CN102015749B - 核酸类的序列选择性提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对具有特定碱基序列的核酸类进行提纯和回收的方法，所述方法能在非常短的时间内进行，且兼备高的序列选择性和高的回收率。本发明涉及一种核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类的提纯方法，该方法包括以下工序：使具有式I表示的基团作为碱基部分的光连接性核酸类与核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类形成杂交体的工序；对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类进行光照射，使其发生光连接的工序；通过清洗除去没有发生光连接的核酸类的工序；对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类进行光照射，使其发生光裂解的工序。

Description

核酸类的序列选择性提纯方法
技术领域
本发明涉及核酸类的序列选择性提纯方法。
背景技术
在基因工程学中，具有特定碱基序列的核酸类的提纯和回收是重要的基本手段之一。在具有特定碱基序列的核酸类的提纯和回收中，作为使特定碱基序列的特异性识别成为可能的基本原理，人们一直使用与具有互补于该特定序列的碱基序列的核酸探针形成杂交体(杂交)(参见非专利文献1)。
然而，在实际形成杂交体的条件下，仅使用作为完全互补链形成杂交体的目标碱基序列的核酸类，很难与核酸探针分子产生键合。即，正如人们所知的，即使对于作为互补链的不完全的非目标碱基序列的核酸类，也会形成包含一定错配的不完全杂交体，产生与核酸探针分子的键合。在此后的回收阶段，与该核酸探针不期望的键合(错误)以噪声(杂质)的形式出现。如果为了不出现该噪声、提高检测的特异性，就必须排除不完全杂交体的形成。
另一方面，为了降低噪声(杂质)，需要在尽可能不会形成不完全杂交体的条件下进行处理，但在该条件下，形成的目标杂交体也是不稳定的，结果，目标核酸类的回收率降低。
然而，杂交体形成的识别利用的是平衡体系中的热稳定性的差，无论是形成完全的杂交体还是形成不完全的杂交体，其差别仅是热稳定性的差别。因此，区别两者的适当条件根据目标碱基序列有所不同，进一步地，即使在适当的条件下，改变热稳定性的条件也对两者产生相同的作用。即使在进行严格温度管理的实验条件下，这一点也是不会改变的。即，只要仅以平衡体系中形成杂交体的热稳定性的差作为区别两者的原理使用，即使在严格设定温度管理等条件的实验条件下，也需要在提纯纯度和回收率两者的平衡之间进行折衷，需要承受一定的噪音(杂质)。
此外，近年来，为了创制新药或诊断基因，要求具有单碱基取代的碱基序列的核酸类的提纯和回收技术。尤其对于DNA的单核苷酸多态性进行分型的技术，在医疗诊断的领域中非常期待。因此，非常需要兼备能识别单碱基取代的高序列选择性和可实用的回收率的提纯和回收技术。
此外，近年来，要求用于通称为非编码RNA(ncRNA)的、不被翻译的RNA的提纯和回收技术。在所述ncRNA中，包括由于体积小而被称为微RNA(miRNA)的一类。此外，目前由于通常具有polyA且能被剪接，因此也认为相当比例的单纯的mRNA的分子也属于被称为mRNA型ncRNA的一类。然而，这些RNA除了分子数少、存在大量种类外，还容易分解、寿命非常短，必须在非常短的时间内进行提纯和回收。因此，尤其要求能在非常短的时间内处理的RNA的序列选择性提纯和回收技术。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Lambert，K.N.；Williamson，V.M.Nucleic Acids Res.1993，21，pp775-776.
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种对具有特定碱基序列的核酸类进行提纯和回收的方法，所述方法能在非常短的时间内进行，且兼备高的序列选择性和高的回收率。
本发明者为了实现上述目的，进行了多年的精心研究，设想了使用光连接技术。此外，本发明者开发的新的人工碱基(人工核酸碱基)能进行光连接和光裂解，发现进行非常短时间的光照射是可能的，通过使用该人工碱基(人工核酸碱基)，能将核酸类的杂交体形成、光连接以及光裂解组合进行，从而实现上述目的。
即，利用使用了新的人工碱基的光连接，仅在形成完全杂交体的情况下使其发生特异性的光连接，不再依赖于维持杂交体的形成，就能在解离互补双链的条件下，将共价连接的试样核酸类和探针充分清洗，然后通过进行光裂解，对具有特定碱基序列的核酸类进行提纯和回收，且兼备高的序列选择性和高的回收率。通过对新的人工碱基进行光连接和光裂解，从而能在非常短的时间内进行所述提纯和回收。
因此，本发明为如下的[1]～[9]。
[1]一种提纯核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类的方法，该方法包括以下工序：
使具有下式I表示的基团作为碱基部分的光连接性核酸类(其中，在核酸类中，包括核酸、肽核酸)与核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类形成杂交体的工序，
(其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢)；
对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类进行光照射，使其发生光连接的工序；
通过清洗除去没有发生光连接的核酸类的工序；
对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类进行光照射，使其发生光裂解的工序。
[2]如[1]所述的方法，其中，通过清洗除去没有发生光连接的核酸类的工序在解离互补双链的清洗条件下进行清洗。
[3]如[1]～[2]任一项所述的方法，其中，光连接性核酸类具有标记部位。
[4]如[1]～[2]任一项所述的方法，其中，光连接性核酸类被固定化于载体上。
[5]如[1]～[4]任一项所述的方法，其中，使其发生光连接的工序的光照射通过350～380nm范围波长的光照射进行。
[6]如[1]～[5]任一项所述的方法，其中，使其发生光裂解的工序的光照射通过310～345nm范围波长的光照射进行。
[7]如[1]～[6]任一项所述的方法，其中，使其发生光连接的工序在包含具有缓冲作用的盐的反应溶液中进行。
[8]一种光连接性核酸类(其中，在核酸类中，包括核酸、肽核酸)，其具有下式I表示的基团作为碱基部分，且具有标记部位，
(其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢)。
[9]一种光连接性核酸类(其中，在核酸类中，包括核酸、肽核酸)，其具有下式I表示的基团作为碱基部分，且被固定于载体上，
(其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢)。
根据本发明，能在兼备高的序列选择性和高的回收率的情况下，对具有特定碱基序列的核酸类进行提纯和回收。因此，对于创制新药和基因诊断而引人注目的具有单碱基取代的碱基序列的核酸类也能进行提纯和回收。
此外，由于本发明的提纯和回收是通过光连接、光裂解人工碱基，故而能在非常短的时间内进行。因此，对于作为对象的容易分解、寿命非常短的RNA，也能进行提纯和回收。
因此，本发明的提纯和回收兼备高的序列选择性和高的回收率，且能在非常短的时间内进行。尤其是对于那些即使是分子数少、存在大量种类、且容易分解、寿命短的非编码RNA(ncRNA)，也能开拓分离提纯的用途。特别是，对于不具有称为polyA的RNA，本发明的提纯和回收也能广泛地适用，这是前所未有的。
附图说明
图1表示作为光应答性核酸的3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷(CNVK)的结构图。
图2表示通过HPLC进行分析的ODN(A CNVK-GT)光裂解产物的结果示意图。
图3表示通过HPLC进行分析的ODN(G CNVK-GC)光裂解产物的结果示意图。
图4表示光交联体的光裂解随时间变化的示意图。
图5表示通过HPLC进行分析的ODN(A CNVK-GT)光裂解产物的结果示意图。
图6表示光交联体的光裂解随时间变化的示意图。
图7表示序列选择性提纯DNA的一个例子概述的说明图。
图8表示序列选择性提纯DNA的结果示意图。
图9表示序列选择性提纯DNA的结果示意图。
图10表示通过HPLC进行分析的由光交联反应获得的生成物的结果示意图。
图11表示确认能进行光交联的RNA碱基的实验结果示意图。
图12表示通过HPLC进行分析的ODN(ACNVK)<>RNA(GU)的光裂解生成物的结果示意图。
图13表示通过HPLC进行分析的ODN(GCNVK)<>RNA(GC)的光裂解生成物的结果示意图。
具体实施方式
以下，通过列举本发明的实施方式，对本发明进行详细的说明。但本发明并不受以下示例的实施方式的限制。
本发明是一种提纯核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类的方法，该方法包括以下工序：
使具有下式I表示的基团作为碱基部分的光连接性核酸类(其中，在核酸类中，包括核酸、肽核酸)与核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类形成杂交体的工序，
(其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢)；
对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类进行光照射，使其发生光连接的工序；
通过清洗除去没有发生光连接的核酸类的工序；
对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类中进行光照射，使其发生光裂解的工序。
通过这些工序，本发明的提纯和回收能兼备高的序列选择性和高的回收率，而且能在短时间内进行。
式I中的Ra为氰基、酰胺基、羧基、烷氧羰基或氢，优选为氰基、酰胺基、羧基、烷氧羰基或氢，更优选为氰基、酰胺基、羧基或烷氧羰基。烷氧羰基优选使用C2～C7，更优选使用C2～C6，更优选使用C2～C5，更优选使用C2～C4，更优选使用C2～C3，特别优选使用C2的烷氧羰基。
式I中的R1和R2各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、烷氧羰基或氢，优选为氰基、酰胺基、羧基、烷氧羰基或氢，更优选为氰基、酰胺基、羧基或烷氧羰基。烷氧羰基优选使用C2～C7，更优选使用C2～C6，更优选使用C2～C5，更优选使用C2～C4，更优选使用C2～C3，特别优选使用C2的烷氧羰基。
上式I表示的基团为本发明的新的人工碱基(人工核酸碱基)。具有这些基团作为碱基部分的核酸由此具有光连接性。通过具有人工核酸碱基作为碱基部分而赋予所述光连接性，因此即使作为核酸(DNA、RNA)也好，肽核酸也好，都能赋予该光连接性。可以根据通常的核酸制造方法来制造光连接性核酸类。
与通常的核酸类相同，赋予光连接性的核酸类(光连接性核酸类)，其序列能与对于互补序列的核酸类形成杂交体。即，在多数的核酸类混合物中，能与具有特定碱基序列的核酸类(目标核酸类)形成杂交体。换言之，光连接性核酸类是由与具有特定碱基序列的目标核酸类的碱基序列互补的碱基序列的核酸类制作而成。
在光连接性核酸类与目标核酸类形成杂交体的情况下，与式I表示的人工碱基形成碱基对的位置上设置的碱基种类可以是任意的。在式I表示的人工碱基(K)和对应的另一方碱基的位置中，就算设置A、T、C、G、U中的任何一种，与光连接性核酸类和目标核酸类均能良好地形成杂交体。式I中表示的人工碱基也可以设置在核酸类的碱基序列的任一位置中。光连接性核酸类与目标核酸类形成杂交体的可能的核酸类，可以是相同种类的核酸类，也可以是不同种类的核酸类。
光连接性核酸类能通过式I表示的人工碱基进行光连接的另一方核酸类中的碱基是含有嘧啶环的碱基。即，可以列举T、C、U。由于对U进行光连接，因此，本发明优选以RNA作为目标核酸类进行。如实施例中所示，在形成杂交体时，根据与式I表示的人工碱基(K)对应的另一方的碱基的位置，对于位于另一方的链中3′末端侧位置的碱基，只有一个碱基产生本发明的光连接。
在优选的实施方式中，光连接性核酸类还可以具有标记部位。作为标记部位，可以使用各种标记，例如，可以使用生物素标记、色素标记(包括荧光色素标记)、RI标记、酶标记(包括发色酶标记)。由于具有该标记部位，目标核酸类和交联状态的光连接性核酸类就能容易地分离并回收。
作为在该标记部位中使用的标记，本发明中优选能十分耐受清洗的标记。从操作的容易性和在强清洗条件下的耐受性来看，优选生物素标记或荧光色素标记。生物素标记使用具有抗生物素蛋白部分的各种标记，通过生物素-抗生物素蛋白键合，可以进行检测或固定化，并进行回收。这些标记部位的添加可以通过通常的制造方法进行。光连接性核酸类通常优选末端附近具有标记部位，还可以在对光连接和杂交体的形成不会产生不利影响的范围内，在其他某个部位具有标记部位。
在优选的实施方式中，光连接性核酸类还可以在载体上固定化。由此，只要能使用在载体上固定化的光连接性核酸类，则光连接的目标核酸类能在载体上被固定化，从而就能容易地分离回收。作为载体，可以使用用作生物学领域固相载体的各种物质的材料。可以列举，例如玻璃、多孔玻璃等无机物质类、聚苯乙烯(PS)等树脂类、金等金属类等。作为优选的载体，可以列举出具有腺苷残基的固相载体(低聚亲和性载体(OAS)等)、醛基修饰玻璃等。优选玻璃板、CPG、聚苯乙烯珠等。也可以优选使用用作DNA芯片基材的通常的材料。该材料用于该目的可以是通常使用的各种形状，可以是例如珠状、颗粒状、圆筒状、纤维状、平面基板状。
在优选的实施方式中，光连接性核酸类可以直接键合被固定在载体上，也可以通过连接体部分被固定在载体上。作为连接体部分，只要是在核酸类的化学反应中是惰性的，具有5个以上，优选10个以上的原子，优选为直链状的分子种类即可。作为连接体部分，优选DNA、RNA、PNA等核酸；聚乙二醇、烷烃类等。特别优选聚乙二醇，可以优选使用六聚乙二醇。制造被固定在载体上的核酸类的方法，可以通过在连接体部分上键合核酸类末端的磷酸基而制造。还可以将连接体部分与核酸类键合，然后键合于载体上；相反，也可以先将载体与连接体部分键合，然后再将连接体部分与核酸类键合。与核酸类键合的位置通常优选使用末端的磷酸基，但并不限定于此。例如，还可以与核酸类中间的碱基部分的官能团进行键合。
使光连接性核酸类与目标核酸类形成杂交体的工序可以在适于形成杂交体的通常条件(温度、pH、盐浓度、缓冲液等)下进行，但从操作性的观点出发，优选与此后进行的光照射而使其发生光连接的工序在相同的反应溶液中进行。
通过对形成杂交体的光连接性核酸类和目标核酸类进行光照射，从而使其发生光连接。该光连接通过人工碱基部分的光反应，从而能在光连接性核酸分子与目标核酸类分子之间形成分子间的共价键，因此能形成分子间的交联。由此交联形成的分子与分子不再仅以单纯的热稳定性而聚集，因此，即使在互补双链解离的条件下，也不会解离而是键合。
在优选的实施方式中，光连接工序可以在包含具有缓冲作用的盐的反应溶液中进行。作为具有缓冲作用的盐，可以列举二甲胂酸盐、磷酸盐、Tris盐。在本发明中，从荧光强度强度增大的观点出发，特别优选具有缓冲作用的盐是二甲胂酸盐。具有缓冲作用的盐的浓度优选在5～250mM的范围内，特别优选在10～100mM的范围内。在优选的实施方式中，反应溶液的pH优选在6.5～8.0，更优选在6.5～7.5，特别优选在6.7～7.3的范围内。在优选的实施方式中，反应溶液优选包含碱金属和/或碱土类金属的盐。作为碱金属和/或碱土类金属的盐，可以列举氯化钠和氯化镁，优选氯化钠。
光连接工序的光照射通常在350～380nm的范围内，优选在360～370nm的范围内，更优选包含366nm波长的光。特别优选366nm单波长的激光。在优选的实施方式中，通过光照射进行的光反应在1秒～数秒以内，优选在1秒以内的反应时间内进行。只是，如果考虑容器和溶液的光透过性，在搅拌容器的同时，则还可以进一步花时间进行光照射。
在光连接工序后，进行将没有发生光连接的核酸类清洗并除去的工序。通过光反应形成交联的分子与分子不再仅以单纯的热稳定性而聚集，因此即使在互补双链解离的条件下，也不会解离而是键合。因此，将没有发生光连接的核酸类清洗并除去的工序，优选在能解离互补双链的清洗条件下进行清洗。
作为解离互补双链的清洗条件，可以使用通常已知的互补双链的解离条件。例如，温度可以使用80～100℃，优选90～100℃，特别优选95～100℃范围的温度。只要是温度不会分解共价键，就可以是从沸点～到可实现范围内的最高温度。pH值只要在不会分解共价键的范围内，就没有特别的限制，优选从难以发生共价键水解的pH～中性pH附近。对于盐种类和盐浓度，只要在操作中不会产生不利的试样沉淀的范围内，就没有特别的限制，通常，适当浓度的盐(例如约0.1M NaCl)的存在由于能促进互补双链的解离，因此是适合的。此外，为了促进互补双链的解离，可以添加例如作为变性剂的尿素。此外，为了促进互补双链的解离，可以添加例如作为表面活性剂的十二烷基硫酸钠。此外，可以使用已知作为促进互补双链解离的条件。
本发明的优异特征是将没有发生光连接的核酸类清洗并除去的工序可以通过在剧烈的清洗条件下进行清洗，也不必是非常剧烈的条件，根据预想的杂质(噪声)，可以选择适当的清洗条件。例如，不使用盐、表面活性剂、变性剂等，而可以使用纯水进行清洗。
在将没有发生光连接的核酸类清洗并除去的工序后，可以通过在形成杂交体的光连接性核酸类与目标核酸类中进行光照射而发生光裂解的工序，由此回收目标核酸类。由此，最终能将核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类进行提纯和回收。由于本发明光连接性核酸类的光连接和光裂解是可逆的，由此完全不会破坏获得的目标核酸类分子在原来的核酸类混合物中的状态。此外，本发明的光连接性核酸类的光连接和光裂解是可逆的，因此也不会破坏光连接性核酸类分子原来的状态。因此，根据本发明，光连接性核酸类可以重复使用。
光裂解工序的光照射通常为含有310～345nm的范围、优选为310～340nm、更优选为310～330nm范围、更优选为310～320nm的光，更优选为含有312nm波长的光。特别优选为312nm的单波长激光。在优选的实施方式中，光照射引发的光反应在1秒～数秒以内、优选在1秒以内的反应时间内进行。其中，如果考虑容器和溶液的光透过性，则还可以在搅拌容器的同时，进一步花费时间进行光照射。可以通过公知的方法回收通过光裂解而在反应溶液中游离出的目标核酸类。
本发明中使用的光连接性核酸类为具有下式I表示的基团作为碱基部分的光连接性核酸类，
(其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢)；
在该光连接性核酸类中，包含插入如下式II表示的核苷(核糖核苷)形成的核酸：
(其中，式II中的Ra、R1、R2如式I中所述。)
还包含插入如下式III表示的核苷(脱氧核苷)形成的核酸，
(其中，式III中的Ra、R1、R2如式I中所述)。
实施例
以下，通过列举实施例对本发明进行说明，但本发明并不限于这些实施例。
1.使用312nm的光交联体的光裂解反应
作为光应答性核酸的3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷(CNVK)的结构式如图1所示。
胸腺嘧啶与作为光交联体的ODN(A CNVK-GT)(20μM)的水溶液(2M脲水溶液∶CH3CN＝1∶1)中进行光裂解反应(总体积：30μL)。使用透照器(transilluminator)用312nm的光在室温下照射3分钟(流程1)。该光反应物HPLC的分析结果如图2中所示。同样，作为与胞嘧啶的光交联体的ODN(GCNVK-GC)(20μM)的水溶液(2M脲水溶液∶CH3CN＝1∶1)中进行光裂解反应(总体积：30μL)。使用透照器用312nm的光在室温下照射3分钟(流程2)。该光反应物HPLC的分析结果如图3中所示。其随时间的变化过程如图4中所示。发现在任一光裂解反应中，均能以数分钟的单位有效地进行反应。
流程1
流程2
2.使用312nm的光交联体的光裂解反应(在70℃下加热)
在ODN(ACNVK-GT)(20μM)的水溶液中进行光裂解反应(总体积：30μL)。使用透照器用312nm的光在70℃下照射30分钟(流程3)。在图5中示出该光反应物HPLC的分析结果。其随时间的变化过程如图6中所示。在水溶液中进行光裂解反应，在交联部位具有T的交联体能在30分钟内完全反应。
流程3
3.通过光基团操作法进行DNA的序列选择性提纯
在图7中示出DNA序列选择性提纯的一个例子概述。
为了对DNA进行序列选择性提纯，可以按照1μmol的规模合成下述示出的2种DNA，在DNA合成后，取出聚苯乙烯珠(PS)，加入氨水，在55℃下保温15小时进行脱保护。用MilliQ将PS清洗5次，使pH值为7。然后在SpeedVac中干燥1小时。
ODN1(CNVK)-PS：5′-ATGA CNVKGCGT-SSS-PS-3′
ODN2(CNVK)-PS：5′-GTAA CNVKTTCC-SSS-PS-3′
根据流程4，使用固相进行DNA的序列选择性提纯。
流程4
对于ODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)，在ODN1(CNVK)-PS的存在下进行光照射。反应条件是，ODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)各自为25μM，ODN1(CNVK)-PS(32nmol/mg)为2mg，二甲胂酸缓冲液(pH 7.0)为50mM，NaCl为1M，总溶液量为50μL。用毛细管凝胶电泳(CGE)分析光照射前的反应溶液(图8(a))。
对于该反应溶液，在0℃下，使用UV-LED，用366nm的光照射15分钟(每5分钟搅拌反应溶液)。用CGE分析该反应溶液的上清液(图8(b))。取出上清液后，用超纯水清洗5次。在所得固相载体中加入超纯水(50μL)，用312nm的光照射15分钟，用CGE进行分析(图8(c))。
在使用ODN1(CNVK)-PS时，可以回收目标ODN(20)。
根据流程5，使用固相的DNA的序列选择性提纯。
流程5
对于ODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)，在ODN2(CNVK)-PS的存在下进行光照射。反应条件是，ODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)各自为25μM，ODN2(CNVK)-PS(32nmol/mg)为2mg，二甲胂酸缓冲液(pH 7.0)为50mM，NaCl为1M，总溶液量为50μL。用CGE分析光照射前的反应溶液(图9(a))。
对于该反应溶液，在0℃下，使用UV-LED，用366nm的光照射15分钟(每5分钟搅拌反应溶液)。用CGE分析该反应溶液的上清液(图9(b))。在取出上清液后，用超纯水清洗5次。在所得固相载体中加入超纯水(50μL)，用312nm的光照射15分钟，用CGE进行分析(图9(c))。
在使用ODN2(CNVK)-PS时，可以回收目标ODN(20)。
4.使用含有CNVK的ODN与RNA的光交联反应
使用含有CNVK的ODN，光照射时间为1秒进行光交联反应。进行ODN(ACNVK)(20μM)和RNA(GU)(20μM)的光交联反应(二甲胂酸钠50mM，NaCl 100mM，总体积：30μL)。使用UV-LED，在0℃下用366nm的光照射1秒(流程6)。在图10中示出该光反应物HPLC的分析结果。发现使用RNA(GU)进行1秒的光交联反应时，能更有效地进行反应，回收率为86％，因此可以进行1秒的RNA光操作。
流程6
5.使用含有CNVK的ODN的8种光交联反应
使用含有CNVK的ODN进行光交联反应。进行ODN(ACNVK)(10μM)与RNA(XU)(X＝A，G，C，U，10μM)的光交联反应(二甲胂酸钠50mM，NaCl 100mM，总体积：200μL)。使用UV-LED，用366nm的光在0℃下照射20秒，使用UPLC进行分析。在图11(a)中示出其结果。同样，使用含有C为光交联部位的CNVK的ODN进行光交联反应。进行ODN(GCNVK)(10μM)与RNA(XC)(X＝A，G，C，U，10μM)的光交联反应(二甲胂酸钠50mM，NaCl 100mM，总体积：200μL)。使用UV-LED，用366nm的光在0℃下照射20秒，使用UPLC进行分析。在图11(b)中示出其结果。由这些结果发现，当交联方为U和C时，能更有效地进行与RNA的光交联反应。
6.使用312nm的光与RNA的光交联体的光裂解反应
通过光反应，调制U或C为光交联部位的光交联体ODN(ACNVK)<>RNA(GU)或ODN(GCNVK)<>RNA(GC)，用HPLC分别取样。然后，测定所得光交联体和质量。
ODN(ACNVK)<>RNA(GU)的计算值：[(M+H)+]5675.74，实测值5675.25。
ODN(GCNVK)<>RNA(GC)的计算值：[(M+H)+]5690.75，实测值5690.68。
在ODN(ACNVK)<>RNA(GU)的水溶液(2M尿素水溶液∶CH3CN＝1∶1)中进行光裂解反应(总体积：30μL)。使用透照器用312nm的光在室温下照射1分钟(流程7)。在图12中示出该光反应物的HPLC分析结果。同样，在ODN(GCNVK)<>RNA(GC)的水溶液(2M尿素水溶液∶CH3CN＝1∶1)中进行光裂解反应(总体积：30μL)。使用透照器用312nm的光在室温下照射3分钟(流程8)。在图13中示出该光反应物的HPLC分析结果。在用312nm的光进行光裂解反应时，在交联部位具有U的交联体在1分钟内完全反应。此外，在用312nm的光进行光裂解反应时，在交联部位具有C的交联体在3分钟内完全反应。
流程7
流程8
7.在碱基部位具有乙烯基咔唑的ODN的合成
根据如下的流程9进行合成。在以下的说明中，有时用化合物的编号表示化合物。
流程9
3-碘代咔唑(1)
在咔唑(2.50g，15.0mmol)的乙醇溶液(500mL)中，依次加入NaIO4(0.80g，3.75mmol)和I2(1.89g，7.45mmol)，然后加入H2SO4(1.60mL，30.0mmol)的乙醇溶液(100mL)，将反应溶液在65℃下回流1小时。用TLC(HexH∶AcOEt＝4∶1)确认原料消失后，加入NaOH(1.4g)的乙醇溶液(100mL)进行中和。在除去乙醇后，用氯仿萃取反应溶液2次，用水清洗2次。用Na2SO4干燥有机相，除去溶剂。用柱色谱(HexH∶AcOEt＝4∶1)提纯，获得白色粉末1(3.06g，70％)，获得白色粉末3，6-二碘代咔唑(0.47g，7.5％)。
1：1H NMR(DMSO-d6)δ11.4(s，1H)，8.49(d，1H，J＝1.7Hz)，8.14(d，1H，J＝8.0Hz)，7.62(dd，1H，J＝8.4，1.7Hz)，7.48(d，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，1H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.16(m，1H)。
3，6-二碘代咔唑：1H NMR(DMSO-d6)δ11.5(s，1H)，8.56(d，2H，J＝1.7Hz)，7.65(dd，2H，J＝8.5，1.7Hz)，7.34(d，2H，J＝8.5Hz)。
3-氰基乙烯基咔唑(2)
在三苯基膦(139mg，0.53μmol)的二噁烷溶液(10mL)中，依次加入醋酸钯(40.0mg，0.18μmol)和三乙胺(0.59μL，4.23mmol)，在75℃下搅拌5分钟。加入1(1.03g，3.52mmol)的二噁烷溶液(15mL)和乙腈(0.46μL，7.04mmol)，将反应溶液回流11.5小时。用TLC(HexH∶AcOEt＝4∶1)确认原料消失后，然后用棉漏斗过滤，除去钯粉末。用柱色谱(HexH∶AcOEt＝4∶1)提纯，获得白色粉末2(0.14g，18％，顺式∶反式＝97∶3)，回收白色粉末1(0.37g，回收率37％)。
2：1H NMR(DMSO-d6)δ11.6(s，1H)，8.44(s，1H)，8.11(d，1H，J＝8.0Hz)，7.75(d，1H，J＝16.7Hz)，7.69-7.72(m，1H)，7.40-7.52(m，3H)，7.19-7.24(m，1H)，6.36(d，1H，J＝16.7Hz)。
3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷-3′，5′-二(对甲苯甲酰)酯(3)
在室温下，在KOH(0.22g，3.87mmol)和TDA-1(11mg，34μmol)的乙腈溶液(20mL)中，加入2(0.26g，1.20mmol)，搅拌20分钟。在室温下，在反应溶液中加入氯代糖(0.53g，1.24mmol)，搅拌20分钟，用TLC(HexH∶AcOEt＝4∶1)确认原料消失。在除去沉淀物后，用柱色谱(CHCl3)提纯，获得黄色油状物3(0.23g，33％)。
3：1H NMR(CDCl3)δ8.09(s，1H)，8.02(d，2H，J＝8.4Hz)，7.98(d，2H，J＝8.4Hz)，7.62-7.65(m，1H)，7.62(d，1H，J＝8.8Hz)，7.49(d，1H，J＝16.5Hz)，7.25-7.31(m，7H)，7.17-7.20(m，1H)，6.68(dd，1H，J＝9.3，5.8Hz)，5.78(m，1H)，5.76(d，1H，J＝16.5Hz)，4.91(dd，1H，J＝12.4，2.7Hz)，4.78(dd，1H，J＝12.4，3.3Hz)，4.55-4.57(m，1H)，3.09-3.20(m，1H)，2.45-2.52(m，1H)，2.45(s，3H)，2.44(s，3H)，HRMS (MALDI)：C36H30N2O5Na的计算值：[(M+Na)+]593.2053；实测值：593.2018。
3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷(4)
在3(0.22g，0.39mmol)的甲醇溶液(20mL)中，加入0.5M甲醇-甲醇钠(2.3mL，1.2mmol)和氯仿(5.0mL)，在室温下搅拌反应溶液3.5小时。用TLC(CHCl3∶MeOH＝9∶1)确认原料消失。在除去溶剂后，用柱色谱(CHCl3∶MeOH＝9∶1)提纯，获得白色粉末4(0.11g，81％)。
4：1H NMR(CDCl3)δ8.12(d，1H，J＝1.7Hz)，8.06(d，1H，J＝7.7Hz)，7.59(d，1H，J＝9.1Hz)，7.43-7.57(m，4H)，7.26-7.31(m，1H)，6.64(dd，1H，J＝8.2，6.9Hz)，5.87(d，1H，J＝16.5Hz)，4.77-4.82(m，1H)，3.95-4.06(m，3H)，2.95(dt，1H，J＝14.0，8.2Hz)，2.30(ddd，1H，J＝14.0，6.9，3.3Hz)，HRMS(MALDI)：C20H18N2O3Na的计算值：[(M+Na)+]357.1215，实测值357.1265。
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷(5)
与吡啶(1.0mL×2)共沸的4(97mg，0.29mmol)中加入吡啶(0.5mL)。在反应溶液中加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(118mg，0.35mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(7.0mg，58μmol)的吡啶溶液(1.0mL)，在室温下搅拌反应溶液18小时。用TLC(CHCl3∶MeOH＝95∶5)确认生成物后，除去吡啶。用柱色谱(CHCl3∶MeOH＝98∶2)提纯，获得黄色粉末5(113mg，61％)。
5：1H NMR(CDCl3)δ8.07(d，1H，J＝1.7Hz)，8.02-8.05(m，1H)，7.71(d，1H，J＝8.5Hz)，7.62-7.65(m，1H)，7.45-7.52(m，3H)，7.33-7.37(m，4H)，7.25-7.28(m，4H)，7.12(dd，1H，J＝8.8，1.7Hz)，6.81(dd，4H，J＝8.8，1.7Hz)，6.61(dd，1H，J＝8.2，6.3Hz)，5.77(d，1H，J＝16.7Hz)，4.80-4.82(m，1H)，4.05-4.07(m，1H)，3.77(s，3H)，3.76(s，3H)，3.56-3.58(m，2H)，2.89(dt，1H，J＝13.8，8.2Hz)，2.23(ddd，1H，J＝13.8，6.3，2.7Hz)，1.98(d，1H，J＝3.6Hz)，HRMS(MALDI)：C41H36N2O5Na的计算值：[(M+Na)+]659.2522，实测值：659.2485。
5′-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷-3′-O-(氰基乙氧基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺(6)
与乙腈(1.5mL)共沸的5(0.11g，0.17mol)中加入乙腈(1.5mL)。在反应溶液中加入2-氰基乙基-N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰胺(52μL，0.17mol)和0.45M四唑的乙腈溶液(0.37mL，0.17mol)在室温下搅拌反应溶液1.0小时。用经过脱乙酸处理的乙酸乙酯萃取反应溶液2次，用饱和NaHCO3水溶液和H2O清洗。用MgSO4干燥有机相，除去溶剂。将黄色油状的粗产物6(0.12g)用乙腈移至橡胶塞瓶中，共沸3次后，无需进一步的提纯即可用于DNA的合成。
含有3-氰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷( CNV K)的ODN的合成
合成以下所示的包含CNVK的ODN：
ODN(ACNVK)：5′-TGCACNVKCCGT-3′
ODN(GCNVK)：5′-TGCGCNVKCCGT-3′
ODN(CCNVK)：5′-TGCCCNVKCCGT-3′
ODN(TCNVK)：5′-TGCTCNVKCCGT-3′
根据以下的流程10进行合成。
流程10
3-甲氧基羰基乙烯基咔唑(7)
在乙酸钯(38.0mg，0.17μmol)的DMF溶液(0.25mL)中，依次加入1(0.50g，1.71mmol)、三丁胺(0.41μL，1.71mmol)、丙烯酸甲酯(0.38L，4.27mmol)和H2O(1.0mL)，使用微波将反应溶液在160℃下反应10分钟，用TLC追踪反应，确认1消失。使用桐山漏斗除去钯粉末，用柱色谱(HexH∶AcOEt＝3∶1)提纯，获得白色粉末7(0.26g，62％)。
7：1H NMR(CDCl3)δ8.26(s，1H)，8.21(s，1H)，8.07(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(d，1H，J＝15.9Hz)，7.61(dd，1H，J＝1.7，8.5Hz)，7.39-7.44(m，3H)，7.23-7.29(m，1H)，6.47(d，1H，J＝15.9Hz)，3.81(s，3H)。
3-甲氧基羰基咔唑-1′-β-脱氧核苷-3′5′-二(对甲苯甲酰)酯(8)
室温下，在7(0.55g，2.22mmol)的乙腈溶液(49mL)中加入NaH(92.0mg，2.31mmol)，搅拌10分钟。在反应溶液中加入氯代糖(1.14g，2.66mmol)，在室温下搅拌60分钟，用TLC(HexH∶AcOEt＝4∶1)确认原料消失。除去沉淀物后，用柱色谱(HexH∶AcOEt＝4∶1)提纯，获得白色粉末8(0.98g，71％)。
3-甲氧基羰基咔唑-1′-β-脱氧核苷(9)
在8(0.96g，1.59mmol)的甲醇溶液(46mL)中加入0.5M甲醇-甲醇钠(9.6mL，4.8mmol)和二氯甲烷(12mL)，在室温下搅拌反应溶液1小时。用TLC(CHCl3∶MeOH＝9∶1)确认原料消失。在除去溶剂后，用柱色谱(CHCl3∶MeOH＝9∶1)提纯，获得白色粉末9(0.28g，48％)。
9：1H NMR(CDCl3)δ8.20(s，1H)，8.06(d，1H，J＝7.7Hz)，7.86(d，1H，J＝15.9Hz)，7.53-7.61(m，3H)，7.44(t，1H，J＝7.1Hz)，7.24-7.27(m，1H)，6.63(dd，1H，J＝8.2，7.0Hz)，6.46(d，1H，J＝15.9Hz)，4.75-4.80(m，1H)，3.95-4.04(m，3H)，3.81(s，1H)，2.95(dt，1H，J＝14.0，8.2Hz)，2.28(ddd，1H，J＝14.0，7.0，3.6Hz)。
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-甲氧基羰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷(10)
在与吡啶(1.0mL×2)共沸的9(0.23g，0.63mmol)中加入吡啶(0.5mL)。在反应溶液中加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.26g，0.75mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(15.0mg，0.13μmol)的吡啶溶液(2.2mL)，将反应溶液在室温下搅拌16小时。用TLC(CHCl3∶MeOH＝95∶5)确认生成物后，除去吡啶。用柱色谱(CHCl3∶MeOH＝99∶1)提纯，获得黄色粉末10(0.21g，51％)。
10：1H NMR(CDCl3)δ8.17(s，1H)，8.02-8.05(m，1H)，7.83(d，1H，J＝15.9Hz)，7.62-7.66(m，3H)，7.46-7.49(m，2H)，7.34-7.38(m，4H)，7.25-7.28(m，4H)，7.15(d，1H，J＝8.8Hz)，6.81(dd，4H，J＝8.8，1.4Hz)，6.61(dd，1H，J＝8.5，6.3Hz)，6.40(d，1H，J＝15.9Hz)，4.76-4.80(m，1H)，4.05-4.09(m，1H)，3.80(s，3H)，3.77(s，3H)，3.76(s，3H)，3.56-3.57(m，2H)，2.89(dt，1H，J＝14.0，8.5Hz)，2.18(m，1H)，2.17(d，1H，J＝3.8Hz)。
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-甲氧基羰基乙烯基咔唑-1′-β-脱氧核苷-3′-O-(氰基乙氧基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺(11)
与乙腈(1.0mL)共沸的10(0.20g，0.29μmol)中加入乙腈(1.3mL)。在反应溶液中加入2-氰基乙基-N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰胺(92μL，0.29μmol)和0.45M四唑的乙腈溶液(0.65mL，0.29μmol)，在室温下搅拌反应溶液2小时。用经过脱乙酸处理的乙酸乙酯萃取反应溶液2次，用饱和NaHCO3水溶液和H2O清洗。用MgSO4干燥有机相，除去溶剂。将黄色油状的粗产物11(0.25g)用乙腈移至橡胶塞瓶中，共沸3次后，无需进一步的提纯即可用于DNA的合成。
修饰ODN的合成
ODN(AX)(5′-TGCAXCCGT-3′，X＝9)和ODN(GX)(5′-TGCGXCCGT-3′，X＝9)使用ABI 3400DNA合成仪合成。将分别得到的反应混合物CPG分成二份，一份反应混合物使用在H2O∶CH3OH＝1∶4中的0.4M NaOH，在37℃下保温17小时进行脱保护，在2M TEAA中进行中和，然后冻干。另一份反应混合物使用在CH3OH中的0.05MK2CO3，在室温下保温17小时进行脱保护，在2M TEAA中进行中和，然后冻干。通过反相HPLC提纯ODN(AOHVK)、ODN(GOHVK)、ODN(AOMeVK)、ODN(GOMeVK)的DNA。将各个DNA进行酶分解。分解收率分别为5，10，11，13％。分子量通过MALDI-TOF-MS测定。
ODN(AOHVK)，5′-TGCAOHVKCCGT-3′的计算值：[(M+H)+]2801.93，实测值：2802.12。
ODN(GOHVK)，5′-TGCGOHVKCCGT-3′的计算值：[(M+H)+]2817.93，实测值：2818.08。
ODN(AOMeVK)，5′-TGCAOMeVKCCGT-3′的计算值：[(M+H)+]2815.95，实测值：2816.07。
ODN(GOMeVK)，5′-TGCGOMeVKCCGT-3′的计算值：[(M+H)+]2831.95，实测值：2831.98。
合成以下示出的含有NH2VK的ODN。
ODN(ANH2VK)：5′-TGCANH2VKCCGT-3′
ODN(GNH2VK)：5′-TGCGNH2VKCCGT-3′
工业实用性
根据本发明，能对具有特定碱基序列的核酸类进行提纯和回收，且兼备高的序列选择性和高的回收率。还能进行由于创制新药或诊断基因而引人注目的具有单碱基取代的碱基序列的核酸类的提纯和回收，这在工业上是有用的。此外，根据本发明，通过对人工碱基进行光连接，使其光裂解，从而能在非常短的时间内进行提纯和回收。因此，还可以将容易分解、寿命短的RNA作为对象进行提纯和回收，这在工业上是有用的。

Claims (9)

1.一种提纯核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类的方法，该方法包括以下工序：
使具有下式I表示的基团作为键合在核糖环或脱氧核糖环第1’位的碳原子上的碱基部分的光连接性核酸与核酸类混合物中含有的、具有特定碱基序列的目标核酸类形成杂交体的工序，
其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢；
对形成杂交体的光连接性核酸和目标核酸类进行光照射，使其发生光连接的工序；
通过清洗除去没有发生光连接的核酸类的工序；
对形成杂交体的光连接性核酸和目标核酸类进行光照射，使其发生光裂解的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中，通过清洗除去没有发生光连接的核酸类的工序在解离互补双链的清洗条件下进行清洗。
3.如权利要求1～2任一项所述的方法，其中，所述光连接性核酸具有标记部位。
4.如权利要求1～2任一项所述的方法，其中，所述光连接性核酸被固定化于载体上。
5.如权利要求1～2任一项所述的方法，其中，使其发生光连接的工序的光照射通过350～380nm范围波长的光照射进行。
6.如权利要求1～2任一项所述的方法，其中，使其发生光裂解的工序的光照射通过310～345nm范围波长的光照射进行。
7.如权利要求1～2任一项所述的方法，其中，使其发生光连接的工序在包含具有缓冲作用的盐的反应溶液中进行。
8.一种光连接性核酸，所述光连接性核酸具有下式I表示的基团作为键合在核糖环或脱氧核糖环第1’位的碳原子上的碱基部分，且具有标记部位，
其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢。
9.一种光连接性核酸，所述光连接性核酸具有下式I表示的基团作为键合在核糖环或脱氧核糖环第1’位的碳原子上的碱基部分，且被固定于载体上，
其中，在式I中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢，R1和R2各自独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧羰基或氢。
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