ES2795404T3 - Método y composiciones para reducir productos de amplificación no específicos - Google Patents

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Abstract

Un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla, comprendiendo el método: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana en donde dicha amplificación genera una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir una resolvasa que reconoce una estructura de ADN anormal y escindir dichos productos de amplificación no específicos con la resolvasa para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana, en donde la resolvasa es una de: endonucleasa VII de T4 o endonucleasa I de T7.

Description

DESCRIPCIÓN
Método y composiciones para reducir productos de amplificación no específicos
Campo
Los métodos, composiciones, sistemas y kits descritos en el presente documento se refieren a la amplificación de secuencias de nucleótidos. En particular, los métodos, composiciones, sistemas y kits descritos en el presente documento se refieren a la reducción de productos de amplificación no específicos (por ejemplo, dímeros de cebadores) cuando se amplifican múltiples regiones de nucleótidos diferentes, tal como durante una PCR múltiple, incluida la secuenciación de próxima generación (NGS, de sus siglas en inglés).
Antecedentes
En una reacción de PCR uniplex (en adelante denominada PCR uniplex), la reacción contiene normalmente ADN de plantilla, dos cebadores que flanquean un único sitio de amplificación, una ADN polimerasa termoestable, dNTP y tampón. Los productos de amplificación resultantes, los amplicones, suelen ser los fragmentos de ADN diana. Los productos de amplificación no específicos ocasionales generalmente se eliminan mediante ajuste delicado de las condiciones de p Cr , tales como la temperatura de hibridación, concentración de magnesio o mediante un diseño más estricto de los cebadores.
La PCR múltiple se refiere a la amplificación de una pluralidad de fragmentos de ADN diana simultáneamente en el mismo tubo o pocillo. Esto implica colocar más de un par de cebadores juntos. En aplicaciones prácticas, generalmente se espera que se amplifiquen simultáneamente de decenas a decenas de miles de diferentes tipos de fragmentos de ADN diana en un solo tubo. La PCR múltiple proporciona una simplicidad extraordinaria, rendimiento y ventajas económicas sobre la PCR uniplex cuando se necesitan diferentes fragmentos de ADN para amplificarse juntos en un solo tubo. También se usa con frecuencia cuando se trata de muestras valiosas (por ejemplo, muestras clínicas).
La PCR múltiple ya encuentra amplias aplicaciones en la detección y el diagnóstico clínico de genes y microorganismos en seres humanos, animales, cultivos y plantas, en la autenticación de especies y, más recientemente, en la preparación de muestras y bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (que incluye, pero sin limitación, secuenciación de novo y resecuenciación dirigida). En las pruebas y el diagnóstico de genes, la p Cr múltiple se usa en ensayos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, de sus siglas en inglés), genotipado, variación del número de copias, epigenética, expresión génica y matrices de mutación e hibridación.
La PCR múltiple normalmente requiere colocar juntos una gran cantidad de cebadores a determinadas concentraciones en el mismo volumen. Estos cebadores se acumulan en cantidades muy altas, por ejemplo, hasta microgramos, cuando se usan unos pocos miles de cebadores. Una dificultad de la PCR múltiple es que estos cebadores se pueden hibridar entre sí, lo que lleva a la generación de enormes cantidades de productos de amplificación no específicos. Estos productos de amplificación no específicos generalmente hacen que los fragmentos diana sean indetectables, o simplemente cancelan la producción de los fragmentos diana.
Las técnicas actuales para hacer que la PCR múltiple sea viable a pesar del problema de estas grandes cantidades de cebadores y el 'ruido' de fondo resultante pueden incluir el diseño específico de cebadores dentro de intervalos de parámetros muy estrechos y/o la incorporación de marcadores especiales (por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.586.310 y 8.673.560, describen la modificación de los cebadores mediante el reemplazo de timidinas con uridinas para que los productos no específicos se formen predominantemente a partir del híbrido de cebadores no específico que tienen múltiples uridinas intercaladas a lo largo de su longitud y se puedan dirigir específicamente sobre esta base.), el uso de oligonucleótidos para evitar, o reducir, la formación de dímeros de cebadores (véase, por ejemplo, el documento WO2015063154 A1), y el uso de cebadores específicos de diana dirigidos que están bloqueados en combinación con cebadores universales y una estrategia para activar específicamente cebadores bloqueados (véase, por ejemplo, el documento US20140329245). Todas estas técnicas tienen inconvenientes y limitaciones sustanciales.
Por ejemplo, los métodos para evitar o reducir la formación de artefactos, tales como dímeros de cebadores, durante la amplificación de ácido nucleico que se centran en el proceso de diseño de cebadores y a menudo utilizan paquetes de programas informáticos (por ejemplo, Visual OMP de DNAsoftwares, MultiPLX, Primer Express de ABI, etc.) dedicados para diseñar pares de cebadores que se predice que exhiben una interacción mínima entre los otros cebadores en el grupo durante la amplificación. Mediante el uso de dicho programa informático, los cebadores se pueden diseñar para que sean lo más específicos posible de la diana o del amplicón, y a menudo se agrupan en subconjuntos para minimizar las interacciones cebador-cebador, formación de dímeros de cebadores y superamplicones. Los estrictos parámetros de diseño, sin embargo, limitan el número de amplicones que pueden amplificarse de forma conjunta simultáneamente y, en algunos casos, pueden evitar la amplificación de algunos amplicones por completo. Otros métodos actuales requieren el uso de múltiples grupos de cebadores de PCR para separar los cebadores en grupos no solapados para minimizar o evitar artefactos de cebadores durante la etapa de amplificación. Otros métodos incluyen el uso de múltiples grupos de cebadores o reacciones de una sola unidad para mejorar el rendimiento global del producto de amplificación por reacción.
En una reacción de PCR múltiple, cada par de cebadores compite en la reacción de amplificación con pares de cebadores adicionales por una cantidad finita de dNTP, polimerasa y otros reactivos. Los cebadores pueden estar diseñados para ser más largos que en una PCR uniplex (24-35 bases), con temperaturas de fusión más altas (65 °C o más) y un contenido de GC del 50-60 %, manteniendo una temperatura de fusión similar en todos los cebadores y evitando secuencias complementarias y secuenciación de tres o más G o C en el extremo 3'; la especificidad de cada par de cebadores se valida primero en una PCR uniplex para garantizar que se amplifique un único fragmento diana; la concentración de los pares de cebadores se valora, generalmente de 50 nM a 400 nM para garantizar la uniformidad del rendimiento; los cebadores se separan en grupos no solapados; se determinan concentraciones óptimas de dNTPS, magnesio y de la ADN polimerasa termoestable, que generalmente son más altas que en la PCR uniplex; y la concentración de sal también se valora para optimizar la especificidad de amplificación. Con estos parámetros optimizados, generalmente se amplifican simultáneamente con éxito de 2 a 5 fragmentos diana. A través de un diseño adicional de cebadores asistido por computadora, se han visto en el mercado métodos para amplificar -20 fragmentos diana simultáneamente en el mismo tubo. Debido a la dificultad de mitigar o eliminar los productos no específicos, actualmente solo se amplifican decenas de dianas en las prácticas de diagnóstico de rutina. Estos métodos requieren un diseño cuidadoso de los cebadores y las condiciones de PCR, y no se utilizan como patrón para aplicaciones de diagnóstico general.
Se ha informado que numerosos cebadores internos o estrategias similares amplían el número de dianas para amplificar en la PCR múltiple. Estos métodos pueden o no siempre aliviar la generación de productos no específicos. Además, se requieren más capas de cebadores, estrategias de manipulación y ciclación en estos métodos. Por lo tanto, estos métodos encuentran un uso limitado.
Por lo tanto, existe una necesidad de métodos, composiciones, sistemas, aparatos y kits mejorados que permitan la amplificación selectiva de múltiples moléculas de ácido nucleico diana dentro de una población de moléculas de ácido nucleico mientras se evita, o minimiza, la formación de artefactos (también denominados como productos de amplificación no específicos), incluyendo dímeros de cebadores. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos, composiciones, sistemas, aparatos y kits mejorados que permitan la amplificación selectiva de múltiples moléculas de ácido nucleico diana a partir de una única muestra de ácido nucleico, tal como ADN genómico y/o ADN incluido en parafina fijada en formalina (FFPE, de sus siglas en inglés) mientras se evita, o minimiza, la formación de artefactos. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos, composiciones, sistemas y kits mejorados que permitan la amplificación simultánea de miles de moléculas de ácido nucleico específicas de diana en una única reacción, que se pueden usar en cualquier ensayo o análisis posterior aplicable. Los métodos, composiciones, sistemas y kits descritos en el presente documento pueden abordar los problemas y limitaciones discutidos anteriormente.
El documento WO 2005/095605 describe un proceso para reducir el número de emparejamientos incorrectos en polinucleótidos bicatenarios.
M.FUHRMANN et al. "Removal of mismatched bases from synthetic genes by enzymatic mismatch cleavage", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 33, n.° 6, 23 de marzo de 2005 (23-03-2005), páginas e58-e58, describe una estrategia para eliminar las variantes de secuencia no deseadas de los productos de síntesis génica primarios.
El documento WO 2006/127423 describe métodos para ensamblar construcciones de ácido nucleico a partir de componentes.
El documento WO 2012/149438 describe métodos y composiciones para PCR múltiple.
Sumario de la divulgación
En general, en el presente documento se describen métodos, composiciones, sistemas y kits para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla. Estos métodos, composiciones, sistemas y kits pueden ser útiles en cualquier reacción en la que se pueden usar una pluralidad de cebadores y pueden generar productos de hibridación y/o amplificación no específicos, incluidos los denominados "dímeros de cebadores". Por ejemplo, los métodos, composiciones, sistemas y kits descritos en el presente documento pueden ser particularmente adecuados para su uso con PCR multiplexada y secuenciación de próxima generación.
La invención proporciona un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla, comprendiendo el método: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana en donde dicha amplificación genera una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir una resolvasa que reconoce una estructura de ADN anormal y escindir dichos productos de amplificación no específicos con la resolvasa para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana, en donde la resolvasa es una de: endonucleasa VII de T4 o endonucleasa I de T7.
Los métodos, composiciones, sistemas y kits descritos en el presente documento surgen del hallazgo novedoso e inesperado de que las resolvasas, y particularmente la endonucleasa VII de T4 y/o la endonucleasa I de T7, pueden usarse para escindir de manera efectiva y eficaz productos de amplificación no específicos, dejando la proporción sustancial de productos de amplificación específicos de diana en la misma mezcla de reacción durante o después de la amplificación (por ejemplo, amplificación múltiple) en la que se usa un exceso de una pluralidad de pares de cebadores por ejemplo, > 10, > 100, > 1000, > 10.000, etc.). Sin comprometerse a ninguna teoría particular de la operación, los métodos, composiciones, sistemas y kits descritos en el presente documento son inesperadamente eficaces porque se dirigen a sitios anormales (por ejemplo, estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN o ADN que no coinciden perfectamente). Dichos sitios anormales son una característica de la gran mayoría de productos de amplificación no específicos en una amplificación múltiple y, sorprendentemente, mediante la direccionalidad a estos sitios anormales, una amplificación multiplexada puede escindirse significativamente mientras se deja inalterado un porcentaje sustancial de productos de amplificación específicos de diana.
Por ejemplo, un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla puede incluir: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana en donde dicha amplificación genera una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir una resolvasa que reconoce una estructura de ADN anormal y escindir dichos productos de amplificación no específicos con la resolvasa para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana. Puede usarse cualquier resolvasa apropiada. En particular, la resolvasa puede ser uno de: endonucleasa VII de T4 o endonucleasa I de T7. En algunos ejemplos, la resolvasa es endonucleasa VII de T4.
Por ejemplo, un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla puede incluir: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana para formar una mezcla que comprende una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir una resolvasa en la mezcla que reconoce una estructura de ADN anormal y escindir la pluralidad de productos de amplificación no específicos con la resolvasa para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana, en donde la resolvasa es una de: endonucleasa VII de T4 o endonucleasa I de T7; y eliminar los productos de amplificación no específicos escindidos, dejando la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana.
Un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla puede incluir: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana para formar una mezcla que comprende una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir una endonucleasa VII de T4 en la mezcla, en donde la endonucleasa VII de T4 reconoce una estructura de ADN anormal en los productos de amplificación no específicos; escindir la pluralidad de productos de amplificación no específicos con la endonucleasa VII de T4 para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene más de un 50 % de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana; y eliminar los productos de amplificación no específicos escindidos, dejando la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana.
En cualquiera de estos métodos, después de la amplificación de los polinucleótidos y la escisión con una resolvasa, se puede usar una ADN ligasa para sellar cualquier muesca incurrida en las dianas específicas (y, no consecuentemente, los productos no específicos), y se puede realizar una o más rondas de PCR para amplificar las dianas. En dichos casos, la primera pluralidad de pares de cebadores específicos de diana puede contener al menos parte de la secuencia de los segundos cebadores de PCR.
Por ejemplo, un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla puede incluir: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana para formar una mezcla que comprende una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir una resolvasa en la mezcla que reconoce una estructura de ADN anormal y escindir la pluralidad de productos de amplificación no específicos con la resolvasa para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana, en donde la resolvasa es una de: endonucleasa VII de T4 o endonucleasa I de T7; eliminar los productos de amplificación no específicos escindidos, dejando la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana; reparar muescas en los productos de amplificación específicos de diana con una ADN ligasa; y volver a amplificar los productos de amplificación específicos de diana.
En cualquiera de estos métodos, el método también puede incluir la eliminación de los productos de amplificación no específicos escindidos, dejando la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana.
Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede incluir el análisis de los productos de amplificación específicos de diana. El análisis puede incluir cualquier método o técnica apropiados, que incluye, pero sin limitación, secuenciación, tal como la reacción de secuenciación de próxima generación.
La amplificación puede incluir cualquier técnica de amplificación de polinucleótido apropiada, que incluye, en particular, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés) múltiple.
En general, los ácidos nucleicos diana pueden comprender ADN o ARN, por ejemplo, ADN genómico o ADNc.
Los cebadores específicos de diana pueden comprender cualquier pluralidad apropiada de pares, tales como 10 pares o más (por ejemplo, al menos 10 pares) de cebadores específicos de diana, entre 10 pares y 100.000 pares, entre 10 pares y 1000 pares, entre 1.000 pares a 100.000 pares, más de 100.000 pares de cebadores específicos de diana, etc.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la resolvasa reconoce una estructura nucleotídica anormal (por ejemplo, ADN). En particular, la resolvasa reconoce una estructura polinucleotídica anormal que comprende al menos una de las estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN o ADN que no coinciden perfectamente.
Cualquiera de estos métodos puede incluir realizar una reparación de extremos en la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos, ya sea antes o después de la introducción y/o tratamiento con la resolvasa. Por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede incluir realizar una reparación de extremos en la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos antes de la introducción de la resolvasa.
Cualquiera de estos métodos puede incluir adaptadores de unión a la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana después de la introducción de la resolvasa. Los adaptadores pueden comprender al menos tres fosforotioatos consecutivos.
Como se ha mencionado, cualquiera de estos métodos puede incluir escindir dichos productos de amplificación no específicos con una exonucleasa. Por ejemplo, cualquiera de estos métodos puede incluir escindir dichos productos de amplificación no específicos con una exonucleasa, que comprende al menos una de exonucleasa lambda o exonucleasa I de E. coli, después de realizar una reparación de extremos y una unión del adaptador en la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos.
El tratamiento con la resolvasa se puede realizar en cualquier condición apropiada (por ejemplo, concentración de resolvasa, tiempo de tratamiento, temperatura, etc.). En general, la escisión de dichos productos de amplificación no específicos con la resolvasa puede incluir la exposición de los productos de amplificación no específicos y la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana a entre aproximadamente 0,2 unidades (U) y 1000 U de una o más resolvasas durante entre aproximadamente 0,5 minutos y 60 minutos (por ejemplo, 0,5 minutos a 30 minutos, 20 minutos, 15 minutos, etc.) a entre 10 °C y 40 °C (por ejemplo, más particularmente entre 16 °C y 37 °C).
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el tratamiento con resolvasa puede valorarse de modo que se mantenga en la mezcla una proporción sustancial predeterminada de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana. La proporción sustancial de la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana puede comprender un 30 % o más (y/o mayor que 30 %), 40 % o más (y/o mayor que 40 %), 50 % o más (y/o mayor que 50 %), 60 % o más (y/o mayor que 60 %), 70 % o más (y/o mayor que 70 %), 80 % o más (y/o mayor que 80 %), 90 % o más (y/o mayor que 90 %), 95 % o más (y/o mayor que 95 %) de la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana. Por lo tanto, la reacción con resolvasa se puede realizar, pero se detiene para evitar la escisión sustancial del producto de amplificación específico de diana. Esto puede ajustarse mediante el ajuste de las condiciones de tratamiento con resolvasa como se discutió anteriormente (por ejemplo, aproximadamente 0,2 unidades (U) y 1000 U de una o más resolvasas durante aproximadamente entre 0,5 minutos y 60 minutos, por ejemplo, 0,5 minutos a 30 minutos, 20 minutos, 15 minutos, etc., a entre 10 °C y 40 °C, por ejemplo, más particularmente entre 16 °C y 37 °C). Las condiciones apropiadas del tampón de resolvasa pueden usarse como se describe en el presente documento.
También se describen en el presente documento kits para realizar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un kit para una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla que elimina selectivamente productos de amplificación no específicos puede incluir: una polimerasa; una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana; un tampón de amplificación; un tampón de resolvasa; al menos una resolvasa que reconoce y corta un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal; e instrucciones para el uso de dicho kit para eliminar productos de amplificación no específicos de una reacción de amplificación después de la amplificación usando la resolvasa. Cualquiera de estos kits puede incluir al menos un adaptador de ácido nucleico, que incluye al menos un adaptador de ácido nucleico que comprende al menos tres fosforotioatos.
Como se ha mencionado anteriormente, los cebadores específicos de diana en el kit pueden comprender al menos 10 pares de cebadores específicos de diana (10 o más, 100 o más, 1000 o más, 10.000 o más, entre 10 y 100.000, entre 10 y 10.000, entre 10 y 1000, entre 100 y 100.000, entre 100 y 10.000, entre 100 y 1000, entre 1000 y 100.000, entre 1000 y 10.000, etc.). Por ejemplo, el kit puede incluir aproximadamente 1.000 a aproximadamente 100.000 cebadores específicos de diana. En algunas variaciones, el kit incluye más de 100.000 cebadores específicos de diana.
El kit puede incluir cualquier resolvasa apropiada que reconozca una estructura polinucleotídica (por ejemplo, ADN) anormal, tal como una estructura polinucleotídica anormal que comprenda al menos una de estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN o ADN que no coinciden perfectamente. Por ejemplo, la resolvasa puede ser endonucleasa VII de T4.
Cualquiera de los kits descritos en el presente documento también puede incluir una o más exonucleasas para escindir los productos de amplificación no específicos. Por ejemplo, un kit puede incluir una exonucleasa para escindir los productos de amplificación no específicos en donde la exonucleasa comprende exonucleasa lambda o exonucleasa I de E. coli.
También se describen en el presente documento métodos para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla que incluyen las etapas de: amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana para formar una mezcla que comprende una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; introducir en la mezcla una proteína que reconoce y se une a un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal para eliminar dichos productos de amplificación no específicos mientras se mantiene una proporción sustancial de la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana, en donde dicha estructura de ADN anormal comprende al menos una de estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN o ADN que no coinciden perfectamente.
En particular, la proteína que reconoce y se une a un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal puede ser MutS. En general, la proteína que reconoce y se une a un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal puede unirse a un sustrato. Como se detalla en el presente documento, una enzima que se usa para absorber pero no escindir los productos de amplificación no específicos puede ser cualquier MutS de diferentes especies, o endonucleasa V humana. Una enzima preferida es MutS de E. coli, o una mezcla de MutS de E.coli y T. aquaticus, y la endonucleasa V humana.
Como se ha mencionado anteriormente, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede incluir el análisis de los productos de amplificación específicos de diana, por ejemplo, mediante secuenciación (por ejemplo, reacción de secuenciación de próxima generación).
En general, la amplificación puede incluir realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple. Los ácidos nucleicos diana pueden comprender ADN y/o ARN. Los ácidos nucleicos diana son ADN genómico o ADNc. Se puede usar cualquier número apropiado de cebadores específicos de diana (por ejemplo, más de 10, 100, 1000, 10.000, 100.000, etc.).
Como se ha mencionado, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento también puede incluir realizar una reparación de extremos en la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos antes de la introducción de la proteína que reconoce y se une a un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal. Cualquiera de estos métodos puede incluir adaptadores de unión a la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana después de la introducción de la proteína que reconoce y se une a un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal. Los adaptadores pueden incluir al menos tres fosforotioatos consecutivos.
La etapa de introducir una proteína que reconoce y se une a un polinucleótido que tiene una estructura de ADN anormal puede incluir incubar los productos de amplificación no específicos y la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana para cualquier tiempo y condiciones de incubación apropiados, tales como entre aproximadamente 0,5 minutos y 60 minutos (por ejemplo, 0,5 minutos y 40 minutos, 0,5 minutos y 30 minutos, 0,5 minutos y 20 minutos, etc.) a entre aproximadamente 10 °C y 40 °C 9 (por ejemplo, entre 15 °C y 37 °C, 20 °C y 40 °C, etc.).
Los métodos para reducir productos de amplificación no específicos en una reacción de amplificación, tal como una PCR múltiple descrita en el presente documento, pueden incluir cualquier composición apropiada de una reacción de amplificación, que puede ser cualquier reacción que utilice una pluralidad de cebadores de ADN. La reacción de PCR múltiple puede ser cualquier PCR múltiple conocida en el campo. De manera más específica, la plantilla puede ser ADN de cualquier fuente; se puede usar cualquier ADN polimerasa termófila, y sin limitación, se puede emplear cualquier pH funcional, concentración de sal, aditivos, concentración de dNTP, cebadores y cualquier número de pares de cebadores de 10 a más de 100.000 (o más). También se puede emplear cualquier número funcional de ciclos de la reacción de amplificación de 2 a más de 30, dependiendo del número de pares de cebadores utilizados. En algunos casos, los productos de amplificación no específicos generados a partir de reacciones de amplificación, tales como en una PCR múltiple, se pueden reducir de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 50 % de la cantidad total de productos de amplificación siguiendo los métodos, y/o utilizando los kits, descritos en el presente documento y en mayor detalle a continuación. Como se detalla en el presente documento, una enzima ("resolvasa") que se usa para escindir los productos de amplificación no específicos puede ser una cualquiera de las enzimas específicas de estructuras de ADN anormales definidas. Una enzima preferida, pero no limitante, es la endonucleasa I de T7 o la endonucleasa VII de T4.
En general, una resolvasa es una enzima o colección de enzimas que reconoce específicamente una estructura de ADN anormal y corta en o cerca de la estructura de ADN anormal. Por lo tanto, una resolvasa puede denominarse como una enzima específica de estructuras de ADN anormales (genéricamente denominada en el presente documento como resolvasa) y puede escindir los productos de amplificación no específicos en o cerca de las estructuras de ADN anormal en el polinucleótido. Las estructuras de ADN anormales pueden incluir al menos una de estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN u otros ADN que no coinciden perfectamente. Pueden incluir además estructuras que comprenden más de dos cadenas de fragmentos de ADN monocatenario. Se pueden añadir cebadores o ADN de plantilla de cebador sin emparejamiento de bases significativo. Una enzima específica de estructuras de ADN anormales preferida es la endonucleasa I de T7 o la endonucleasa VII de T4. Otras enzimas que pueden ser resolvasa (o pueden usarse como parte de un cóctel de enzimas que actúan como resolvasas) pueden incluir: resolvasas de uniones de Holliday, Ser-recombinasas, Tyr-recombinasas, Cre recombinasas, Hin recombinasa, integrasas, recombinasa A (Rec A), etc. Se pueden usar una o más (por ejemplo, combinaciones) de estas.
Como se detalla en el presente documento, después de la escisión enzimática, los productos de amplificación no específicos escindidos se pueden eliminar mediante purificación (mediante cualquier método de purificación común con selección de tamaño, tal como perlas AMPure o filtración en columna) o, como alternativa, no eliminarse. Además, y como se describe en el presente documento, las muescas en los productos de amplificación específicos pueden rellenarse adicionalmente, por ejemplo, usando una cualquiera de las siguientes enzimas: ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, Ampligase®, etc. A continuación, los productos de amplificación específicos se pueden amplificar adicionalmente mediante PCR, particularmente cuando se usan cebadores internos en la reacción de amplificación.
Adicionalmente, después de la amplificación y antes de la escisión enzimática, los productos de amplificación se pueden reparar por los extremos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Se pueden añadir adaptadores en ambos extremos de dichos productos de amplificación específicos reparados por el extremo mediante unión. La ligasa utilizada es una combinación de ADN ligasa de T4 y uno de los siguientes: ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, Ampligase®, etc. Los adaptadores pueden contener fosforotioatos en el extremo 3' o 5', o biotina, u otros grupos químicos o proteínas que evitan a los adaptadores la digestión de las exonucleasas. Después de la unión de los adaptadores, los productos de amplificación no específicos escindidos se pueden digerir adicionalmente mediante exonucleasas conocidas por los expertos en la materia. Después de la digestión de los productos de amplificación no específicos escindidos con exonucleasas, los productos de amplificación específicos unidos al adaptador se pueden amplificar adicionalmente mediante PCR.
Por lo tanto, se divulga un método para generar una reacción de amplificación que tiene productos de amplificación no específicos reducidos y puede incluir: proporcionar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un ácido nucleico diana; amplificar al menos un ácido nucleico diana utilizando cebadores específicos de diana en donde la amplificación genera una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos; e introducir una enzima específica de estructuras de ADN anormales para escindir los productos de amplificación no específicos para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana.
Como se ha mencionado, cualquiera de estos métodos puede implicar además eliminar los productos de amplificación no específicos escindidos. La enzima específica de estructuras de ADN anormales (resolvasa) puede escindir los productos de amplificación no específicos en estructuras de ADN anormales. Las estructuras de ADN anormales pueden incluir al menos una de estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN u otros ADN que no coinciden perfectamente. Pueden incluir además estructuras que comprenden más de dos cadenas de fragmentos de ADN monocatenario. Se pueden añadir cebadores o ADN de plantilla de cebador sin emparejamiento de bases significativo. Una enzima específica de estructuras de ADN anormales preferida es la endonucleasa I de T7 o la endonucleasa VII de T4.
Los métodos descritos en el presente documento pueden implicar la combinación de los productos de amplificación no específicos escindidos con una exonucleasa. La exonucleasa puede ser al menos una de exonucleasa lambda o exonucleasa I de E. coli. Además, el método puede implicar, antes de la combinación de los productos de amplificación no específicos escindidos con la exonucleasa, que los productos de amplificación específicos de diana estén protegidos de la escisión mediante la exonucleasa. La protección puede implicar adaptadores de unión a ambos extremos de dichos productos de amplificación específicos de diana. Los adaptadores pueden incluir al menos tres fosforotioatos consecutivos. Opcionalmente, los al menos tres fosforotioatos consecutivos incluirán tres, cuatro, cinco o seis fosforotioatos consecutivos. Adicionalmente, el método puede implicar la unión que se realiza mediante la ADN ligasa de T4. Adicionalmente, la unión puede implicar además al menos una de ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, o Ampligase®.
Como se ha mencionado, se describen kits para eliminar productos de amplificación no específicos a partir de una reacción de amplificación. Un kit puede incluir al menos una enzima específica de estructuras de ADN anormales (resolvasa); un tampón; e instrucciones para el uso del kit para eliminar productos de amplificación no específicos de dicha reacción de amplificación. El kit puede incluir al menos un adaptador de ácido nucleico. El al menos un adaptador de ácido nucleico puede incluir al menos tres fosforotioatos. Adicionalmente, los al menos tres fosforotioatos pueden incluir tres, cuatro, cinco o seis fosforotioatos. Los al menos tres fosforotioatos pueden ser consecutivos. El kit puede incluir además reactivos para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple, en donde los reactivos incluyen al menos un tampón, dNTP, una ADN polimerasa y, opcionalmente, al menos un par de cebadores específicos de diana. El al menos un par de cebadores específicos de diana puede incluir al menos 10 pares de cebadores específicos de diana. Adicionalmente, el kit puede incluir al menos una exonucleasa. La al menos una exonucleasa puede incluir la exonucleasa lambda o la exonucleasa I de E. coli.
Un kit para eliminar productos de amplificación no específicos de una reacción de amplificación puede incluir al menos una proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN; un tampón; e instrucciones para el uso del kit para eliminar productos de amplificación no específicos de la reacción de amplificación. La proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN puede ser, por ejemplo, MutS.
En el presente documento se divulgan enzimas específicas de estructuras de ADN anormales para su uso en la reducción de productos de amplificación no específicos en una reacción de amplificación. La enzima específica de estructuras de ADN anormales puede escindir los productos de amplificación no específicos en las proximidades del inicio de las estructuras de ADN anormales o en las estructuras de a Dn anormales. Las estructuras de ADN anormales pueden incluir al menos una de estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN u otros ADN que no coinciden perfectamente. Pueden incluir además estructuras que comprenden más de dos cadenas de fragmentos de ADN monocatenario. Se pueden añadir cebadores o ADN de plantilla de cebador sin emparejamiento de bases significativo. La enzima específica de estructuras de ADN anormales puede ser la endonucleasa I de T7 o la endonucleasa VII de T4.
Breve descripción de los dibujos
Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones que siguen. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:
La Figura 1 ilustra esquemáticamente un método de la presente divulgación para eliminar productos no específicos generados en PCR múltiple mediante la escisión de productos de amplificación no específicos que tienen estructuras polinucleotídicas anormales.
La Figura 2 muestra otro ejemplo de un método de la presente divulgación para eliminar productos no específicos generados en amplificación múltiple mediante absorción de productos de amplificación no específicos que tienen estructuras polinucleotídicas anormales.
La Figura 3 ilustra otro ejemplo de un método de la presente divulgación para obtener productos de amplificación de polinucleótidos diana a partir de una reacción de amplificación múltiple.
La Figura 4 muestra otro posible método para obtener fragmentos de ADN diana a partir de una reacción de amplificación múltiple como se describe en el presente documento.
La Figura 5 ilustra un método alternativo de la presente divulgación para obtener productos de amplificación diana a partir de una reacción de amplificación múltiple.
La Figura 6A es un gráfico que muestra los resultados de un ejemplo de valoración de una resolvasa (en este ejemplo, endonucleasa VII de T4) a diversos parámetros de tratamiento (por ejemplo, unidades de resolvasa durante 10 minutos a 37 °C).
La Figura 6B es un gráfico que muestra la cantidad restante de productos de amplificación no específicos en una curva de valoración similar a la mostrada en la Figura 6A (donde los productos de amplificación no específicos se denominan "dímeros de cebadores").
Las Figuras 7A y 7B son gráficos que ilustran la evolución temporal de una resolvasa (en este ejemplo, endonucleasa VII de T4) en diferentes condiciones de tratamiento (1 U, 5 U, 10 U, a 37 °C) que pueden usarse para encontrar la condición óptima para eliminar productos de amplificación no específicos de una mezcla de reacción de amplificación multiplexada.
La Figura 8A ilustra un ejemplo de una reacción de amplificación múltiple que muestra un fondo normal resultante de productos de amplificación no específicos. En este ejemplo, los productos de amplificación no específicos superan a los productos de amplificación específicos deseados ("dianas").
La Figura 8B ilustra esquemáticamente el método de reducción de productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla mediante el tratamiento con una resolvasa (por ejemplo, endonucleasa VII de T4) para eliminar selectivamente los productos de amplificación no específicos mediante el corte sitios anormales en los productos de amplificación no específicos.
Las Figuras 8C y 8D muestran un ejemplo que ilustra la eficacia del método de reducción de productos de amplificación no específicos mediante el tratamiento con una resolvasa para eliminar selectivamente los productos de amplificación no específicos; La Figura 8C muestra los resultados antes del tratamiento con resolvasa, y la Figura 8D muestra los resultados después del tratamiento, ilustrando la eliminación de productos de amplificación no específicos generados en una reacción de amplificación múltiple con 207 pares de cebadores.
Las Figuras 9A y 9B muestran otros ejemplos de eliminación de productos de amplificación no específicos generados en una reacción de amplificación múltiple con 207 pares de cebadores largos; La Figura 9A ilustra los resultados antes del tratamiento con resolvasa y la Figura 9B muestra los resultados después del tratamiento y degradación de productos de amplificación no específicos.
Las Figuras 10A-10F ilustran el uso de varias ADN polimerasas con los métodos descritos en el presente documento para eliminar productos de amplificación no específicos de una reacción de amplificación múltiple (en este ejemplo, usando 207 pares de cebadores).
La Figura 11 es un gráfico que ilustra el efecto de aumentar la concentración global de pares de cebadores en el rendimiento general del amplicón diana que muestra que una concentración global más alta dio como resultado rendimientos más altos mientras se trata de manera eficaz mediante los métodos para eliminar los productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento. En este ejemplo, se usaron 207 pares de cebadores.
La Figura 12 es un gráfico que ilustra el efecto la duración de la extensión y la hibridación para la amplificación múltiple (nuevamente usando 207 pares de cebadores) con los métodos para eliminar los productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento.
La Figura 13 ilustra un ejemplo del método para eliminar los productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento en una reacción de amplificación (PCR) múltiple que implica 2915 pares de cebadores.
La Figura 14 es otro ejemplo del método para eliminar los productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento en una reacción de amplificación (por ejemplo, PCR) múltiple que implica 16000 pares de cebadores.
La Figura 15 ilustra un ejemplo de una reacción de amplificación múltiple con 207 pares de cebadores usando ADN incluido en parafina fijada en formalina (FFPE) de cáncer de mama humano.
La Figura 16 ilustra los resultados de un ejemplo experimental fallido de amplificación múltiple usando 207 pares de cebadores fosforilados como se describe a continuación.
La Figura 17 muestra un ejemplo de los resultados de hacer una biblioteca (por ejemplo, para secuenciación) usando amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento (en este ejemplo, usando 207 pares de cebadores).
La Figura 18 ilustra otro ejemplo de un método para hacer una biblioteca (por ejemplo, para secuenciación) usando amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento (en este ejemplo, usando 2915 pares de cebadores).
La Figura 19 ilustra otro ejemplo de un método del método para hacer una biblioteca (por ejemplo, para secuenciación) usando amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento (en este ejemplo, usando 207 pares de cebadores). La Figura 20 ilustra otro ejemplo de un método del método para hacer una biblioteca (por ejemplo, para secuenciación) usando amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento (en este ejemplo, usando 207 pares de cebadores largos).
La Figura 21A ilustra esquemáticamente un método para hacer una biblioteca (por ejemplo, para secuenciación). La Figura 21B ilustra los resultados de un método tal como el que se muestra en la Figura 21A para hacer una biblioteca usando amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento usando 16000 pares de cebadores largos.
La Figura 22 muestra una tabla (también denominada en el presente documento Tabla 1) que ilustra la confirmación de calidad basada en la secuenciación de una biblioteca realizada utilizando el método descrito en el presente documento utilizando amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos (en este ejemplo, utilizando 207 pares de cebadores).
La Figura 23 es una tabla (referida en el presente documento como Tabla 2) que ilustra la confirmación de calidad basada en los resultados de secuenciación de una biblioteca (generada con 207 pares de cebadores largos) de un método de uso de amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento.
La Figura 24 es una tabla (referida en el presente documento como Tabla 3) que ilustra la confirmación de calidad basada en los resultados de secuenciación de una biblioteca (generada con 16000 pares de cebadores) de un método de uso de amplificación múltiple y tratamiento con resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos como se describe en el presente documento.
Descripción detallada
En general, en el presente documento se describen métodos, composiciones, sistemas y kits que se pueden usar para amplificar o mejorar la amplificación de productos de amplificación específicos de diana mediante la reducción de productos de amplificación no específicos (por ejemplo, dímeros de cebadores) cuando se amplifican múltiples regiones nucleotídicas diferentes. Estos métodos, composiciones, sistemas y kits normalmente incluyen, o incluyen el uso de, una o más resolvasas que reconocen y se unen a y/o cortan una estructura de ADN anormal.
Por ejemplo, los métodos proporcionados en el presente documento se pueden usar para la mejora de los protocolos de amplificación múltiple (por ejemplo, PCR) o cualquier otro método que implique una pluralidad de oligonucleótidos o cebadores de ADN. Más particularmente, los métodos proporcionados en el presente documento se pueden usar para reducir productos de amplificación no específicos en protocolos de PCR múltiple o cualquier otro método que implique una pluralidad de oligonucleótidos o cebadores de ADN. Los métodos divulgados en el presente documento proporcionan protocolos optimizados para realizar reacciones de PCR múltiple de modo que se eliminan productos de amplificación no específicos y se conservan amplicones de ADN diana. En general, los métodos pueden relacionarse con métodos mejorados de preparación de bibliotecas de ácido nucleico.
En un aspecto, los métodos proporcionan la reducción de productos de amplificación no específicos de una reacción de amplificación. El método puede implicar proporcionar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un ácido nucleico diana. Los ácidos nucleicos pueden ser ARN o ADN. El ADN puede ser ADN genómico o ADNc o cualquier combinación de los mismos. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario. El ADN puede proceder de una célula eucariota, una célula arquea, una célula bacteriana, una célula micobacteriana, un bacteriófago, un ADN vírico o un ARN vírico, o convertirse a partir de ARN. En algunos casos, el ADN puede proceder de un mamífero. En algunos casos, el ADN puede proceder de un ser humano. El ADN puede estar sin modificar o se puede modificar (por ejemplo, metilado, glucosilado, etc.). Los ácidos nucleicos se pueden usar en una reacción de amplificación. Los ácidos nucleicos utilizados en la reacción de amplificación pueden comprender al menos una secuencia de ácido nucleico diana. Una secuencia de ácido nucleico diana generalmente se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está dirigida y enriquecida, por ejemplo, con cebadores específicos de diana, en una mezcla de ácidos nucleicos. La reacción de amplificación puede ser cualquier método que implique hibridar una pluralidad de oligonucleótidos o cebadores de ADN con sus dianas correspondientes. La amplificación puede ser una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En un ejemplo, la reacción de amplificación es una PCR múltiple. En otros ejemplos, las reacciones de amplificación pueden ser amplificación por extensión de unión, PCR múltiple interna, amplificación de genoma completo, amplificación de exón completo o reacciones de amplificación isotérmica con más de un par de oligonucleótidos, etc. Sirviendo como ejemplo, la PCR múltiple proporciona la amplificación simultánea de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en un solo recipiente (es decir, tubo, pocillo, vial y similares) para generar una pluralidad de amplicones. La PCR múltiple generalmente implica el uso de una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana que pueden enriquecer selectivamente una pluralidad de ácidos nucleicos diana. La pluralidad de pares de cebadores específicos de diana puede ser de menos de 10 pares de cebadores a más de 100.000 pares de cebadores. En un caso, la pluralidad de pares de cebadores específicos de diana comprende al menos 10 pares de pares de cebadores específicos de diana. En otro caso, la pluralidad de pares de cebadores específicos de diana comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pares de cebadores. En otro caso, la pluralidad de pares de cebadores específicos de diana comprende de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 pares de cebadores. En otro caso más, la pluralidad de pares de cebadores específicos de diana comprende de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 100.000 pares de cebadores. En un caso adicional, la pluralidad de pares de cebadores específicos de diana comprende más de 100.000 pares de cebadores.
Los cebadores pueden comprender enlaces fosfodiéster y/o bases no modificadas, o enlaces fosfodiéster y/o bases modificadas, extremos 5' no protegidos o extremos 5' protegidos, extremos 5' fosforilados o 5' no fosforilados. Los pares de cebadores se pueden diseñar de modo que la longitud del amplicón pueda ser de menos de 100 a más de 1000 pares de bases. Las reacciones de PCR múltiple según lo previsto en esta divulgación se pueden realizar mediante ADN polimerasas termoestables comúnmente usadas en reacciones de PCR. Las ADN polimerasas termoestables pueden ser de tipo silvestre, pueden tener actividad de exonucleasa 3'-5', 5'-3' o ambas 3'-5' y 5'-3', o pueden ser una mezcla de polimerasas termoestables para una mayor exactitud, o pueden sintetizar amplicones largos, o tener una velocidad de síntesis más rápida. Un ejemplo de una ADN polimerasa termoestable adecuada puede ser la ADN polimerasa Taq. El perfil térmico (temperatura y tiempo) para la PCR se puede optimizar, la concentración del cebador también se puede optimizar para lograr el mejor rendimiento. Finalmente, se puede usar cualquier aditivo que pueda promover la amplificación óptima de amplicones. Estos aditivos incluyen, sin limitación, dimetilsulfóxido, betaína, formamida, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40, N-óxido de 4-metilmorfolina, cloruro de tetrametilamonio, 7-deaza-2'-desoxiguanosina, L-prolina, albúmina sérica bovina, trehalosa y proteína del gen 32 de T4.
Los métodos descritos en el presente documento pueden implicar la amplificación de un ácido nucleico diana usando cebadores específicos de diana en donde la etapa de amplificación genera una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos. Las reacciones de PCR múltiple pueden generar una pluralidad de productos de amplificación que comprenden una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos. En algunos casos, la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana pueden ser los productos de amplificación más abundantes en la reacción de amplificación (es decir, más de un 50 % de los productos de reacción de amplificación) y en otros casos, la pluralidad de productos de amplificación no específicos puede ser los productos de amplificación más abundantes en la reacción de amplificación. En algunos casos, puede ser deseable eliminar o reducir los productos de amplificación no específicos para generar una reacción de amplificación que tenga productos de amplificación no específicos reducidos (es decir, de modo que los productos de amplificación específicos de diana sean el producto de amplificación más abundante en la amplificación reacción).
Los productos de amplificación no específicos son a menudo un subproducto indeseable de una reacción de PCR múltiple que puede frustrar la capacidad de analizar productos de amplificación específicos de diana en una reacción de amplificación. La formación de productos de amplificación no específicos puede depender del número de pares de cebadores utilizados en la reacción de PCR múltiple. La formación de productos de amplificación no específicos en una reacción de amplificación puede ser un proceso complejo que puede depender de una serie de factores que incluyen: el número de pares de cebadores utilizados, la temperatura de la reacción, la concentración de sal en la reacción, la longitud de los cebadores, el contenido de GC de los cebadores, formación de estructura secundaria y competencia entre la unión cebador-cebador y la unión cebador-plantilla. En los primeros ciclos de la PCR múltiple, los productos de amplificación no específicos se forman primero mediante hibridación parcial entre cebadores, o hibridación parcial entre cebador-ADN de plantilla, o mediante la agregación de cebadores y/o ADN de plantilla y cebador sin emparejamiento de bases significativo. En estas primeras etapas de la PCR múltiple, estos productos de amplificación no específicos pueden contener regiones de a Dn que no coinciden perfectamente como partes de sus estructuras (es decir, las porciones parcialmente hibridadas contienen estructuras de ADN que no coinciden perfectamente, siendo las porciones recién sintetizadas ADN bicatenario perfectamente coincidente). En los ciclos posteriores de la PCR múltiple, estas regiones que no coinciden perfectamente se convierten en ADN bicatenario perfectamente coincidente (es decir, las estructuras completas de productos de amplificación no específicos se convierten en ADN bicatenario perfectamente emparejado con bases).
Sorprendentemente, el inventor ha determinado que dentro de un número limitado de ciclos de PCR (es decir, 8-28 ciclos), los productos de amplificación no específicos se pueden reducir mediante el tratamiento de los productos de PCR múltiple con endonucleasa VII de T4 en condiciones que favorecen la escisión de estructuras de ADN anormales. La endonucleasa VII de T4 y la endonucleasa I de T7, así como otras, pertenecen a un grupo de enzimas que tienen un amplio espectro de sustratos. Se ha informado en una serie de publicaciones que la endonucleasa VII de T4 y la endonucleasa I de T7 reconocen una variedad de estructuras de ADN anormales que se desvían del ADN bicatenario perfectamente coincidente y escinden una o ambas cadenas de ADN dentro de 1 a 10 bases del inicio de la estructura de ADN anormal. Estas estructuras de ADN anormales incluyen ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos, estructuras o uniones de Holliday y otros tipos de ADN que no coinciden perfectamente. Pueden incluir además estructuras que comprenden más de dos cadenas de fragmentos de ADN monocatenario. Se pueden añadir cebadores o ADN de plantilla de cebador sin emparejamiento de bases significativo. Sorprendentemente, los productos de amplificación no específicos formados en los primeros 8-28 ciclos de PCR múltiple contienen una variedad de estructuras de ADN bicatenarias y monocatenarias anormales que se pueden escindir mediante las enzimas que tienen actividades similares con la endonucleasa VII de T4. En el presente documento se describen métodos, composiciones, sistemas y kits mediante los cuales los productos de amplificación no específicos generados en los primeros 8-28 ciclos de PCR múltiple se pueden eliminar mediante escisión con endonucleasa VII de T4. Estos hallazgos son de uso particular para los métodos de esta divulgación.
Los métodos que se divulgan en el presente documento pueden implicar además poner en contacto la reacción de amplificación con una enzima para escindir los productos de amplificación no específicos, generando así una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos. Como se usa en el presente documento, la expresión "poner en contacto" equivale a introducir dicha enzima en una mezcla existente previamente como se describe en el presente documento. Los métodos de la presente divulgación pueden usar una variedad de enzimas que pueden reconocer y escindir estructuras de ADN anormales. En algunos casos, las enzimas útiles para realizar los métodos divulgados en el presente documento son enzimas específicas de estructuras de ADN anormales. La expresión "enzima específica de estructuras de ADN anormales" se usará en el presente documento para referirse a una enzima que se une a y escinde estructuras de ADN anormales. La forma plural se usará en el presente documento para referirse a enzimas que se unen y escinden estructuras de ADN anormales. Las enzimas específicas de estructuras de ADN anormales generalmente tendrán, pero sin limitación, al menos una actividad que produzca al menos un evento de ruptura o escisión en cualquiera de las cadenas (es decir, de sentido o de antisentido) en la proximidad de o dentro de una estructura de ADN bicatenario anormal en un tramo de al menos dos pares de bases no emparejadas perfectamente (es decir, no complementarias). Estas enzimas específicas de estructuras de ADN anormales pueden tener una pluralidad de actividades enzimáticas que no se limitan a la escisión de estructuras de ADN anormales. La enzima específica de estructuras de ADN anormales puede escindir el enlace fosfodiéster de la cadena principal de ADN, lo que da como resultado una ruptura o una muesca en una cadena sencilla del ADN bicatenario. Las enzimas específicas de estructuras de ADN anormales divulgadas en el presente documento pueden reconocer una variedad de estructuras de ADN anormales, incluyendo, sin limitación, estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos y otros tipos de ADN que no coinciden perfectamente. Pueden incluir además estructuras que comprenden más de dos cadenas de fragmentos de ADN monocatenario. Se pueden añadir cebadores o ADN de plantilla de cebador sin emparejamiento de bases significativo. En algunos casos, la enzima específica de estructuras de ADN anormales puede reconocer un tipo particular de estructura de ADN anormal. En otros casos, la enzima específica de estructuras de ADN anormales puede reconocer más de un tipo de estructura de ADN anormal. Los métodos que se proporcionan en el presente documento pueden combinar una enzima específica de estructuras de ADN anormales que puede reconocer y escindir estructuras de ADN anormales generadas en una reacción de amplificación que comprende una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos. En algunos casos, la enzima específica de estructuras de ADN anormal puede escindir selectivamente productos de amplificación no específicos. En algunos casos, la enzima específica de estructuras de ADN anormales puede escindir tanto productos de amplificación no específicos como productos de amplificación específicos de diana. En algunos ejemplos, la enzima específica de estructuras de ADN anormales puede reducir la cantidad de productos de amplificación no específicos en la reacción de amplificación sin reducir la cantidad de productos de amplificación específicos de diana. En otros ejemplos, se pueden reducir tanto productos de amplificación no específicos como productos de amplificación específicos de diana. En algunos casos, la reacción de amplificación puede estar sustancialmente libre de productos de amplificación no específicos. Sustancialmente libre de productos de amplificación no específicos puede significar que la cantidad de productos de amplificación no específicos en la reacción de amplificación se ha reducido en más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, hasta el 100 %.
Los ejemplos de enzimas específicas de estructuras de ADN anormales que se pueden utilizar para escindir las estructuras de ADN anormales en los métodos proporcionados en el presente documento incluyen, sin limitación, endonucleasa I T7 de resolvasa de unión de Holliday de bacteriófago del fago T7, o sus homólogos del fago T3, YeO3-12; endonucleasa VII T4 del fago T4, o sus homólogos del fago YeO3-12, L5, D29; Rap del fago Lambda, A22 del poxvirus, o sus homólogos del fago P22, H-19B, 933W, 21, PS34, VT2-Sa, D3; endonucleasa tipo RuvC del fago bIL66/67/70, o sus homólogos del fago sk1, c2, vML3, 712; RusA de r1t, G44P del fago SPP1, o sus homólogos del fago Tuc, ul36, g1e, 82, HK122/97, PVL, TM4, A118; endonucleasa flap (FEN, de sus siglas en inglés), o sus homólogos de bacterias, arqueas y eucariotas; endonucleasa V o sus homólogos de bacterias, arqueas y eucariotas incluyendo la endonucleasa V de E. coli, endonucleasa V de Thermotoga marítima; endonucleasas específicas de estructuras de bacterias, arqueas y eucariotas, incluyendo Ru-vC, RecU, Hjc, Hje, Hjr, CCE1, YDC2, categoría XPG: GEN1/Yen1, categoría UvrC: Slx1-Slx4, categoría ERCC4: Xpf (Xpf-Ercc1), Mus81 (MUS81-EME1/Mms4); enzimas de reparación de emparejamientos incorrectos MutHLS de bacterias; nucleasas específicas de cadena sencilla de hongos y plantas, incluyendo éstas nucleasa S1 de Aspergillus oryzae, nucleasas P1 de Penicillium citrinum, nucleasa de frijol mungo o la familia de nucleasas CEL (CEL I y SP1). Ejemplos de enzimas que se pueden utilizar para unir pero no escindir las estructuras de ADN anormales en los métodos proporcionados en el presente documento incluyen, sin limitación, MutS de bacterias o endonucleasa V humana. En ejemplos específicos, la enzima específica de estructuras de ADN anormales puede ser la endonucleasa I de T7 o la endonucleasa VII de T4. Debe entenderse que esencialmente se contempla cualquier enzima específica de estructuras de ADN anormales o su mutante que pueda realizar los métodos de la divulgación como se describe en el presente documento. Más particularmente, se puede utilizar cualquier enzima específica de estructuras de ADN anormales o su mutante que pueda escindir o unirse a estructuras de ADN anormales.
En otros métodos de la divulgación, los productos de amplificación no específicos se pueden eliminar de la reacción de amplificación sin la escisión de las estructuras de ADN anormales. En este caso, la reacción de amplificación que comprende una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y productos de amplificación no específicos se puede poner en contacto con una proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN. Las proteínas de este tipo pueden ser enzimas implicadas en la ruta de reparación de emparejamientos incorrectos de ADN, un sistema para reconocer y reparar emparejamientos incorrectos de ADN durante la síntesis o recombinación de ADN. En estos ejemplos, la proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN se puede unir selectivamente a emparejamientos incorrectos de pares de bases de ADN (es decir, emparejamiento de bases no complementarias), incluyendo un tramo de bases no emparejadas, en una muestra de ácido nucleico. En estos ejemplos, los productos de amplificación no específicos se pueden unir selectivamente a la proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN, mientras que los productos de amplificación específicos de diana no se unirán a la proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN. Las proteínas de unión a emparejamientos incorrectos de ADN útiles en los métodos descritos en el presente documento pueden ser cualquier proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN que pueda reconocer y unirse a al menos un emparejamiento incorrectos de ADN en una muestra de ácido nucleico. En un ejemplo concreto, la proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN puede ser MutS. MutS pueden proceder de una bacteria, en algunos casos E. coli o T. aquaticus. En algunos casos, la proteína de unión a emparejamientos incorrectos de ADN se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. En este ejemplo, los productos de amplificación no específicos se pueden absorber sobre el soporte sólido y eliminar de la reacción de amplificación. Aunque se han divulgado ejemplos particulares, se puede usar esencialmente cualquier sustancia que pueda unirse selectivamente a productos de amplificación no específicos.
En algunos casos, los métodos pueden implicar la eliminación de los productos de amplificación no específicos escindidos de la reacción de amplificación. En otros casos, los productos de amplificación no específicos escindidos no se eliminan. Los productos no específicos escindidos pueden ser digeridos adicionalmente en pequeños oligonucleótidos y nucleótidos mediante exonucleasas. Estas incluyen exonucleasas específicas de ADN bicatenario y exonucleasas específicas de ADN monocatenario. En algunos casos, las exonucleasas pueden ser exonucleasa lambda, exonucleasa I de E. coli o una combinación de los dos. En este ejemplo, puede ser deseable proteger los extremos de los productos de amplificación específicos de diana de la digestión con la exonucleasa. En este caso, la exonucleasa digerirá los productos de amplificación no específicos y no los productos de amplificación específicos de diana. En un ejemplo, proteger los productos de amplificación de específicos de diana de la digestión puede implicar la unión de adaptadores a los extremos de los productos de amplificación específicos de diana. Estos adaptadores pueden tener una pluralidad de fosforotioatos consecutivos en el extremo 3' de la cadena de sentido. Los fosforotioatos son variantes del ADN normal que son resistentes a la escisión mediante nucleasas. En algunos casos, los adaptadores pueden comprender 3, 4, 5, 6 o más de 6 fosforotioatos consecutivos en el extremo 3' de la cadena de sentido. En un ejemplo, los adaptadores pueden ser adaptadores utilizados para hacer bibliotecas para secuenciación de próxima generación, como se describe con mayor detalle a continuación. Los adaptadores pueden comprender además códigos de barras o marcadores. Los fragmentos de ADN diana unidos al adaptador se pueden amplificar adicionalmente mediante PCR. En algunos casos, los adaptadores se fosforilan en el extremo 5' de la cadena de sentido. En algunos casos, el extremo 3' de la cadena de antisentido del adaptador puede tener un saliente de timina (T). En este ejemplo, el saliente en T del adaptador se puede unir a un producto de amplificación específico de diana con cola A reparado en el extremo.
En algunos casos, los productos de amplificación descritos en el presente documento se pueden usar para preparar bibliotecas para secuenciación de próxima generación. Los adaptadores útiles para las aplicaciones de secuenciación de próxima generación se pueden unir a los extremos de productos de amplificación específicos de diana, como se ha descrito anteriormente. En algunos casos, los adaptadores pueden tener una pluralidad de fosforotioatos consecutivos en el extremo 3' de la cadena de sentido. En algunos casos, los adaptadores pueden comprender 3, 4, 5, 6 o más de 6 fosforotioatos consecutivos en el extremo 3' de la cadena de sentido. Los adaptadores pueden ser adaptadores de secuenciación útiles en una plataforma de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, adaptadores Illumina TruSeq). Por ejemplo, los métodos de la invención son útiles para la secuenciación de próxima generación mediante los métodos comercializados por Illumina, como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5.750.341 (Macevicz); 6.306.597 (Macevicz); y 5.969.119 (Macevicz).
Kits
La presente divulgación proporciona además kits útiles para practicar los métodos divulgados en el presente documento. En un aspecto, la divulgación proporciona un kit para realizar una reacción de PCR múltiple y para reducir productos de amplificación no específicos. En este ejemplo, el kit puede comprender reactivos adecuados para su uso en una reacción de PCR múltiple, por ejemplo, sin limitación, un tampón, dNTP y una ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa Taq). Se pueden vender por separado una pluralidad de pares de cebadores para su uso en la reacción de PCR múltiple. En algunos casos, los pares de cebadores están hechos a medida. En algunos casos, los pares de cebadores son seleccionados por el cliente. En algunos casos, los pares de cebadores son pares de cebadores específicos de diana. En otros casos, los pares de cebadores pueden ser pares de cebadores aleatorios. Los pares de cebadores pueden comprender de 10 a más de 100.000 pares de cebadores. El kit de este ejemplo puede comprender además una enzima específica de estructuras de a Dn anormales y un tampón adecuado para reducir productos de amplificación no específicos (por ejemplo, endonucleasa VII de T4). El kit de este ejemplo puede comprender además una ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa Taq) y un par de cebadores de PCR para realizar una segunda ronda de PCR.
En otro caso, la divulgación proporciona un kit para preparar una biblioteca ligada por adaptador para secuenciación de próxima generación. En este ejemplo, el kit puede comprender cualquiera de los reactivos divulgados anteriormente para realizar una reacción de p Cr múltiple y para reducir los productos de amplificación no específicos, así como reactivos adicionales para la preparación de una biblioteca. Los reactivos adicionales para la preparación de una biblioteca pueden comprender, sin limitación, enzimas y tampones adecuados para la de reparación de extremos (por ejemplo, polimerasa Klenow y/o ADN polimerasa de T4), enzimas y tampones adecuados para fosforilar los extremos 5' de los productos de amplificación (por ejemplo, polinucleótido cinasa de T4), enzimas y tampones adecuados para salientes A (por ejemplo, ADN polimerasa Taq), adaptadores, ADN ligasas y tampones adecuados para realizar una reacción de unión, una exonucleasa (por ejemplo, exonucleasa lambda, exonucleasa I) y cebadores de PCR para amplificar ácidos nucleicos unidos por adaptador. Los adaptadores pueden ser cualquier adaptador o combinaciones de los mismos como se divulga en el presente documento, incluidos los adaptadores que comprenden una pluralidad de fosforotioatos y/o adaptadores adecuados para la secuenciación de próxima generación. Las ADN ligasas pueden comprender ADN ligasa de T4 y al menos una ligasa adicional seleccionada del grupo que consiste en ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, y Ampligase®. Los cebadores de PCR que se usan para amplificar ácidos nucleicos unidos por adaptador pueden comprender una secuencia que se hibrida a al menos una parte de la secuencia del adaptador.
En otro caso, la divulgación proporciona kits para realizar una reacción de PCR múltiple y un método alternativo para reducir productos de amplificación no específicos. En este ejemplo, el kit puede comprender reactivos adecuados para su uso en una reacción de PCR múltiple, por ejemplo, sin limitación, un tampón, dNTP y una ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa Taq). Se pueden vender por separado una pluralidad de pares de cebadores para su uso en la reacción de PCR múltiple. En algunos casos, los pares de cebadores están hechos a medida. En algunos casos, los pares de cebadores son seleccionados por el cliente. En algunos casos, los pares de cebadores son pares de cebadores específicos de diana. En otros casos, los pares de cebadores pueden ser pares de cebadores aleatorios. Los pares de cebadores pueden comprender de 10 a más de 100.000 pares de cebadores. El kit puede comprender además una proteína de unión de emparejamientos incorrectos de ADN, por ejemplo, MutS. En algunos casos, se puede proporcionar un soporte sólido con MutS unido a la superficie en el kit. En otros casos, MutS y el soporte sólido se pueden proporcionar por separado con reactivos adecuados para unir MutS al soporte sólido. El kit puede comprender además cualquier tampón de lavado adecuado, tampón de elución y similares adecuados para realizar los métodos de la presente divulgación.
Ahora se hará referencia particular a aspectos y figuras específicos de la divulgación. Dichos aspectos se proporcionan solo a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les ocurrirán ahora a los expertos en la materia sin apartarse de la divulgación.
En la Figura 1, la PCR múltiple se realiza con ADN de plantilla, cebadores, dNTP y una ADN polimerasa termoestable. El número de pares de cebadores puede ser cualquier número de menos de 10 a más de 100.000 en una sola reacción en un solo tubo o pocillo. Los productos de PCR incluyen fragmentos de ADN diana, es decir, los amplicones, y varios productos no específicos que contienen estructuras de ADN anormales. Los productos se ponen en contacto con la endonucleasa VII de T4, que produce roturas bicatenarias en la proximidad de estructuras de ADN anormales, mientras que los fragmentos de ADN diana permanecen inalterados. Los fragmentos de ADN diana se obtienen, con o sin purificación adicional para eliminar los productos no específicos escindidos, y se usan en diversas aplicaciones posteriores. La exonucleasa I de E. coli puede usarse junto con la endonucleasa VII de T4 después de la p Cr múltiple para degradar ADN monocatenario en pequeños oligonucleótidos y nucleótidos. El fragmento de ADN diana puede marcarse con fluorescencia o radioisótopos mediante traducción de muescas y analizarse en micromatrices, hibridación u otras técnicas para detección y diagnóstico. Adicionalmente, las muescas en los fragmentos de ADN diana se pueden rellenar con cualquiera de las siguientes enzimas: ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, Ampligase®, etc. Después de llenar las muescas, los fragmentos de ADN se pueden amplificar adicionalmente mediante PCR, siempre que se usen cebadores internos en la PCR múltiple.
En la Figura 1 el diagrama esquemático de un procedimiento para eliminar productos de amplificación no específicos generados en PCR múltiple muestra que después de la PCR múltiple, los productos de amplificación no específicos pueden cortarse con una resolvasa (en este ejemplo, endonucleasa VII de T4) y opcionalmente eliminarse mediante purificación. Los amplicones diana pueden usarse directamente en la siguiente etapa o someterse a una ronda adicional de PCR para aumentar el rendimiento o añadir secuencias adicionales, tales como adaptadores, y usarse como bibliotecas.
Como alternativa o de modo adicional, la proteína (por ejemplo, resolvasa) que se une a las anormalidades en el polinucleótido puede usarse para unirse a, y eliminar, en lugar de simplemente cortar, los productos de amplificación de unión no específicos. Por ejemplo, una resolvasa o la porción de unión a anormalidades de la resolvasa puede estar atada a un sustrato en fase sólida. La Figura 2 es un diagrama esquemático de un procedimiento para eliminar productos de amplificación no específicos generados en PCR múltiple. Después de la PCR múltiple, los productos de amplificación no específicos se absorben en MutS inmovilizadas o una combinación de MutS inmovilizadas de diferentes organismos, mientras que los fragmentos de ADN diana están en la solución y se separan de los productos no específicos. La MutS inmovilizada puede estar contenida en una columna o cartucho y de E. coli o Thermus aquaticus. La MutS incluye uno o más sitios de unión para unirse a anormalidades en un polinucleótido.
En la Figura 2, una PCR múltiple se realiza con ADN de plantilla, cebadores, dNTP y una ADN polimerasa termófila. El número de pares de cebadores puede ser cualquier número de menos de 10 a más de 100.000 en una sola reacción en un solo tubo o pocillo. Los productos de PCR incluyen fragmentos de ADN diana, es decir, los amplicones, y varios productos no específicos que contienen estructuras de ADN anormales. Estos productos de PCR se ponen en contacto con MutS inmovilizadas o una combinación de MutS inmovilizadas de diferentes organismos. Los productos no específicos se absorben en las proteínas inmovilizadas, mientras que los fragmentos de ADN diana están en la solución y se separan de los productos no específicos. Como se ha mencionado, la MutS inmovilizada puede ser de E. coli o Thermus aquaticus.
Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede usarse para generar una biblioteca; la biblioteca puede usarse para secuenciación, por ejemplo. Esto se ilustra en las Figuras 3 y 21A. La Figura 3 es un diagrama esquemático de un procedimiento para eliminar productos de amplificación no específicos generados en PCR múltiple y una biblioteca de los amplicones diana. El procedimiento implica reparación de extremos de los extremos de los fragmentos de ADN, escisión de los productos no específicos, unión del adaptador, eliminación de los adaptadores no unidos y amplificación adicional de la biblioteca.
En la Figura 3, una PCR múltiple se realiza con ADN de plantilla, cebadores no fosforilados, dNTP y una ADN polimerasa termoestable. El número de pares de cebadores puede ser cualquier número de menos de 10 a más de 100.000 en una sola reacción en un solo tubo o pocillo. Los productos incluyen fragmentos de ADN diana, es decir, los amplicones, y varios productos no específicos que contienen estructuras de ADN anormales. Después de la PCR, se reparan los extremos de los productos mediante la ADN polimerasa de T4 para formar extremos romos, luego mediante la polinucleótido cinasa de T4 para fosforilar los extremos 5', luego mediante la polimerasa Taq para añadir una A a los extremos 3' en un tampón que contiene dATP. Luego, los productos se ponen en contacto con la endonucleasa VII de T4, que produce roturas bicatenarias en o cerca de estructuras de ADN anormales, mientras que los fragmentos de ADN diana permanecen inalterados. Luego, la mezcla de ADN se une con adaptadores. Los adaptadores contienen de tres a seis fosforotioatos consecutivos en el extremo 3' de la cadena de sentido (indicado por *N3' en la Figura 3). Cuando la mezcla de ADN se digiere mediante la exonucleasa I de E. coli y la exonucleasa lambda, los fragmentos de ADN diana están protegidos en ambos lados mediante los adaptadores, mientras que todos los demás fragmentos de ADN se degradan en pequeños oligonucleótidos y nucleótidos. Los fragmentos de ADN diana se pueden usar en diversas aplicaciones posteriores con, o sin, purificación adicional para eliminar los restos de los productos no específicos.
Más detalladamente, los adaptadores se fosforilan en el extremo 5' de la cadena de sentido. El extremo 3' de la cadena de antisentido contiene una T adicional, que permite la unión de T-A con productos de PCR reparados en los extremos.
En mayor detalle, la reacción de unión incluye ADN ligasa de T4 y una de las siguientes ADN ligasas: ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, Ampligase®, etc.
En mayor detalle, después de la unión del adaptador y la eliminación de productos no específicos, los fragmentos de ADN diana pueden amplificarse aún más mediante p Cr .
La Figura 4 es un diagrama esquemático de un procedimiento profético para eliminar productos de amplificación no específicos generados en PCR múltiple y una biblioteca de los amplicones diana. En este procedimiento, se utilizan cebadores fosforilados. El procedimiento implica reparación de extremos de los extremos de los fragmentos de ADN, escisión de los productos no específicos, unión del adaptador, eliminación de los adaptadores no unidos y amplificación adicional de la biblioteca. En la Figura 4, los cebadores fosforilados se utilizan en PCR múltiple. La PCR se realiza con ADN de plantilla, cebadores fosforilados, dNTP y una ADN polimerasa termoestable. El número de pares de cebadores puede ser cualquier número de menos de 10 a más de 100.000 en una sola reacción en un solo tubo o pocillo. Los productos incluyen fragmentos de ADN diana, es decir, los amplicones, y varios productos no específicos que contienen estructuras anormales. Los productos se ponen en contacto con la endonucleasa VII de T4, que produce roturas bicatenarias en la proximidad de estructuras de ADN anormales, mientras que los fragmentos de ADN diana permanecen inalterados. Luego, la mezcla de ADN se une con adaptadores. Los adaptadores contienen de tres a seis fosforotioatos consecutivos en el extremo 3' de la cadena de sentido (indicado por *N3' en la Figura 4). Cuando la mezcla de ADN se digiere mediante la exonucleasa I de E. coli y la exonucleasa lambda, los fragmentos de ADN diana están protegidos en ambos lados mediante los adaptadores, mientras que todos los demás fragmentos de ADN se degradan en pequeños oligonucleótidos y nucleótidos. Los fragmentos de ADN diana se pueden usar en diversas aplicaciones posteriores con, o sin, purificación adicional para eliminar los restos de los productos no específicos. Más detalladamente, los adaptadores se pueden fosforilan en el extremo 5' de la cadena de sentido. El extremo 3' de la cadena de antisentido contiene una T adicional, que permite la unión de T-A con productos de PCR. En mayor detalle, la reacción de unión puede incluir ADN ligasa de T4 y una de las siguientes ADN ligasas: ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, Ampligase®, etc. Después de la unión del adaptador y la eliminación de productos no específicos, los fragmentos de ADN diana pueden amplificarse aún más mediante p Cr .
La Figura 5 muestra un diagrama esquemático de otra variación de un procedimiento para eliminar productos de amplificación no específicos generados en PCR múltiple y una biblioteca de los amplicones diana. En este procedimiento, los adaptadores no ligados no se eliminan mediante digestión. El procedimiento implica reparación de extremos de los extremos de los fragmentos de ADN, escisión de los productos no específicos, unión de los adaptadores y amplificación adicional de la biblioteca. En la Figura 5, una PCR múltiple se realiza con ADN de plantilla, cebadores no fosforilados, dNTP y una ADN polimerasa termoestable. El número de pares de cebadores puede ser cualquier número de menos de 10 a más de 100.000 en una sola reacción en un solo tubo o pocillo. Los productos incluyen fragmentos de ADN diana, es decir, los amplicones, y varios productos no específicos que contienen estructuras anormales. Se reparan los extremos de los productos mediante la ADN polimerasa de T4 para formar extremos romos, luego mediante la polinucleótido cinasa de T4 para fosforilar los extremos 5', luego mediante la polimerasa Taq para añadir una A a los extremos 3' en un tampón que contiene dATP. Luego, los productos se ponen en contacto con la endonucleasa VII de T4, que produce roturas bicatenarias en la proximidad de estructuras de ADN anormales, mientras que los fragmentos de ADN diana permanecen inalterados. Luego, la mezcla de ADN se une con adaptadores. Los fragmentos de ADN diana unidos se amplifican adicionalmente mediante PCR.
Los adaptadores se pueden fosforilan en el extremo 5' de la cadena de sentido. El extremo 3' de la cadena de antisentido contiene una T adicional, que permite la unión de T-A con productos de PCR reparados en los extremos. Los adaptadores no contienen fosforotioatos. La reacción de unión puede incluir ADN ligasa de T4 y una de las siguientes ADN ligasas: ADN ligasa 9°N™, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tth, ADN ligasa Tfi, Ampligase®, etc.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar varias realizaciones de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en el presente documento son actualmente representativos de realizaciones preferidas, son ejemplos y no pretenden ser limitaciones en el alcance de la invención.
EJEMPLO 1
El ejemplo 1 se muestra en la Figura 1, discutido brevemente arriba, y muestra un diagrama esquemático de PCR múltiple con ADN de plantilla, cebadores, dNTP y una ADN polimerasa termoestable.
EJEMPLO 2
El ejemplo 2 se muestra en la Figura 2 discutido anteriormente, y es un método de PCR múltiple con ADN de plantilla, cebadores, dNTP y una ADN polimerasa termófila.
EJEMPLO 3
El ejemplo 3, mostrado en la Figura 3 discutido brevemente arriba, es un método de PCR múltiple con ADN de plantilla, cebadores no fosforilados, dNTP y una ADN polimerasa termoestable.
EJEMPLO 4
El ejemplo 4, mostrado en la Figura 4 discutido brevemente arriba, es un método de PCR múltiple con cebadores fosforilados utilizados en PCR múltiple.
EJEMPLO 5
El ejemplo 5, mostrado en la Figura 5 y discutido brevemente arriba, es un diagrama esquemático de PCR múltiple con ADN de plantilla, cebadores no fosforilados, dNTP y una ADN polimerasa termoestable.
EJEMPLO 6: Optimización de las condiciones de reacción
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, se pueden determinar las condiciones de la resolvasa (concentración, tampón, tiempo de incubación/tratamiento y/o temperatura). En el presente documento se proporcionan parámetros generales para el uso de resolvasa para reducir los productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana. Por ejemplo, en general, la escisión de productos de amplificación no específicos con la resolvasa mientras se mantiene una proporción sustancial de productos de amplificación específicos de diana puede incluir la exposición de los productos de amplificación no específicos y la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana a entre aproximadamente 0,2 U y 1000 U de resolvasa, durante entre 0,5 minutos y 60 minutos, a entre 16 °C y 37 °C. Las figuras 6A-7B ilustran la determinación de dichos intervalos. Las Figuras 6A y 6B ilustran la valoración de endonucleasa VII de T4 para encontrar intervalos de concentración que pueden usarse para eliminar los productos de amplificación no específicos en una PCR múltiple que implica 207 pares de cebadores. El efecto de la endonucleasa VII de T4 se analizó mediante la cantidad de a Dn diana restante o la cantidad de dímeros de cebadores restantes. Como se describe con mayor detalle a continuación, se encontró suficiente un intervalo de entre aproximadamente 0,5 y 20 (por ejemplo, aproximadamente 10 unidades) de endonucleasa VII de T4. Las Figuras 7A y 7B muestran ejemplos de evolución temporal de la endonucleasa VII de T4 para encontrar las duraciones óptimas para eliminar los productos de amplificación no específicos en una PCR múltiple que implica 207 pares de cebadores. El efecto de la endonucleasa VII de T4 se analizó mediante la cantidad de ADN diana restante. Se encontró que entre aproximadamente 0,5 minutos y 20 minutos (por ejemplo, 5 minutos) de incubación fue suficiente.
Si bien hay muchas enzimas que pueden cortar el ADN en las proximidades de estructuras de ADN anormales con diversas actividades, la endonucleasa I de T7, la endonucleasa VII de T4 y la endonucleasa V de E. coli y T. marítima están disponibles comercialmente. Se informa que tanto la endonucleasa I de T7 como la endonucleasa VII de T4 tienen fuertes actividades en diversas estructuras de ADN anormales. La endonucleasa I de T7 produce extremos protuberantes en 5' de hasta 6 nucleótidos de largo, mientras que la endonucleasa VII de T4 genera extremos protuberantes en 3' de la misma longitud. Estas dos endonucleasas también tienen una fuerte actividad en el ADN monocatenario. Son funcionalmente intercambiables. La endonucleasa V se considera una enzima de reparación de ADN que reconoce la desoxiinosina, un producto de desaminación de la desoxiadenosina en el ADN, y a menudo se llama endonucleasa 3' de desoxiinosina. La endonucleasa V tiene actividades débiles en diversas estructuras de ADN anormales. Todas estas enzimas producen muescas aleatorias en el ADN bicatenario. Tras una incubación prolongada con una gran cantidad de enzima, el ADN bicatenario se cortará gradualmente en pequeños trozos de fragmentos de ADN. Por estas razones, la endonucleasa VII de T4 se usó en los siguientes experimentos, sin embargo, se pueden usar otras resolvasas y los métodos, kits y composiciones descritos en el presente documento no se limitan a la endonucleasa VII de T4.
Para encontrar la concentración óptima de endonucleasa VII de T4, se realizó PCR múltiple y luego se utilizó endonucleasa VII de T4 para tratar los productos de amplificación. Los pequeños fragmentos de ADN se eliminaron mediante una ronda de purificación con perlas magnéticas. El ADN resultante se analizó con un chip de alta sensibilidad de BioAnalyzer.
Se usó el panel de cebadores de Ion AmpliSeq™ hotspot cancer panel v2 (Life Technologies, número de catálogo 4475346) en la PCR múltiple. Este panel de cebadores cubre aproximadamente 2.800 mutaciones COSMIC de 50 oncogenes y genes supresores de tumores. Tiene 207 pares de cebadores en un grupo. Las reacciones de PCR múltiple se realizaron en 10 pl. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thomas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snapstrip II, número de catálogo 1228F73): 5 pl del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 pl de tampón de PCR 10X (tampón de PCR 1X: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl25 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 pl de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/pl) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 pl de 10 ng/pl de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 pl de agua destilada.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878).
La PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 17 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 4 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 10 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 pl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 10 minutos.
Después de la incubación, la reacción se detuvo con 1 pl de EDTA 0,5 M. El ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas paramagnéticas fueron de Amsbio LLC (Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, número de catálogo MD61021). Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, luego se añadieron 64 pl de perlas MagSi-NGSprep, que representaban 1,6 veces del volumen de los amplicones amplificados y combinados, en el tubo que contenía los amplicones amplificados. El tubo se mezcló mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, el tubo se centrifugó en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocó en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. El imán dentro de la gradilla magnética era de KJ Magnetics (KJ Magnetics, número de catálogo D4X0DIA-N52). Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar el tubo de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado al tubo. Luego, el tubo se rotó 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, el tubo se centrifugó en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro del tubo se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con la tapa del tubo abierta. Por último, el tubo se retiró de la gradilla magnética y se añadieron 40 pl de agua destilada al tubo. El tubo se mezcló en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, el sobrenadante que contenía los fragmentos de ADN eluidos se transfirió a un tubo nuevo. Los fragmentos de ADN se purificaron con perlas MagSi-NGSprep 1.6X mediante este método en un total de dos veces. Después de la purificación final, los fragmentos de ADN se eluyeron en 5 pl de agua destilada y se analizaron en la siguiente etapa.
El tamaño, la concentración y la pureza de los fragmentos de ADN se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 ml de los fragmentos de ADN purificados obtenidos en la etapa anterior se analizaron con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Como se ha mencionado anteriormente, la Figura 6A muestra el ADN diana restante tratado por 0-200 unidades de endonucleasa VII de T4 (también denominada T4E7) en 10 minutos a 37 °C. El ADN diana restante se refiere a los productos de PCR con los tamaños esperados. Se vio que el ADN bicatenario se degrada con concentraciones más altas de endonucleasa VII de T4. Esto también puede indicar que los productos no específicos con tamaños similares se eliminaron mediante la enzima, dejando atrás el ADN diana.
La Figura 6B muestra el dímero de cebadores restante por 0-200 unidades de endonucleasa VII de T4, T4E7, en 10 minutos a 37 °C. La cantidad de productos de amplificación no específicos se redujo. Además, se vio que los tamaños de los productos de amplificación no específicos se desplazaron al analizarlos con BioAnalyzer, lo que indica que se cortaron mediante la endonucleasa VII de T4 al menos una vez. Esto facilitará la eliminación de estos fragmentos mediante enfoques adicionales tales como la digestión selectiva y/o una ronda adicional de reacción en cadena de la polimerasa.
Dado que los productos de amplificación no específicos se pueden eliminar después de cortarse una vez, los resultados anteriores indican que la actividad limitada de la endonucleasa VII de T4 es suficiente. Esto puede preservar el ADN diana mientras se eliminan los productos de amplificación no específicos.
La PCR múltiple se realizó como se ha descrito anteriormente. Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 10 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 pl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 |jl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante varios períodos de tiempo. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron y el ADN se purificó y se analizó en BioAnalyzer, como se ha descrito anteriormente.
En el primer experimento, se ensayó el efecto de la endonucleasa VII de T4 hasta 20 minutos en intervalos de 5 minutos (Figura 7A). Se vio una reducción gradual del ADN diana con baja concentración (5 unidades) de endonucleasa VII de T4, y una aguda reducción del ADN diana en 10 unidades de endonucleasa VII de T4. En el segundo experimento, se ensayó el efecto de la endonucleasa VII de T4 hasta 9 minutos en intervalos de 1 minuto (Figura 7B). Esta valoración encontró que 10 unidades de endonucleasa VII de T4 en 5 minutos a 37 °C es suficiente para eliminar los productos de amplificación no específicos.
La Figura 8A ilustra una reacción de amplificación múltiple ejemplar que muestra un fondo normal resultante de productos de amplificación no específicos. Los productos de amplificación específicos de diana en este ejemplo están prácticamente inundados por los productos de amplificación no específicos ("fondo generado por PCR múltiple") entre los marcadores de tamaño, según el gráfico que muestra la intensidad fluorescente relativa (cantidad en unidades de fluorescencia, UF) para el tamaño en pares de bases (pb).
EJEMPLO 7
La Figura 8B, similar a los métodos ejemplificados en las Figuras 1 y 3-5, ilustran el uso de una resolvasa (tal como la endonucleasa VII de T4) para reducir el producto de amplificación no específico y revelar los productos de amplificación específicos de diana en un procedimiento de amplificación múltiple. En la Figura 8B, la resolvasa se dirige a los productos de amplificación no específicos de fondo que se hipotetizan para tener una o más estructuras polinucleotídicas anormales, como se muestra (por ejemplo, estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN o ADN que no coinciden perfectamente).
Las Figuras 8C y 8D ilustran un ejemplo de trabajo de este método. Se usó el panel de cebadores de Ion AmpliSeq™ hotspot cancer panel v2 (Life Technologies, número de catálogo 4475346) en la PCR múltiple. Este panel de cebadores cubre aproximadamente 2.800 mutaciones COSMIC de 50 oncogenes y genes supresores de tumores. Tiene 207 pares de cebadores en un grupo. La reacción de PCR múltiple se realizó en 10 pl. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thosmas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snapstrip II, número de catálogo 1228F73): 5 pl del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 pl de tampón de PCR 10X (tampón de PCR 1X: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl25 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 pl de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/pl) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 pl de 10 ng/pl de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 pl de agua destilada.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878).
La PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 15 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 4 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 0 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 pl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 j l de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 10 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas paramagnéticas fueron de Amsbio LLC (Amsbio LLC, MagSi-NG-Sprep, número de catálogo Md 61021). Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, luego se añadieron 64 pl de perlas MagSiNGSprep, que representaban 1,6 veces del volumen de los amplicones amplificados y combinados, en el tubo que contenía los amplicones amplificados. El tubo se mezcló mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, el tubo se centrifugó en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocó en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. El imán dentro de la gradilla magnética era de KJ Magnetics (KJ Magnetics, número de catálogo D4X0DIA-N52). Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar el tubo de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado al tubo. Luego, el tubo se rotó 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, el tubo se centrifugó en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro del tubo se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con la tapa del tubo abierta. Por último, el tubo se retiró de la gradilla magnética y se añadieron 40 pl de agua destilada al tubo. El tubo se mezcló en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, el sobrenadante que contenía los fragmentos de ADN eluidos se transfirió a un tubo nuevo. Los fragmentos de ADN se purificaron con perlas MagSi-NGSprep 1.6X mediante este método en un total de dos veces. Después de la purificación final, los fragmentos de ADN se eluyeron en 5 pl de agua destilada y se analizaron en la siguiente etapa.
El tamaño, la concentración y la pureza de los fragmentos de ADN se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 pl de los fragmentos de ADN purificados obtenidos en la etapa anterior se analizaron con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en las Figuras 8C y 8D. La Figura 8C muestra la presencia de amplicones diana y productos de amplificación no específicos antes de la digestión mediante endonucleasa VII de T4. Los productos de amplificación no específicos son de 200 pb a más de 2000 pb. Los máximos de 100 pb a 200 pb eran fragmentos de ADN diana. La Figura 8D muestra el efecto después de la digestión con endonucleasa VII de t 4. Los productos de amplificación no específicos de 200 pb a más de 2000 pb se eliminaron mediante digestión con endonucleasa de T4 y la posterior purificación.
EJEMPLO 8
Se puede ver una reducción similar en productos de amplificación no específicos en una PCR múltiple con 207 pares de cebadores largos, como se muestra en las Figuras 9A-9B. En este ejemplo, el panel de cebadores fue idéntico al de Ion AmpliSeq™ hotspot cancer panel v2 (Life Technologies, número de catálogo 4475346), excepto que se añadió 5'CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3' al extremo 5' de cada cebador directo y se añadió 5TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3' al extremo 5' de cada cebador inverso. Estos cebadores "largos" permiten la adición fácil de adaptadores en amplicones mediante una ronda adicional de PCR.
Los métodos para realizar la PCR múltiple y los tratamientos y ensayos posteriores fueron idénticos a los del EJEMPLO 7 anterior. Los resultados se presentan en la Figuras 9A-9B. La Figura 9A muestra el resultado de la PCR múltiple con cebadores largos antes de la digestión con endonucleasa VII de T4. La Figura 9B muestra la eliminación de productos de amplificación no específicos mediante digestión con endonucleasa VII de T4.
EJEMPLO 9: Polimerasa en PCR múltiple
En general, se puede usar cualquier polimerasa apropiada para realizar la amplificación (amplificación múltiple) descrita en el presente documento. Los métodos, composiciones y kits descritos en el presente documento son compatibles con una variedad de enzimas. Las Figuras 10A-10F ilustran el uso de varias enzimas polimerasas en PCR múltiple. En cada ejemplo, la PCR múltiple se realizó como se describe en el EJEMPLO 6 anterior, excepto que se usaron 5 unidades de taq de platino (Figura 10A), taq de titanio (Figura 10B), taq Omni Klen (Figura 10C), Taq Klenow (Figura 10D), ADN polimerasa Ko D (Figura 10E) y ADN polimerasa Tfi (Figura 10F) en cada reacción de PCR. Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 10 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 pl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron con EDTA 0,5 M. El ADN se purificó y analizó en BioAnalyzer, como se describe en el EJEMPLO 6. Los resultados muestran que Taq de platino, taq de titanio y taq de Omni Klen produjeron rendimientos comparables de amplicones diana, mientras que Taq Klenow, ADN polimerasa KOD y ADN polimerasa Tfi produjeron cantidades extraordinariamente altas de productos de amplificación no específicos. En este ejemplo, la taq de platino, la taq de titanio y la taq Omni Klen pueden ser preferibles para la PCR múltiple.
EJEMPLO 10
La concentración del cebador en la PCR múltiple se puede valorar. En este ejemplo, la PCR múltiple se realizó como se describe en el EJEMPLO 6, excepto que se usaron 20, 30, 40, 50 nM de 207 pares de cebadores en cada reacción de PCR múltiple. Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 10 j l de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 |jl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron con EDTA 0,5 M. El ADN se purificó y analizó en BioAnalyzer, como se describe en el EJEMPLO 6. Los resultados se presentan en la Figura 11. Este experimento mostró que una alta concentración de cebadores conduce a un mayor rendimiento de los amplicones diana.
EJEMPLO 11
El tiempo de hibridación y extensión de la PCR múltiple también se puede ajustar para optimizar los efectos descritos en el presente documento, como se muestra en la Figura 12. En este ejemplo, la PCR múltiple se realizó como se describe en el EJEMPLO 6, excepto que se usaron 1, 2, 3 minutos de tiempo de hibridación y extensión en cada reacción de PCR múltiple. Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 10 j l de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 j l de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron con EDTA 0,5 M. El ADN se purificó y analizó en BioAnalyzer, como se describe en el EJEMPLO 6. Los resultados se presentan en la Figura 12. Este experimento mostró que 1 minuto de hibridación y extensión conduce a un mayor rendimiento de los amplicones diana.
EJEMPLO 12
Como se ha mencionado anteriormente, se puede usar una gran cantidad de pares de cebadores en los métodos descritos en el presente documento y todavía dar como resultado una reducción sustancial de productos de amplificación no específicos. Por ejemplo, la Figura 13 ilustra la eliminación de productos de amplificación no específicos en una PCR múltiple que implica 2915 pares de cebadores.
El panel de cebadores fue GeneRead DNAseq human breast cancer panel de Qiagen (Qiagen, número de catálogo NGHS-001X-12). Este panel cubre 44 genes de 268621 bases diana, con 2915 pares de cebadores, y divididos en 4 grupos, conteniendo cada grupo aproximadamente 730 pares de cebadores. Este panel ha informado una cobertura del 98,2 % a una profundidad de secuencia media de 20X, 96,8 % de especificidad, 91 % de uniformidad. No hay nucleótido de uracilo ni ninguna otra modificación de bases en cada cebador de este panel. Este panel de cebadores está concentrado 2 veces. Por lo tanto, se realizaron 4 reacciones de PCR con cada uno de los 4 grupos de cebadores, y un 50 % del volumen total de PCR en cada reacción fue cada uno de los 4 grupos.
Cada una de las reacciones de PCR múltiple se realizó en 10 jl. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thomas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snapstrip II, número de catálogo 1228F73): 5 j l del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 j l de tampón de PCR 10X (tampón de PCR 1X: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl2 5 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 j l de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/jl) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 j l de 10 ng/jl de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 j l de agua destilada. Hubo 4 reacciones de PCR múltiple para el GeneRead DNAseq human breast cancer panel de Qiagen.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878). Los siguientes dos perfiles de temperatura se realizaron para cada uno de los paneles de cebadores.
Para el GeneRead DNAseq human breast cancer panel de Qiagen, la PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 15 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 4 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 40 j l de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 4 j l de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la incubación, las reacciones se detuvieron con EDTA 0,5 M. El ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 128 j l de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 j l de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 5 j l de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a tubos nuevos y se analizaron en la siguiente etapa.
El tamaño, la concentración y la pureza de los fragmentos de ADN se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 ml de los fragmentos de ADN purificados obtenidos en la etapa anterior se analizaron con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 13.
EJEMPLO 13
La Figura 14 ilustra un ejemplo de una eliminación de productos de amplificación no específicos en una PCR múltiple que implica 16000 pares de cebadores. En este ejemplo, el panel de cebadores fue Ion AmpliSeq™ comprehensive cancer panel (Life Technologies, número de catálogo 4477685). Este panel de cebadores cubre todos los exones de 409 genes supresores de tumores clave y oncogenes que con frecuencia mutan y se citan en publicaciones científicas. Esto tiene 16000 pares de cebadores en 4 grupos; cada grupo tiene aproximadamente 4.000 pares de cebadores. Las longitudes de los amplicones varían desde 125-175 pares de bases, la región diana cubre aproximadamente 1,73 millones de bases. Cuando las bibliotecas se hicieron con este panel y el kit de biblioteca Ion AmpliSeq™ de Life Technologies 2.0, y se secuenciaron en el sistema Ion PGM™ de Life Technologies, este panel informó una cobertura del 94 % a > 20 % de profundidad de secuencia media, con bases diana (bases mapeadas a regiones diana, del total de bases mapeadas por ciclo) del 97 %. En la PCR múltiple, cada uno de los 4 grupos de cebadores requiere 10 ng de ADN genómico humano como plantilla, un total de 40 ng para cubrir todo el panel. Hay al menos un nucleótido de uracilo en cada cebador de este panel de cebadores. Este panel de cebadores está concentrado 2 veces. Por lo tanto, se realizaron 4 reacciones de p Cr con cada uno de los 4 grupos de cebadores.
Cada una de las reacciones de PCR múltiple se realizó en 10 ml. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thomas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snapstrip II, número de catálogo 1228F73): 5 ml del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 ml de tampón de PCR 10X (tampón de PCR 1X: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl25 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 ml de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/ml) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 ml de 10 ng/ml de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 ml de agua destilada. Hubo 4 reacciones de PCR múltiple para el Ion AmpliSeq™ comprehensive cancer panel y 4 reacciones de PCR múltiple para el GeneRead DNAseq human breast cancer panel de Qiagen.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878). Los siguientes dos perfiles de temperatura se realizaron para cada uno de los paneles de cebadores.
La PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 13 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 8 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 ml de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 ml de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 128 ml de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 ml de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 10 ml de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a tubos nuevos y se analizaron en la siguiente etapa.
El tamaño, la concentración y la pureza de los fragmentos de ADN se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 ml de los fragmentos de ADN purificados obtenidos en la etapa anterior se analizaron con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 14.
EJEMPLO 14
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse incluso con una plantilla de ADN muy pequeña y/o dañada, incluyendo, en particular, para la eliminación de productos de amplificación no específicos en una p Cr múltiple con ADN FFPE como plantilla. En este ejemplo, la PCR múltiple se realizó como se describe en el EJEMPLO 6, excepto que se usaron 10 ng de ADN FFPE en cada reacción de PCR múltiple. Después de la PCR, los siguientes componentes se añadieron directamente a las reacciones anteriores: 10 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 1 pl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 7830050KU), 18 |jl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron con EDTA 0,5 M. El ADN se purificó y analizó en BioAnalyzer, como se describe en el EJEMPLO 6. Los resultados se presentan en la Figura 15. Este experimento mostró que los productos de amplificación no específicos se eliminaron eficazmente de una PCR múltiple que implica 207 pares de cebadores y 10 ng de ADN FFPE.
EJEMPLO 15
Se intentó la PCR múltiple que implica cebadores fosforilados usando los métodos descritos en el presente documento. El panel de cebadores de Ion AmpliSeq™ hotspot cancer panel v2 (Life Technologies, número de catálogo 4475346) se fosforiló en el extremo 5' mediante una polinucleótido cinasa de T4. Los cebadores se usaron luego en una reacción de PCR múltiple a 50 nM en 10 pl. La p Cr múltiple y la purificación de ADN a continuación se realizaron como se describe en el EJEMPLO 8. El ADN purificado se eluyó de perlas magnéticas en 20 pl de agua destilada.
Los fragmentos de ADN se terminaron romos en un total de 40 j l mediante la adición a la solución de ADN purificada anterior, de 4 pl de tampón de extremo romo 10X (tampón romo IX: Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MGCl2 10 mM, beta mercaptoetanol 10 mM, ATP 1 mM, dNTP 0,4 mM cada uno), 12 unidades de ADN polimerasa de T4 (Laboratorios de Molecular Cloning, número de catálogo T4DP-100), 40 unidades de polinucleótido cinasa (laboratorios Molecular Cloning, número de catálogo T4PK-100). La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8. El ADN se eluyó de perlas magnéticas en 20 pl de agua destilada.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN purificada: 4 pl de tampón de cola A 10X (tampón de cola A IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,5 pl de ATP 100 mM, 1 pl de ADN polimerasa Taq Omni Klen (4,2unidades/pl) y agua destilada a 40 pl. La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a 72 °C durante 10 minutos.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 pl de endonucleasa V iI de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 |jl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó en 10 j l de agua destilada.
Para la unión del adaptador, se sintetizaron dos oligonucleótidos mediante Integrated DNA Technologies. Un oligonucleótido tiene la misma secuencia de nucleótidos con el adaptador universal Illumina TruSeq (5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), el otro tiene la misma secuencia con el adaptador de TruSeq index 1 (5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G *C*T*T*G3'), en donde * representa el enlace fosforotioato adicionalmente añadido a las secuencias. Para hacer el adaptador bicatenario, los oligonucleótidos anteriores se mezclaron entre sí a 10 pM cada uno en tampón de ADN ligasa de T4 1X (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, MGCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM) en un total de 100 pl en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml. El tubo se colocó en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) y se calentó a 95 °C durante 2 minutos, 75 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, y se mantuvo a 25 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN anterior: 4 pl de tampón de ADN ligasa de T4, 2 pl de adaptador 10 pM, 1 pl de ADN ligasa de T4 (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0202S), 1 pl de ADN ligasa 9°N™ (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0238S), y agua destilada a 40 pl. Incubar a 16 °C, 15 minutos, luego a 45 °C, 15 minutos.
Los siguientes componentes se añadieron directamente a la reacción anterior: 1 j l de exonucleasa lambda (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0262S), 1 j l de exonucleasa I de E. coli (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0293S). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó en 20 j l de agua destilada.
Los fragmentos de ADN obtenidos de la etapa anterior se amplificaron adicionalmente mediante PCR durante 5 ciclos. Los siguientes componentes se añadieron a la solución de a Dn anterior: 5 pl de tampón de PCR 10X, 2,5 pl de mezcla de cebadores 10 pM, 2 pl de polimerasa Taq Omni KlenTaq (4,2unidades/pl) y agua destilada a 50 pl. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (GeneAmp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) mediante desnaturalización a 98 °C durante 2 minutos, luego 5 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 58 °C, 1 minuto, y luego se mantiene a 10 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los cebadores utilizados para la PCR fueron: 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' y 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante Integrated DNA Technologies.
Por último, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó de las perlas magnéticas en 20 j l de tampón TE.
El tamaño, la concentración y la pureza de las bibliotecas se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 j l de cada biblioteca obtenida en la etapa anterior se analizó con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 16. En este ejemplo, no se produjo una cantidad significativa de amplicones diana después de la unión y una segunda ronda de PCR.
EJEMPLO 16
La creación de una biblioteca sin eliminación de los adaptadores no ligados se realizó con éxito utilizando los métodos descritos en el presente documento. La PCR múltiple y la purificación de ADN a continuación se realizaron como se describe en el EJEMPLO 8. El ADN purificado se eluyó de perlas magnéticas en 20 pl de agua destilada.
Los fragmentos de ADN se terminaron romos en un total de 40 j l mediante la adición a la solución de ADN purificada anterior, de 4 pl de tampón de extremo romo 10X (tampón romo IX: Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MGCl2 10 mM, beta mercaptoetanol 10 mM, ATP 1 mM, dNTP 0,4 mM cada uno), 12 unidades de ADN polimerasa de T4 (Laboratorios de Molecular Cloning, número de catálogo T4DP-100), 40 unidades de polinucleótido cinasa (laboratorios Molecular Cloning, número de catálogo T4PK-100). La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8. El ADN se eluyó de perlas magnéticas en 20 |jl de agua destilada.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN purificada: 4 j l de tampón de cola A 10X (tampón de cola A IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,5 j l de ATP 100 mM, 1 j l de ADN polimerasa Taq Omni Klen (4,2unidades/jl) y agua destilada a 40 jl. La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a 72 °C durante 10 minutos.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 j l de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó en 10 pl de agua destilada.
Para la unión del adaptador, se sintetizaron dos oligonucleótidos mediante Integrated DNA Technologies. Un oligonucleótido tiene la misma secuencia de nucleótidos con el adaptador universal Illumina TruSeq (5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), el otro tiene la misma secuencia con el adaptador de TruSeq index 1 (5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G *C*T*T*G3'), en donde * representa el enlace fosforotioato adicionalmente añadido a las secuencias. Para hacer el adaptador bicatenario, los oligonucleótidos anteriores se mezclaron entre sí a 10 jM cada uno en tampón de ADN ligasa de T4 1X (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, MGCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM) en un total de 100 j l en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml. El tubo se colocó en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) y se calentó a 95 °C durante 2 minutos, 75 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, y se mantuvo a 25 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN anterior: 4 j l de tampón de ADN ligasa de T4, 2 j l de adaptador 10 jM , 1 j l de ADN ligasa de T4 (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0202S), 1 j l de ADN ligasa 9°N™ (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0238S), y agua destilada a 40 jl. Incubar a 16 °C, 15 minutos, luego a 45 °C, 15 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó en 20 pl de agua destilada.
Los fragmentos de ADN obtenidos de la etapa anterior se amplificaron adicionalmente mediante PCR durante 5 ciclos. Los siguientes componentes se añadieron a la solución de a Dn anterior: 5 j l de tampón de PCR 10X, 2,5 j l de mezcla de cebadores 10 jM , 2 j l de polimerasa Taq Omni KlenTaq (4,2unidades/jl) y agua destilada a 50 jl. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (GeneAmp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) mediante desnaturalización a 98 °C durante 2 minutos, luego 5 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 58 °C, 1 minuto, y luego se mantiene a 10 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los cebadores utilizados para la PCR fueron: 5' AAT GATACGGCGACCACCGA3' y 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante Integrated Dn A Technologies.
Por último, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó de las perlas magnéticas en 20 pl de tampón TE.
El tamaño, la concentración y la pureza de las bibliotecas se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 pl de cada biblioteca obtenida en la etapa anterior se analizó con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 17. Algunos productos no específicos estaban presentes en la biblioteca final.
EJEMPLO 17
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para hacer una biblioteca. Por ejemplo, la Figura 18 ilustra los resultados del uso de resolvasa para eliminar productos de amplificación no específicos en la producción de una biblioteca que implica 2915 pares de cebadores.
En este ejemplo, el panel de cebadores, GeneRead DNAseq human breast cancer panel de Qiagen, (Qiagen, número de catálogo NGHS-001X-12), como se describe en el EJEMPLO 8, se utilizó para probar el flujo de trabajo para hacer una biblioteca. La PCR múltiple y la purificación de ADN a continuación se realizaron como se describe en el EJEMPLO 8. El ADN purificado se eluyó de perlas magnéticas en 20 j l de agua destilada.
Los fragmentos de ADN se terminaron romos en un total de 40 pl mediante la adición a la solución de ADN purificada anterior, de 4 j l de tampón de extremo romo 10X (tampón romo IX: Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MGCl2 10 mM, beta mercaptoetanol 10 mM, ATP 1 mM, dNTP 0,4 mM cada uno), 12 unidades de ADN polimerasa de T4 (Laboratorios de Molecular Cloning, número de catálogo T4DP-100), 40 unidades de polinucleótido cinasa (laboratorios Molecular Cloning, número de catálogo T4PK-100). La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8. El ADN se eluyó de perlas magnéticas en 20 j l de agua destilada.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN purificada: 4 j l de tampón de cola A 10X (tampón de cola A IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,5 j l de ATP 100 mM, 1 j l de ADN polimerasa Taq Omni Klen (4,2unidades/jl) y agua destilada a 40 jl. La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a 72 °C durante 10 minutos.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MGCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 j l de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó en 10 pl de agua destilada.
Para la unión del adaptador, se sintetizaron dos oligonucleótidos mediante Integrated DNA Technologies. Un oligonucleótido tiene la misma secuencia de nucleótidos con el adaptador universal Illumina TruSeq (5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), el otro tiene la misma secuencia con el adaptador de TruSeq index 1 (5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G *C*T*T*G3'), en donde * representa el enlace fosforotioato adicionalmente añadido a las secuencias. Para hacer el adaptador bicatenario, los oligonucleótidos anteriores se mezclaron entre sí a 10 jM cada uno en tampón de ADN ligasa de T4 1X (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, MGCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM) en un total de 100 j l en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml. El tubo se colocó en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) y se calentó a 95 °C durante 2 minutos, 75 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, y se mantuvo a 25 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN anterior: 4 j l de tampón de ADN ligasa de T4, 2 j l de adaptador 10 jM , 1 j l de ADN ligasa de T4 (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0202S), 1 j l de ADN ligasa 9°N™ (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0238S), y agua destilada a 40 jl. Incubar a 16 °C, 15 minutos, luego a 45 °C, 15 minutos.
Los siguientes componentes se añadieron directamente a la reacción anterior: 1 pl de exonucleasa lambda (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0262S), 1 pl de exonucleasa I de E. coli (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0293S). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó en 20 pl de agua destilada.
Los fragmentos de ADN obtenidos de la etapa anterior se amplificaron adicionalmente mediante PCR durante 5 ciclos. Los siguientes componentes se añadieron a la solución de a Dn anterior: 5 j l de tampón de PCR 10X, 2,5 j l de mezcla de cebadores 10 jM , 2 j l de polimerasa Taq Omni KlenTaq (4,2unidades/jl) y agua destilada a 50 jl. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (GeneAmp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) mediante desnaturalización a 98 °C durante 2 minutos, luego 5 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 58 °C, 1 minuto, y luego se mantiene a 10 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los cebadores utilizados para la PCR fueron: 5' AATGATACGGCGACCACCGA3' y 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante Integrated DNA Technologies.
Por último, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X como se describe en el EJEMPLO 8 y se eluyó de las perlas magnéticas en 20 j l de tampón TE.
El tamaño, la concentración y la pureza de las bibliotecas se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 j l de cada biblioteca obtenida en la etapa anterior se analizó con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 18. En este ejemplo, los productos de amplificación diana se muestran mediante los máximos entre 200-300 pb; queda muy poco fondo después del tratamiento con resolvasa discutido anteriormente.
EJEMPLO 18
La Figura 19 ilustra otro ejemplo de una biblioteca hecha con 207 pares de cebadores, para la secuenciación. En este ejemplo, se usó el panel de cebadores de Ion AmpliSeq™ hotspot cancer panel v2 (Life Technologies, número de catálogo 4475346) en la PCR múltiple. Este panel de cebadores cubre aproximadamente 2.800 mutaciones COSMIC de 50 oncogenes y genes supresores de tumores. Tiene 207 pares de cebadores en un grupo. La reacción de PCR múltiple se realizó en 10 pl. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thomas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snapstrip II, número de catálogo 1228F73): 5 pl del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 pl de tampón de PCR 10X (tampón de PCR IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl2 5 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 pl de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/pl) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 pl de 10 ng/pl de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 pl de agua destilada.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878).
La PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 17 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 4 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la PCR, se usaron perlas paramagnéticas para absorber ADN, que luego se lavó con etanol al 70 % para eliminar proteínas, dNTP, sales y parte de los cebadores de PCR. Las perlas paramagnéticas fueron de Amsbio LLC (Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, número de catálogo MD61021). Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, luego se añadieron a cada tubo 64 pl de perlas MagSi-NGSprep, que representaban 1,6 veces del volumen de los amplicones amplificados y combinados. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. El imán dentro de la gradilla magnética era de KJ Magnetics (KJ Magnetics, número de catálogo D4X0DIA-N52). Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los fragmentos de ADN se terminaron romos en un total de 40 j l mediante la adición a la solución de ADN purificada anterior, de 4 pl de tampón de extremo romo 10X (tampón romo IX: Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MGCl2 10 mM, beta mercaptoetanol 10 mM, ATP 1 mM, dNTP 0,4 mM cada uno), 12 unidades de ADN polimerasa de T4 (Laboratorios de Molecular Cloning, número de catálogo T4DP-100), 40 unidades de polinucleótido cinasa (laboratorios Molecular Cloning, número de catálogo T4PK-100). La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 64 pl de perlas MagSi NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN purificada: 4 pl de tampón de cola A 10X (tampón de cola A IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,5 pl de ATP 100 mM, 1 pl de ADN polimerasa Taq Omni Klen (4,2unidades/pl) y agua destilada a 40 pl. La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a 72 °C durante 10 minutos.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 pl de endonucleasa Vil de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 128 pl de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 10 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Para la unión con adaptadores, se sintetizaron dos oligonucleótidos mediante Integrated DNA Technologies. Un oligonucleótido tiene la misma secuencia de nucleótidos con el adaptador universal Illumina TruSeq (5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), el otro tiene la misma secuencia con el adaptador de TruSeq index 1 (5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G *C*T*T*G3'), en donde * representa el enlace fosforotioato adicionalmente añadido a las secuencias. Para hacer el adaptador bicatenario, los oligonucleótidos anteriores se mezclaron entre sí a 10 pM cada uno en tampón de ADN ligasa de T4 1X (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, MGCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM) en un total de 100 pl en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml. El tubo se colocó en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) y se calentó a 95 °C durante 2 minutos, 75 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, y se mantuvo a 25 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN anterior: 4 pl de tampón de ADN ligasa de T4, 2 pl de adaptador 10 pM, 1 pl de ADN ligasa de T4 (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0202S), 1 pl de ADN ligasa 9°N™ (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0238S), y agua destilada a 40 pl. Incubar a 16 °C, 15 minutos, luego a 45 °C, 15 minutes.
Los siguientes componentes se añadieron directamente a la reacción anterior: 1 |jl de exonucleasa lambda (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0262S), 1 j l de exonucleasa I de E. coli (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0293S). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 64 pl de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los fragmentos de ADN obtenidos de la etapa anterior se amplificaron adicionalmente mediante PCR durante 5 ciclos. Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN anterior: 5 pl de tampón de PCR 10X, 2,5 pl de mezcla de cebadores 10 pM, 2 pl de polimerasa Taq Omni KlenTaq (4,2unidades/pl) y agua destilada a 50 pl. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (GeneAmp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) mediante desnaturalización a 98 °C durante 2 minutos, luego 5 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 58 °C, 1 minuto, y luego se mantiene a 10 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los cebadores utilizados para la PCR fueron: 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' y 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante Integrated DNA Technologies.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 64 pl de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
El tamaño, la concentración y la pureza de las bibliotecas se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 j l de cada biblioteca obtenida en la etapa anterior se analizó con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 19. Esta biblioteca fue secuenciada y analizada por SeqMatic LLC (Fremont, CA 94539), los resultados se presentaron en la Figura 22 (Tabla 1). Esta biblioteca tenía un máximo principal de 300 pares de bases (por ejemplo, entre 200 y 400 pb). La Tabla 1 muestra la confirmación de calidad de los resultados de secuenciación de la biblioteca con 207 pares de cebadores. Lo más destacado de las especificaciones son PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED 99,46 %, PCT_AMPLIFIED_BASES 95,63 %, Porcentaje de amplicón al > = 20 % de la media 98,55 %. La cobertura (PCT_TARGET_BASES_2X-PCT_TARGET_BASES_100X) mostró una excelente cobertura (99,97-100 %) en este ejemplo, mientras que la uniformidad (porcentaje de amplicón al > = 20 % de la media del 98,55 %) fue extremadamente alta.
EJEMPLO 19
La Figura 20 muestra otro ejemplo de una biblioteca hecha como se describe en el presente documento, con 207 pares de cebadores largos para la secuenciación. Un análisis de esta biblioteca se muestra en la tabla (Tabla 2) en la Figura 23. En este ejemplo, el panel de cebadores fue idéntico al de Ion AmpliSeq™ hotspot cancer panel v2 (Life Technologies, número de catálogo 4475346), excepto que se añadió 5'CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3' al extremo 5' de cada cebador directo y se añadió 5TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3' al extremo 5' de cada cebador inverso. Estos cebadores "largos" permiten la adición fácil de adaptadores en amplicones mediante una ronda adicional de PCR. La reacción de PCR múltiple se realizó en 10 pl. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thosmas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snap-strip II, número de catálogo 1228F73): 5 pl del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 pl de tampón de PCR 10X (tampón de PCR IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl2 5 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 pl de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/pl) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 pl de 10 ng/pl de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 pl de agua destilada.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878).
La PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 17 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 4 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la PCR, se usaron perlas paramagnéticas para absorber ADN, que luego se lavó con etanol al 70 % para eliminar proteínas, dNTP, sales y parte de los cebadores de PCR. Las perlas paramagnéticas fueron de Amsbio LLC (Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, número de catálogo MD61021). Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, luego se añadieron a cada tubo 64 pl de perlas MagSi-NGSprep, que representaban 1,6 veces del volumen de los amplicones amplificados y combinados. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. El imán dentro de la gradilla magnética era de KJ Magnetics (KJ Magnetics, número de catálogo D4X0DIA-N52). Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 pl de endonucleasa VII de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 128 pl de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 10 |jl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los fragmentos de ADN obtenidos de la etapa anterior se amplificaron adicionalmente mediante PCR durante 5 ciclos. Los siguientes componentes se añadieron a la solución de a Dn anterior: 5 j l de tampón de PCR 10X, 2,5 j l de mezcla de cebadores 10 jM , 2 j l de polimerasa Taq Omni KlenTaq (4,2unidades/jl) y agua destilada a 50 jl. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (GeneAmp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) mediante desnaturalización a 98 °C durante 2 minutos, luego 5 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 58 °C, 1 minuto, y luego se mantiene a 10 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los cebadores utilizados para la PCR fueron: 5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTC CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3' y 5' GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTT G3'. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante Integrated DNA Technologies.
El tamaño, la concentración y la pureza de las bibliotecas se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 pl de cada biblioteca obtenida en la etapa anterior se analizó con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 20. Esta biblioteca fue secuenciada y analizada por SeqMatic LLC (Fremont, CA 94539), los resultados se presentaron en la Tabla 2 de la Figura 23. Esta biblioteca tenía un máximo principal de 300 pares de bases (por ejemplo, entre 200-400). La confirmación de calidad de los resultados de secuenciación de la biblioteca con 207 pares de cebadores largos mostrados en la Figura 23 muestra lo más destacado de las especificaciones que incluyen PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED 99,62 %, PCT_AMPLIFIED_BASES 98,94 % y una alta uniformidad (por ejemplo, porcentaje de amplicón al > = 20 % de la media 97,52 %).
EJEMPLO 20
La Figura 21A muestra los resultados de otro ejemplo de una biblioteca hecha como se describe en el presente documento, que incluye el tratamiento con resolvasa para reducir los productos de amplificación no específicos, en la que la biblioteca se hizo con 16000 pares de cebadores para la secuenciación. La tabla 3 (Figura 24) describe un análisis de esta biblioteca.
El panel de cebadores fue Ion AmpliSeq™ comprehensive cancer panel (Life Technologies, número de catálogo 4477685). Este panel de cebadores cubre todos los exones de 409 genes supresores de tumores clave y oncogenes que con frecuencia mutan y se citan en publicaciones científicas. Esto tiene 16000 pares de cebadores en 4 grupos; cada grupo tiene aproximadamente 4.000 pares de cebadores. Las longitudes de los amplicones varían desde 125­ 175 pares de bases, la región diana cubre aproximadamente 1,73 millones de bases. Cuando las bibliotecas se hicieron con este panel y el kit de biblioteca Ion AmpliSeq™ de Life Technologies 2.0, y se secuenciaron en el sistema Ion PGM™ de Life Technologies, este panel informó una cobertura del 94 % a > 20 % de profundidad de secuencia media, con bases diana (bases mapeadas a regiones diana, del total de bases mapeadas por ciclo) del 97 %. En la PCR múltiple, cada uno de los 4 grupos de cebadores requiere 10 ng de ADN genómico humano como plantilla, un total de 40 ng para cubrir todo el panel. Hay al menos un nucleótido de uracilo en cada cebador de este panel de cebadores. Este panel de cebadores está concentrado 2 veces. Por lo tanto, se realizaron 4 reacciones de PCR con cada uno de los 4 grupos de cebadores.
La reacción de PCR múltiple se realizó en 10 jl. Los siguientes componentes se añadieron a cada uno de un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml (Thosmas Scientific, tubo de tira de PCR natural de 0,2 ml Snapstrip II, número de catálogo 1228F73): 5 j l del grupo de cebadores concentrado 2 veces, 1 j l de tampón de PCR 10X (tampón de PCR IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MGCl25 mM, dNTP 0,8 mM cada uno), 2 j l de ADN polimerasa Omni KlenTaq (4,2 unidades/jl) (Enzymatics, P7500-LC-F), 1 j l de 10 ng/jl de ADN humano (Instituto Coriell, NA12878) y 1 j l de agua destilada. Hubo 4 reacciones de PCR múltiple para el Ion AmpliSeq™ comprehensive cancer panel.
Los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml se taparon con las tapas unidas, se mezclaron en vórtex brevemente durante 3 segundos y se centrifugaron en una minicentrífuga (Pipette.com, minicentrífuga MyFuge de 12 puestos, número de catálogo C1012) durante 3 segundos. No se requirió aceite mineral para cubrir la mezcla de reacción de PCR. Los tubos se colocaron en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos, Life Technologies, número de catálogo 4314878). Los siguientes dos perfiles de temperatura se realizaron para cada uno de los paneles de cebadores.
La PCR se mantuvo inicialmente a 98 °C durante 2 minutos, seguida de 13 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 segundos e hibridación y síntesis a 60 °C durante 8 minutos. Después del ciclo, las reacciones se mantuvieron a 10 °C hasta proceder a la siguiente etapa.
Después de la PCR, se combinaron las 4 reacciones que representaban el panel de cebadores completo de cualquiera de Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panel, dando como resultado 1 tubo de una biblioteca de amplicón amplificado de 40 pl. Se usaron perlas paramagnéticas para absorber ADN, que luego se lavó con etanol al 70 % para eliminar proteínas, dNTP, sales y parte de los cebadores de PCR. Las perlas paramagnéticas fueron de Amsbio LLC (Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, número de catálogo MD61021). Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, luego se añadieron a cada tubo 64 pl de perlas MagSi-NGSprep, que representaban 1,6 veces del volumen de los amplicones amplificados y combinados. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. El imán dentro de la gradilla magnética era de KJ Magnetics (KJ Magnetics, número de catálogo D4X0DIA-N52). Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los fragmentos de ADN se terminaron romos en un total de 40 pl mediante la adición a la solución de ADN purificada anterior, de 4 pl de tampón de extremo romo 10X (tampón romo IX: Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MGCl2 10 mM, beta mercaptoetanol 10 mM, ATP 1 mM, dNTP 0,4 mM cada uno), 12 unidades de ADN polimerasa de T4 (Laboratorios de Molecular Cloning, número de catálogo T4DP-100), 40 unidades de polinucleótido cinasa (laboratorios Molecular Cloning, número de catálogo T4PK-100). La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 64 pl de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN purificada: 4 pl de tampón de cola A 10X (tampón de cola A IX: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,5 pl de ATP 100 mM, 1 pl de ADN polimerasa Taq Omni Klen (4,2unidades/pl) y agua destilada a 40 pl. La mezcla de reacción en cada tubo primero se centrifugó brevemente durante 3 segundos en una minicentrífuga para recoger todas las gotitas en el fondo del tubo, se mezcló en vórtex durante 3 segundos y, luego, se centrifugó durante 3 segundos otra vez para garantizar la uniformidad de la reacción. Los tubos se incubaron a 72 °C durante 10 minutos.
Después de la incubación, la mezcla de reacción procedió directamente a esta etapa sin cambiar el tampón. Los siguientes componentes se añadieron directamente a cada una de las reacciones anteriores: 20 pl de tampón de digestión 2X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl2 15 mM, beta mercaptoetanol 20 mM), 2 pl de endonucleasa Vil de T4 (Affymetrix, número de pieza 78300 50KU), 18 pl de agua destilada. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 128 j l de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 j l de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 10 j l de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Para la unión con adaptadores, se sintetizaron dos oligonucleótidos mediante Integrated DNA Technologies. Un oligonucleótido tiene la misma secuencia de nucleótidos con el adaptador universal Illumina TruSeq (5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), el otro tiene la misma secuencia con el adaptador de TruSeq index 1 (5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G *C*T*T*G3'), en donde * representa el enlace fosforotioato adicionalmente añadido a las secuencias. Para hacer el adaptador bicatenario, los oligonucleótidos anteriores se mezclaron entre sí a 10 jM cada uno en tampón de ADN ligasa de T4 1X (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, MGCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM) en un total de 100 j l en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml. El tubo se colocó en un termociclador (Gene-Amp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) y se calentó a 95 °C durante 2 minutos, 75 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, y se mantuvo a 25 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los siguientes componentes se añadieron a la solución de ADN anterior: 4 j l de tampón de ADN ligasa de T4, 2 j l de adaptador 10 jM , 1 j l de ADN ligasa de T4 (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0202S), 1 j l de ADN ligasa 9°N™ (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0238S), y agua destilada a 40 jl. Incubar a 16 °C, 15 minutos, luego a 45 °C, 15 minutes.
Los siguientes componentes se añadieron directamente a la reacción anterior: 1 pl de exonucleasa lambda (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0262S), 1 pl de exonucleasa I de E. coli (New England BioLabs Inc., número de catálogo M0293S). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 5 minutos.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 64 j l de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 j l de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 j l de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
Los fragmentos de ADN obtenidos de la etapa anterior se amplificaron adicionalmente mediante PCR durante 5 ciclos. Los siguientes componentes se añadieron a la solución de a Dn anterior: 5 j l de tampón de PCR 10X, 2,5 j l de mezcla de cebadores 10 jM , 2 j l de polimerasa Taq Omni KlenTaq (4,2unidades/jl) y agua destilada a 50 jl. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (GeneAmp® PCR system 9700 chapado en oro de 96 pocillos) mediante desnaturalización a 98 °C durante 2 minutos, luego 5 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 58 °C, 1 minuto, y luego se mantiene a 10 °C hasta pasar a la siguiente etapa.
Los cebadores utilizados para la PCR fueron: 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' y 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'. Estos oligonudeótidos se sintetizaron mediante Integrated Dn A Technologies.
Después de la reacción, el ADN se purificó una vez con perlas MagSi-NGSprep 1.6X. Las perlas MagSi-NGSprep se suspendieron completamente en el recipiente mediante mezcla en vórtex, se añadieron 64 pl de perlas MagSi-NGSprep a cada tubo. Estos tubos se mezclaron mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en una gradilla magnética para capturar las perlas durante 2 minutos. Una vez que la solución se aclaró, el sobrenadante se pipeteó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento de perlas. Sin quitar los tubos de la gradilla magnética, se añadieron 150 pl de etanol al 70 % recién preparado a cada tubo. Luego, los tubos se rotaron 180 grados en la gradilla magnética, permitiendo que los gránulos de perlas se separen de un lado de la pared interna de cada tubo y los sedimentos en el lado opuesto. Una vez que la solución se aclaró, los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente y se desecharon sin alterar el sedimento de perlas. Las perlas se lavaron con etanol al 70 % de esta manera durante un total de 2 veces. Después de pipetear el etanol al 70 % en el lavado final, los tubos se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos. Cualquier gotita de etanol restante dentro de los tubos se pipeteó sin alterar los sedimentos de perlas. Los sedimentos de perlas se secaron al aire durante 3 minutos a temperatura ambiente en la gradilla magnética con las tapas de los tubos abiertas. Por último, los tubos se retiraron de la gradilla magnética y se añadieron 20 pl de agua destilada a cada tubo. Los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas en agua destilada, se centrifugaron en una minicentrífuga durante 3 segundos y se colocaron en la gradilla magnética durante 2 minutos. Después de que la solución se aclaró, los sobrenadantes que contenían los fragmentos de ADN eluidos se transfirieron a un tubo nuevo, respectivamente.
El tamaño, la concentración y la pureza de las bibliotecas se analizaron en un instrumento BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, número de catálogo G2938B). 1 pl de cada biblioteca obtenida en la etapa anterior se analizó con un kit de análisis de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, número de catálogo 5067-4626), de acuerdo con los métodos proporcionados por el proveedor. Los resultados se presentan en la Figura 21B. Esta biblioteca fue secuenciada y analizada por SeqMatic LLC (Fremont, CA 94539), los resultados se presentaron en la Tabla 3 (Figura 24). Como se describe en la Figura 21A, la biblioteca (que puede usarse para la secuenciación de próxima generación) se hizo con 16000 pares de cebadores y ADN genómico humano (NA12878) mediante los métodos descritos en el Ejemplo 3, y la biblioteca final mostrada en la Figura 21B. Esta biblioteca es el máximo único de 300 pares de bases (entre 200-400 pb). Como se muestra en la Tabla 3 (Figura 24), la confirmación de calidad de los resultados de secuencia de esta biblioteca realizada con 16000 pares de cebadores da como resultado una alta cobertura y uniformidad (por ejemplo, PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED 98,18 %, PCT_AMPLIFIED_BASES 99,39 %, Porcentaje de amplicón al > = 20 % de la media 95,20 %).
La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante de la invención. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/una" y "el" "la" pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Se entenderá además que los términos "comprende" y/o "que comprende", cuando se usan en esta memoria descriptiva, especifican la presencia de características, etapas, operaciones, elementos y/o componentes establecidos, pero no excluyen la presencia o adición de una o más de otras características, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos. Como se usa en el presente documento, el término "y/o" incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados y puede abreviarse como "/".
Aunque los términos "primero" y "segundo" pueden usarse en el presente documento para describir varias características/elementos (incluidos las etapas), estas características/elementos no deben estar limitados por estos términos, a menos que el contexto indique lo contrario. Estos términos pueden usarse para distinguir una característica/elemento de otra característica/elemento. Por lo tanto, una primera característica/elemento discutido a continuación podría denominarse una segunda característica/elemento, y de manera similar, una segunda característica/elemento discutido a continuación podría denominarse una primera característica/elemento sin apartarse de las enseñanzas de la presente invención.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones que la siguen, a no ser que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" significa que varios componentes se pueden emplear conjuntamente en los métodos y artículos (por ejemplo, composiciones y aparatos, que incluyen dispositivos y métodos). Por ejemplo, se entenderá que la expresión "que comprende" implica la inclusión de cualquier elemento o etapa establecida, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o etapa.
Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, que incluye como se usa en los ejemplos y, a menos que se especifique expresamente lo contrario, todos los números pueden leerse como precedidos por la palabra "aproximadamente" o "alrededor de", incluso si el término no aparece de forma expresa. La frase "aproximadamente" o "alrededor de" se puede usar cuando se describe la magnitud y/o posición para indicar que el valor y/o la posición descrita está dentro de un intervalo de valores y/o posiciones razonable esperado. Por ejemplo, un valor numérico puede tener un valor que es /- 0,1 % del valor establecido (o intervalo de valores), /- 1 % del valor establecido (o intervalo de valores), /- 2 % del valor establecido (o intervalo de valores), /- 5 % del valor establecido (o intervalo de valores), /- 10 % del valor establecido (o intervalo de valores), etc. También debe entenderse que cualquier valor numérico dado en el presente documento incluye aproximadamente o alrededor de ese valor, a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", entonces se divulga también "aproximadamente 10". Cualquier intervalo numérico citado en el presente documento pretende incluir todos los subintervalos subincluidos en el mismo. Se entiende también que cuando se divulga un valor que es "inferior o igual a" el valor, "superior o igual al valor" y posibles intervalos entre valores también se divulgan, como entiende apropiadamente un experto en la materia. Por ejemplo, si se divulga el valor "X", también se divulga "inferior o igual a X" así como "superior o igual a X" (por ejemplo, donde X es un valor numérico). También se entiende que, en toda la solicitud, los datos se proporcionan en un número de distintos formatos, y que estos datos, representan puntos finales y puntos de partida, y los intervalos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, si se divulgan un punto de dato particular "10" y un punto de dato particular "15", se entiende que superior a, superior o igual a, inferior a, inferior o igual a, e igual a 10 y 15 se consideran divulgados así como entre 10 y 15. Se entiende también que cada unidad entre dos unidades particulares se divulgan también. Por ejemplo, si se divulgan 10 y 15, entonces 11, 12, 13 y 14 se divulgan también.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para reducir productos de amplificación no específicos de una reacción de extensión de cebadores dependiente de plantilla, comprendiendo el método:
amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana usando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana en donde dicha amplificación genera una pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos;
introducir una resolvasa que reconoce una estructura de ADN anormal y escindir dichos productos de amplificación no específicos con la resolvasa para generar una pluralidad de productos de amplificación no específicos escindidos mientras se mantiene una proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana, en donde la resolvasa es una de: endonucleasa VII de T4 o endonucleasa I de T7.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además eliminar los productos de amplificación no específicos escindidos, dejando la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la amplificación comprende realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichos ácidos nucleicos diana comprenden ADN, ARN, ADN genómico o ADNc.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos cebadores específicos de diana comprenden al menos 10 pares de cebadores específicos de diana.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos cebadores específicos de diana comprenden más de 100.000 pares de cebadores específicos de diana.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha resolvasa reconoce una estructura de ADN anormal que comprende al menos una de estructuras o uniones de Holliday, ADN ramificados, estructuras en Y, cruciformes, bucles heteroduplex, aductos voluminosos, salientes monocatenarios, emparejamientos incorrectos de ADN o ADN que no coinciden perfectamente.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la resolvasa es endonucleasa VII de T4.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además escindir dichos productos de amplificación no específicos con una exonucleasa.
10. El método de la reivindicación 9, que comprende además escindir dichos productos de amplificación no específicos con una exonucleasa que comprende al menos una de exonucleasa lambda o exonucleasa I de E. coli, después de realizar una reparación de extremos en la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además realizar una reparación de extremos en la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana y una pluralidad de productos de amplificación no específicos antes de la introducción de la resolvasa.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la unión de adaptadores a la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana después de la introducción de la resolvasa.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la escisión de dichos productos de amplificación no específicos con la resolvasa comprende la exposición de los productos de amplificación no específicos y la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana a entre aproximadamente 0,2 U y 1000 U de resolvasa durante aproximadamente 0,5 minutos y 60 minutos a una temperatura entre 16 °C y 37 °C.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proporción sustancial de dicha pluralidad de productos de amplificación específicos de diana comprende más de un 50 % de la pluralidad de productos de amplificación específicos de diana.
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