CN105579437B - 具有光致交联能力的光响应性核苷酸类似物 - Google Patents

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Abstract

提供能够用于核酸的光反应技术的新的光反应性化合物和使用该光反应性化合物的光反应性交联剂。可以使用式I所示的光反应性的化合物。

Description

具有光致交联能力的光响应性核苷酸类似物
技术领域
本发明涉及：具有能够与核酸类交联的光反应性的核酸碱基类似结构和脱氧核糖替代结构的光反应性交联剂、以及具备该核酸碱基类似结构作为碱基部分且具备该脱氧核糖替代结构作为脱氧核糖部分的、具有光致交联(光交联)能力的光响应性核苷酸类似化合物(光响应性核苷酸类似物)。
背景技术
分子生物学领域的基本技术包括核酸的连接和核酸的交联。核酸的连接、交联例如与杂交法组合而用于基因的导入、碱基序列的检测或用于例如基因表达的抑制。因此，核酸的连接和交联的技术不仅是用于分子生物学的基础研究的极重要的技术，而且也是用于例如：医疗领域中的诊断、治疗或治疗药、诊断药等的开发、制造；工业和农业领域中的酶、微生物等的开发、制造的极重要的技术。
作为这样的核酸的连接或交联的技术，不使用酶类且利用光反应的技术由于能够自由控制反应的时间、空间，能够在比通常的有机化学反应缓和的条件下反应等优点而开始受到关注。
作为这样的核酸的光反应技术，有：使用5-氰基乙烯基脱氧尿苷的光连接技术(专利文献1：日本专利第3753938号、专利文献2：日本专利第3753942号)、使用在碱基部位具有3-乙烯基咔唑结构的修饰核苷的光交联技术(专利文献3：日本专利第4814904号、专利文献4：日本专利第4940311号)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本国专利第3753938号公报
专利文献2：日本国专利第3753942号公报
专利文献3：日本国专利第4814904号公报
专利文献4：日本国专利第4940311号公报
发明内容
发明要解决的问题
从核酸的光反应技术的重要性出发，进一步要求能够用于核酸的光反应技术的新的化合物。本发明的目的在于，提供能够用于核酸的光反应技术的新的光反应性化合物、和使用了该光反应性化合物的光反应性交联剂。
用于解决问题的方案
本发明人对作为核酸的光反应技术中能够使用的光反应性交联剂的光反应性化合物进行了深入探索，结果发现：具有乙烯基咔唑骨架结构代替核酸碱基的碱基部分且具有后述的式I所示的骨架结构代替核糖和脱氧核糖部分的化合物成为这样的核酸的光反应技术中能够使用的光反应性交联剂，从而实现了本发明。
本发明的化合物具有后述的式I所示的骨架结构，而不具有由天然的核苷和核苷酸所应当具有的核糖或脱氧核糖所形成的糖结构。进而，本发明的化合物不具有天然的核苷和核苷酸所应当具有的嘌呤碱基或嘧啶碱基所形成的碱基结构。即，本发明的化合物成为被认为与天然的核苷和核苷酸在结构上完全不类似的化学结构。尽管如此，本发明的化合物形成单链的核酸时，该单链核酸和与其互补的单链的核酸形成双螺旋，乙烯基咔唑部分通过光反应形成交联时，从双螺旋的一条链至另一条链形成光交联(光致交联)，因此，本发明的光反应性的化合物可以作为能够与期望的序列发生特异性反应的双螺旋的光致交联剂(光交联剂)而使用。
因此，本发明在于如下(1)～(10)。
(1)
一种光反应性的化合物，其如下式I所示：
(其中，式I中，
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基或氢原子，
R1和R2分别独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢原子，
R3表示氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中，Ra、R1和R2对应于式I中的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式I中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团)，
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)，
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示：氢原子；与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；或者DMTr基，
Q2表示：氢原子；与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或者如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团))。
(2)
根据(1)所述的化合物，其如下式II所示：
(其中，式II中，
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基或氢原子，
R1和R2分别独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢原子，
R3表示氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中，Ra、R1和R2对应于式I中的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式I中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团)
R5表示氢原子、甲基或乙基，
Q1表示：氢原子；与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的，或者DMTr基，
Q2表示：氢原子；与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或者如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团))。
(3)
根据(1)所述的化合物，其如下式III所示：
(其中，式III中，
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基或氢原子，
R1和R2分别独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢原子，
R3表示氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中，Ra、R1和R2对应于式I中的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式I中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团)，
R7表示氢原子或甲基，
Q1表示：氢原子；与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；或者DMTr基，
Q2表示：氢原子；与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或者如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团))。
(4)
上述式II所示的(2)所述的化合物，其中，式II中的如下式IIa所示的骨架结构为如下式所示的D-苏氨醇结构、如下式所示的L-苏氨醇结构或如下式所示的丝氨醇结构：
上述式III所示的(3)所述的化合物，其中，式III中的如下式IIIa所示的骨架结构为如下式所示的(R)-3-氨基-1,2-丙二醇结构或如下式所示的(S)-3-氨基-1,2-丙二醇结构：
根据(1)～(5)中任一项所述的化合物，其中，R3为氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、三氟甲基、苯基、2-萘基、2-吲哚基、苯并咪唑-2-基或苯并噻吩-2-基。
(7)
根据(1)～(6)中任一项所述的化合物，其中，
Q1为介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的，
Q2为介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
(8)
根据(1)～(6)中任一项所述的化合物，其中，
Q1为氢原子，Q2为氢原子。
(9)
根据(1)～(6)中任一项所述的化合物，其中，
Q1为DMTr基，
Q2为氢原子、与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基、如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或者如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)。
(10)
一种光反应性交联剂，其包含(1)～(9)中任一项所述的化合物。
进而，本发明还在于如下(11)～(14)。
(11)
一种形成光交联的方法，所述方法使用(1)～(9)中任一项所述的化合物在具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联。
(12)
一种光交联的形成方法，其包括如下工序：
将(7)所述的化合物与具有嘧啶环作为核酸碱基的核酸进行杂交形成双螺旋的工序；和，
对所形成的双螺旋进行光照射的工序。
(13)
(1)～(9)中任一项所述的化合物的与具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联的应用(use)。
(14)
(7)所述的化合物的与杂交而形成的双螺旋中具有嘧啶环作为核酸碱基的其他核酸类之间形成光交联的应用。
进而，本发明还在于如下(21)～(23)。
(21)
一种制造如下式VI所示的化合物的方法，使如下式IV所示的化合物与如下式V所示的化学物进行脱水缩合反应，从而制造如下式VI所示的化合物，
(其中，式IV中，
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基或氢原子，
R1和R2分别独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢原子，
R3表示氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中，Ra、R1和R2对应于式IV的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式IV中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团))
(其中，式V中，
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示氢原子，Q2表示氢原子)
(其中，式VI中，
Ra、R1、R2、R3、R4、R5、R6表示上述式IV和式V中的如上所述的基团)。
(22)
使用如下式VI所示的化合物作为核苷分子的替代分子，制造如下式VII所示的核酸合成用的化合物的方法，
(其中，式VI中，
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基或氢原子，
R1和R2分别独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢原子，
R3表示氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中，Ra、R1和R2对应于式VI中的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式VI中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团)
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示氢原子，Q2表示氢原子)
(其中，式VII中，
Ra、R1、R2、R3表示上述式VI中的上述基团，
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基，R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示DMTr基，
Q2表示与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基、如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团))。
(23)
使用如下式VII所示的核酸合成用的化合物，制造如下式I所示的光反应性的化合物的方法：
(其中，式VII中，
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基或氢原子，
R1和R2分别独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢原子，
R3表示氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中，Ra、R1和R2对应于式VII中的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式VII中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团)
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示DMTr基，
Q2表示与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基、如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团))，
(其中，式I中，
Ra、R1、R2、R3表示上述式VII中的上述基团，
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的，
Q2表示介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的)。
发明的效果
本发明提供能够用于核酸的光反应技术的、新型的光反应性交联剂。其由既不具备天然的糖结构也不具备碱基结构的、新型的化学结构形成。根据本发明，通过与以往相比简便且高收率的合成而能够在短时间内得到显示出高转化率的光反应性交联剂。
附图说明
图1为示出利用光交联形成光二聚体的实验的步骤和结果的图。
图2为说明合成步骤数和总收率的图。
具体实施方式
列举具体的实施方式，以下详细地说明本发明。本发明不限定于以下列举的具体的实施方式。
[化合物的结构]
本发明在于如下式I所示的光反应性的化合物：
上述式I中，
Ra为氰基、酰胺基(-CO-NH2)、羧基、烷氧基羰基、膦酰基(-PO(OH)2)、磺基(-SO2(OH))或氢，优选为氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢，进一步优选为氰基、酰胺基、羧基或烷氧基羰基。烷氧基羰基可以使用优选C2～C7、进一步优选C2～C6、进一步优选C2～C5、进一步优选C2～C4、进一步优选C2～C3、特别优选C2的基团。
上述式I中，
R1和R2分别独立地为氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢，优选为氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢，进一步优选为氰基、酰胺基、羧基或烷氧基羰基。烷氧基羰基可以使用优选C2～C7、进一步优选C2～C6、进一步优选C2～C5、进一步优选C2～C4、进一步优选C2～C3、特别优选C2的基团。
上述式I中，
R3为氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的单环式或二环式的芳香族化合物的一价基团、C6～C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的一价基团、或如下式所示的一价基团：
(其中，上述式中、Ra、R1和R2对应于式I中的上述Ra、R1和R2，独立地表示从作为式I中的上述Ra、R1和R2列举的基团中选择的基团)。
适合的实施方式中，R3可以设为氢原子、羟基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、三氟甲基、苯基、2-萘基、2-吲哚基、苯并咪唑-2-基或苯并噻吩-2-基。
适合的实施方式中，例如作为R3，可以使用如下列举的基团。(其中，波浪线表示自由价的位置。)
上述式I中，
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基。
上述Q1表示：氢原子；与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基、介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；或者DMTr基，
Q2表示：氢原子；与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或者如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)。
适合的实施方式中，可以将上述式I的R4设为Q1-O-CH2-基，R5设为氢原子、甲基或乙基，R6设为-O-Q2基。该情况下，上述式I所示的化合物为如下式II所示的化合物：
上述式II中的部分结构即如下式IIa所示的骨架结构可以优选设为如下式所示的D-苏氨醇结构、如下式所示的L-苏氨醇结构或如下式所示的丝氨醇结构，
适合的实施方式中，可以将上述式I的R4设为氢原子、R5设为-O-Q1基、R6设为-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基(即，R6为-CH(R7)-O-Q2基，其中，R7为氢原子或甲基)。该情况下，上述式I所示的化合物为如下式III所示的化合物：
上述式III中的部分结构即如下式IIIa所示的骨架结构可以优选设为如下式所示的(R)-3-氨基-1,2-丙二醇结构或如下式所示的(S)-3-氨基-1,2-丙二醇结构，
[修饰核酸类]
适合的实施方式中，可以将Q1设为介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的，可以将Q2设为介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。即，上述式I所示的化合物可以设为具有特征性的结构的光响应性人工核苷酸类似物被引入到序列中的核酸或低聚核苷酸(有时也称为本发明的修饰核酸或修饰低聚核苷酸、本发明的修饰核酸类)。另外，本发明的修饰核酸类中，具有特征性的结构的光响应性人工核苷酸类似物可以位于序列中的末端，该情况下，仅Q1或Q2中的任意一侧变为介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q1或Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
[核苷类似物]
适合的实施方式中，可以将Q1和Q2设为氢原子。即，上述式I所示的化合物可以设为具有特征性的结构的光响应性人工核苷类似物分子(有时也称为本发明的核苷类似物)。
[核苷酸类似物]
适合的实施方式中，可以将Q1设为与键合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基，Q2设为氢原子。即，上述式I所示的化合物可以设为具有特征性的结构的光响应性人工核苷酸类似物分子(有时也称为本发明的核苷酸类似物)。
[修饰核酸合成单体]
适合的实施方式中，可以将Q1设为DMTr基，Q2设为与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基、介由磷酸二酯键连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的、如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)
或如下式所示的基团：
(其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团)。
即，上述式I所示的化合物可以设为具有特征性的结构的光响应性修饰核酸合成用的单体(有时称为本发明的修饰核酸合成单体)。正如所熟知的那样，这样结构的单体成为能够通过亚磷酰胺法和H-膦酸酯法使用的核酸合成试剂。
作为这样的修饰核酸合成单体，可以例示出如下的单体。
[光交联的形成]
对于本发明的修饰核酸类，将其作为单链核酸时，能够和与其互补的单链核酸杂交而形成双螺旋。形成双螺旋时，对应于乙烯基咔唑结构部分的互补链中应当形成碱基对的位置的核酸碱基，可以没有特别限制地自由选择。对所形成的双螺旋进行光照射时，在形成双螺旋的核酸链之间能够通过光反应而形成交联。该光交联形成在：序列中自乙烯基咔唑结构部分作为核酸碱基所处的位置起至序列中位于5’末端侧的仅1个碱基的核酸碱基所对应的、互补链中形成碱基对的核酸碱基与乙烯基咔唑结构之间。换言之，该光交联形成在：对应于乙烯基咔唑结构部分的互补链中自应当形成碱基对的位置的核酸碱基起至序列中位于3’末端侧仅1个碱基的核酸碱基与乙烯基咔唑结构之间。
本发明的光反应性的化合物的乙烯基咔唑结构能够形成光交联的对方碱基为具有嘧啶环的碱基。另一方面，本发明的光反应性的人工核酸碱基不与具有嘌呤环的碱基形成光交联。即，本发明的光交联性的化合物具有强的特异性即：与作为天然的核酸碱基的胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶形成光交联，而另一方面与鸟嘌呤和腺嘌呤不形成光交联。
本发明的光反应性的化合物通过作为光反应性的修饰核酸类(光交联性修饰核酸类)使用而和具有与该修饰核酸类互补的碱基序列的序列杂交而形成双螺旋，因此可以仅对作为目标的特定序列进行光致交联反应(光交联反应)。即，本发明的光交联剂化合物可以根据需要序列设计来赋予非常高的序列选择性。
为了光交联而照射的光理想的是包含通常350～380nm的范围、优选360～370nm的范围、进一步优选366nm的波长的光，特别优选为366nm的单波长的激光。
经过光交联后，可以通过进一步光照射进行光裂解。即，本发明的光反应性的化合物可以进行可逆性的光交联，可以作为可逆性的光交联剂使用。
为了光裂解而照射的光可以使用包含通常330～370nm的范围、优选330～360nm的波长的光。另外，适合的实施方式中，可以使用包含366nm的波长的光、特别优选366nm的单波长的激光。
适合的实施方式中，这些光交联和光裂解的光反应可以通过照射包含350～370nm的范围的波长的光来进行，可以使用优选366nm的单波长的激光来进行。如果使用该范围的波长的光，则利用同一光源均可以进行光交联和光裂解的光反应，在无需准备2种光源的方面是有利的。使用该范围的波长的光时，根据温度条件，可以控制光交联、和光裂解的任一光反应是否进行。为了使光交联反应进行，在通常0～50℃、优选0～40℃、进一步优选0～30℃、进一步优选0～20℃、进一步优选0～10℃、进一步优选0～5℃的范围的温度、特别优选0℃下进行光照射。为了使光裂解反应进行，在通常60～100℃、优选60～90℃、进一步优选70～90℃的范围的温度下进行光照射。
本发明的光交联和光裂解由于利用了光反应，从而对pH、温度、盐浓度等没有特别限制，可以在核酸类等生物体高分子能够稳定地存在的pH、温度、盐浓度的溶液中通过光照射来进行。
本发明的光交联和光裂解极迅速地进行，例如：在作为光反应性的化合物而已知的补骨脂素(psoralen)需要数小时的条件(350nm光照射)下，仅需要1秒(366nm光照射)就能够进行光反应。即，如果使用本发明的光交联剂，则能够通过数秒例如1～9秒、1～7秒、1～5秒或1～3秒的时间的光照射而使光反应进行来形成光交联。
[与具有糖结构的现有型的光响应性人工核苷酸的对比]
本发明人历经长年研究了作为光响应性人工核苷酸的具有核糖或脱氧核糖的结构的人工核苷酸结构(参照专利文献1～4)。结果，如上述那样，本发明的化合物虽然不具有核糖和脱氧核糖的结构，但是也可以与光响应性人工核苷酸同样地使用，使光交联反应进行。即，虽然不具有核糖和脱氧核糖的结构，但是也可以同样地发挥本发明人的专利文献4(日本国专利第4940311号)中公开的优异的特性。而且，本发明的化合物在具有相同乙烯基咔唑结构的情况下，与具有脱氧核糖的结构的现有型的光响应性人工核苷酸(光交联剂)相比，发挥以更短的光照射时间显示出更高的转化率(即，光交联的形成的比例)的优异的效果。
[光响应性人工核苷类似物分子的合成]
本发明的光响应性人工核苷类似物分子可以根据后述的方案1(Scheme1)所示的合成路线来合成。
该方案1的合成路线如下：由如下式VIII所示的修饰乙烯基咔唑分子(VIII)合成如下式IV所示的羧酸，使其与如下式V所示的胺进行脱水缩合反应，从而得到如下式VI所示的光响应性人工核苷类似物分子，
(其中，式V中，
R4表示氢原子或Q1-O-CH2-基，
R5表示-O-Q1基、氢原子、甲基或乙基，
(其中，R4为氢原子时，R5表示-O-Q1基；R4为Q1-O-CH2-基时，R5表示氢原子、甲基或乙基)
R6表示-O-Q2基、-CH2-O-Q2基或-CH(CH3)-O-Q2基，
Q1表示氢原子，Q2表示氢原子)
(其中，式VI中、R4、R5、R6表示对应于上述式V中的上述所示的基团)。
上述合成路线中，所得光响应性人工核苷类似物分子(VI)中的应该与糖结构对应的部分的骨架结构直接反映出所使用的胺(V)的结构。
因此，想要将光响应性人工核苷类似物分子(VI)中的应该与糖结构对应的部分的骨架结构设为例如D-苏氨醇结构时，作为胺(V)，只要使用D-苏氨醇即可；想要设为例如L-苏氨醇结构时，作为胺(V)，只要使用L-苏氨醇即可；想要设为例如丝氨醇结构时，作为胺(V)，只要使用丝氨醇即可；想要设为例如(R)-3-氨基-1,2-丙二醇结构时，作为胺(V)，只要使用(R)-3-氨基-1,2-丙二醇即可；想要设为例如(S)-3-氨基-1,2-丙二醇结构时，作为胺(V)，只要使用(S)-3-氨基-1,2-丙二醇即可。
根据上述合成路线，自修饰乙烯基咔唑分子(VIII)至得到光响应性人工核苷类似物分子(VI)的步骤，从少且简便、能够非常高地维持总收率的方面出发，是优异的。进而，在合成路线中，在不包括利用氯化氢的活化的步骤等操作中需要注意和熟练的步骤的方面，是有利的。与此相对，现有型的光反应性的修饰核苷分子合成中，由于在其结构中具有脱氧核糖或核糖，因此与上述本发明的合成路线相比，合成路线中的步骤多、复杂、总收率为上述本发明的合成路线的总收率的几分之一的程度，较低。另外，现有型的光反应性的修饰核苷分子的合成中，由于在其结构中具有脱氧核糖或核糖，因此为了进行糖的羟基的保护和活化，包括了利用氯化氢的活化的步骤等操作中需要注意和熟练的步骤。因此，本发明的化合物在上述合成的简便性和总收率的高低的方面是优异的。另外，本发明还在于上述优异的合成方法(制造方法)。
[修饰核酸合成单体和修饰核酸类的合成]
使用由上述合成路线得到的光响应性人工核苷类似物分子(VI)，使用后述的方案1所述的手法或对于本领域技术人员来说公知的手法，可以得到本发明的修饰核酸合成单体。本发明的修饰核酸合成单体的结构如上所述，如果通过亚磷酰胺法和H-膦酸酯法等公知的手法使用其作为核酸合成试剂，则可以得到序列中引入了光响应性人工核苷类似物分子(VI)的核酸或低聚核苷酸(本发明的修饰核酸类)。如此，从亚磷酰胺法和H-膦酸酯法等公知的手法中可以作为核酸合成试剂使用的方面出发，本发明的修饰核酸合成单体是优异的。
实施例
以下列举实施例，详细地说明本发明。本发明不限定于以下示例的实施例。
[制造例1]
[核苷类似物(光反应性单元)的合成]
依照如下方案1所示的合成路线，对光响应性人工核苷类似物分子(有时称为核苷类似物或光反应性单元)进一步进行修饰核酸合成单体的合成。
(方案1)
(1)化合物2的合成
在1L的三口烧瓶中将咔唑(化合物1、4.0g、23.6mmol)溶解于乙醇(800mL)，将碘(3.0g)、NaIO4(1.28g)加入至烧瓶中，添加浓硫酸乙醇溶液(2.5mL/100mL)后，于60℃搅拌2小时。利用TLC(己烷：乙酸乙酯、4:1)确认反应结束后，用氢氧化钠的乙醇溶液进行中和，除去溶剂。将残渣溶解于氯仿，用水·饱和碳酸氢钠溶液·饱和食盐水清洗后，通过蒸发仪除去溶剂。将残渣溶解于乙醇，通过重结晶得到化合物2。(收量：3.4g、收率：49％)
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.40(s,1H,NH),8.51(d,1H,J＝1.7Hz,H-4),8.14(d,1H,J＝7.8Hz,H-5),7.62(dd,1H,J＝8.5,1.7Hz,H-2),7.51(d,1H,J＝8.1Hz,H-8),7.40(m,1H,H-7),7.36(d,1H,J＝8.5Hz,H-1),7.19(m,1H,H-6)
(2)化合物3的合成
在化合物2(3.4g、12mmol)的DMF溶液(6mL)中加入乙酸钯(269mg、1.2mmol)、丙烯腈(2.0mL、31mmol)、三丁基胺(2.9mL、12mmol)，在微波照射下(60W)、以160°搅拌10分钟。用TLC(己烷：乙酸乙酯、4:1)确认反应结束后，溶解于氯仿，用水·饱和碳酸氢钠溶液·饱和食盐水清洗后，通过蒸发仪除去溶剂。用硫酸钠干燥后，利用硅胶柱色谱法(氯仿)进行纯化，得到化合物3。(收量：2.2g、收率：83％)
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.60(s,1H,NH),8.44(s,1H,H-4),8.12(d,1H,J＝7.6Hz,H-5),7.77(d,1H,J＝16.6Hz,vinyl(乙烯基)),7.69(dd,1H,J＝14.3,1.7Hz,H-8),7.53(m,1H,H-1),7.51(d,1H,J＝3.5Hz,H-2),7.45(m,1H,H-7),7.24(m,1H,H-6),6.38(d,1H,J＝16.6Hz,vinyl)
(3)化合物4的合成
将化合物3(0.6g、2.8mmol)、KOH(0.46g、8.3mmol)、四丁基溴化铵(28mg、0.09mmol)溶解于丙酮(15mL)，于85℃搅拌30分钟。将溴乙酸乙酯(Ethyl bromoacetate)(0.8mL、3.3mmol)滴加至反应溶液后，回流12小时。用TLC(氯仿：甲醇、9:1)确认原料消失后，除去溶剂，再溶解于氯仿后，用水清洗。将有机层通过蒸发仪浓缩，通过硅胶柱色谱法(氯仿)进行纯化。(收量：0.72g、2.4mmol、收率：85％)
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.03-7.03(m,8H,ArH,ArCH),5.87(d,0.85H,trans(反式)-CNCH),5.35(d,1H,0.15H,cis(顺式)-CNCH),5.00(s,2H,CH2CO),4.22(q,2H,CH3CH2),1.24(t,3H,CH3).MALDI-TOF-MS:calcd.(理论值)；305.12([(M+H)+]),found(测量值)；304.68.
(4)化合物5的合成
将化合物4(0.12g,0.41mmol)溶解于氯仿(6mL)，加入甲醇(7mL)、水(3mL)并搅拌。进而加入氢氧化钠(0.39g、1mmol)，在室温下进行4小时的搅拌。用TLC确认原料消失后，向反应混合物中加入盐酸的甲醇溶液，将pH调整至2。浓缩后，使其溶解于乙酸乙酯，用水清洗，用硫酸镁干燥后，通过硅胶柱色谱法(氯仿：甲醇、7:3)进行纯化。(收量：0.1g、0.34mmol、收率：92％)
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.4(s,1H,OH),8.08-7.26(m,8H,Ar-H,ArCH),6.4(d,0.92H,trans-CNCH),5.7(d,0.08H,cis-CNCH),4.8(s,2H,CH2CO).
(5)化合物6的合成
在化合物5(0.75g、2.7mmol)、WSC(0.5g、2.7mmol)、HOBt(0.35g、2.7mmol)的DMF溶液(20mL)中加入D-苏氨醇(0.27g、2.7mmol)，在室温下进行24小时的搅拌。用TLC(氯仿：甲醇、9:1)确认原料消失后，将反应液用氯仿稀释。将该溶液用水和饱和碳酸氢钠水溶液清洗，通过硅胶柱色谱法(氯仿：甲醇、9:1)进行纯化。(收量：0.92g、2.6mmol、收率：94％)
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.5(s,1H,NHCO),8.0-7.2(m,8H,Ar-H,ArCH),6.4(d,0.78H,trans-CNCH),5.7(d,0.21H,cis-CNCH),5.1(t,2H,CH2CO),4.7(m,2H,CH2OH),3.9(m,1H,NCH),3.6(q,1H,CH2OH),3.5(m,1H,CHOH),3.4(m,1H,CHOH),1.0(d,3H,CH3).MALDI-TOF-MS:calcd.；363.15[(M+H)+],found；364.71.
(6)化合物7的合成
在100mL二口烧瓶中加入化合物6(0.95g,2.4mmol)，进行氮气置换后，滴加DMTrCl(0.90g,2.7mmol)、DMAP(60mg,0.49mmol)的吡啶溶液(20mL)，在室温下搅拌一晩。在反应溶液中加入甲醇后，加入碳酸氢钠水溶液，将溶液用氯仿提取后，将有机层蒸发并浓缩。通过硅胶柱色谱法(0.2％三乙胺(trietylamine)，1％甲醇的氯仿液(MeOH in CHCl3))纯化目标物。(收量：0.86g、1.3mmol、收率：54％)
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.1(s,1H,NHCO),7.5-6.3(m,21H,Ar-H,ArCH),5.8(d,0.9H,trans-CNCH),5.3(d,0.1H,cis-CNCH),4.9(t,2H,CH2CO),3.9(m,1H,CHOH),3.8(m,1H,NCH),3.74(s,6H,OCH3),3.1-3.2(m,2H,CH2O),2.7(m,1H,CHOH),0.9(d,3H,CH3).
(7)化合物8的合成
在橡胶密封瓶(25mL)中加入化合物7(0.37g,0.55mmol)的无水乙腈溶液，密封后，使其共沸2次。之后，对容器内进行氮气置换，添加无水乙腈(5.0mL)、2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(2-cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphordiamidite)(0.17g,0.55mmol)、乙腈中含0.25M BTT(0.25M BTT in MeCN)(2.2mL,0.55mmol)，在室温下搅拌1小时。通过TLC确认原料消失后，将反应混合物用经过脱乙酸处理的乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠水溶液和氯化钠水溶液清洗。将有机层用无水硫酸镁干燥后，进行过滤、溶剂的除去，得到化合物8。(收量：0.48g、0.52mmol、收率：94％)
[制造例2]
[包含光反应性成分的低聚DNA的合成]
根据通常的氰基乙基亚磷酰胺法，通过DNA自动合成机合成包含光反应性单元(有时称为核酸光反应性单元)的低聚DNA。仅将化合物8的固相缩合反应的反应时间设定为999秒。利用Trityl monitor的化合物8的偶联收率为97％以上。利用28％氨水溶液进行自固相的切出·脱保护，然后利用反相HPLC进行纯化，得到包含目标核酸光反应性单元的低聚DNA(5’-TGCAXCCGT-3’、X为核酸光反应性单元)。低聚DNA的鉴定通过MALDI-TOF-MS解析进行。([(M+H)+]；Calcd.2809.55,Found 2809.35)
[制造例3]
[包含现有型的光反应性修饰核苷的低聚DNA的合成]
作为对照实验，作为具备乙烯基咔唑骨架结构代替核酸碱基的碱基部分且在脱氧核糖部分具有脱氧核糖的、现有型的光反应性修饰核苷，合成如下式的3-氰基乙烯基咔唑基-1’-β-脱氧核糖苷(CNVK)：
由该化合物合成如下式的核酸合成试剂：
它们的合成依照专利文献4(日本国专利第4940311号)的实施例的方案1的步骤进行。之后，与上述同样地，根据通常的氰基乙基亚磷酰胺法，通过DNA自动合成机，合成包含现有型的光反应性修饰核苷的低聚DNA(5’-TGCAXCCGT-3’、X为CNVK)。
[光反应性的评价]
制造例2中得到的包含光反应性单元的低聚DNA和互补的低聚DNA(5’-ACGGGTGCA-3’)的等量混合液(50mM卡可酸钠缓冲液(pH 7.4)中5μM、100mM NaCl)中添加作为内标的脱氧尿苷(25μM)，在0℃下进行光照射(366nm、1600mW/cm2)。将该溶液通过UPLC(洗脱液：乙腈/50mM甲酸铵、1～20％乙腈/10分钟、流速：0.2mL/分钟)进行分析，从而评价光反应性。
图1的(a)为示出该操作的内容的说明图。对于图中的修饰ODN，在序列中的X的位置导入本发明的核苷类似物(光反应性单元)作为改良型光反应性单元(制造例2)。另外，作为比较对象实验，使用制造例3中得到的、包含现有型的光反应性修饰核苷的低聚DNA。上述情况下，在序列中的X的位置导入CNVK。
图1的(b)为示出使用与制造例2的低聚DNA互补的低聚DNA进行了光照射后、通过UPLC分析而得到的结果的图。与纵轴方向并列的图分别对应于光照射时间(0.0秒、0.2秒、0.5秒、1.0秒、3.0秒、5.0秒)，横轴表示保留时间(分钟)。在光照射前(0.0秒)的时刻存在的2种单链ODN(单体)通过光照射而减少，同时形成单链ODN的光二聚体，通过光照射而增大。图1的(c)是将该变化作图而得到的。图1的(c)的横轴为光照射时间(秒)，纵轴为转化率(％)。空心的圆(○)表示现有型，涂黑的四边形(■)表示改良型。对于该转化率即自单体向二聚体变化的比例，将完全变化为二聚体的情况设为转化率100％。本发明的核苷类似物、即改良型光反应性单元在0.2秒后示出约57％、在0.5秒后示出约83％、在1.0秒后示出96％这样高的转化率。另一方面，对于作为比较例的现有型的光反应性修饰核苷，在0.2秒后示出约35％、在0.5秒后示出约71％、在1.0秒后示出90％这样的转化率。即使为该现有型的转化率，也反映出为光化学反应，可以以短时间实现足够高的转化率，改良型的转化率与现有型相比，例如在0.2秒内示出约1.6倍这样高的转化率。
[合成收率的比较]
本发明的核苷类似物(改良型)可以利用上述方案1所示那样的路线合成，其从容易购买的起始材料用5步骤合成，总收率为30％。另一方面，现有型的光反应性修饰核苷可以利用上述那样的路线合成，其从容易购买的起始材料用7步骤合成，总收率为17％。图2为将它们的合成的步骤和总收率进行对比的说明图。如此，本发明的核苷类似物的合成与保持了糖结构的现有型的光反应性修饰核苷的合成相比，以少的合成步骤数即可，可以实现约2.3倍这样的高的总收率。进而，本发明的核苷类似物的合成在合成路线中不包括保持了糖结构的现有型的光反应性修饰核苷的合成中所必须的利用氯化氢的活化的步骤等在操作中需要注意和熟练的步骤，从这一点出发是有利的。
产业上的可利用性
本发明提供能够用于核酸的光反应技术的、新型的光反应性交联剂。本发明是在产业上有用的发明。

Claims (8)

1.下式II所示的化合物，
其中，式II中，
Ra表示氰基，
R1和R2表示氢原子，
R3为氢原子，
R5表示氢原子、甲基或乙基，
Q1表示：氢原子；或者DMTr基，
Q2表示：氢原子；与键合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；或者如下式所示的基团：
其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，Q2为氢原子。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，Q2为下式所示的基团：
其中，上述式表示在P上具有自由价的一价基团。
4.根据权利要求1、2或3所述的化合物，其中，所述Q1表示氢原子。
5.根据权利要求1、2或3所述的化合物，其中，所述Q1为DMTr基。
6.一种光反应性交联剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的化合物。
7.根据权利要求6所述的光反应性交联剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的化合物，所述化合物的Q2介由磷酸二酯键与核苷酸或核酸连接，所述磷酸二酯键是由与键合于该Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
8.一种形成光交联的方法，使用权利要求1～5中任一项所述的化合物，在该化合物与具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联。
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