JPH0827115A

JPH0827115A - 光増感機能をもつ新規アミノ酸

Info

Publication number: JPH0827115A
Application number: JP6171050A
Authority: JP
Inventors: Retsu Saito; 烈斎藤
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1996-01-30
Anticipated expiration: 2014-11-29
Also published as: JP2982621B2

Abstract

(57)【要約】【目的】光増感機能を有し、ＤＮＡを塩基配列特異的
に光切断する化合物を提供すること。【構成】下記一般式（Ｉ）で表される光増感機能をも
つ新規アミノ酸。【化１】上記式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立にＨまたはＮ
Ｏ₂を表わす。ただし、Ｒ¹およびＲ²が同時にＮＯ₂
を表わす場合を除く。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、光増感機能をもつ新規
アミノ酸、更に詳しくは、光増感機能をもつＬ−リジン
の新規誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者は、分子生物学や光生物化学に
応用でき、しかも光をトリガーとしてＤＮＡを切断する
アミノ酸（Photochemical DNA-cleaving Amino Acid, P
CAA ）の開発研究を行なっている。

【０００３】これまで人工制限酵素を目指したＤＮＡ切
断分子の研究が盛んにおこなわれているが、塩基配列特
異的に切断する分子は天然の抗生物質では見られるもの
の、人工的にデザインしたものではほとんど知られてい
ない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前項に記載の従来の技
術の背景下に、本発明は、塩基配列特異的な光ＤＮＡ切
断活性を有する化合物を開発し提供することを目的とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前項に記載
の目的を達成すべく鋭意研究の結果、本発明者の合成し
たＬ−リジンの新規誘導体のなかのいくつかが光照射
（366nm ）により塩基配列特異的にＤＮＡを切断するこ
とを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、Ｌ−リジンから容易
に得られる、塩基配列特異的な光ＤＮＡ切断活性を有す
る非天然型アミノ酸、具体的には、下記一般式（Ｉ）で
表される光増感機能をもつ新規アミノ酸に関する。

【０００７】

【化２】

【０００８】上記式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立
にＨまたはＮＯ₂を表わす。ただし、Ｒ¹およびＲ²が
同時にＮＯ₂を表わす場合を除く。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】本発明者がデザインし、合成したＬ−リジ
ンの新規誘導体には、次の化合物（１）〜（６）が含ま
れるが、これらの化合物のうち、化合物（１）〜（３）
が特に光増感機能に優れ、延いては塩基配列特異的な光
ＤＮＡ切断活性に優れている。

【００１１】

【化３】

【００１２】これらの新規誘導体の合成法自体には特別
の困難はなく、上に述べたように、Ｌ−リジンから容易
に得ることができる（なお後掲実施例１参照）。

【００１３】以上のように、本発明者は、ＤＮＡを光切
断できるアミノ酸（PhotochemicalDNA-Cleaving Amino
Acid 、PCAA）をデザインし、いくつか合成したが、こ
れらのアミノ酸は、（１）Ｌ−リジンより一段階で大量
合成することができる、（２）ＤＮＡに強く結合し、 3
00〜380nm の光照射でＤＮＡやＲＮＡを塩基配列特異的
に切断し、しかもナフタルイミド部位の置換基を変える
ことでＤＮＡ切断の塩基特異性が変わる（化合物（１）
は−ＧＧ−特異的切断、化合物（２）はＴ特異的切断、
そして化合物（３）は−Ｇ−および−Ｔ−の双方で切
断）、（３）この性質を利用して制ガン剤としての用途
が期待される、（４）光治療のための増感剤としての利
用できる、（５）強いケイ光を有するのでケイ光性アミ
ノ酸として利用できる、（６）水溶性の光増感剤、特に
電子移動型光増感剤として広い範囲で光増感反応や生体
分子の酸化反応等に用いられる、そして（７）固相化学
合成で任意のポリペプチドに組み込むことができ、遺伝
子工学的手法を用いれば蛋白質にも組み込むことが可能
なものである。

【００１４】

【作用】化合物（１）は、ＧＧ配列の５′側のＧを切断
することからＧから化合物（１）への電子移動とそれに
続く酸化により切断を起こしていると考えられる。ま
た、化合物（２）は、チミン塩基のメチル基を酸化して
Ｔ特異的に切断することがわかった。この化合物はＴの
光シークエンシングや遺伝子のＴのみを変異させるポイ
ントミューテーションにも有用であろう。

【００１５】

【実施例】以下、実施例を掲げて本発明を更に説明す
る。

【００１６】実施例１（合成例）下記化合物（ａ）〜（ｈ）を合成した。ただし、化合物
（ｇ）を除く。

【００１７】

【化４】

【００１８】（ｉ）Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシカ
ルボニルペンチル）−１，８−ナフタルイミド（化合物
（ａ））の合成Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ（1.21ｇ，4.69mmol）と
１，８−ナフタル酸無水物（0.977 ｇ，4.69mmol）をト
ルエン20mlに溶解し、３時間加熱還流した。溶媒留去後
得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィーによ
り精製してＮ−（５−ブトキシカルボニルアミノ−５−
メトキシカルボニルペンチル）−１，８−ナフタルイミ
ド（化合物（ｂ））を1.81ｇ、収率90.4％で得た。

【００１９】この化合物（ｂ）1.81ｇ（4.11mmol）をト
リフルオロ酢酸10mlに溶解し、室温で１時間攪拌した。
溶媒留去後Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシカルボニル
ペンチル）−１，８−ナフタルイミド（化合物（ａ））
を1.86ｇ、収率 100％で得た。

【００２０】¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ：1.40-2.20
(m,6H) ，3.71(s,3H)，3.96(t,1H,J=6.2Hz)，4.17(t,2
H,J=6.3Hz)，7.80(t,2H,J=7.4Hz)，8.84(d,2H,J=7.4H
z)，8.54(d,2H,J=7.3Hz)．ＵＶ（ＣＨ₃ＣＮ）λ_max332nm ：ｌｏｇε＝4.08．ＭＳｍ／ｅ（相対強度）：340 （Ｍ＋0.5 ），323
（100 ）．ｍｐ：68〜73℃．ケイ光Ｅ^m _max：３８０ｎｍ（３３５ｎｍ励起）。

【００２１】（ii）Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシカ
ルボニルペンチル）−３−ニトロ−１，８−ナフタルイ
ミド（化合物（ｃ））の合成Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ（856mg ，2.47mmol）と３
−ニトロ−１，８−ナフタル酸無水物（500mg ，2.05mm
ol）をＤＭＦ20mlに溶解し、３時間加熱還流した。溶媒
留去後得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィ
ーにより精製してＮ−（５−ｔ−ブトキシカルボニルア
ミノ−５−メトキシカルボニルペンチル）−３−ニトロ
−１，８−ナフタルイミド（化合物（ｄ））を250mg 、
収率25.1％で得た。

【００２２】この化合物（ｄ）250mg （0.515mmol ）を
トリフルオロ酢酸10mlに溶解し、室温で１時間攪拌し
た。溶媒留去後Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシカルボ
ニルペンチル）−３−ニトロ−１，８−ナフタルイミド
（化合物（ｃ））を242mg 、収率93.9％で得た。

【００２３】¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ：1.40-2.10
(m,6H) ，3.71(s,3H)，4.05(t,1H,J=6.3Hz)，4.20(t,2
H,J=7.3Hz)，8.00(dd,1H,J=7.3Hz,J=7.5Hz) ，8.62(d,1
H,J=8.2Hz)，8.74(d,1H,J=6.2Hz)，9.18(d,1H,J=2.3H
z)，9.33(d,1H,J=2.3Hz)．ＵＶ（ＣＨ₃ＣＮ）λ_max331nm ：ｌｏｇε＝3.82．ＭＳｍ／ｅ（相対強度）：386 （Ｍ⁺，0.5 ），369
（100 ）．ｍｐ：58〜62℃．ケイ光Ｅ^m _max：４００ｎｍ（３３５ｎｍ励起）。

【００２４】（iii ）Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシ
カルボニルペンチル）−４−ニトロ−１，８−ナフタル
イミド（化合物（ｅ））の合成Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ（1.21ｇ，4.69mmol）と４
−ニトロ−１，８−ナフタル酸無水物（1.20ｇ，4.93mm
ol）をＤＭＦ50mlに溶解し、３時間加熱還流した。溶媒
留去後得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィ
ーにより精製してＮ−（５−ｔ−ブトキシカルボニルア
ミノ−５−メトキシカルボニルペンチル）−４−ニトロ
−１，８−ナフタルイミド（化合物（ｆ））を706mg 、
収率31.0％で得た。

【００２５】同様にして得られた化合物（ｆ）を合し、
その840mg （1.46mmol）をトリフルオロ酢酸10mlに溶解
し、室温で１時間攪拌した。溶媒留去後Ｎ−（５−アミ
ノ−５−メトキシカルボニルペンチル）−４−ニトロ−
１，８ナフタルイミド（化合物（ｅ））を864mg 、収率
100％で得た。

【００２６】¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ：1.43-2.06
(m,6H) ，3.82(s,3H)，4.05(t,1H,J=6.3Hz)，4.17(t,2
H,J=7.3Hz)，7.91-8.07(m,2H) ，8.44-8.50(m,1H) ，8.
61-8.78(m,3H) ．ＵＶ（ＣＨ₃ＣＮ）λ_max334nm ：ｌｏｇε＝3.92．ＭＳｍ／ｅ（相対強度）：386 （Ｍ⁺，1.5 ），369
（100 ）．ｍｐ：66-69 ℃．ケイ光Ｅ^m _max：４３０ｎｍ（３３５ｎｍ励起）。

【００２７】（iv）Ｎ−（５−（Ｎ−９−フルオレニル
メトキシカルボニル）アミノ−５−メトキシカルボニル
ペンチル）−１，８−ナフタルイミド（化合物（ｈ））
の合成Ｎ₂雰囲気下Ｎ−（５−アミノ−５−カルボニルペンチ
ル）−１，８−ナフタルイミド（化合物（ｇ））（893.
3mg ，2.15mmol）を10％Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液１mlに溶解
し、氷冷下にFmocOSu （869mg ，2.58mmol）を加えた。
反応溶液を室温で１時間攪拌後、塩酸で酸性にして酢酸
エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水
硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去して得た粗精製
物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製してＮ−
（５−（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）ア
ミノ−５−メトキシカルボニルペンチル）−１，８−ナ
フタルイミド（化合物（ｈ））を707mg 、収率56.8％で
得た。

【００２８】¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：1.35-2.10
(m,6H) ，4.20(d,2H,J=6.6Hz)，4.33(t,1H,J=7.0Hz)，
7.20-7.60(m,8H) ，7.60-7.75(m,2H) ，8.16(d,2H,J=8.
3Hz)，8.58(d,2H,J=6.3Hz)。

【００２９】実施例２（光化学的なＤＮＡ切断活性の検
査）化合物（１）、（２）および（４）〜（６）の、それぞ
れの存在下におけるＤＮＡの光化学的な切断活性をｐＢ
Ｒ322 ＤＮＡのform変換により検査した。

【００３０】切断反応の条件は、次の通りとした。すな
わち、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（５０μM 燐酸塩濃度）のカ
コジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ 7.0、10ｍＭ）溶液に
化合物（１）、（２）および（４）〜（６）をそれぞれ
を10μＭになるように加えて、これらの溶液を同一条件
下でフナコシ製「フナコシトランスイルミネーターＴＬ
33」（ 366ｎｍ）を用い、10cmの距離から０℃で１時間
光照射し、光照射溶液をアガローズゲル電気泳動し、 f
orm Ｉ（supercoiled circular）から form II（nicked
circular ）への変換を調べた。ＤＮＡ切断活性は
（２）＞（１）＞（４）＞＞（６）＞（５）の順に低下
し、（２）が最も活性高く、（６）および（５）は殆ん
どＤＮＡ切断活性を示さなかった。（２）は10μＭの濃
度でform III（linear ＤＮＡ）まで切断した。

【００３１】実施例３（ＤＮＡの塩基配列特異的光切
断）Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシカルボニルペンチル）
−１，８−ナフタルイミド（化合物（ａ）＝化合物
（１））50μM 、約 0.1μM リン酸濃度の³²Ｐ５′末端
ラベルＤＮＡフラグメント（³²Ｐ−５′−end-labeled
261-bp fragment ofhuman c-Ha-ras-1 protooncogene
、約0.1 Ｃｉ／mmol）及び50μM リン酸濃度仔牛胸線
ＤＮＡを10ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0
） 100μＬに溶解した。得られた溶液を冷却下ＵＶラ
ンプ「フナコシトランスイルミネーターＴＬ33」（フナ
コシ社製）によりＵＶ光を10cmの距離から20分間照射し
た。このようにして光反応させた後、ＤＮＡをエタノー
ル沈殿により回収し、これを再度１Ｍピペリジン水溶液
100μL に溶解し、90℃で20分間加熱した。エタノール
沈殿により回収したＤＮＡをＤＮＡシーケンシングシス
テム「ＬＫＢ2010 Macrophor」（ファルマシア社製）を
用いてゲル電気泳動法によりＤＮＡ切断の塩基配列特異
性をMaxam-Gilbert 法で解析した。

【００３２】Ｎ−（５−アミノ−５−メトキシカルボニ
ルペンチル）−３−ニトロ−１，８−ナフタルイミド
（化合物（ｃ）＝化合物（２））10μM 、およびＮ−
（５−アミノ−５−メトキシカルボニルペンチル）−４
−ニトロ−１，８−ナフタルイミド（化合物（ｅ）＝化
合物（３））25μM の場合もそれぞれ同様に行なった。

【００３３】解析結果から得られる結論は、次の通りで
ある。すなわち、化合物（１）の場合は、ＧＧ配列の
５′側のＧで特異的な切断が起り、化合物（２）の場合
は、ＡＴリッチ部位のところのＴで特異的な切断が起
り、そして化合物（３）は上記のＧおよびＴの双方で切
断が起る。このようにニトロ基を導入するだけで塩基配
列特異性がドラマチックに変化する。

【００３４】因みに、化合物（１）および（２）のMaxa
m-Gilbert 法での解析結果を図１および図２にそれぞれ
示す。図１から化合物（１）は５′−ＧＧ−配列の５′
側のＧの位置でＤＮＡを切断することが判り、また、図
２から化合物（２）は５′−ＸＴ−（Ｘ＝Ａ，Ｔまたは
Ｃ）の位置で切断することが判る。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、光増感機能を有し、ＤＮ
Ａを塩基配列特異的に光切断する新規化合物がＬ−リジ
ンから容易に合成され、提供されるところとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】Maxam-Gilbert 法による解析結果を示す（実施
例３）。

【図２】Maxam-Gilbert 法による解析結果を示す（実施
例３）。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（Ｉ）で表される光増感機能
をもつ新規アミノ酸。【化１】上記式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立にＨまたはＮ
Ｏ₂を表わす。ただし、Ｒ¹およびＲ²が同時にＮＯ₂
を表わす場合を除く。