JP2005348645A - フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド - Google Patents
フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005348645A JP2005348645A JP2004171928A JP2004171928A JP2005348645A JP 2005348645 A JP2005348645 A JP 2005348645A JP 2004171928 A JP2004171928 A JP 2004171928A JP 2004171928 A JP2004171928 A JP 2004171928A JP 2005348645 A JP2005348645 A JP 2005348645A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleotide
- formula
- deoxyribose
- photoresponsive
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 0 *CC(C(*)C1)O[C@@]1Cl Chemical compound *CC(C(*)C1)O[C@@]1Cl 0.000 description 5
- WNUONTHLHNYRON-WOFVOEOOSA-N COC(CCC(C=CC1)=CC1O[C@H](C1)OC(CO)C1O)=O Chemical compound COC(CCC(C=CC1)=CC1O[C@H](C1)OC(CO)C1O)=O WNUONTHLHNYRON-WOFVOEOOSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
【解決手段】一般式(1)
【化7】
〔Xは水素原子、ジメトキシトリチル基、リン酸基または1塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Yは水素原子、次式(2)のフォスフォロアミダイト基
【化8】
(Aは結合部位を示す。)、リン酸基または1塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Rは−CN、アミド結合を特徴とする−CONR1R2、またはカルボニル結合を特徴とする−COOR3であって、かかるR1ないしR3はそれぞれ水素原子またはアルキル基CnH2n+1(n≧1)を示す。〕であるフェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体。
【選択図】なし
Description
現在までのところ、核酸に対するクロスリンクを行う手段としては、ソラレン誘導体(Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283)やアミノプリン誘導体(特開2001-206896)が知られている。しかしながら、前者は5´−AT−3´である塩基配列のチミン特異的に反応し、後者は配列依存性はないもののシチジン特異的であるなど、適用範囲に一定の制約があった。
式(3)に示すm-iodophenol (1.04 g, 4.74 mmol)のTHF溶液 (80 mL)に0 °CでNaH (0.20 g, 5.00 mmol)と式(4)に示すChlorosugar(2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-α- D -ribofuranosyl chloride) (2.14 g, 5.00 mmol)を順に加えて10分間撹拌した。反応溶液を室温で19時間撹拌し、TLC (CHCl3)で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (CHCl3)で精製し、無色油状の生成物1(1.97 g, 73%)を得た。この生成物1は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式(5)に示す反応中間体、すなわち1-α-(m-iodo)phenoxy-2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-riboseと同定された。
HRMS (ESI) cald. for C27H25IO6Na (MNa+): 595.0588, found: 595.0531.
〔実施例2〕<反応中間体の合成2>
前記実施例1の生成物1(1.96 g, 3.43 mmol;式(5))のdichloromethane溶液(100 mL) に0.5 M methanolic NaOMe (20 mL, 10 mmol)を加えて、反応溶液を45 °Cで12時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で精製し、白色粉末として生成物2 (0.77 g, 67%)を得た。この生成物2は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式(6)に示す反応中間体、すなわち1-α-(m-iodo)phenoxy-2-deoxyriboseと同定された。
1H NMR (CDCl3) d 7.37-7.38 (m, 1H), 7.31-7.34 (m, 1H), 6.96-6.98 (m, 2H), 5.83 (dd, 1H, J = 5.6, 1.8 Hz), 4.60-4.66 (m, 1H), 4.09 (dd, 1H, J = 8.7, 4.5 Hz), 3.60-3.76 (m, 2H), 2.52 (ddd, 1H, J = 13.8, 6.9, 1.8 Hz), 2.30 (dt, 1H, J = 13.8, 6.0 Hz), 1.89-1.95 (m, 2H);
HRMS (ESI) cald. for C11H13IO4Na (MNa+): 358.9751, found: 358.9729.
〔実施例3〕<デオキシリボース誘導体の合成>
triphenylphosphine (87 mg, 0.3 μmol)のジオキサン溶液(15 mL)にpalladium acetate (25 mg, 0.1 μmol)とtriethylamine (0.37μL, 2+.64 mmol)を順に加えて、75°Cで5分間撹拌した。前記実施例2の生成物2(0.74 g, 2.20 mmol)とmethyl acrylate (0.40 μL, 4.40 mmol)を加えて、反応溶液を2時間環流した。TLC (CHCl3 : MeOH = 9 : 1)で生成物を確認した後、綿ろ過でpalladium粉末を取り除いた。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 95 : 5)で精製し、黄色油状物質として生成物3 (0.6 g, 93%)を得た。生成物3はNOESY実験(図1)によってα体と同定され、また下記の質量および紫外吸光度分析値およびNMR分析結果より、式(7)に示すデオキシリボース誘導体、すなわち(E)-1-α-(m-metoxycarbonylvinyl)phenoxy-2-deoxyriboseと同定された。
HRMS (ESI) cald. for C15H18O6Na (MNa+): 317.0996, found: 317.0981;
UV (H2O : CH3OH = 1 : 1) lmax (e) 278 nm (1.2×104 M-1cm-1), 366 nm (68 M-1cm-1).
〔実施例4〕<ジメチルトリチル基を導入したデオキシリボース誘導体の合成>
式(7)に示すデオキシリボース誘導体の5位のヒドロキシル基に保護基(ジメチルトリチル基)の導入を試みた。pyridine (2.0 mL×2)で共沸した前記デオキシリボース誘導体である実施例3得た生成物3(0.20 g, 0.68 mmol)にpyridine (1.0 mL)を加えた。反応溶液に4,4'-dimethoxytritylchloride (0.23 g, 0.82 mmol)と4-(dimethylamino)pyridine (17.0 mg, 0.14 mmol)のピリジン溶液(2.0 mL)を加えて、反応溶液を室温で14時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 97 : 3)で生成物を確認した後、pyridineを除去した。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で精製し、黄色粉末として生成物4(0.30 g, 75%)を得た。生成物4は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式(8)に示すデオキシリボース誘導体と同定された。
HRMS (ESI) cald. for C36H36O8Na (MNa+): 619.2302, found: 619.2268.
〔実施例5〕<フォスフォロアミダイト誘導体の合成>
式(8)に示す5位をジメチルトリチル基で保護したデオキシリボース誘導体の3位のヒドロキシル基にフォスフォロアミダイトの導入を試みた。acetonitrile (1.0 mL)で共沸した前記実施例4で得た生成物4 (0.22 g, 0.36 mmol)にacetonitrile (3.0 mL)を加えた。反応溶液に2-cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoro-diamidite (0.12 μL, 0.36 mmol)と0.45 M tetrazoleのacetonitrile溶液 (0.80 mL, 0.36 mmol)を加えて、反応溶液を室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで2回抽出し、Sat. NaHCO3 aq.とH2Oで洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を除去した。白色粉末の粗生成物である生成物5 (0.33 g)を得た。この生成物5は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式(9)に示すフォスフォロアミダイト誘導体と同定された。
HRMS (MALDI) cald. for C45H53N2O9Na (MNa+): 819.3387, found: 819.8709.
〔実施例6〕<光応答性ヌクレオチドの合成>
ABI 3400 DNA合成機を用いてb-シアノエチルホスフォアミダイト法により以下のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)をそれぞれ合成した。前記実施例5で得たフォスフォロアミダイト誘導体をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3回共沸した後、さらなる精製をせずにアミダイト試薬として使用した。ODNは得られた反応混合物のアンモニア水溶液を65 °Cで4時間置き、脱保護した。アンモニア水溶液を除去した後、日本分光PU-980、UV-970、HG-980-31による逆相高速液体クロマトグラフィーを通じて精製した。それぞれのODNはApplide Biosystems Voyager-DE-PRO-SFによる質量分析とP1ヌクレアーゼ、アルカリフォスファターゼを用いて酵素分解を行いA、G、C、T、Uの各ヌクレオシドの組成比から下記のとおり塩基配列と分子量が同定された。
ODN1: HRMS (MALDI) calcd for 5'-TGTGCT: [(M-H)-] 1796.3, found 1796.6.
ODN2: HRMS (MALDI) calcd for 5'-cvPhGCGTG: [(M-H)-] 1858.4, found 1858.4.
ODN3: HRMS (MALDI) calcd for 3'-ACACGAACGCAC: [(M+H)+] 3607.4, found 3607.7.
ODN4: HRMS (MALDI) calcd for 3'-ACACGGACGCAC: [(M+H)+] 3625.4, found 3625.7.
なお、ヌクレオチド配列中のcvPhはこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体を示す。
ODN1(10 mM)、ODN2(20 mM)およびODN3(10 mM)をカコジル酸ナトリウム緩衝溶液 (30 ml)に溶解し、トランスイルミネーターを用いて0℃で5時間、366 nmの光照射を行った。光反応生成物をChemcobond 5-ODS-Hカラムを用いHPLC分析した(図2)。溶離液は、30分間にギ酸アンモニウム : アセトニトリル = 97 :3から80 : 20へと移動相の組成を変化させたものを用いた。
次に、光連結体ODN4をP1ヌクレアーゼとアルカリフォスファターゼとSnake Venomを用いて酵素分解を行った。この分解産物の分子量をMALDI-TOF MSで測定した結果、式(10)に示すcvPh-A付加体が検出され、これよりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体はアデニンとクロスリンクすることが確認された。
ODN2(20 mM)とODN5(10 mM)をカコジル酸ナトリウム緩衝溶液 (30 ml)に溶解し、トランスイルミネーターを用いて0℃で5時間、366 nmの光照射を行った。光反応生成物を実施例7と同様にHPLC分析した(図4)。
次に、ODN2/ODN5のTm値、および光連結体ODN6のTm値をJASCO V-550 UV/Vis spectrophotometerで測定した。標準プロトコールに従いそれぞれのODN試料を1.0 °C/minの速度で昇温させ、紫外領域260 nmの吸光度を測定した(図6)。図6に示す吸光度曲線(a)は前者のODN2/ODN5、(b)はODN6をそれぞれ示す。これより前者のTm値は19.0 °Cであったが、後者のTm値は65.3 °Cと、この出願の発明かかるデオキシリボース誘導体によるクロスリンクは核酸の熱的安定性を向上させることを確認した。
実施例6と同様にODN3X (3'-ACACGAXCGCAC-5'、塩基XはA,G,C,Tのいずれかを示す)を作成した。ODN3X(20 mM)とODN2(30 mM)を実施例7と同様に366 nm光照射によりクロスリンクさせた。各ODN3Xの塩基Xの種類とクロスリンク形成効率であるODNの減少率を表1に示す。表1よりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体はアデニンとのクロスリンク形成において高い反応性を示し、シトシン、チミン、グアニンとは反応性が低いことが確認された。
表2よりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体におけるアデニンとのクロスリンク形成においては周辺の塩基配列依存性は認められなかった。
Claims (6)
- Yが式(2)に示すフォスフォロアミダイト基である請求項1のデオキシリボース誘導体を含むことを特徴とする核酸合成用アミダイト試薬。
- XおよびYそれぞれに1塩基以上のヌクレオチド鎖が結合されていることを特徴とする請求項1記載のデオキシリボース誘導体からなる光応答性ヌクレオチド。
- XまたはYのいずれか一方に1塩基以上のヌクレオチド鎖が結合されていることを特徴とする請求項1記載のデオキシリボース誘導体からなる光応答性ヌクレオチド。
- 請求項2の核酸合成用アミダイト試薬を使用することを特徴とする請求項3または4記載の光応答性ヌクレオチドの合成方法。
- 請求項3または4記載の光応答性ヌクレオチドを含む核酸のクロスリンク試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004171928A JP4015136B2 (ja) | 2004-06-09 | 2004-06-09 | フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004171928A JP4015136B2 (ja) | 2004-06-09 | 2004-06-09 | フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005348645A true JP2005348645A (ja) | 2005-12-22 |
JP4015136B2 JP4015136B2 (ja) | 2007-11-28 |
Family
ID=35583612
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004171928A Expired - Fee Related JP4015136B2 (ja) | 2004-06-09 | 2004-06-09 | フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4015136B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012033190A1 (ja) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 光を用いた核酸の増幅抑制方法および高感度な選択的核酸増幅方法 |
WO2014014106A1 (ja) | 2012-07-20 | 2014-01-23 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法 |
-
2004
- 2004-06-09 JP JP2004171928A patent/JP4015136B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012033190A1 (ja) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 光を用いた核酸の増幅抑制方法および高感度な選択的核酸増幅方法 |
WO2014014106A1 (ja) | 2012-07-20 | 2014-01-23 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4015136B2 (ja) | 2007-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2552048B2 (ja) | ヌクレオチド鎖合成用試薬 | |
EP0260032B1 (en) | Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers | |
US5367066A (en) | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites | |
JP3081882B2 (ja) | 還元によるヒドロキシル保護基の直交除去及びオリゴヌクレオチドの化学合成におけるそれらの利用 | |
AU2006317195B2 (en) | Polynucleotide containing a phosphate mimetic | |
EP0466773A4 (en) | Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents | |
JP2011084573A (ja) | 固体支持体上での標識化オリゴヌクレオチドおよびアナログの合成のための方法および組成物 | |
EP2560982A2 (en) | Phosphoramidites for synthetic rna in the reverse direction | |
WO2007064291A1 (en) | Method and compounds for rna synthesis | |
JP2011088935A (ja) | リン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造のための光学活性ヌクレオシド3’−ホスホロアミダイト | |
Zhou et al. | 2-(4-Tolylsulfonyl) ethoxymethyl (TEM)—a new 2′-OH protecting group for solid-supported RNA synthesis | |
JPH03505209A (ja) | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 | |
JP4015136B2 (ja) | フェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体および光応答性ヌクレオチド | |
Haas et al. | A novel entry to 2′-O-aminopropyl modified nucleosides amenable for further modifications | |
JP4550447B2 (ja) | 核酸固相合成用シリルリンカー | |
JP6429264B2 (ja) | ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマー | |
US20040220397A1 (en) | Solid support for the synthesis of 3'-amino oligonucleotides | |
JPH0374239B2 (ja) | ||
CN117264004A (zh) | 一种化合物及核酸合成方法 | |
KR20240005930A (ko) | 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 키메라형 핵산 올리고머 및 그 제조 방법 | |
JP2005350386A (ja) | デオキシウリジン誘導体および光応答性ヌクレオチド | |
Misra et al. | Fluorescent labelling of ribonucleosides at 2′-terminus; Comparative fluorescence studies | |
JP2010509938A (ja) | Rna脱シリル化方法 | |
JPWO2005085271A1 (ja) | 2‘水酸基を修飾された新規人工rna | |
Bogdan | Approaches towards the site-selective incorporation of N (4)-acetylcytidine into oligoribonucleotides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061121 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070220 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070423 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070821 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070912 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100921 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110921 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |