JP2010158178A - 核酸増幅法及びそれを用いた変異型核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】鋳型核酸との結合親和性がプライマーよりも高く、3'側に伸長せず、正常型核酸とは相補的であるが変異型核酸とはミスマッチを含む、増幅阻害オリゴ核酸の存在下で核酸増幅法を行うと共に、アニーリング工程を、高温側から低温側に温度を降下させながら行うことにより、正常型の核酸の増幅が特異的に阻害され、変異型核酸のみが増幅され、その結果、変異型核酸を検出することが可能となる。
【選択図】なし
Description
前記増幅は、前記基本型核酸と前記プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する増幅阻害オリゴ核酸の存在下において行われ、該増幅阻害オリゴ核酸は、
(1) リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含むリボヌクレオチドを含み、
(2)その3'末端がポリメラーゼにより伸長できないように修飾されており、かつ、
(3)前記基本型の塩基配列の部分領域及び/又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含み、
前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸及び前記プライマーとのハイブリダイゼーションを行うアニーリング工程が、前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸とから成る二本鎖核酸の融解温度及び前記鋳型核酸と前記プライマーから成る二本鎖核酸の融解温度の両者を包含する温度範囲において高温側から低温側に温度を下げながら行われる、核酸増幅法を提供する。
(1) リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含むリボヌクレオチドを含み、
(2)その3'末端がポリメラーゼにより伸長できないように修飾されており、かつ、
(3)前記基本型の塩基配列の部分領域及び/又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含むものである。以下、これらについて説明する。
野生型K-ras遺伝子中に変異型K-ras遺伝子を含む遺伝子混合物の増幅
本発明の方法を適用したPCR-RFLPに基づき、K-ras codon 12点突然変異の検出を行った。K-ras codon 12点突然変異は、野生型のK-ras codon 12のggtがgttに変異したものであり、膵癌、大腸癌、肺癌等で高率に出現する点突然変異である。なお、野生型のK-ras遺伝子の部分領域が本発明で言う「基本型核酸」、変異型のK-ras遺伝子の部分領域が本発明で言う「変異型核酸」に該当する。本実施例で増幅した領域の塩基配列を図1及び配列番号1に示す。図1中、大文字で記載されている領域がエクソン、小文字で記載されている領域がイントロンである。なお、図1及び配列番号1に示す配列は、野生型遺伝子の配列であり、変異型遺伝子では、配列番号1中の24nt〜26ntのggtがgttに点突然変異している。
5'-gtaaaacgacggccag-ataaacttgtggtagttggagccg-3'
3'末端から2番目の下線を引いたcは、K-ras遺伝子の部分領域の増幅産物に制限酵素MspIの切断部位を与えるために導入したミスマッチ部位である。このフォワード側プライマーを用いた場合、変異型遺伝子の部分領域の増幅産物には、MspI部位が存在しないが、野生型遺伝子の部分領域の増幅産物にはMspI部位が存在することになるので、RFLPにより変異型遺伝子の検出が可能になる。上記フォワード側プライマーの中央付近のハイフンよりも上流の領域は、K-ras遺伝子とは全く無関係な配列を有し、鋳型とは全くハイブリダイズしない。これは上記したサイズ増大領域であり、MspIにより切断される部位よりも上流の断片のサイズを大きくして電気泳動分離後にこの断片のバンドを検出し易くするものである。また、PCRに用いたリバース側プライマーの塩基配列は、配列番号3に示す通りであり、上記したフォワード側プライマーとこのリバース側プライマーを用いたPCRにより、図1及び配列番号1に示す領域が増幅される(ただし、実際に主として増幅される配列は上記の変異部位を含む変異型のK-ras遺伝子の部分領域である)。
g+ta+gt+tg+ga+gcc+gg+tg
である(右肩に+が付いているヌクレオチドがLNA(登録商標)である)。また、各増幅阻害オリゴ核酸の3'末端はリン酸化し、ポリメラーゼによる伸長ができなくした。なお、3'末端のリン酸化は、常法により、化学合成時にmodified CPGを用い合成することにより行った。
Claims (12)
- 基本型の塩基配列を有する基本型核酸と、該基本型の塩基配列中に変異部位を有する変異型核酸の混合物を鋳型核酸とし、該鋳型核酸中の一部領域を、該鋳型核酸とハイブリダイズする少なくとも1種類のプライマーの伸長反応の繰返しにより増幅する核酸増幅法であって、
前記増幅は、前記基本型核酸と前記プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する増幅阻害オリゴ核酸の存在下において行われ、該増幅阻害オリゴ核酸は、
(1) リボースの2'位の炭素原子と4'位の炭素原子がメチレン鎖を介して架橋された修飾リボースを含むリボヌクレオチドを含み、
(2)その3'末端がポリメラーゼにより伸長できないように修飾されており、かつ、
(3)前記基本型の塩基配列の部分領域及び/又は前記基本型核酸の増幅産物の部分領域と相補的な塩基配列を有するが、前記変異型の塩基配列の部分領域とはミスマッチ部位を含み、
前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸及び前記プライマーとのハイブリダイゼーションを行うアニーリング工程が、前記鋳型核酸と前記増幅阻害オリゴ核酸とから成る二本鎖核酸の融解温度及び前記鋳型核酸と前記プライマーから成る二本鎖核酸の融解温度の両者を包含する温度範囲において高温側から低温側に温度を下げながら行われる、核酸増幅法。 - 前記増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズする領域と、前記プライマーがハイブリダイズする領域とが少なくとも部分的に重複している請求項1記載の核酸増幅法。
- 前記増幅阻害オリゴ核酸がハイブリダイズした二本鎖核酸の融解温度が、前記プライマーがハイブリダイズした二本鎖核酸の融解温度よりも高い、請求項1又は2記載の核酸増幅法。
- 前記プライマーがハイブリダイズする領域に、前記変異部位が含まれない請求項1ないし3のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 前記変異部位は1個の点変異のみである請求項1ないし4のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 前記増幅阻害オリゴ核酸を構成する少なくとも一部のヌクレオチドが、耐ヌクレアーゼ修飾を有するものである請求項1ないし5のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 前記核酸増幅法が、PCR法である請求項1ないし6のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 前記基本型核酸の増幅産物及び前記変異型核酸の増幅産物は、これらのいずれか一方のみが切断される制限酵素部位を有する請求項1ないし7のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 前記プライマーは、前記制限酵素部位を与えるミスマッチ部位を含む請求項8記載の核酸増幅法。
- 前記プライマーは、前記鋳型核酸とハイブリダイズしない無関係な配列から成るサイズ増大領域が5'側に付加されている請求項8又は9記載の核酸増幅法。
- 請求項8ないし10のいずれか1項に記載の核酸増幅法により前記鋳型核酸の一部領域を増幅した後、増幅産物を前記制限酵素で消化し、消化後の核酸断片のサイズに基づき、前記変異型核酸の増幅産物の有無を検出することを含む、前記変異型核酸の検出方法。
- 前記検出は、前記制限酵素で消化した増幅産物を電気泳動にかけ、分離されたバンドを検出することにより行われる請求項11記載の方法。
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