ES2922645T3 - Ensayos de unión en fase líquida - Google Patents

Abstract

Ensayos de ligación en fase líquida para la detección de secuencias de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayos de unión en fase líquida

Campo técnico

Esta invención se relaciona con la biología molecular y, más particularmente, con ensayos para detectar secuencias de ácidos nucleicos en muestras.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona un método para detectar secuencias de ácido nucleico diana en una muestra de acuerdo con la reivindicación 1 y un kit de acuerdo con la reivindicación 17 para realizar este método. También se describen en la presente descripción métodos para detectar secuencias diana de secuencias de ácidos nucleicos de interés en una muestra y también proporciona kits para realizar el método.

En un ensayo de unión típico, la muestra se pone en contacto con un conjunto de oligos detectores, donde se proporcionan un detector aguas abajo (DD) y un detector aguas arriba (UD) para cada secuencia diana. Una porción (DR') de la DD es complementaria a una región de la secuencia diana designada como región aguas abajo (DR). El detector aguas arriba tiene una porción (UR') complementaria a una región aguas arriba (UR) de la secuencia diana. Los detectores aguas abajo y aguas arriba se ponen en contacto con la muestra y se les permite hibridar con las regiones correspondientes de la secuencia diana presente en la muestra. Cuando los detectores se hibridan específicamente con una secuencia diana, pueden unirse en el sitio de unión entre detectores adyacentes, ya sea directamente o después de una etapa de extensión opcional. Por lo tanto, la formación de un producto de unión sirve como prueba de que la secuencia diana estaba presente en la muestra y el producto de unión puede detectarse mediante varios métodos, como marcadores detectables, micromatrices, qPCR, contadores de flujo continuo y secuenciación.

El documento WO 2014/149599 describe una técnica de unión en tándem, por ejemplo, la unión de dos o más oligonucleótidos de secuencia fija y uno o más oligonucleótidos puente complementarios a una región entre los oligonucleótidos de secuencia fija, combinada con la detección de niveles de regiones genómicas particulares mediante el uso de hibridación en matriz.

El documento WO 2011/041411 describe un método para detectar un polimorfismo de un solo nucleótido que incluye proporcionar un primer polinucleótido molde, un segundo polinucleótido que comprende una primera y una segunda secuencia (complementario a una primera porción del primer polinucleótido) y un tercer polinucleótido (complementario a una segunda porción del primer polinucleótido). Los polinucleótidos primero, segundo y tercero se hibridan, se unen y, opcionalmente, se repiten estas etapas.

El documento EP1975254 A1 describe un método de detección de secuencias de nucleótidos.

El documento WO 2006/071582 describe reacciones de unión y amplificación que generan productos de polinucleótidos autocomplementarios. Las reacciones de unión se realizan con sondas que dan como resultado la formación de un producto de unión autocomplementario. La unión de un enlazador de horquilla al producto de unión autocomplementario puede formar un producto de unión en bucle.

El documento WO 2014/036743 describe un método para el análisis de ácidos nucleicos por multiplex. El método incluye etapas de hibridación de conjuntos de sondas con ácidos nucleicos diana en una muestra, unión de las sondas hibridadas, amplificación de las sondas unidas y análisis de los productos de amplificación para determinar la presencia, ausencia o cantidad de los ácidos nucleicos diana en la muestra.

El documento WO 2012/158967 describe composiciones, aparatos y métodos para detectar una o más dianas de ácido nucleico presentes en una muestra. Los métodos incluyen la utilización de dos o más sondas de unión que se unen de manera reversible a un ácido nucleico diana en estrecha proximidad entre sí y poseen porciones de unión reactivas complementarias.

El documento EP150007710 describe un método para detectar ácidos nucleicos diana.

El documento WO 2008/094902 describe composiciones y métodos para generar una señal indicativa de la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra mediante el uso de un dúplex cebador-sonda.

La presente descripción proporciona ensayos en los que se proporcionan una o más nucleasas durante las etapas del método para degradar selectivamente detectores no usados o en exceso o detectores que no están hibridados específicamente con secuencias diana. En consecuencia, los detectores y otros componentes del ensayo se configuran en varios ejemplos para resistir las nucleasas mientras detectan secuencias diana. Las configuraciones permiten la detección sensible de ácidos nucleicos, tales como ARNm y miARN, en la multiplexación de transcriptoma completo o miRNoma y al nivel de células individuales. Además, las etapas pueden realizarse en un solo pozo o recipiente sin necesidad de transferencias, separación o inmovilización en fase sólida y por lo tanto, son ideales para plataformas de microfluidos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra un ensayo de unión representativo para detectar secuencias de ácido nucleico diana. Brevemente, se permite que los oligonucleótidos de sonda del detector aguas abajo (DD) y el detector aguas arriba (UD) (a) hibriden con una secuencia diana, que tiene regiones DR y UR, en una muestra. Por conveniencia de identificación, las regiones aguas arriba a menudo se subrayan en la presente descripción. Mientras se hibrida con DR y UR de la secuencia diana, el DD está (b2) unido selectivamente a la UR. Opcionalmente, el DD se extiende (b0) antes de la unión (b2). El producto de unión se amplifica opcionalmente (c) a través de las regiones de amplificación P1 y P2' por uno o más cebadores, como P1 y P2.

La Figura 2a muestra un diseño de ensayo "anclado" de la invención en el que el UD se configura con una segunda región complementaria (UR2' o "ancla") separada por una región no complementaria (CP1). El DD y el UD pueden hibridar con una secuencia diana como en la Figura 2b, tras formar un complejo de hibridación (HC) que proporciona un sustrato para la unión en el sitio de unión (L) entre DR' y UR'. Después de la unión, La Figura 2c muestra que el producto de unión (LP) puede amplificarse con cebadores para producir productos de amplificación (AP) en la Figura 2d.

El tratamiento con una exonucleasa, tal como una exonucleasa con actividad monocatenaria de 3' a 5', puede usarse en varias etapas del método para eliminar componentes no deseados, como detectores DD y UD no unidos o en exceso como en la Figura 2e. Los detectores que están hibridados de forma no específica o incompleta con las secuencias diana pueden ser degradados por la exonucleasa o no darán como resultado un producto de unión o amplificación, como en la Figura 2f.

Como se muestra en la Figura 2g, puede ser deseable proporcionar cantidades predeterminadas de ^{oligonucleótidos atenuadores como UR2' (o alternativamente} U^r2) ^{para disminuir la formación de productos} resultantes de ciertas secuencias diana muy abundantes (HAT).

La Figura 2h muestra un par de detectores que se configuran para tener una modificación en un extremo para resistir las exonucleasas que degradan el ADN monocatenario (ss). El UD tiene una modificación en el extremo 3' que resiste la degradación del detector por una exonucleasa que tiene actividad 3' en cadenas sencillas de ADN. Alternativamente, el DD puede tener una modificación 5' para resistir la degradación por una exonucleasa ss 5'.

Las Figuras 2i y 2j ilustran detectores que se configuran para resistir exonucleasas tras hibridarse con un oligoprotector, como los que tienen la secuencia DR2 o UR2 que se unen a las secuencias DR2' y UR2' correspondientes de los detectores, de manera que presentan estructuras de doble cadena en cada extremo. Los protectores pueden modificarse en 5' o 3' para resistir las exonucleasas, como se muestra. La Figura 2j también ilustra una secuencia diana (3-DR-UR -5') que es relativamente corta, como un microARN, en la que la diana se ha poliadenilado en su extremo 3'. El DD presenta una porción de poli-T complementaria adyacente a la DR'.

La Figura 3a representa un diseño de ensayo circularizable mediante el uso de una sonda oligo detectora (DO) que puede (a) hibridarse a través de las regiones DR' y UR' con una secuencia diana, de manera que forma una estructura circularizada (no covalente). Después del tratamiento con una nucleasa y una ligasa, puede (c) amplificarse un producto de unión circularizado. Las Figuras 3b, 3c y 3d ilustran detectores de DO parcialmente hibridados, detectores hibridados con secuencias no diana o detectores hibridados de forma no específica, que pueden ser digeridos por nucleasas o ser inadecuados para la amplificación exponencial. La Figura 4 muestra un ensayo en el que se proporciona una segunda cadena (universal) (2S) durante la hibridación para que la diana (DR-UR), DO y el 2S formen una estructura de doble cadena circular. El tratamiento con ligasa da como resultado un producto de unión circularizado covalentemente. Opcionalmente, las nucleasas ss pueden usarse para degradar detectores en exceso y complejos de hibridación que no son específicos para la diana. Las nucleasas pueden inactivarse. Si se desea, la estructura circularizada puede linealizarse, por ejemplo, mediante una endonucleasa de restricción.

La Figura 5a muestra una vista detallada de un complejo de hibridación mediante el uso de una variante de DO circularizable que tiene una aleta corta no complementaria (CP5) en su extremo 5' y, opcionalmente, una secuencia corta no complementaria (CP3) en el extremo 3'. La Figura 5b muestra el complejo de hibridación después de que una nucleasa de aleta, como Fen-1, elimina el CP5. Si se desea, el extremo 5' puede fosforilarse, como en la Figura 5c. La Figura 5d ilustra cómo CP3 puede llenar el espacio dejado por Fen-1, de modo que el DO pueda unirse en forma circular como en la Figura 5e. Las aletas CP5 y/o CP3 no complementarias pueden incorporarse en cualquiera de los diseños DD y UD.

La Figura 6a proporciona secuencias diana (SEQ ID NO: 33-56) usadas para diseñar detectores para productos de expresión de ARNm para 24 genes humanos de interés. Los genes se seleccionaron para demostrar la detección en un intervalo esperado de 6 órdenes de magnitud en abundancia, con entrada de ARN de muestra de 10, 1 y 0,1 ng. El número de productos de unión amplificados, confirmados por secuenciación, se muestran para diseños de detector anclado (Figuras 6b, 6c y 6d) y diseños circularizables (Figuras 6e, 6f y 6g). El eje x es para la primera réplica técnica; el eje y es para la segunda réplica.

Descripción detallada de la invención

ensayos de unión, generalmente

Un ensayo de unión típico se ilustra esquemáticamente en la Figura 1, que se analiza con más detalle en el Ejemplo 1. Una muestra que puede contener secuencias diana se pone en contacto con un grupo de sondas detectaras de oligonucleótidos ("sondas" o "detectores"). Para cada secuencia diana, se proporciona un par de detectores: un detector aguas abajo (DD) y un detector aguas arriba (UD). Un detector aguas abajo puede tener una porción (DR') que es complementaria a una región de la secuencia diana designada como región aguas abajo (DR). Un detector aguas arriba puede tener una porción (UR') que es complementaria a una región de la secuencia diana designada como la región aguas arriba (UR). Aquí, los términos "aguas abajo" y "aguas arriba" se usan en relación con la dirección de transcripción de 5' a 3' cuando la secuencia diana es una porción de un ARNm y, por conveniencia, las regiones designadas como aguas arriba a menudo se muestran subrayadas.

Como se muestra en la Figura 1, se permite que la DR' del DD y la UR' del UD para cada secuencia diana hibriden con la DR y la UR correspondientes de la secuencia diana, si están presentes en la muestra. Cuando las DR y UR de una secuencia diana son adyacentes y las DR' y UR' del par de oligos detectores se hibridan específicamente con la secuencia diana para formar un complejo de hibridación, los detectores DD y UD adyacentes pueden unirse. Por lo tanto, la formación de un producto de unión de DD-UD sirve como evidencia de que la secuencia diana (DR-UR) estaba presente en la muestra. En los casos en que las DR y UR de una secuencia diana estén separadas por al menos un nucleótido, la etapa de unión puede estar precedida por extender la DR' (b0) mediante el uso de la muestra como plantilla para que las DR' y UR' extendidas se vuelvan adyacentes y puedan unirse. El producto de unión puede detectarse después por una variedad de medios; si se desea, los productos pueden amplificarse antes de la detección.

La presente descripción proporciona métodos en los que los complejos de hibridación se exponen en una o más etapas a al menos una nucleasa que puede degradar cadenas sencillas de ácido nucleico. Como se analiza con más detalle a continuación, la descripción proporciona detectores y otros componentes del ensayo que están configurados para resistir selectivamente las nucleasas al detectar secuencias diana. Las nucleasas pueden degradar los detectores sobrantes o no usados, o los detectores que están unidos de forma no específica o no productiva a componentes de la muestra que no son de interés. El uso estratégico de nucleasas permite que el ensayo de unión se realice tras añadir un reactivo tras otro en un solo recipiente de reacción, se comienza con la muestra.

muestras

Las muestras usadas en el método pueden ser cualquier sustancia en la que se desee detectar si está presente una secuencia diana de un ácido nucleico de interés. Tales sustancias son típicamente de origen biológico, pero pueden provenir de muestras ambientales o creadas artificialmente. Las muestras biológicas pueden ser de animales vivos o muertos, plantas, levaduras y otros microorganismos, procariotas o líneas celulares de estos. Los ejemplos particulares de animales incluyen humanos, primates, perros, ratas, ratones, peces cebra, moscas de la fruta (como Drosophila melanogaster), varios gusanos (como Caenorhabditis elegans) y cualquier otro animal estudiado en laboratorios o como modelos animales de enfermedades. Las muestras pueden estar en forma de organismos o sistemas completos, muestras de tejido, muestras de células o muestras sin células. Los ejemplos particulares son células cancerosas, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), hepatocitos primarios y linfocitos y subpoblaciones de estos. Las muestras pueden proporcionarse en fase líquida, como homogeneizados sin células o medios líquidos de cultivos de tejidos, o células no adherentes en suspensión, fragmentos de tejido u homogeneizados, o en fase sólida, como cuando la muestra se monta en un portaobjetos o en forma de células o tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE), o cuando las células se cultivan sobre o en una superficie, siempre que los detectores puedan ponerse en contacto para una posible hibridación con los ácidos nucleicos de la muestra.

ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos de interés para ser detectados en muestras incluyen el genoma, el transcriptoma y otros conjuntos funcionales de ácidos nucleicos y subconjuntos y fracciones de estos. Los ácidos nucleicos de interés pueden ser ADN, como ADN nuclear o mitocondrial, o ADNc que se transcribe inversamente a partir de ARN. La secuencia de interés también puede ser de ARN, como ARNm, ARNr, ARNt, ARNip (por ejemplo, ARN de interferencia pequeños, ARN inhibidores pequeños y ARN inhibidores sintéticos), ARN antisentido, ARN circulares o ARN largos no codificantes. El ácido nucleico de interés puede ser un microARN (miARN) en cualquier etapa de procesamiento, como un microARN primario (pri-miARN), un microARN precursor (pre-miARN), una variante de microARN que forma horquilla (miARN*), o un miARN maduro. La detección de microARN se analiza en el Ejemplo 3a.

Los ácidos nucleicos de interés relativamente cortos, como los miARN maduros, pueden alargarse para mejorar la hibridación con los detectores. Por ejemplo, muchos microARN se fosforilan en un extremo y pueden alargarse mediante unión química o enzimática con un oligo suplementario. El oligo suplementario puede ser monocatenario, bicatenario o parcialmente bicatenario, en dependencia del método de unión que se utilice. Si se desea, el oligo suplementario puede ser único para cada secuencia diana o puede ser genérico para algunas o todas las secuencias diana que se están uniendo. A continuación, los detectores pueden diseñarse con regiones DR' y/o UR' extendidas que incluyen una porción que se hibrida con la secuencia suplementaria. Una secuencia diana también puede suplementarse tras añadir nucleótidos, como por poliadenilación, donde los detectores extendidos incluyen al menos una porción para hibridar con la cola poliA suplementaria. La detección de una familia de secuencias de miARN maduros mediante el uso de detectores extendidos se analiza en el Ejemplo 3b y se ilustra en la Figura 2j. La cantidad de ácido nucleico en la muestra variará según el tipo de muestra, la complejidad y la pureza relativa de la muestra. Debido a la sensibilidad del ensayo, la muestra puede tomarse de un pequeño número de células, por ejemplo, de menos de 100000, 10000, 1000, 100, 50, 20, 10, 5 o incluso de una sola célula. La cantidad total de ácido nucleico en la muestra también puede ser bastante pequeña: menos de 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1 microgramos, 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 nanogramos, 50, 20, 10, 5, 2, 1 picogramo o menos de ácido nucleico (consulte la Figura 6d). El número de copias de una secuencia diana particular puede ser inferior a 100000, 10000, 1000, 100, 50, 20, 10, 5 o incluso una sola copia presente en la muestra, particularmente cuando se combina con una amplificación representativa del producto de unión para la detección. La cantidad de ácido nucleico de entrada también variará, por supuesto, en dependencia de la complejidad de la muestra y el número de secuencias diana a detectar.

detectores

Sobre la base de las secuencias diana particulares, la descripción proporciona grupos de oligos detectores en los que una secuencia diana tiene un par de detectores aguas arriba y aguas abajo (UD y DD) que corresponden a DR y Ur , que típicamente son subsecuencias de toda la secuencia de ácido nucleico de interés. Pueden proporcionarse detectores para detectar dianas que contienen mutaciones, que incluyen polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) individuales, fusiones de genes y variantes de empalme de exones. Una secuencia diana individual puede tener más de un conjunto de DR y UR, que el usuario puede seleccionar para optimizar el rendimiento del ensayo. Múltiples conjuntos de las DR y UR pueden proporcionar múltiples mediciones de la misma secuencia diana o de diferentes porciones de la secuencia diana, tales como diferentes exones o sitios de unión de exones o proporcionar la medición de una porción de la secuencia que no está mutada frente a una porción de la secuencia que puede albergar una mutación.

secuencias diana

Las secuencias diana pueden seleccionarse de cualquier combinación de secuencias o subsecuencias en el genoma o transcriptoma de una especie o un ambiente. El conjunto puede ser específico para un tipo de muestra, como un tipo de célula o tejido. Para algunos tipos de muestras, el número de secuencias diana puede oscilar en cualquier combinación de límites superior e inferior de 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 23000, 30000, 38000, 40000, 50000 o más. El número de secuencias diana también puede expresarse como un porcentaje del número total de un conjunto definido de secuencias, como los ARN en el transcriptoma humano o los genes en el genoma humano, con cualquier combinación de límites superior e inferior de 0,1 %, 0,2 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 65 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95 % y 100 %. Cuando se usan conjuntos grandes de oligos detectores, puede ser útil comprobar la secuencia completa de cada oligo para detectar posibles hibridaciones cruzadas con otros oligos del conjunto, donde, por ejemplo, un oligo puede servir inadvertidamente como plantilla para otros detectores. Si bien estos artefactos no específicos pueden identificarse por secuencia y típicamente se descartan de los resultados de detección, pueden representar eventos de hibridación no informativos que compiten por los recursos de reacción. Los propios oligos detectores pueden ser ADN, ARN o una mezcla o híbrido de ambos. Si se desea, pueden tener un nucleótido modificado como didesoxinucleótidos, desoxiuridina (dU), 5-metilcitosina (5mC), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC), 5-carboxilcitosina (5caC) e inosina. Aún otras modificaciones de los oligos detectores incluyen bases modificadas como 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, 2-fluorobases, 5-bromouracilo o 5-nitroindol. Otros oligos detectores pueden tener una cadena principal de azúcar-fosfato modificada en una o más posiciones. Dichas modificaciones incluyen una inversión de enlace 3'-3' o 5'-5', un ácido nucleico bloqueado (LNA) o una cadena principal de ácido nucleico peptídico (PNA). Los LNA pueden ser útiles por sus propiedades de hibridación más fuertes con bases complementarias, lo que mejora la selectividad o la afinidad de unión general por el oligo detector en su conjunto. Las bases o enlaces modificados también pueden usarse en las posiciones 1, 2 o 3 alejadas del punto de unión.

Como se muestra esquemáticamente en la Figura 1, un detector aguas abajo (DD) tiene una región complementaria aguas abajo (DR'), que puede ser al menos de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. De manera similar, un detector aguas arriba (UD) tiene una región complementaria aguas arriba (UR'), que puede ser al menos de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. En un par dado de DD y UD para una secuencia diana, las DR' y UR' no necesitan tener exactamente la misma longitud, pero típicamente serán similares para que puedan hibridarse con la diana en condiciones y rigurosidad similares.

Como se analiza con más detalle a continuación, los detectores pueden optimizarse para la unión, por ejemplo, tras proporcionar un 5'-fosfato en la UD, aunque esto no es necesario, en dependencia de la selección de la ligasa u otros métodos de unión. Los ribonucleótidos también pueden sustituirse en los extremos de unión de los DD y UD para aumentar la especificidad y la eficacia de la unión, como cuando se usa una ligasa de ARN.

marcadores de detectores

Cuando el ensayo de unión precede directamente a una etapa de detección, uno o ambos detectores pueden diseñarse para marcarse adecuadamente para la detección. Por ejemplo, el detector puede marcarse con un colorante de color o fluorescente, una perla de látex, puntos cuánticos o nanopuntos. El marcador también puede adoptar la forma de una secuencia de nucleótidos adicional que sirve para permitir la detección y la identificación, tal como una secuencia de código de barras. Por ejemplo, una secuencia de código de barras útil puede identificar de forma única el gen específico o la secuencia diana, o un grupo de genes seleccionados o secuencias diana dentro de la muestra que se está midiendo. Tales secuencias pueden posicionarse entre la secuencia UR' y P2', y/o entre la secuencia DR' y P1, de modo que se amplifiquen cuando se utilicen cebadores flanqueantes. Esta secuencia también puede ser una secuencia aleatoria, útil para identificar el número de copias del gen diana en la muestra, independientemente de la eficiencia particular de cualquier etapa de amplificación.

hibridación

Volviendo a las etapas del ensayo, los detectores se proporcionan de modo que entren en contacto con la muestra para permitir que los detectores hibriden específicamente con los ácidos nucleicos diana. El experto en la técnica puede seleccionar las condiciones de hibridación para permitir y optimizar la hibridación entre los polinucleótidos con el grado deseado de especificidad o desajustes, y tales condiciones variarán con las longitudes y composiciones de las secuencias presentes en la reacción de hibridación, la naturaleza de cualquier modificación, así como también condiciones tales como las concentraciones de los polinucleótidos y la fuerza iónica. Las temperaturas de hibridación particulares incluyen 30 °, 32,5 °, 35 °, 37,5 °, 40 °, 42,5 °, 45 °, 47,5 °, 50 °, 52,5 °, 55 °, 57,5 °, 60 °, 62,5 °, 65 °, 67,5 °, 70 °, 72,5 °, 75 °, 77,5 °, 80 °, 82,5 °, 85 °, 87,5 ° y/o 90 °. Pueden lograrse temperaturas de hibridación particulares tras aumentar o disminuir la temperatura a varias tasas y perfiles, como mesetas de temperatura cronometradas, uno o más aumentos o disminuciones incrementales de 5 °C, 10 °C o 15 °C y ciclos repetidos entre dos o más temperaturas. Los iones como Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+ y/o Mn2+ también pueden estar presentes en 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 y 500 mM, y tales iones pueden afectar la selección de las otras condiciones de hibridación. La hibridación también se ve afectada por componentes estéricos como polisacáridos ramificados, glicerol y polietilenglicol. En las reacciones de hibridación (y posteriores), pueden estar presentes aditivos adicionales tales como DMSO, detergentes no iónicos, betaína, etilenglicol, 1,2-propanodiol, formamida, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) y/o proteínas como la albúmina de suero bovino (BSA), de acuerdo con la especificidad deseada.

Opcionalmente, las condiciones para la hibridación pueden ajustarse o ponerse a punto para permitir que se realicen otras etapas en el mismo ambiente. Por ejemplo, los mismos tampones usados para la hibridación pueden usarse para lisar células en una muestra, lo que promueve la hibridación de ciertos tipos celulares, facilita la eliminación o penetración de las paredes celulares, membranas celulares o fracciones subcelulares, según se desee. En dependencia del método de unión usado en el ensayo, las condiciones de hibridación pueden seleccionarse para que sean compatibles con las condiciones para la unión tal cual, o con la adición de uno o más componentes y preferentemente sin necesidad de cambiar el recipiente de reacción cuando se pasa de las etapas de hibridación a las de unión.

unión

La reacción de unión puede ocurrir por unión química o mediante el uso de una enzima ligasa o un cofactor que facilita la unión. Una variedad de ligasas reparadoras de muescas están disponibles comercialmente para catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre polinucleótidos monocatenarios adyacentes cuando se hibridan con otra plantilla monocatenaria, como para unir ADN con ARN cuando se hibridan con plantilla. Un ejemplo es la ADN ligasa del bacteriófago T4, que generalmente se entiende que usa ATP como cofactor. El ATP puede suministrarse durante la reacción de la ligasa. En otras reacciones, la ligasa puede adenilarse previamente. Aún en otras reacciones, el UD debe estar adenilado previamente en el extremo 5', como con una ligasa de ADN/ARN App en 5'. El UD en una reacción típica tendrá un 5'-fosfato para facilitar la unión al DD, aunque esto no es necesario, en dependencia de la selección de la ligasa y las condiciones de unión. (Cuando se requiere un 5'-fosfato en el DD para una unión eficiente, puede usarse un oligonucleótido comparable sin fosforilación 5' para inhibir o reducir la unión no deseada). Las condiciones de unión preferidas incluyen 10, 25, 50, 100 mM Tris-HCl (pH 7,5, 8,0 u 8,5); al menos 10 mM, 5 mM, 2 mM, 1 mM MgCh; al menos ATP 2 mM, 1 mM, 0,7 mM, 0,5 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM; o al menos 10 mM, 7 mM, 5 mM, 2 mM, 1 mM, 0,5 mM de DTT u otro antioxidante. También puede usarse la ligasa de ADN T3, que puede unir una gama más amplia de sustratos y tiene una mayor tolerancia a la concentración de sal. Al igual que con otras etapas, la temperatura puede seleccionarse de acuerdo con las características de los componentes de la reacción y las condiciones, tal como la fuerza iónica.

Como se discutió anteriormente, la etapa de unión puede estar precedida por una etapa de extensión opcional, como en la Figura 1, etapa (b0). La etapa de unión también puede estar precedida por una etapa de escisión opcional, tal como por una nucleasa, para eliminar cualquier saliente. En otros casos, una parte del DD puede superponerse con la secuencia UR con la que se hibrida el UD, de modo que después de la hibridación del UD y el ^dD, ^{hay una secuencia saliente de 1, 2, 3 o más bases. Una enzima útil para eliminar un saliente es una} endonucleasa de aleta, como Fen-1.

amplificación

Si se desea, el producto de unión puede amplificarse (por ejemplo, mediante PCR o qPCR) para facilitar la detección. Los métodos e instrumentos de amplificación están disponibles comercialmente, lo que incluye los formatos de gotitas y placas de PCR y las enzimas de amplificación (como Taq y sus variantes comerciales) y las condiciones de reacción puede seleccionarse y adaptarse a la plataforma en particular. Opcionalmente, la polimerasa seleccionada para amplificación puede tener actividad de desplazamiento de cadena. Como se ilustra en la Figura. 1, los detectores pueden tener secuencias adicionales ("colas") que incluyen secuencias de hibridación de cebadores por ejemplo, P1, P2') o complementos de estas, que sirven como secuencias de amplificación, de modo que después de la unión, el producto de la unión puede amplificarse con un par de cebadores de amplificación (P1, P2). Una secuencia de amplificación aguas abajo ilustrativa (P1) es

5 ' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3 ' (SEQ ID NO: 1), que puede usarse con un cebador que tiene la misma secuencia (P1). Una secuencia de amplificación aguas arriba ilustrativa (P2') es

5'-ATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3' (SEQ ID NO:2),

que puede usarse con el cebador P2 (que se muestra en una orientación de 3' a 5'):

3'-TAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-5' (SEQ ID NO:3).

Si se desea, el cebador de amplificación puede incorporar una secuencia de código de barras, por ejemplo, una secuencia de código de barras que identifique de forma única la muestra en un experimento de múltiples muestras y, opcionalmente, tenga características redundantes y/o de corrección de errores. En algunos experimentos, por ejemplo, pueden usarse diferentes códigos de barras de muestra para 96, 384, 1536 o, más generalmente, 2n o 4n muestras diferentes que se preparan con diferentes códigos de barras por separado para algunas etapas, tales como hibridación, unión y amplificación y combinarse para otros, como detección. La secuencia del código de barras puede incorporarse al cebador, como 3' a la secuencia de amplificación, de modo que el código de barras se convierta en parte de la cadena amplificada. En otros casos, la secuencia de amplificación del cebador puede ampliarse con una secuencia adicional para proporcionar una secuencia de hibridación del cebador que puede usarse en etapas de secuenciación posteriores. El código de barras también puede interponerse entre la secuencia de amplificación y, si se desea, la secuencia de amplificación extendida y otra secuencia que puede usarse para la captura, tal como la captura en una superficie como parte de un proceso de secuenciación y/o para otra secuencia de hibridación del cebador que se usa para la secuenciación. En cada caso, el código de barras se amplificará con el resto de las secuencias del detector, por ejemplo, para formar una sola molécula alargada amplificada que contiene secuencias de hibridación de cebadores de secuenciación, código de barras de muestra y una secuencia específica de gen, que puede incluir un código de barras específico de gen o un código de barras específico de la molécula diana así como también una secuencia o complemento de la secuencia del gen diana. En el caso de que el oligo diana sea un ADNc, puede añadirse una secuencia específica de gen o una secuencia específica de muestra como ^{parte del cebador usado para la transcripción inversa y ser parte de la secuencia diana de} U^{d y DD.}

En otros casos, pueden usarse métodos conocidos en la técnica para amplificar las secuencias DD y UD unidas, tal como por ciclos repetitivos de (1) unión, (2) calentamiento para fundir el producto unido, (3) enfriamiento para permitir la hibridación de DD y UD a la diana, (4) unión, después repetir las etapas de calentamiento (2), enfriamiento (3) y unión (4). Estas etapas de amplificación adicionales pueden realizarse antes de la etapa de amplificación (c), durante la cual los códigos de barras de muestra y otras secuencias se añaden a las secuencias UD y DD unidas. La diana de la hibridación de UD y DD también puede amplificarse mediante la amplificación del transcriptoma completo del ARN o la amplificación del ADNc.

detección

El producto de unión (o sus amplicones) puede detectarse opcionalmente mediante métodos como secuenciación, qPCR o marcaje para la detección en una matriz u otra detección de moléculas. Otros métodos de detección incluyen sistemas de flujo continuo para contar moléculas marcadas. En dependencia del método de detección, el usuario experto podrá modificar el diseño de los detectores y los cebadores de amplificación para incluir características funcionales apropiadas, tales como la amplificación puente en una celda de flujo de secuenciación. Los recursos experimentales usados para la amplificación y la detección pueden ser limitados y, a menudo, se encuentran entre los más costosos, y su consumo puede optimizarse tras reducir la cantidad de componentes de ensayo no informativos presentes en varias etapas del ensayo.

nucleasas

En consecuencia, la descripción proporciona nucleasas y componentes de ensayo que están configurados para resistir la degradación para permitir un uso más eficiente de los recursos y una detección más sensible. Como ventaja adicional, la invención permite un flujo de trabajo de ensayo más simple que puede realizarse en un solo recipiente de reacción o completamente en fase líquida.

La nucleasa puede ser una enzima que digiere o degrada cadenas sencillas de ácidos nucleicos. Preferentemente, la nucleasa no digiere (o tiene una actividad significativamente menor sobre) las cadenas dobles, que incluye los híbridos de ADN:ARN. Por ejemplo, la nucleasa puede tener menos del 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o 0,1 % de actividad en cadenas dobles en comparación con cadenas sencillas en una relación de sustrato molar en las mismas condiciones. De manera similar, la nucleasa puede seleccionarse de modo que no se digiera apreciablemente en las muescas monocatenarias en una cadena doble. La nucleasa puede ser una endonucleasa que degrada cadenas sencillas, tal como la nucleasa de frijol mungo bajo ciertas condiciones. La nucleasa también puede ser una exonucleasa que degrada cadenas sencillas, que pueden ser cadenas sencillas de ADN. Por ejemplo, una nucleasa que tiene actividad de exonucleasa 3' a 5' monocatenaria (3' exo) incluye la exonucleasa I de E. coli (exo I) y la exonucleasa T3. Pueden usarse enzimas como la exonucleasa T (RNasa T), que tiene actividad 3' exo en cadenas simples de ADN y ARN, siempre que los detectores se hayan unido y las cadenas de ARN ya no sean necesarias en el ensayo. Las nucleasas que tienen actividad de exonucleasa 5' a 3' monocatenaria incluyen la exonucleasa VIII y RecJf. La nucleasa puede ser una enzima que digiere los salientes o aletas 5', como la endonucleasa de aleta 1. Las nucleasas pueden usarse solas o en un cóctel de nucleasas, como un par de exonucleasas 3' y 5'.

Las nucleasas pueden usarse en varias etapas del ensayo. Por ejemplo, puede proporcionarse una nucleasa (b2) después de la etapa de unión (b1) para eliminar los detectores no unidos o en exceso, como en la Figura 2e. La nucleasa también puede degradar los detectores que están hibridados solo parcialmente o de forma no específica con las secuencias diana, como en la Figura 2f. Si es compatible con las condiciones de unión usadas, la nucleasa también puede proporcionarse durante la etapa de unión (b1 y b2 juntos) o incluso antes de la etapa de unión (b2, después b1), siempre que no interfiera con la detección prevista de las secuencias diana. En dependencia del diseño del ensayo, la nucleasa puede proporcionarse antes, durante o después de las etapas opcionales de extensión (b0) y amplificación (d) o en varias etapas para lograr el propósito deseado de eliminar la diana, los detectores, otros oligos o cualquier producto no deseado.

Cuando ya no se desea la actividad de la nucleasa, las nucleasas pueden eliminarse o inactivarse, tal como después de la etapa de unión. Las nucleasas pueden inactivarse mediante métodos seleccionados para una nucleasa en particular, pero no interferirán sustancialmente con el resto del ensayo. Para algunas nucleasas, puede añadirse un inhibidor de nucleasas (como en la Figura 4, abajo a la derecha) o un agente quelante, como EDTA, siempre que no interfiera con (o pueda eliminarse antes de) una la etapa posterior que puede requerir Mg++ por ejemplo. Otras nucleasas pueden inactivarse por calor, por ejemplo, incubación única o repetida a 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C o 98 °C, durante 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 minutos o 1 hora. Si se usa más de una nucleasa, una o ambas pueden inactivarse individualmente o por los mismos medios. Para resistir la actividad de las nucleasas proporcionadas en una o más etapas de la invención, la invención proporciona componentes del ensayo en diversas configuraciones que permiten la detección de secuencias diana. La selección del método de configuración dependerá, por supuesto, de la nucleasa particular que se use.

detectores anclados

En una configuración, el detector aguas arriba tiene una segunda región (UR2') que es complementaria a una segunda región de la secuencia diana (UR2), como se ilustra en la Figura 2a. Debido a que la cola del UD puede hibridarse con una porción separada de la diana, esta configuración puede describirse como un detector "anclado", como en la Figura 2b. El ancla en el extremo 3' de la UD se hibrida con la diana para formar una cadena doble y, por lo tanto, se configura para resistir la digestión de las nucleasas que degradan las cadenas simples, tales como las exonucleasas 3' como exo I.

Como una región de unión a la diana separada, el ancla UR2' puede usarse para proporcionar una discriminación adicional entre secuencias similares, tales como las isoformas de una familia de genes donde las diferencias de secuencia entre las isoformas se encuentran más allá del intervalo de la secuencia diana de DR y UR.

La UR2' puede tener al menos de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. La UR2' puede estar separada de la UR' por una región no complementaria (CP1), que puede ser al menos de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de longitud. En general, la UR2' estará aguas arriba con respecto a la UR'. Si está presente una región de amplificación (como P2'), puede estar aguas arriba de UR', tal como dentro de CP1 o parte de UR2' para permitir la amplificación de la porción UR' como se muestra en la Figura 2c para generar los productos de amplificación (AP) en la Figura 2d.

En una configuración de imagen especular, el detector aguas abajo es el que tiene la región de anclaje (DR2') complementaria a una segunda región de la secuencia diana. El ancla DR2' se hibrida con una DR2 en la diana de manera que la configuración resiste la acción de las exonucleasas ss 5'. La UR2' del DD generalmente estará aguas abajo en relación con la UR'. Si está presente una región de amplificación (como PI), puede estar aguas abajo de la DR' para permitir la amplificación de la DR' después de la unión. Los DD y UD anclados pueden usarse por separado o en combinación para resistir un cóctel de nucleasas.

Debido a que la región de anclaje separada del detector puede afectar las características de hibridación del detector a través de la cinética monomolecular, las composiciones y las longitudes relativas de DR2', CP1(s), DR', UR' y UR2' pueden ajustarse para optimizar la selectividad de la diana entre el par de detectores y entre los pares del conjunto de detectores.

Los detectores que no se usan en la reacción de unión pueden degradarse como se muestra en la Figura 2e. Además, los detectores unidos de forma incompleta, como los de la Figura 2f, también pueden degradarse, por ejemplo, cuando la UR' de un UD se une con la UR de una diana, pero la UR2' no se une, ya sea porque la UR' está unida a una secuencia distinta a la diana o a una diana que estaba relacionada con la UR diana prevista pero carecía de una UR2. De manera similar, un DD anclado que se une a una DR2 pero no a la DR de una diana será susceptible a una exonucleasa ss 3' (o no generará un producto de unión válido con un UD correspondiente). Otros detectores no se amplificarán, por ejemplo, detectores que excedan la secuencia diana en la muestra o detectores que estén unidos de forma no específica a secuencias distintas de la diana. Por lo tanto, el uso de detectores anclados puede aumentar la especificidad del ensayo de unión para las secuencias diana mientras que permite que las nucleasas degraden los detectores sobrantes o no usados.

detectores bloqueados

Otra configuración tiene detectores que son resistentes a las nucleasas tras tener un grupo bloqueante de nucleasas en un extremo o junto a él. La Figura 2h muestra un DD, que tiene un grupo bloqueante en 5', que puede usarse en combinación con una exonucleasa en 5'. También se muestra un UD que tiene un grupo bloqueante en 3' para usar con una exonucleasa en 3'. Preferentemente, cuando se usa una exonucleasa 5' o 3' donde hay múltiples dianas y pares de detectores, todos los detectores aguas abajo o aguas arriba tienen un bloque 5' o 3', respectivamente. Las configuraciones útiles para resistir las nucleasas incluyen la terminación con un nucleótido invertido como la desoxitimidina (idT), un didesoxinucleótido como la didesoxitimidina (ddT o iddT) o la acetilación en 2'/3'-O del nucleótido terminal. En dependencia de las preferencias de sustrato de la nucleasa seleccionada, uno o más de los otros nucleótidos modificados descritos anteriormente pueden usarse como grupo bloqueante. Alternativamente, uno o más de los nucleótidos terminales se unen al resto del oligo a través de uno o más enlaces fosforotioato en lugar de los enlaces fosfodiéster que se producen de forma natural. Otras modificaciones que pueden resistir una nucleasa incluyen las cadenas principales LNA o PNA discutidas anteriormente. En algunas configuraciones, un bucle en horquilla u otra estructura secundaria en el detector puede servir como grupo bloqueante de nucleasas para un detector. Un extremo de la horquilla puede tener un grupo bloqueante. En otras configuraciones, antes de la hibridación, una proteína u otro componente puede unirse al extremo 5 'de un DD o al extremo 3' de un UD, tal como una proteína de unión monocatenaria específica de secuencia como una proteína de unión (FUBP) de un elemento lejano aguas arriba (FUSE) a través de una secuencia ssFUSE incorporada en un detector. Si el extremo 5' de un detector DD o el extremo 3' de un detector UD se configuran para inmovilizarse, ya sea de forma permanente o reversible, en una fase sólida, la fase sólida en sí misma puede servir como un bloqueo contra la actividad de nucleasa en el detector. Puede ser útil combinar cualquiera de las características anteriores en un solo detector o en ambos detectores para resistir la acción de la nucleasa seleccionada y proporcionar otras ventajas, como las propiedades de estabilidad e hibridación.

protectores

Aún otra configuración proporciona uno o más oligos que protegen los detectores tras hibridar con DD o UD en una región que no interferirá con la hibridación de las regiones DR' o UR' complementarias a la secuencia diana. Por ejemplo, en la Figura 2i, se proporciona un oligoprotector de DR2 para hibridar con una región DR2' en el extremo 5' ^del D^d, ^{lo que forma una configuración de doble cadena (indicada por un corchete) que es resistente a las} exonucleasas en 5'. Si va a usarse una exonucleasa 3', puede proporcionarse un protector UR2 para formar una cadena doble en el extremo 3' del UD. Los propios oligos protectores pueden protegerse de la actividad exonucleasa mediante un grupo o enlace bloqueante como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, en la figura 2i se muestra un protector UR2 bloqueado en 3' y en la figura 2j se muestra un protector DR2 bloqueado en 5'. Si va a usarse un cóctel de exonucleasas 5' y 3', pueden proporcionarse protectores DR2 y UR2, opcionalmente con grupos bloqueantes 5' o 3', respectivamente.

detectores circularizables

En una configuración circularizable con un detector, la región complementaria aguas arriba (UR') y la región complementaria aguas abajo (DR') están en un solo oligo detector circularizable (DO), como se muestra en la Figura 3a. El DO puede tener en la dirección de 5' a 3':

(B) una región complementaria aguas arriba (UR'); (C) una región de amplificación opcional (P2');

(D) una región no complementaria (CP2) que tiene una secuencia que no es complementaria a la secuencia diana; (F) una región complementaria aguas abajo (DR'); y (E) una región de amplificación opcional (P1). El DO puede tener al menos de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200 bases de longitud para permitir la flexibilidad de la molécula para circularizar.

Una configuración alternativa circularizable con dos detectores tiene un DD con una porción CS en el extremo 5' y un UD con una porción inversa complementaria CS' en el extremo 3', de modo que el DD y el UD se hibridan parcialmente entre sí a través de las porciones CS y CS'. Opcionalmente, hay grupos bloqueantes en el extremo 5' de la porción CS o en el extremo 3' de la porción CS'. Otra configuración circularizable tiene tres oligos: dos detectores y un oligo de puente: el DD tiene una porción CS1 en el extremo 5'; el oligo puente tiene una porción CS1' y una porción CS2'; y el UD tiene una porción CS2 en el extremo 3'. El oligo puente tiene opcionalmente grupos bloqueantes en el extremo 5' y/o en el extremo 3'.

En presencia de una secuencia diana DR-UR, los detector(es) circularizable(s) puede(n) (a) circularizar sobre la diana, tras formar un complejo de hibridación (HC) que es resistente a las exonucleasas monocatenarias y que puede unirse (b2).

Si las regiones de amplificación se proporcionan en la orientación adecuada, el producto de unión (LP) puede amplificarse (c) con los cebadores P1 y P2 para formar el producto de amplificación (AP) que contiene las regiones DR' y UR' unidas.

Los DO que no se hibridan específicamente con la diana o se unen de forma incompleta a la diana son susceptibles de degradación por nucleasas (Figura 3d) o las regiones de amplificación P1 y P2' no estarán en las orientaciones correctas para la amplificación del cebador, como se ilustra en la Figura 3b o 3c. En algunos casos, el detector puede amplificarse, pero se amplificará linealmente, en lugar de exponencialmente. En tales casos, las secuencias secundarias pueden detectarse y descontarse o eliminarse de los resultados de detección computacionalmente. segunda cadena simple (2S)

Aún otra configuración proporciona un oligonucleótido de ADN monocatenario (2S) para hibridar con la porción monocatenaria del detector para formar un complejo de hibridación bicatenario, como se ilustra en la Figura 4. El oligo 2S puede ser complementario al CP1 de modo que toda la estructura se vuelva bicatenaria. Cuando el ensayo está destinado a detectar múltiples secuencias diana, el mismo 2S puede usarse de forma genérica para formar la estructura circular, ya que no se basa en la hibridación con las secuencias diana. A continuación, la estructura puede unirse, completar la estructura circular de doble cadena y resistente a exonucleasas, endonucleasas ss y endonucleasas de corte.

Opcionalmente, la estructura circular puede mellarse o cortarse deliberadamente, por ejemplo, mediante una endonucleasa de corte. El DO puede tener un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción, por lo que la estructura circular puede linealizarse si se desea. Para evitar la digestión de secuencias diana o detectores, el sitio de reconocimiento seleccionado para CP1 puede ser un sitio relativamente raro como para AscI, FseI, AsiSI. Si se desea, las estructuras linealizadas pueden separarse de las estructuras circulares mediante métodos convencionales.

aletas

El DO circularizable puede configurarse para que tenga (A) una región no complementaria (CP5) en la dirección 5' de la UR' y (G) una región no complementaria opcional (CP3) en la dirección 3' de la DR', como se muestra en la Figura 5a y se analiza en el Ejemplo 4. Puede proporcionarse una segunda cadena que tenga, en la dirección de 5' a 3': P2, CP2', P1' de modo que, juntos, el ácido nucleico diana, un oligo detector y la segunda cadena formen un complejo de hibridación que tenga una aleta de 5'. Puede usarse una nucleasa, como Fen-1, para eliminar la aleta de 5' (Figura 5b). El extremo 5' del detector circularizable puede fosforilarse (Figura 5c). Si se desea, la región CP3 opcional puede hibridarse con la secuencia diana, lo que forma un extremo 3' que puede unirse (Figura 5d) a la UR' adyacente para formar un producto unido (Figura 5e).

etapas en fases sólidas, líquidas

En algunos ejemplos, las etapas de hibridación, unión o extensión puede realizarse mientras la secuencia diana está in situ. Esto puede ser especialmente útil, por ejemplo, cuando la muestra está en un portaobjetos histológico, de modo que se conoce que la unión se produce en una ubicación registrable y puede compararse con reacciones similares en otras ubicaciones del portaobjetos. Las sondas unidas pueden permanecer en la ubicación mientras se realizan otras etapas, como la obtención de imágenes o la detección de otros analitos en la ubicación o cerca de ella. Si se desea, las sondas unidas pueden permanecer in situ de forma más segura mediante una variedad de métodos químicos o enzimáticos para la reticulación con el sitio, que puede ser permanente o reversible, tal como mediante un enlace fotoescindible como con el uso de un análogo de nucleósido de cianovinilcarbazol (CNVK). En una modalidad particular, los productos de unión pueden eluirse de la muestra in situ para su recogida y posterior procesamiento, preferentemente se eluyen de áreas pequeñas para preservar la información de ubicación y el contexto morfológico de los productos de reacción de unión.

En otros ejemplos, una o más de las la etapas puede realizarse en fase líquida, como en un sistema de microfluidos, de modo que una o más de las etapas no impliquen la captura en una fase sólida, como en una perla o una superficie de placa. Por ejemplo, una cualquiera o una combinación de las etapas de hibridación, extensión, unión, digestión con nucleasas, amplificación o detección puede realizarse en fase líquida. En un ensayo de fase mixta, puede usarse una fase sólida para inmovilizar uno o más de la muestra, los oligos detectores, el complejo de hibridación, el producto de extensión, el producto de unión o el producto de amplificación. En particular, el ácido nucleico diana puede unirse a una superficie sólida durante la etapa de hibridación, la etapa de unión o ambas. La superficie sólida puede ser una perla, tal como una inmovilización reversible magnética, no magnética, polimérica o una perla de látex, o perlas compuestas de estas, o una superficie relativamente plana tal como una superficie de placa o celda de flujo, opcionalmente con recubrimientos de materiales similares. El formato de fase mixta permite transferir los componentes de un ambiente de reacción a otro, o cambiar las condiciones a medida que los componentes permanecen en un recipiente.

añadir sucesivamente al mismo recipiente de reacción

Alternativamente, las reacciones pueden optimizarse para que al menos una de las etapas se realice tras añadir reactivo, como una enzima o un componente tampón, sucesivamente, de modo que la reacción tenga lugar en el mismo recipiente que la etapa anterior, opcionalmente sin requerir una etapa de lavado o transferencia. Preferentemente, la secuencia de adiciones no requiere adiciones significativas de volúmenes de líquido para diluir los componentes para la siguiente reacción, por ejemplo, una dilución de no más de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 10, 15 o 20 veces entre la muestra inicial y la preparación para la detección. Los componentes que se añadirán pueden proporcionarse en un kit, como se describe a continuación.

atenuadores

En los casos en que haya más de una secuencia diana en una muestra dada, es probable que estén presentes en cantidades diferentes. Además, la cantidad de una secuencia diana puede variar entre muestras similares. Idealmente, un ensayo de detección tendrá suficiente intervalo dinámico para medir cuantitativamente la presencia de las diferentes secuencias diana en un solo experimento. Sin embargo, para algunos tipos de muestras, el intervalo de abundancia de varias secuencias diana puede abarcar varios órdenes de magnitud. Por ejemplo, al perfilar los productos de expresión de ARN de una célula, las secuencias individuales de interés particular pueden estar presentes en muy pocas copias, mientras que otras son secuencias diana muy abundantes (HAT). Las HAT pueden estar presentes en una muestra en cantidades tan grandes que pueden disminuir la capacidad de un método para detectar la presencia de secuencias diana menos abundantes.

En dependencia del tipo de célula o tejido, estas HAT muy abundantes pueden incluir secuencias que codifican lo que generalmente se conoce como genes domésticos. Los ejemplos de HAT incluyen secuencias que codifican la totalidad o una porción de mioglobinas, actinas, tubulinas, ubiquitinas, proteínas de choque térmico (HSP), proteínas ribosómicas, ^a Rⁿ ribosómico (ARNr), micro-ARN (miARN) o ARN nuclear pequeño (ARNsn). Otros ejemplos de HAT pueden codificar todo o una porción del citocromo c, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), proteína ribosomal L7 (RPL7), proteína ribosomal S6 (rpS6), snARN RNU, fosfogliceroquinasa (PGK), tirosina 3-monooxigenasa/proteína de activación de triptófano 5-moonoxigenasa zeta (YWHAZ), p-actina o p-tubulina. Otros ejemplos incluyen secuencias que codifican la totalidad o una porción de a-2-microglobulina, vimentina y fibronectinas. Aún otros ejemplos de HAT la totalidad o una porción de un citocromo, como el citocromo b codificado mitocondrialmente (MT-CYB), el citocromo b5 tipo B de la membrana mitocondrial externa, el citocromo b5 microsomal tipo A (ACYB5A) y el citocromo b3 dependiente de ascorbato (CYBASC3). Debido a que las secuencias que son muy abundantes pueden diferir de un tipo de muestra a otro, como entre diferentes tejidos o tipos celulares, ciertas secuencias diana pueden designarse como un conjunto predeterminado de posibles HAT sobre la base de una búsqueda en la literatura para ese tipo de muestra o puede determinarse tras realizar ensayos preliminares para determinar las secuencias más abundantes en el tipo de muestra. Pueden usarse varios oligonucleótidos atenuadores ("atenuadores") para atenuar el número total de productos de unión relacionados con HAT que se van a detectar. Se proporcionan algunos atenuadores que pueden proporcionar una detección positiva del HAT en la muestra, pero a un nivel de señal más bajo.

Un atenuador útil en la invención se muestra en la Figura 2g, donde se proporciona un oligo UR2' para hibridar con dianas UR2 en competencia con los detectores. De manera similar, pueden proporcionarse oligos UR2, DR2' y DR2 para competir con la unión de porciones de detectores anclados a HAT, lo que de ese modo atenúa el número total de detectores que forman productos de unión relacionados con HAT. Los atenuadores particularmente útiles pueden tener una porción de DR2 y una porción de DR; o tener una porción de UR y una porción de UR2, que de ese modo compite por dos porciones del mismo detector anclado.

Para diseños de detector circularizables, un atenuador puede ser un oligonucleótido que tenga una porción que sea idéntica o complementaria a UR o DR, o ambas. Los atenuadores también pueden tomar la forma de oligos que llenan un espacio, como se muestra en la Figura 5b, pero están bloqueados para que no produzcan un producto de unión.

detectores escindibles

Puede ser deseable que un oligo detector contenga una u otras modificaciones que puedan escindirse selectivamente mediante tratamiento después de la etapa de unión o amplificación opcional. Por ejemplo, un oligo detector puede tener un dU ubicado de modo que no interfiera con las etapas de hibridación o unión. Sin embargo, después de la unión, los productos que incorporan el oligo dU pueden ser escindidos por enzimas específicas de dU, como la uracil-ADN glicosilasa seguida de la endonucleasa VIII. Otro sitio escindible de forma selectiva puede ser un sitio de escisión de una enzima de restricción que no esté presente en las secuencias diana a detectar.

kits

La descripción proporciona kits para realizar los métodos descritos anteriormente, que comprenden oligos detectores y, opcionalmente, una nucleasa, una ligasa y/o una polimerasa. Los kits pueden proporcionar además tampones de reacción para las enzimas del kit o componentes de tampones que se añadirán a las reacciones adecuadas para las enzimas. El componente puede ser adecuado para añadirlo a un recipiente para una reacción enzimática para preparar un tampón de reacción adecuado para la enzima. El componente también puede seleccionarse para que sea compatible con el tampón de reacción para la etapa anterior del método, de modo que el componente pueda añadirse al mismo recipiente para formar un tampón de reacción para la siguiente enzima que se usará. Por lo tanto, los componentes pueden seleccionarse para permitir una estrategia de "añadir-añadir-añadir" para múltiples etapas del ensayo para minimizar las transferencias de muestra, oligos, enzimas y/o soluciones entre recipientes separados.

Los kits también pueden tener soluciones de eluyente adecuadas para eliminar oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos unidos, de una muestra de tejido para su posterior análisis. Los kits pueden tener además cebadores de amplificación adecuados para su uso con los detectores del kit.

Ejemplos

Ejemplo 1: Ensayo de unión representativo

Se proporciona un método representativo para ilustrar los ensayos de unión. Aquí, se detectaron más de 100 productos de expresión de ARN en una muestra de células mediante el uso de un formato de ensayo multiplex. Para cada producto de expresión, el ensayo se diseñó para detectar una o más secuencias diana dentro de la secuencia completa del producto. Por ejemplo, en células humanas, un gen GAPDH de interés codifica la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; tres porciones diferentes dentro de la transcripción de ARN del gen GAPDH se detectaron de forma independiente como secuencias diana. Una de esas secuencias diana de ARN, identificada aquí como GAPDH_2, fue

5'-CGACCACUUUGUCAAGCUCAUUUCCUGGUAUGACAACGAAUUUGGCUACA-3' (SEQ ID NO:4)

donde un extremo 5' se designó "aguas arriba" (subrayado) y el extremo 3' se designó "aguas abajo" para la dirección de transcripción y traducción. La misma secuencia diana GAPDH_2 puede mostrarse en la dirección de 3' a 5' para facilitar la discusión posterior:

3'-ACAUCGGUUUAAGCAACAGUAUGGUCCUUUACUCGAACUGUUUCACCAGC-5' (SEQ ID NO:5)

Una región aguas abajo (DR) se definió como las 25 bases aguas abajo de GAPDH_2:

3'-ACAUCGGUUUAAGCAACAGUAUGGU-5' (SEQ ID NO:6)

que tiene una secuencia de ADN complementaria de DR':

5 ' -TGTAGCCAAATTCGTTGTCATACCA-3 ' (SEQ ID NO:7)

La región aguas arriba (UR) se definió como las 25 bases aguas arriba de GAPDH_2:

3'-CCUUUACUCGAACUGUUUCACCAGC-5' (SEQ ID NO:8)

que tiene una secuencia de ADN complementaria de UR':

5'-GGAAATGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3' (SEQ ID NO:9)

Para GAPDH 2 se diseñó un par de detectores: un detector aguas abajo (DD) de secuencia DR' y un detector aguas arriba (UD) de secuencia UR'. Se diseñaron pares similares para cada una de las secuencias diana para proporcionar un grupo de detectores para el ensayo. En este ejemplo, todos los detectores aguas arriba se fosforilaron en el extremo 5'.

En este ejemplo particular, se iba a realizar una etapa de amplificación más adelante en el experimento mediante el uso de dos cebadores, P1 y P2, por lo que todos los UD del experimento incluían una secuencia de cebador (P1) y todos los UR incluían una secuencia de cebador complementaria (P2'). Sin embargo, debido a que la amplificación no es necesaria para la práctica de la invención, la secuencia de los cebadores específicos y las secuencias de los cebadores es una cuestión de selección para adaptarse al método de amplificación particular, si se usa.

Se colocaron al menos 10 ng de ARN aislado de líneas celulares de hígado o riñón humano en un pocillo de una placa de microtitulación para cada experimento de ensayo. A cada pocillo se añadieron 20 pl del Cóctel de unión 2X, que contenía 5 nM de cada detector (lo que proporciona una entrada final de 0,1 pmoles por oligo), oligo(dT)²⁵ biotinilado 100 nM y 5 pl de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en un Tampón de lavado (Tris-Cl 40 mM, pH 7,6, NaCl 1 M, EDTA disódico 2 mM, SDS 0,2 %).

La placa se calentó durante 10 min a 65 °C para desnaturalizar el ARN, después la temperatura se redujo durante 40 min a 45 °C para permitir que los detectores hibridaran con las secuencias diana en la muestra de ARN. A continuación, la placa se transfirió a una base magnética para inmovilizar las perlas, lo que permitió que el sobrenadante, que contenía detectores no unidos y en exceso, se aspirara de los pocillos. Las perlas se lavaron al menos tres veces con 50 pl del Tampón de lavado.

A cada pocillo se añadieron 5 unidades Weiss de ADN ligasa T4 en 20 pl de Tampón de unión 1X, según lo proporcionado por el proveedor. Después de que las perlas se resuspendieran con una pipeta, las placas se incubaron durante 60 min a 37 °C para permitir la unión dependiente de la diana de DD a UD según corresponda. Después de la reacción de unión, las perlas se inmovilizaron y se lavaron dos veces con 50 pl de Tampón de lavado. Para liberar los detectores unidos de sus dianas de ARN, las perlas se resuspendieron en 30 pl y se incubaron durante 5 min a 65 °C. Después de la incubación, se inmovilizaron las perlas y el sobrenadante se eliminó y transfirió a una placa de almacenamiento.

Para la etapa de amplificación opcional, se transfirieron 5 pl del sobrenadante, que contenía los productos de unión, a un pocillo de una placa de PCR. A continuación, se añadieron 10 pl de un cóctel de PCR que contenía 0,45 U de polimerasa Taq, cebador P1 0,6 pM, cebador P20,6 pM, MgCh 1,5 mM y dNTP 200 pM. El termociclador usó el siguiente programa: 10 min a 94 °C, seguido de 20 a 25 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 58 °C y 30 s a 72 °C. Después, los productos de amplificación se secuenciaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo de unión representativo puede modificarse como en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2: Diseños de detectores anclados y circularizables

Se prepararon oligonucleótidos de sonda detectora aguas arriba y aguas abajo como en las Figuras 2a y 3a para 24 secuencias diana identificadas como dianas de cáncer de mama: ACTB_1, TFF1_1, GATA3_3, GAPDH 3, CDH1_1, KRT19 2, TIMP1_2, NFKBIA 1, ESR1_1, VEGFA_3, LAMP1 2, MUC1_3, BAD_3, PTEN_1, BRCA2_1, BCAT2_3, ICAM1 2, IGF2_3, BRCA1 2, EGFR_1, BMP4_1, KIT_3, WNT1_1 y EGF_3 (en orden descendente de conteos esperados). Las dianas se seleccionaron para un intervalo de expresión que abarca 6 órdenes de magnitud desde ACTB_1 hasta EGF_3. Las secuencias diana usadas para los DR y UR se muestran en la Figura 6a.

El ensayo se realizó por triplicado con 100, 10, 1 y 0,1 y 0 (control) nanogramos de ARN total de MCF7 como muestra. Los detectores se añadieron a la muestra en un volumen de 1 o 2 pl y se permitió que se hibridaran tras incubar a 65 °C durante 10 minutos, disminuyeron gradualmente durante 20 minutos de 65 °C a 45 °C, después se mantuvo durante 20 minutos a 45 °C. Se añadió exonucleasa I (E. coli) a la mezcla de hibridación en 6 pl de 0,5 Unidades y se incubó durante 1 hora a 37°C. Se añadió ligasa T4 a la mezcla en 6 pl de 5 Unidades y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Se realizó una etapa de calentamiento durante 30 minutos a 80 °C. La mezcla se amplificó tras añadir mezcla maestra de PCR 2X. Los productos de amplificación correspondientes a las secuencias diana se detectaron y cuantificaron mediante qPCR y secuenciación. Los resultados se proporcionan en las Figuras 6b-6g. Ejemplo 3a: Diseño de detector circularizable para microARN

Los detectores de DO circularizables se diseñaron para la familia de miARN Let-7. Estos miARN se transcriben inicialmente como transcripciones relativamente largas (pri-miARN), pero se procesan en pre-miARN y, posteriormente, se procesan en una forma madura relativamente corta. En forma madura, la familia Let-7 altamente homóloga se muestra de 5' a 3', con variantes de la secuencia let-7a en negrita).

Hsa let-7a ugagguaguagguuguauaguu SEQ ID NO:10

Hsa let-7b ugagguaguagguugugugguu SEQ ID NO:11

Hsa let-7c ugagguaguagguuguaugguu SEQ ID NO:12

Hsa let-7d agagguaguagguugcauaguu SEQ ID NO:13

Hsa let-7e ugagguaggagguuguauaguu SEQ ID NO:14

Hsa let-7f ugagguaguagauuguauaguu SEQ ID NO:15

Hsa let-7g ugagguaguaguuuguacaguu SEQ ID NO:16

Hsa let-7h ugagguaguaguuugugcuguu SEQ ID NO:17

Mediante el uso de Hsa let-7a como ejemplo, la DR' era 5 '-AACTATACAAC-3' (SEQ ID NO:18) y la UR' era 5'-CTACTACCTCA-3' (SEQ ID NO: 19). Se proporciona un oligonucleótido de ADN monocatenario (2S), de aproximadamente 80 nucleótidos, para hibridar con la porción monocatenaria del DO para formar un complejo de hibridación bicatenario, como se ilustra en la Figura 4.

Después de la hibridación, la región de DR y UR puede representarse como

5' - . . . ^TAAGAG-AACTATACAAC CTACTACCTCA- ^CGGAAC. ..-3'SEQ ID NO:20

3'-..ATTCTC uugauauguug-gaugauggagu GCCTTG...-5' SEQ ID NO:21 donde el miARN diana está en minúsculas. Parte del DO se muestra como la secuencia superior, con el DR' en romano y el UR' subrayado en romano, flanqueado por una secuencia, parcialmente mostrada, en cursiva, como P1 o P2'. Las bases en negrita y cursiva representan el extremo 3' (a la izquierda) y el extremo 5' (a la derecha) del mismo oligonucleótido 2S.

Después de la unión, la porción que se muestra forma una estructura de doble cadena sin muescas

5 . . . TAAGAG-AACTATACAAC-CTACTACCTCA-CGGAAC... - 3 ' SEQ ID NO:22

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

3'-...ATTCTC-uugauauguug-gaugauggagu-GCCTTG...-5' SEQ ID NO:23 que es resistente al ataque por exonucleasas.

Si el DO para let-7a se hibrida con let-7c similar, se forma la siguiente estructura:

5'-. ..^TAAGAG-AACTATACAAC-CTACTACCTCA-^CGGAAC...-3' SEQ ID NO:24

3'-...ATTCTC-uugguauguug-gaugauggagu-GCCTTG...-5' SEQ ID NO:25

El complejo, que contiene un desajuste, puede cortarse con una variedad de enzimas, como la endonucleasa VII de T4, la endonucleasa I de T7, o en combinaciones de exonucleasa I y exonucleasa III de E. coli, nucleasa S1 o nucleasa BAL-31. A continuación, el complejo cortado puede degradarse mediante tratamiento con una nucleasa en la etapa (b1) para que no se forme ningún producto de unión.

Como se ilustra, la estructura bicatenaria circularizada covalentemente puede linealizarse por tratamiento con una endonucleasa de restricción, si se desea, donde el 2S contiene un sitio de restricción apropiado. El producto linealizado puede amplificarse con cebadores.

Ejemplo 3b: Diseño de detector extendido para microARN

Se diseñaron detectores extendidos para los microARN de la familia Let-7 que se han poliadenilado. Los microARN se extienden mediante el uso de la polinucleótido adenililtransferasa para añadir una cola de poliadenina 3'. Para un microARN de Hsa let-7a (SEQ ID NO: 10), a continuación se muestra una secuencia poliadenilada (SEQ ID NO: 28) en cursiva. Se proporciona un detector aguas arriba con SEQ ID NO:27 y un detector aguas abajo extendido con SEQ ID NO:26, que tiene una región poli-T en cursiva (habitualmente poli-dT si el detector es ADN).

3'-aaaaauugauaug-uuggaugauggagu-5' SEQ ID NO:28

La combinación de la cola de poliadenina 3' suplementaria y la región poli-T extendida proporciona una región complementaria más larga para la hibridación de la diana con el detector y permite una mayor libertad para diseñar DR y UR para la diana. Por ejemplo, las longitudes de las regiones complementarias para DD y UD pueden ser más similares en longitud. Cuando se detecta una familia de secuencias diana relacionadas, puede usarse un DD o UD para detectar más de un miembro de la familia (un "detector genérico"). Así para Hsa let-7b,

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar secuencias de ácido nucleico diana en una muestra, en donde una secuencia diana tiene una región aguas abajo (DR) y una región aguas arriba (UR), y el ácido nucleico diana tiene al menos una región DR2 o UR2, el método comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con

un oligo detector aguas abajo (DD) que tiene una región complementaria aguas abajo (DR') y un oligo detector aguas arriba (UD) que tiene una región complementaria aguas arriba (UR'), en donde al menos uno de los DD o UD tiene una segunda región complementaria (DR2' o UR2') separada de la DR' o UR' por una región no complementaria (CP1),

lo que permite de ese modo que las DR' y UR', y al menos una de la DR2' o UR2' de los detectores se hibriden específicamente con DR y UR y al menos una de las DR2 y UR2 de ácidos nucleicos diana;

(b1) unir las DR' y UR' si ambas se hibridan específicamente con las DR y UR de una secuencia diana; y (b2) exponer los complejos de hibridación a al menos una nucleasa que degrada las cadenas simples pero no degrada significativamente las cadenas dobles, por lo que la nucleasa degrada los Dd y UD hibridados de forma no específica;

por lo que el producto de unión indica la presencia de la secuencia diana en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra de tejido, una sola célula, está montada en un portaobjetos o procede de una muestra fijada con formalina e incluida en parafina (FFPE).

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el ácido nucleico diana es un ARN, opcionalmente un ^a Rⁿ circular, ARNip, ARN antisentido, ARN largo no codificante o microARN o una porción de este, en donde opcionalmente el microARN se poliadenila en 3' antes de la etapa (a) y el DD tiene una región poli-T adyacente a la DR'.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el DD tiene una primera región de amplificación (P1) aguas abajo de la DR', y el UD tiene una segunda región de amplificación (P2') aguas arriba de la UR'.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la etapa (b2) degrada las regiones P1 o P2' monocatenarias.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde conjuntos de DD y UD, que tienen diferentes DR o UR, proporcionan la medición de diferentes porciones de la secuencia diana.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la nucleasa tiene actividad de 3' a 5'; o tiene actividad de 5' a 3'.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde (i) el DD tiene un grupo bloqueante de exonucleasa 5', (ii) el UD tiene un grupo bloqueante de exonucleasa 3', o ambos (i) y (ii).

9. El método de la reivindicación 8, en donde el grupo bloqueante comprende un nucleótido invertido, un didesoxinucleótido, un enlace fosforotioato o una fase sólida.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde un oligo detector tiene, en una o más posiciones, una cadena principal de ácido nucleico bloqueado (LNA) o ácido nucleico peptídico (PNA).

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde (i) DD tiene una región DR2' en el extremo 5' que se hibrida con un oligo protector de DR2; o (ii) en donde el UD tiene una secuencia de UR2' en el extremo 3' que se hibrida con un oligo protector de UR2.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde (i) la etapa (b2) se realiza antes de la etapa (b1); (ii) la etapa (b2) se realiza durante la etapa (b1); o (iii) la etapa (b2) se realiza después de la etapa (b1).

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde una o más de la etapa (a), la etapa (b1) o la etapa (b2) se realizan en fase líquida; mientras que el ácido nucleico diana está unido a una superficie sólida; o mientras la secuencia diana está in situ.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la presencia del producto de unión o los productos de amplificación de este se detecta mediante secuenciación, qPCR o un sistema de flujo continuo para contar moléculas marcadas.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el método comprende además cualquiera de (a0) permeabilizar las paredes celulares, las membranas celulares o las estructuras subcelulares;

(c) inactivar la nucleasa;

(d) eluir el producto de unión;

(e) amplificar los productos de unión; o

en donde DR y UR están separadas por al menos un nucleótido,

(b0) extender la DR' mediante el uso de la muestra como plantilla.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde además se proporciona un oligonucleótido atenuador que tiene una secuencia que es complementaria a una porción de uno o más de DR2, DR2', UR2, UR2', DR o UR de una secuencia diana muy abundante (HAT).

17. Un kit para realizar el método de la reivindicación 1, que comprende detectores para secuencias diana que tienen una región aguas abajo (DR) y una región aguas arriba (UR), en donde para cada secuencia diana, un oligo detector aguas abajo (DD) tiene una región complementaria aguas abajo (DR') y

un oligo detector aguas arriba (UD) tiene una región complementaria aguas arriba (UR'), por lo que DD y UD pueden hibridar con una secuencia diana, que forma un complejo de hibridación (HC), lo que proporciona de ese modo un sustrato para la unión en el sitio de unión (L) entre DR' y UR',

en donde al menos uno de los DD o UD tiene una segunda región complementaria (DR2' o UR2') separada de la DR' o UR' por una región no complementaria (CP1),

y al menos una exonucleasa que degrada cadenas simples pero no degrada significativamente cadenas dobles;

y que comprende además un reactivo de unión química, una enzima ligasa o un cofactor que facilita la unión.

18. El kit de la reivindicación 17, en donde el DD tiene una primera región de amplificación (P1) aguas abajo de la DR', y el UD tiene una segunda región de amplificación (P2') aguas arriba de la UR'.

19. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, que comprende además conjuntos de DD y UD, que tienen diferentes DR o UR, correspondientes a diferentes porciones de la secuencia diana.

20. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la exonucleasa tiene actividad de 3' a 5'; o tiene actividad de 5' a 3'.

21. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde (i) el DD tiene un grupo bloqueante de exonucleasa 5', (ii) el UD tiene un grupo bloqueante de exonucleasa 3', o ambos (i) y (ii).

22. El kit de cualquiera de la reivindicación 21, en donde el grupo bloqueante comprende un nucleótido invertido, un didesoxinucleótido, un enlace fosforotioato o una fase sólida.

23. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en donde un oligo detector tiene, en una o más posiciones, una cadena principal de ácido nucleico bloqueado (LNA) o ácido nucleico peptídico (PNA).

24. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en donde el DD tiene una región DR2' en el extremo 5' o en donde el UD tiene una secuencia UR2' en el extremo 3'; en donde el kit comprende además un oligo protector de DR2 o un oligo protector de UR2.

25. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, que comprende además (i) un inhibidor de la nucleasa, (ii) una polimerasa o (iii) una solución eluyente para eliminar oligonucleótidos de una muestra de tejido.

26. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, en donde dicho kit comprende además un oligonucleótido atenuador que tiene una secuencia que es complementaria a una porción de uno o más de DR2, DR2', UR2, UR2', DR o UR de una secuencia diana muy abundante (HAT).