつの反応混合物は0.4 M NaOH in H2O : CH3OH = 1 : 4 を用いて37 °C で17 時間インキュベートして脱保護し、2 M TEAA で中和した後凍結乾燥した。もうひとつの反応混合物は0.05 M K2CO3 in CH3OH を用いて室温で17 時間インキュベートして脱保護し、2 M TEAA で中和した後凍結乾燥した。ODN(AOHVK), ODN(GOHVK), ODN(AOMeVK), ODN(GOMeVK)のDNA を逆相HPLC によって精製した。それぞれのDNA を酵素分解した。単離収率はそれぞれ5, 10, 11, 13%であった。分子量をMALDI-TOF-MS で測定した。
calcd. for ODN(AOHVK), 5’-TGCAOHVKCCGT-3’: [(M+H)+] 2801.93, found 2802.12.
calcd. for ODN(GOHVK), 5’-TGCGOHVKCCGT-3’: [(M+H) +] 2817.93, found 2818.08.
calcd. for ODN(AOMeVK), 5’-TGCAOMeVKCCGT-3’: [(M+H) +] 2815.95, found 2816.07.
calcd. for ODN(GOMeVK), 5’-TGCGOMeVKCCGT-3’: [(M+H) +] 2831.95, found 2831.98.
ODN(ANH2VK): 5’-TGCANH2VKCCGT-3’
ODN(GNH2VK): 5’-TGCGNH2VKCCGT-3’
Claims (9)
- 塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である。)
で表される基を有する、光連結性核酸類(ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる)と、
核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、
を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法。 - 光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程が、相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 光連結性核酸類が、標識部位を備えている、請求項1〜2の何れかに記載の方法。
- 光連結性核酸類が、担体に固定化されている、請求項1〜2の何れかに記載の方法。
- 光連結させる工程の光照射が、350〜380nmの範囲の波長の光照射によって行われる、請求項1〜4の何れかに記載の方法。
- 光開裂させる工程の光照射が、310〜345nmの範囲の波長の光照射によって行われる、請求項1〜5の何れかに記載の方法。
- 光連結させる工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行われる、請求項1〜6の何れかに記載の方法。
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