CN108112258A - 在液相中的连接测定 - Google Patents

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Abstract

用于检测核酸序列的在液相中的连接测定。

Description

在液相中的连接测定
与相关申请的引用
本申请要求2015年1月27日提交的美国临时申请系列62/108,161和2015年6月30日提交的美国申请系列14/788,670的优先权的利益，上述两者的全部内容并入本文。
政府支持声明
在授权号为1R43HG007815的政府支持下作出本发明，由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予。政府对本发明有一定的权利。
技术领域
本发明涉及分子生物学，以及更具体地涉及用于检测在样品中的核酸序列的测定。
发明内容
本发明提供了用于在样品中检测感兴趣的核酸序列的靶序列的方法，以及还提供了用于进行上述方法的试剂盒。
在典型的连接测定中，使样品接触一组检测器寡核苷酸(a pool of detectoroligos)，其中为每个靶序列提供下游检测器(DD)和上游检测器(UD)。DD的部分(DR’)与指定为下游区(DR)的靶序列的区互补。上游检测器具有互补与靶序列的上游区(UR)的部分(UR’)。
使下游和上游检测器接触样品并允许杂交于在样品中存在的靶序列的相应区。当检测器特异性地杂交于靶序列时，可以在相邻检测器之间的接合点处连接它们，无论直接或在可选的延伸步骤以后。因而，连接产物的形成证明在样品中存在靶序列，以及可以通过各种方法来检测连接产物，如可检测标记、微阵列、qPCR、流通计数器、和测序。
本发明提供了测定，其中在方法的步骤期间提供一种或多种核酸酶，以选择性地降解未使用或过量的检测器、或没有特异性地杂交于靶序列的检测器。因此，在许多实施方式中，测定的检测器和其它成分成配置为在检测靶序列的同时抵抗核酸酶。该配置使得能够在全转录体或全miRNome复用下以及在单个细胞的水平下敏感检测核酸，如mRNA和miRNA。此外，可以在单孔或容器中进行上述步骤，而无需转移、分离、或固相固定，因而可理想用于微流控平台。
附图说明
图1示出了用于检测靶核酸序列的代表性连接测定。简要地，允许下游检测器(DD)和上游检测器(UD)探针寡核苷酸(a)杂交于在样品中的具有DR和UR区的靶序列。为了方便识别，在本文中经常下划线上游区。在杂交于靶序列的DR和UR的同时，将DD(b2)选择性地连接于UR。可选地，在(b2)连接之前，(b0)延伸DD。通过扩增区P1和P2’，并借助于一种或多种引物，如P1和P2，来可选地(c)扩增连接产物。
图2a示出了本发明的“锚定”测定设计，其中UD配置有通过非互补区(CP1)分隔开的第二互补区(UR2’或“锚形物”)。如在2b图中，DD和UD可以杂交于靶序列，从而形成杂交复合物(HC)，提供用于在DR’和UR’之间的接合(L)处的连接的底物。在连接以后，图2c示出了可以通过引物来扩增连接产物(LP)以产生在图2d中的扩增产物(AP)。
在方法的各个阶段，可以使用借助于外切核酸酶进行的治疗，如具有单链3’-至-5’活性的外切核酸酶，以除去不希望的成分，如未结合或过量的DD和UD检测器，如在2e图中。非特异性地或不完全杂交于靶序列的检测器可以通过外切核酸酶加以降解或将不会导致连接或扩增产物，如在图2f中。
如图2g所示，可能期望提供预定量的衰减子寡核苷酸如UR2’(或可替代地UR2)以减少来自某些高丰度靶序列(HAT)的产物的形成。
图2h示出了一对检测器，其成配置为在一端具有修饰，从而抵抗降解单链(ss)DNA的外切核酸酶。UD具有在3’端处的修饰，其抵抗通过在DNA单链上具有的3’活性的外切核酸酶的检测器的降解。可替换地，DD可以具有5’修饰以抵抗由5’-ss-外切核酸酶的降解。
图2i和图2j示出了检测器，其配置为抵抗杂交于保护器寡核苷酸的外切核酸酶，如这样的保护器寡核苷酸，其具有结合于检测器的相应的DR2’和UR2’序列的序列DR2或UR2，在任一端处呈现双链结构。可以5’-或3’-修饰保护器本身以抵抗外切核酸酶，如所示。图2j还示出了靶序列(3’-DR-UR-5’)，其相对较短，如微小RNA，其中已在其3’端处多腺苷酰化靶。DD的特征在于邻近DR’的互补多-T部分。
图3a示出了本发明的环化的测定设计，其中利用检测器寡核苷酸探针(DO)，其可以(a)通过DR’和UR’区杂交于靶序列，从而形成(非共价)环化结构。在用核酸酶和连接酶加以治疗以后，然后可以(c)扩增环化连接产物。图3b、图3c、和图3d示出了部分杂交的DO检测器、杂交于非靶序列的检测器、或非特异性地杂交的检测器，其可以通过核酸酶加以消化或不适合于指数扩增。
图4示出了本发明的测定，其中在杂交期间提供(通用)第二链(2S)，以致靶(DR-UR)、DO、和2S形成环化、双链结构。用连接酶加以处理导致导致共价环化连接产物。可选地，ss-核酸酶可以用来降解过量的检测器和杂交复合物，其对于靶不是特异性的。可以灭活核酸酶。如果需要，可以线性化环化结构，例如通过限制性内切核酸酶。
图5a示出了杂交复合物的详细视图，其中利用不同的环化的DO，在其5’端具有短非互补活瓣(CP5)，以及可选地在3’端上的短非互补序列(CP3)。图5b示出了在通过活瓣核酸酶(如Fen-1)除去CP5以后的杂交复合物。如在图5c中所示，如果需要可以磷酸化5’端。图5d示出了CP3如何可以填充由Fen-1留下的间隙，以致可以将DO连接成环化形式，如在图5e中。可以将非互补CP5和/或CP3活瓣并入任何DD和UD设计。
图6a提供靶序列(SEQ ID NO:33-56)，用来设计检测器，其用于针对感兴趣的24种人基因的mRNA表达产物。选择基因以显示在6个数量级丰度的预期范围内的检测，其具有10、1、和0.1ng样品RNA输入。针对锚定检测器设计(图6b、图6c、和图6d)和环化的设计(图6e、图6f、和图6g)，示出通过测序确认的扩增的连接产物的数目。x轴是用于第一技术重复；y轴是用于第二重复。
具体实施方式
连接测定，通常
在图1中示意性地说明典型的连接测定，其在实施例1中详细讨论。使可能含有靶序列的样品接触一组检测器寡核苷酸探针(“探针”或“检测器”)。对于每个靶序列，提供一对检测器：下游检测器(DD)和上游检测器(UD)。下游检测器可以具有部分(DR’)，其互补与指定为下游区(DR)的靶序列的区。上游检测器可以具有部分(UR’)，其互补与指定为上游区(UR)的靶序列的区。在本文中，当靶序列是mRNA的一部分时，相对于转录的5’-至-3’方向，来使用术语“下游”和“上游”，以及为方便起见，经常下划线示出指定为上游的区。
如图1所示，对于每个靶序列，允许DD的DR’和UD的UR’杂交于靶序列的相应的DR和UR(如果存在于样品中)。当靶序列的DR和UR是邻近的以及检测器寡核苷酸对的DR’和UR’特异性地杂交于靶序列以形成杂交复合物时，可以连接相邻检测器DD和UD。因而，DD-UD连接产物的形成作为证据：靶序列(DR-UR)存在于样品中。在其中由至少一个核苷酸来分开靶序列的DR和UR的情况下，在连接步骤以前可以是利用样品作为模板来(b0)延伸DR’，以致延伸的DR’和UR’变成邻近的并且可以加以连接。然后可以通过各种方式来检测连接产物；如果需要，可以在检测之前扩增产物。
本发明提供了方法，其中在一个或多个步骤中将杂交复合物暴露于可以降解核酸的单链的至少一种核酸酶。如下面详细讨论的，本发明提供了测定的检测器和其它成分，其成一定构造以当检测靶序列时选择性地抵抗核酸酶。核酸酶可以降解过量或未使用的检测器、或非特异性地或非生产性地结合于在样品中的不是感兴趣的成分的检测器。核酸酶的策略性使用使得可以通过在单反应容器中在一种试剂以后添加一种试剂(从样品开始)来进行连接测定。
样品
在本方法中使用的样品可以是任何物质，其中期望检测感兴趣的核酸的靶序列是否存在。这些物质通常是生物来源的，但可以来自人造或环境样品。生物样品可以来自活的或死的动物、植物、酵母和其他微生物、原核生物、或它们的细胞系。动物的具体实例包括人、灵长类动物、狗、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇(如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、各种蠕虫(如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))和在实验室中或作为疾病的动物模型所研究的任何其它动物。样品可以具有以下形式：整个生物体或系统、组织样品、细胞样品、或无细胞的样品。具体实例是癌细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、原代肝细胞、和淋巴细胞以及它们的亚群。可以将样品提供在液相中，如来自组织培养的无细胞匀浆液或液体介质，或在悬浮液、组织碎片或匀浆液中、或在固相中的非贴壁细胞，如当样品被固定在载玻片上或具有福尔马林固定石蜡包封(FFPE)组织或细胞的形式时，或当在表面上或在表面中生长细胞时，只要可以使检测器接触(为了潜在杂交)样品核酸。
核酸
在样品中待检测的感兴趣的核酸包括基因组、转录物组、和核酸的其它功能集、以及它们的子集和组分。感兴趣的核酸可以是DNA，如核或线粒体DNA、或cDNA，其反转录自RNA。感兴趣的序列还可以来自RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、siRNA(例如，小分子干扰RNA、小抑制性RNA、和合成抑制性RNA)、反义RNA、环状RNA、或长非编码RNA。感兴趣的核酸可以是在任何处理阶段的微小RNA(miRNA)，如初级微小RNA(pri-miRNA)、前体微小RNA(pre-miRNA)、发夹形成微小RNA变体(miRNA*)、或成熟miRNA。在实施例3a中讨论了微小RNA的检测。
可以加长感兴趣的相对较短的核酸，如成熟miRNA，以增强与检测器的杂交。例如，许多微小RNA在一端被磷酸化，并且可以通过与补加寡核苷酸的化学或酶连接被加长。补充寡核苷酸可以是单链、双链、或部分双链，其取决于待使用的连接方法。如果需要，补充寡核苷酸对于每个靶序列可以是独特的，或对于一些或全部的待连接的靶序列可以是通用的。然后可以借助于延伸的DR’和/或UR’区，其包括杂交于补充序列的部分，来设计检测器。还可以通过添加核苷酸，如通过多聚腺苷化，来补充靶序列，其中延伸的检测器包括杂交于补充聚A尾的至少一部分。利用延伸的检测器对成熟miRNA序列的家族的检测讨论于实施例3b并说明于图2j。
在样品中核酸的量会有所不同，其取决于样品的类型、复杂性、以及样品的相对纯度。由于测定的灵敏度，样品可以取自少量细胞，例如来自少于100,000、10,000、1000、100、50、20、10、5个细胞，或甚至来自单个细胞。在样品中核酸的总量可以相当小：小于100、50、20、10、5、2、1微克、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1纳克、50、20、10、5、2、1皮克或更少的核酸(见图6d)。特别是当耦合与用于检测的连接产物的代表性扩增时，在样品中存在的特定靶序列的拷贝数可以小于100,000、10,000、1000、100、50、20、10、5、或甚至是单拷贝。当然，输入核酸的量也会有所不同，其取决于样品的复杂性和待检测的靶序列的数目。
检测器
基于特定靶序列，本发明提供了检测器寡核苷酸的汇集，其中靶序列具有一对上游和下游检测器(UD和DD)，其对应于DR和UR，其通常是感兴趣的整个核酸序列的亚序列。可以提供检测器以检测含有突变的靶，其包括各个单核苷酸多态性(SNP)、基因融合、和外显子剪接变体。单独的靶序列可以具有一组以上的DR和UR，其可以由用户加以选择以优化测定的性能。多组的DR和UR可以提供相同靶序列或靶序列的不同部分的多次测量，如不同的外显子或外显子接合点，或提供没有突变的序列的一部分与可能含有突变的序列的一部分的测量。
靶序列
靶序列可以选自在物种或环境的基因组或转录物组中的序列或亚序列的任何组合。上述组可以对于样品类型是特异性的，如细胞或组织类型。对于一些样品类型，靶序列的数目可以为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、23,000、30,000、38,000、40,000、50,000、或更多的上限和下限的任何组合。靶序列的数目还可以表示为定义组的序列的总数的百分比，如在人转录物组中的RNA或在人基因组中的基因，范围为0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、65％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、和100％的上限和下限的任何组合。在使用大组的检测器寡核苷酸的情况下，它可以用来检查每个寡核苷酸的全序列的相对于在组中其它寡核苷酸的潜在交叉杂交，其中，例如，一种寡核苷酸可以无意中作为其它检测器的模板。虽然这样的非特异性人工物可以通过序列加以确定，并且通常丢弃自检测结果，但它们可能表示竞争反应资源的非信息杂交事件。
检测器寡核苷酸本身可以是DNA、RNA、或上述两者的混合物或杂交体。如果需要，它们可以具有修饰核苷酸如双脱氧核苷酸、脱氧尿苷(dU)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)、5-羧基胞嘧啶(5caC)、和肌苷。对于检测器寡核苷酸的还有其它修饰包括修饰碱基如2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氟碱基、5-溴尿嘧啶、或5-硝基吲哚。其它检测器寡核苷酸可以具有在一个或多个位置处的修饰糖-磷酸主链。这样的修饰包括3’-3’或5’-5’连锁倒位、锁核酸(LNA)、或肽核酸(PNA)主链。LNA可用于它们的相对于互补碱基的更强的杂交性能，从而增强对于作为整体的检测器寡核苷酸的选择性或总体结合亲和力。在远离连接点的位置1、2、或3处还可以使用修饰碱基或键。
如在图1中示意性示出，下游检测器(DD)具有互补下游区(DR’)，其长度可以是至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、或50个核苷酸。类似地，上游检测器(UD)具有互补上游区(UR’)，其长度可以是至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、或50个核苷酸。在对于靶序列的DD和UD的给定对中，DR’和UR’不需要完全相同的长度，但通常是相似的，以致它们可以在类似的条件和严格性下杂交于靶。
如下面详细讨论的，可以优化检测器，用于连接，如通过在UD上提供5’-磷酸，虽然这不是必需的，其取决于连接酶或其它连接方法的选择。当使用RNA连接酶时，还可以在DD和UD的可连接端处替代核糖核苷酸，以增加连接的特异性和效率。
检测器标记
在连接测定直接进入检测步骤的情况下，可以设计被适当标记用于检测的一种或两种检测器。例如，可以用彩色或荧光染料、乳胶珠、量子点、或纳米点来标记检测器。标记还可以采取用来使得能够检测和识别的另外核苷酸序列的形式，如条码序列。例如，有用的条码序列可以唯一识别在待测量样品内的特异性基因或靶序列，或一组选择基因或靶序列。这样的序列可以定位在UR’和P2’序列之间，和/或在DR’和P1序列之间，以致当使用旁侧引物时它们被扩增。此序列还可以是随机序列，可用于确定在样品中靶基因的拷贝的数目，其独立于任何扩增步骤的特定效率。
杂交
回到测定步骤，提供检测器以致它们接触样品以允许检测器特异性地杂交于靶核酸。技术人员可以选择杂交条件以允许和优化在多核苷酸之间的具有所期望程度的特异性或错配的杂交，以及这样的条件会有所不同，其取决于在杂交反应中存在的序列的长度和组成、任何修饰的特性、以及条件如多核苷酸的浓度和离子强度。特定杂交温度包括30°、32.5°、35°、37.5°、40°、42.5°、45°、47.5°、50°、52.5°、55°、57.5°、60°、62.5°、65°、67.5°、70°、72.5°、75°、77.5°、80°、82.5°、85°、87.5°、和/或90°。可以通过以不同的速率和分布来升高或降低温度以实现特定杂交温度，如定时温度平台、5℃、10℃、或15℃的一个或多个增量或增减、以及在两个或多个温度之间的反复循环。还可以存在0、1、2、5、10、20、50、100、200、和500mM的离子如Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+和/或Mn2+，以及这样的离子可能影响其它杂交条件的选择。空间拥挤成分如支链多糖、甘油、和聚乙二醇还影响杂交。在杂交(和随后的)反应中可以存在进一步的添加剂，如DMSO、非离子洗涤剂、甜菜碱、乙二醇、1,2-丙二醇、甲酰胺、四甲基氯化铵(TMAC)、和/或蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)(根据所需的特异性)。
可选地，可以调节或微调用于杂交的条件以允许在相同的环境中进行其它步骤。例如，用于杂交的相同的缓冲液可以用于裂解在样品中的细胞，促进某些细胞类型的杂交，促进细胞壁、细胞膜、或亚细胞部分的去除或渗透(根据需要)。取决于在测定中使用的连接方法，可以选择杂交条件以相容与用于连接的条件：按原样；或借助于添加一种或多种成分以及优选地当从杂交转变到连接步骤时无需变化反应容器。
连接
可以通过化学连接或通过使用连接酶或连接促进辅因子来进行连接反应。可商购各种各样的切口修复连接酶来当杂交于另一单链模板时催化在邻近的单链多核苷酸之间的磷酸二酯键的形成，如当杂交于模板时将DNA连接于RNA。实例是噬菌体T4DNA连接酶，其通常被理解为使用ATP作为辅因子。可以在连接酶反应期间供给ATP。在其他反应中，可以预腺苷酸化连接酶。在还有其他的反应中，如同5’App DNA/RNA连接酶，必须在5’端处预腺苷酸化UD。在典型反应中的UD将具有5’-磷酸以促进与DD的连接，虽然这不是必需的，其取决于连接酶和连接条件的选择。(在为了有效连接而需要在DD上的5’-磷酸的情况下，没有5’-磷酸化的可比的寡核苷酸可以用来抑制或减少不需要的连接。)优选的连接条件包括10、25、50、100mM Tris-HCl(pH 7.5、8.0、或8.5)；至少10mM、5mM、2mM、1mM MgCl2；至少2mM、1mM、0.7mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM、0.05mM ATP；或至少10mM、7mM、5mM、2mM、1mM、0.5mM DTT或其它抗氧化剂。还可以使用T3DNA连接酶，其可以连接更广范围的底物以及具有对盐浓度的更宽的耐受性。和其他步骤一样，可以依据反应成分和条件的特性如离子强度，来选择温度。
如上所述，可选的延伸步骤可以先于连接步骤，如在图1的步骤(b0)中。可选的切割步骤还可以先于连接步骤，如通过核酸酶，以除去任何突出端。在其他情况下，DD的一部分可以重叠与UD所杂交的UR序列，以致在UD和DD的杂交以后，存在1、2、3、或更多碱基的突出端序列。用于除去突出端的有用的酶是活瓣内切核酸酶，如Fen-1。
扩增
如果需要，可以扩增(例如通过PCR或qPCR)连接产物以促进检测。可商购扩增方法和仪器，包括PCR板和液滴格式，以及可以针对特定平台来选择和定制扩增酶(如Taq和它的商业变体)和反应条件。可选地，选择用于扩增的聚合酶可以具有链置换活性。如图1所示，检测器可以具有另外的序列(“尾”)，其包括引物杂交序列(例如P1、P2’)或它们的补体，其充当扩增序列，以致在连接以后，可以借助于一对扩增引物(P1、P2)来扩增连接产物。示例性下游扩增序列(P1)是
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3′(SEQ ID NO：1)，
其可以连同具有相同序列(P1)的引物一起加以使用。示例性上游扩增序列(P2’)是
5′-ATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3′(SEQ ID NO：2)，
其可以连同引物P2(以3’-至-5’取向示出)一起加以使用：
3′-TAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-5′(SEQ ID NO：3)，
如果需要，扩增引物可以包含条码序列，例如这样的条码序列，其唯一确定在多样品实验中的样品，以及可选地具有冗余和/或纠错特点。在一些实验中，例如，不同的样品条码可以用于96、384、1536、或更通常2n或4n种不同的样品，其是借助于分别用于一些步骤(如杂交、连接、和扩增)的不同的条码加以制备，以及结合用于其他，如检测。可以将条码序列并入引物，如3’至扩增序列，以致条码变成扩增链的部分。在其他情况下，可以通过另外的序列来延伸引物的扩增序列以提供引物杂交序列，其可以用于随后的测序步骤。还可以将条码插入在扩增序列，以及如果需要，延伸的扩增序列，和另一序列之间，其中上述另一序列可以用于捕捉，如在表面上的作为测序过程的一部分的捕捉，和/或用于又一引物杂交序列，其用于测序。在每种情况下，将连同检测器序列的其余部分一起来扩增条码，例如形成单扩增的、延伸分子，其含有测序引物杂交序列、样品条码、和基因特异性序列，其可以包括基因特异性条码或靶分子特异性条码以及靶基因的序列或序列的补体。在其中靶向寡核苷酸是cDNA的情况下，基因特异性序列或样品特异性序列可以被添加作为用于反转录的引物的一部分，以及是由UD和DD靶向的序列的一部分。
在其他情况下，本领域已知的方法可以用来扩增连接的DD和UD序列，如通过以下重复循环：(1)连接，(2)加热以熔化掉连接产物，(3)冷却以允许DD和UD杂交于靶，(4)连接，然后重复加热(2)、冷却(3)、和连接(4)步骤。可以在扩增步骤(c)以前进行这些另外的扩增步骤，期间，将样品条码和其它序列加入连接的UD和DD序列。还可以通过RNA的全转录物组扩增或cDNA的扩增来扩增UD和DD杂交的靶。
检测
可以可选地通过方法如测序、qPCR、或标记用于在阵列上的检测或其他分子检测，来检测连接产物(或其扩增子)。其它检测方法包括用于计数标记分子的流通系统。取决于检测方法，熟练的用户将能够修改检测器和扩增引物的设计以包括适当的功能特点，如用于在测序流动池上的桥接扩增。用于扩增和检测的实验资源可以受到限制并且往往是在最昂贵的实验资源中，以及可以通过减少在测定的各个阶段中存在的非信息测定成分的数目来优化它们的消耗。
核酸酶
因此，本发明提供了核酸酶和测定成分，其成一定构造以抵抗降解，从而使得能够更有效地利用资源和更加敏感的检测。作为进一步的优点,本发明能够实现更简单的测定工作流程，其可以在单反应容器中或完全在液相中进行。
核酸酶可以是消化或降解核酸的单链的酶。优选地，核酸酶不消化双链(或对于双链具有显著更少活性)，包括DNA:RNA杂交体。例如，相比于单链，基于摩尔底物比率，在相同的条件下，对于双链，核酸酶可以具有小于10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％、或0.1％的活性。类似地，可以选择核酸酶，以致在双链中的单链缺口处它没有明显消化。核酸酶可以是在某些条件下降解单链的内切核酸酶，如绿豆核酸酶。核酸酶还可以是降解单链的外切核酸酶，其可以是DNA的单链。例如，具有单链3’-至-5’外切核酸酶(3’外)活性的核酸酶包括来自大肠杆菌的外切核酸酶I(外I)和T3外切核酸酶。可以使用酶如外切核酸酶T(RNaseT)，其具有对DNA和RNA单链的3’外活性，只要在测定中已连接检测器以及不再需要RNA链。具有单链5’-至-3’外切核酸酶活性的核酸酶包括外切核酸酶VIII和RecJf。核酸酶可以是消化5’突出端或活瓣的酶，如活瓣内切核酸酶1。可以单独或以核酸酶的混合物，如一对3’和5’外切核酸酶，来使用核酸酶。
可以在测定的各个阶段中使用核酸酶。例如，可以在连接步骤(bl)以后提供(b2)核酸酶以除去未连接或过量检测器，如在图2e中。核酸酶还可以降解仅部分或非特异性地杂交于靶序列的检测器。如在图2f中。如果相容与使用的连接条件，还可以在连接步骤(bl和b2一起)期间，或甚至在连接步骤(b2，然后bl)以前，提供核酸酶，只要它不干扰靶序列的预期检测。取决于测定设计，可以在可选的(b0)延伸和(d)扩增步骤、或多步骤以前、期间、或以后提供核酸酶，以实现所希望的除去不需要的靶、检测器、其它寡核苷酸、或任何产物的目的。
当不再需要核酸酶活性时，可以除去或灭活核酸酶，如在连接步骤以后。可以通过选择用于特定核酸酶但基本不会干扰测定的其余部分的方法来灭活核酸酶。对于一些核酸酶，可以添加核酸酶抑制剂(如在图4中，右下)或螯合剂，如EDTA，只要它不干扰可能需要例如Mg++的后续步骤(或可以在后续步骤之前加以除去)。可以通过加热来灭活其它核酸酶，例如在70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或98℃下单一或重复温育1、2、5、10、15、20、25、30、45分钟、或1小时。如果使用一种以上的核酸酶，则可以单独地或通过相同的方式来灭活一种或两种。为了抵抗在本发明的一个或多个步骤中提供的核酸酶的活性，本发明提供了具有允许靶序列的检测的各种构造的测定成分。当然构造方法的选择将取决于待使用的特定核酸酶。
锚定检测器
在一种构造中，上游检测器具有第二区(UR2’)，其互补与靶序列的第二区(UR2)，如图2a所示。由于UD的尾可以杂交于靶的分开的部分，所以这种构造可以被描述为"锚定"检测器，如在图2b中。在UD的3’端处的锚形物杂交与靶以形成双链，因而成一定构造以抵抗消化为降解单链的核酸酶，如3’外切核酸酶如外I。
作为单独的靶结合区，锚形物UR2’可以用来提供在类似序列之间的另外的区别，如基因的家族的同种型，其中超出DR和UR靶序列的范围，发现在同种型之间的序列差异。
UR2’的长度可以是至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、或50个核苷酸。可以通过非互补区(CPl)，UR2’分开自UR’，其中上述非互补区的长度可以是至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个核苷酸。一般来说，UR2’将是相对于UR’的上游。如果存在扩增区(如P2’)，它可以是在UR’的上游，如在CPl或部分的UR2’内以允许UR’部分的扩增，如图2c所示，以生成在图2d中的扩增产物(AP)。
在镜像构造中，正是下游检测器具有互补与靶序列的第二区的锚形物区(DR2’)。DR2’锚形物杂交于在靶上的DR2，以致构造抵抗5’ss-外切核酸酶的作用。DD的UR2’将通常是相对于UR’的下游。如果扩增区(如P1)是存在的，它可以是在DR’的下游以允许在连接以后DR’的扩增。可以单独使用或组合使用锚定DD和UD以抵抗核酸酶的混合物。
由于检测器的单独的锚形物区，通过单分子动力学，可以影响检测器的杂交特性，所以可以调节DR2’、CPl、DR’、UR’和UR2’的组成和相对长度，以优化在检测器对之间以及在检测器池的对之间的靶选择性。
可以降解在连接反应中没有使用的检测器，如图2e所示。此外，还可以降解不完全结合的检测器，如在图2f中的那些检测器，例如当UD的UR’结合于但UR2’不结合于靶的UR时，不管是否由于UR’结合于非靶序列或结合于相关于预期的靶UR但缺少UR2的靶。类似地，结合靶的DR2但不结合DR的锚定DD将容易受到3’ss-外切核酸酶的影响(或将不会产生与相应的UD的有效连接产物)。其它检测器将不会被扩增，例如在样品中在过量的靶序列中的检测器或非特异性地结合于非靶序列的检测器。因而，锚定检测器的使用可以增加针对靶序列的连接测定的特异性，同时允许核酸酶降解过量或未使用的检测器。
封闭检测器
另一种构造具有检测器，通过在一端处或相邻于一端具有核酸酶-阻断基团，其是耐核酸酶的。图2h示出DD，具有5’-阻断基团，其可以连同5’外切核酸酶一起加以使用。还示出具有3’-阻断基团供连同3’外切核酸酶一起使用的UD。优选地，在存在多个靶和检测器对的情况下，当使用5’或3’外切核酸酶时，所有的下游或上游检测器分别具有5’或3’阻断。
用于抵抗核酸酶的有用的构造包括借助于反向核苷酸如脱氧胸苷(idT)、双脱氧核苷酸如二脱氧胸苷(ddT或iddT)、或末端核苷酸的2’/3’-O-乙酰化的终止。取决于所选的核酸酶的底物偏好，前面描述的一种或多种的其它修饰核苷酸可以用作阻断基团。可替换地，通过一个或多个硫代磷酸酯键(代替自然发生的磷酸二酯键)，将末端核苷酸附于其余的寡核苷酸。可以抵抗核酸酶的其它修饰包括前面讨论的LNA或PNA主链。在一些构造中，在检测器上的发夹环或其它二级结构可以充当用于检测器的核酸酶-阻断基团。发夹的一端可以具有阻断基团。在其它构造中，在杂交之前，通过并入检测器的ssFUSE序列，蛋白质或其它成分可以结合于DD的5’端或UD的3’端，如序列特异性单链结合蛋白如远上游元件(FUSE)结合蛋白(FUBP)。如果DD的5’端或UD检测器的3’端成一定构造以被固定(无论是永久还是可逆地)于固相，则固相本身可以充当针对在检测器上的核酸酶活性的阻断剂。可以有用的是，在单检测器或两个检测器中结合任何前述特点以抵抗所选的核酸酶的作用以及提供其他优点，如稳定性和杂交特性。
保护器
又一构造提供了一种或多种寡核苷酸，通过在不会干扰DR’的杂交的区或互补与靶序列的UR’区中杂交于DD或UD，其保护器检测器。例如在图2i中，提供DR2保护器寡核苷酸以杂交于在DD的5’端处的DR2’区，从而形成耐5’外切核酸酶的双链构造(以支柱表示)。如果使用3’外切核酸酶，那么可以提供UR2保护器以在UD的3’端处形成双链。可以通过如上所述的阻断基团或键，来保护器保护器寡核苷酸本身以避免外切核酸酶活性的影响。例如，3’-封闭UR2保护器示于图2i，以及5’-封闭DR2保护器示于图2j。如果将使用5’和3’外切核酸酶的混合物，那么可以提供DR2和UR2保护器，其可选地分别具有5’-或3’-阻断基团。
环化的检测器
在环化的具有一个检测器的构造中，上游互补区(UR’)和下游互补区(DR’)是在单个、环化的检测器寡核苷酸(DO)上，如图3a所示。DO可以在5’-至-3’方向上具有：(B)上游互补区(UR’)；(C)可选的扩增区(P2’)；(D)非互补区(CP2)，其具有并不互补与靶序列的序列；(F)下游互补区(DR’)；以及(E)可选的扩增区(P1)。DO的长度可以是至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200个碱基，以允许分子具有环化的柔性。
具有两个检测器的替换的环化的构造具有DD，其在5’端处具有CS部分，以及UD，其在3’端处具有反向互补CS’部分，以致，通过CS和CS’部分，DD和UD是彼此部分杂交的。可选地，在CS部分的5’端或CS’部分的3’端处存在阻断基团。另一种环化的构造具有三个寡核苷酸：两个检测器和桥接寡核苷酸：DD具有在5’端处的CS1部分；桥接寡核苷酸具有CS1’部分和CS2’部分；以及UD具有在3’端处的CS2部分。桥接寡核苷酸可选地具有在5’端和/或3’端处的阻断基团。
在靶序列DR-UR的存在下，环化的检测器可以(a)环化在靶上，从而形成杂交复合物(HC)，其耐单链外切核酸酶以及其可以被(b2)连接。
如果在适当的方向上提供扩增区，则可以借助于P1和P2引物来(c)扩增连接产物(LP)以形成扩增产物(AP)，其含有连接的DR’和UR’区。
没有特异性地杂交于靶或不完全结合于靶的DO容易被核酸酶降解(图3d)或P1和P2’扩增区将不会在用于引物扩增的正确的方向上，如图3b或3c所示。在一些情况下，可以扩增检测器，但它将是线性扩增，而不是以指数方式。在这样的情况下，可以检测次要序列以及计算上从检测结果打折或删除次要序列。
第二单链(2S)
再一种构造提供了单链DNA寡核苷酸(2S)以杂交于检测器的单链部分，进而形成双链杂交复合物，如图4所示。2S寡核苷酸可以互补与CP1，以致整个结构变成双链。在测定旨在检测多靶序列的情况下，相同的2S可以一般地用来形成环形结构，这是因为它不依赖于与靶序列的杂交。然后可以连接上述结构，从而完成环状、双链结构以及耐外切核酸酶、ss-内切核酸酶、和切口-内切核酸酶。
可选地，可以故意切口或切割环形结构，例如通过切割内切核酸酶。DO可以具有限制性内切核酸酶识别位点，以致可以线性化环形结构(如果需要)。为了避免消化靶序列或检测器，选择用于CP1的识别位点可以是比较少见的位点如用于AscI、Fsel、AsiSI。如果需要，可以通过常规方法从环形结构分开线性化结构。
活瓣
环化的DO可以成一定构造以致它具有(A)在UR’的5’方向上的非互补区(CP5)和(G)在DR’的3’方向上的可选的非互补区(CP3)，如图5a所示以及在实施例4中所讨论的。可以提供第二链，其在5’-至-3’方向上具有：P2、CP2’、Ρ1’，以致靶核酸、检测器寡核苷酸、和第二链一起形成具有5’活瓣的杂交复合物。核酸酶，如Fen-1，可以用来除去5’活瓣(图5b)。可以磷酸化环化的检测器的5’端(图5c)。如果需要，可选的CP3区然后可以杂交于靶序列，从而形成3’端，其可以被连接(图5d)于邻近的UR’以形成连接产物(图5e)。
在固相、液相中的步骤
在一些实施方式中，可以进行杂交、连接、或延伸步骤，同时靶序列在原位。这可以是特别有用的，例如，当样品是在组织载玻片上时，以致已知连接会发生在可记录位置处并且可以比较与在载玻片上的其他位置处的类似反应。连接探针可以保持在上述位置处，同时进行其它步骤，如在或接近上述位置处其它分析物的成像或检测。如果需要，可以通过各种各样的用于交联于上述位点的化学或酶法，其可以是永久的或可逆的，如通过可光切割的连接如同利用氰基乙烯基咔唑核苷类似物(CNVK)，连接探针更牢固地保持原位。在特定实施方式中，连接产物可以原位洗脱自样品，用于收集和进一步处理，优选洗脱自小区域以保存连接反应产物的位置信息和形态背景。
在其他实施方式中，可以在液相中进行一个或多个步骤，如在微流体系统中，以致一个或多个步骤不涉及到固相的捕捉，如到珠或板表面。例如，可以在液相中进行杂交、延伸、连接、核酸酶消化、扩增、或检测步骤的任何之一或或组合。在混合相测定中，固相可以用来固定以下一种或多种：样品、检测器寡核苷酸、杂交复合物、延伸产物、连接产物、或扩增产物。尤其是，在杂交步骤、连接步骤、或两者期间，可以将靶核酸附于固体表面。固体表面可以是珠，如磁性、非磁性、聚合、可逆固定、或乳胶珠、或它们的复合珠，或相对平坦的表面如板或流动池表面，其可选地具有类似材料的涂层。混合相格式允许将成分从一个反应环境转移到另一个反应环境，或当成分留在一个容器中时，来改变条件。
依次加入相同的反应容器
可替换地，可以优化反应以致通过依次添加试剂，如酶或缓冲成分，来进行至少一个步骤，以致在和前面的步骤相同的容器中发生反应，可选地无需中间洗涤或转移步骤。优选地，添加的顺序不需要显著添加液体容积来稀释用于下一步反应的成分，例如在初始样品和用于检测的制剂之间不大于1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、5倍、10倍、15倍、或20倍稀释。可以在试剂盒中提供待添加的成分(如下所述)。
衰减子
在其中在给定样品中存在一种以上的靶序列的情况下，可能的是，它们将存在不同量。此外，在类似的样品中靶序列的量可以有所不同。在理想情况下，检测测定将具有足够的动态范围以在单个实验中定量测量不同靶序列的存在。然而，对于一些类型的样品，各种靶序列的丰度范围可以跨越几个数量级。例如，当分析细胞的RNA表达产物时，特别感兴趣的个别序列可能存在很少的拷贝，而其它序列则是高丰度的靶序列(HAT)。在样品中HAT可以大量存在，以致它们可能会削弱检测低丰度的靶序列的存在的方法的能力。
取决于细胞或组织类型，上述高丰度HAT可以包括这样的序列，其编码通常被称为持家基因的基因。HAT的实例包括这样的序列，其编码全部或部分的肌红蛋白、肌动蛋白、微管蛋白、遍在蛋白、热激蛋白(HSP)、核糖体蛋白、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、或小核RNA(snRNA)。HAT的其它实例可以编码全部或部分的细胞色素c、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L7(RPL7)、核糖体蛋白S6(rpS6)、snRNA RNU、磷酸甘油激酶(PGK)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白ζ(YWHAZ)、β-肌动蛋白、或β-微管蛋白。进一步的实施例包括这样的序列，其编码全部或部分的α-2-微球蛋白、波形蛋白、和纤连蛋白。HAT的还有其它实例编码全部或部分的细胞色素如线粒体编码的细胞色素b(MT-CYB)、外线粒体膜细胞色素b5类型B、微粒体细胞色素b5类型A(ACYB5A)、和抗坏血酸依赖性细胞色素b3(CYBASC3)。之间，何种序列是高丰度的可以不同，所以，基于针对样品的上述类型的文献搜索，某些靶序列可以被指定为预定集的潜在HAT，或可以通过进行初步测定以确定在样品类型中的更丰富的序列加以确定。由于从一个样品类型到另一个样品类型，如在不同的组织或细胞类型各种衰减子寡核苷酸("衰减子")可以用来减少待检测的HAT相关连接产物的总数。提供一些衰减子，其可以提供在样品中HAT的阳性检测(但以信号的较低水平)。
在图2g中示出可用于本发明的衰减子，其中提供UR2’寡核苷酸以杂交于UR2靶(与检测器竞争)。类似地，可以提供UR2、DR2’、和DR2寡核苷酸，以竞争与锚定检测器的部分与HAT的结合，从而减少形成HAT相关连接产物的检测器的总数。特别有用的衰减子可以具有DR2的一部分和DR的一部分；或具有UR的一部分和UR2的一部分，从而为相同锚定检测器的两个部分而竞争。
对于环化的检测器设计，衰减子可以是寡核苷酸，其具有相同或互补与UR或DR、或两者的部分。衰减子还可以采取寡核苷酸的形式，其填充间隙，如图5b所示，但被阻断自产生可连结产物。
可切割检测器
可以期望，检测器寡核苷酸含有一个或其他修饰，在连接或可选的扩增步骤以后，通过处理，其可以被选择性地切割。例如，检测器寡核苷酸可以具有如此定位的dU，以致它不会干扰杂交或连接步骤。然而，在连接以后，可以通过dU特异性酶，如尿嘧啶-DNA糖基化酶，接着内切核酸酶VIII，来切割并入dU寡核苷酸的产物。另一个选择性地可切割位点可以是限制酶切割位点，其不存在于待检测的靶序列中。
试剂盒
本发明提供了试剂盒，用于进行上述方法，包含检测器寡核苷酸、和可选的核酸酶、连接酶、和/或聚合酶。试剂盒可以进一步提供反应缓冲液，其用于在试剂盒中的酶，或待加入适用于酶的反应的缓冲成分。上述成分可以适合于加入用于酶反应的容器以制备用于酶的适宜的反应缓冲液。还可以选择成分以相容与用于方法的前面的步骤的反应缓冲液，以致？可以将成分加入同一容器以形成用于待使用的下一种酶的反应缓冲液。因而，可以选择成分以能够实现用于测定的多步骤的″添加-添加-添加″策略，从而最小化在分开容器之间的样品、寡核苷酸、酶和/或溶液的转移。
试剂盒还可以具有洗脱液，其适用于从供进一步分析的组织样品除去寡核苷酸，如连接的寡核苷酸。试剂盒可以进一步具有适用于试剂盒的检测器的扩增引物。
实施例
实施例1：代表性连接测定
提供了代表性方法以说明连接测定。在这里，利用多重测定格式，在细胞样品中检测了100种以上的RNA表达产物。对于每种表达产物，设计测定以检测在产物的全序列内的一个或多个靶序列。例如，在人细胞中，感兴趣的GAPDH基因编码酶甘油醛3-磷酸脱氢酶；在GAPDH基因的RNA转录物内的三个不同部分被独立地检测为靶序列。一种这样的RNA靶序列，在这里被鉴定为GAPDH2，是
5′-CGACCACUUUGUCAAGCUCAUUUCCUGGUAUGACAACGAAUUUGGCUACA-3′(SEQ ID NO：4)
其中，对于转录和翻译的方向，5’端被指定为″上游″(下划线)以及3’端被指定为″下游″。为了以后讨论方便，可以在3’-至-5’方向上示出相同的GAPDH_2靶序列：
3′-ACAUCGGUUUAAGCAACAGUAUGGUCCUUUACUCGAACUGUUUCACCAGC-5′(SEQ ID NO：5)
下游区(DR)被定义为GAPDH 2的下游25个碱基：
3′-ACAUCGGUUUAAGCAACAGUAUGGU-5′(SEQ ID NO：6)
其具有DR’的互补DNA序列：
5′-TGTAGCCAAATTCGTTGTCATACCA-3′(SEQ ID NO：7)
上游区(UR)被定义为GAPDH 2的上游25个碱基：
3′-CCUUUACUCGAACUGUUUCACCAGC-5′(SEQ ID NO：8)
其具有UR’的互补DNA序列：
5′-GGAATGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3′(SEQ ID NO：9)
对于GAPDH_2，设计了一对检测器：下游检测器(DD)，其具有DR’序列，以及上游检测器(UD)，其具有UR’序列。对于每种靶序列设计了类似的对，以提供用于测定的一组检测器。在此实施例中，在5’端处磷酸化所有上游检测器。
在此特定实施例中，在实验中，利用两种引物，P1和P2，后来进行扩增步骤，所以，在实验中，所有UD包括引物序列(P1)以及所有UR包括互补引物序列(P2’)。然而，由于扩增对于本发明的实践是没有必要的，所以具体引物的序列和引物序列是选择事项以适合特定扩增方法(如果使用)。
对于每个测定实验，将至少10ng的分离自人肾或肝细胞系的RNA放入微量滴定板的孔中。对每个孔，添加20μL的2X结合混合物，其含有5nM的每种检测器(提供0.1皮摩尔/寡核苷酸的最终输入)、100nM生物素化寡核苷酸(dT)25、和5μL链霉亲和素涂层的磁珠，其是在洗涤缓冲液(40mM Tris-Cl pH 7.6、1M NaCl、2mM EDTA二钠、0.2％SDS)中。
在65℃下加热上述板10分钟以变性RNA，然后经40分钟将温度缓降至45℃以允许检测器退火到在RNA样品中的靶序列。然后将上述板转移到磁性底座以固定珠，从而允许上清，其含有未结合和过量的检测器，被吸出自孔。用50μL洗涤缓冲液洗涤上述珠至少三次。
向每个孔添加5Weiss单位的在20μL的IX连接缓冲液中的T4DNA连接酶(如由供应商提供的)。在通过吸管来再悬浮珠以后，在37℃下温育上述板60分钟以允许DD与UD的靶依赖性连接(视情况而定)。在连接反应以后，固定珠并用50μL洗涤缓冲液加以洗涤两次。为了从它们的RNA靶释放连接的检测器，将珠再悬浮在30μL中并在65℃下温育5分钟。在温育以后，固定珠，然后除去上清并转移到储存板。
对于可选的扩增步骤，将5μL上清，其含有连接产物，转移到PCR板的孔。然后添加10μL的PCR混合物，其含有0.45U Taq聚合酶、0.6μΜ P1引物、0.6μΜ P2引物、1.5mMMgCl2、和200μΜ dNTP。热循环仪使用以下程序：在94℃下10分钟，接着在94℃下30秒、在58℃下30秒、以及在72℃下30秒的20至25个循环。然后根据制造商的说明来测序扩增产物。
可以修改这种代表性连接测定，如在以下实施例中。
实施例2：锚定和环化的检测器设计
制备上游和下游检测器探针寡核苷酸，如在图2a和3a中，用于确定为乳腺癌靶的24种靶序列：ACTB_l、TFFl_l、GAT A3_3、GAPDH_3、CDHll、KRT19_2、TIMP1_2、NFKBIA_l、ESRl_l、VEGFA_3、LAMP 1_2、MUC13、BAD_3、PTEN_l、BRCA2_1、BCAT2_3、ICAM1_2、IGF2_3、BRCA1_2、EGFR_l、BMP4_1、KIT_3、WNTl_l、和EGF_3(以预期计数的下降顺序)。选择靶，用于一系列表达，其覆盖从ACTB_l至EGF_3的6个数量级。用于DR和UR的靶序列示于图6a。
用100、10、1、和0.1以及0(对照)纳克的MCF7总RNA作为样品，来重复三次进行测定。将检测器加入在1或2μL的容积中的样品并允许杂交，其中通过在65℃下温育10分钟，经20分钟从65°缓降到45℃，然后在45℃下保持20分钟。将外切核酸酶I(大肠杆菌)加入在6μL的0.5单位中的杂交混合物并在37℃下温育1小时。将T4连接酶加入在6μL的5单位中的混合物并在37℃下温育1小时。在80℃下进行加热步骤30分钟。通过添加2X PCR主混合物来扩增混合物。通过qPCR和测序来检测和量化对应于靶序列的扩增产物。结果见图6b-6g。
实施例3a：用于微小RNA的环化的检测器设计
设计环化的DO检测器，用于miRNA的Let-7家族。这些miRNA最初被转录为相对较长的转录物(pri-miRNAs)，但被处理成pre-miRNA，以及随后被处理成相对较短的成熟形式。在成熟形式中，以5’-至-3’，示出高度同源的Let-7家族，其中来自let-7a序列的变体被加粗)。
使用Hsa let-7a作为例子，DR’是5’-AACTATAC7AAC-3’(SEQ ID NO:18)以及UR’是5’-CTACTACCTCA-3’(SEQ ID NO:19)。提供约80个核苷酸的单链DNA寡核苷酸(2S)以杂交于DO的单链部分，从而形成双链杂交复合物，如图4所示。
在杂交以后，DR和UR的区可以表示为
其中靶miRNA是以小写字母表示。DO的部分被显示为上序列，其中DR’以罗马字体表示以及UR’以下划线罗马字体表示，有序列旁侧，部分示出，用斜体，如P1或P2’。加粗斜体的碱基表示相同2S寡核苷酸的3’端(在左边)和5’端(在右边)。
在连接以后，示出的部分形成没有任何缺口的双链结构
其耐外切核酸酶的攻击。
如果用于let-7a的DO成为杂交于类似的let-7c，则形成以下结构：
可以用各种各样的酶，如T4内切核酸酶VII、T7内切核酸酶I、或以外切核酸酶I和大肠杆菌外切核酸酶III、S1核酸酶、或核酸酶BAL-31的组合，来切割复合物，其含有错配。然后可以在步骤(bl)中借助于核酸酶的处理来降解带切口复合物，以致不形成连接产物。
如所说明的，如果需要，可以通过借助于限制性内切核酸酶的处理来线性化共价环化双链结构，其中2S含有适当的限制位点。可以借助于引物来扩增线性化产物。
实施例3b：用于微小RNA的延伸的检测器设计
设计了延伸的检测器，用于Let-7家族微小RNA，其已被多腺苷酰化。利用多核苷酸腺苷酰转移酶来添加3’多聚腺嘌呤尾来延伸微小RNA。对于Hsa let-7a微小RNA(SEQ IDNO:10)，以下用斜体示出多腺苷酰化序列(SEQ ID NO:28)。提供具有SEQ ID NO:27的上游检测器并提供具有SEQ ID NO:26的延伸下游检测器，其具有斜体聚T区(通常为多聚dT，如果检测器是DNA)。
补充3’多聚腺嘌呤尾和延伸聚T区的组合提供用于靶与检测器的杂交的更长的互补区，以及允许设计用于靶的DR和UR的更大的自由度。例如，用于DD和UD的互补区的长度在长度方面可以是更类似的。当检测相关靶序列的家族时，DD或UD可以用来检测一种以上的家族成员("通用的检测器")。从而对于Hsa let-7b，
相同的上游检测器可以用来检测let-7a和let-7b(以及let-7c)，因为在5’方向上的14个碱基是相同的。技术人员将能够设计用于相关序列的具体和通用的检测器的各种组合，如let-7家族，其取决于检测器的数目和所期望的杂交特性。
在允许延伸检测器杂交于多腺苷酰化微小RNA以后，连接检测器以形成用于检测或可选的扩增的连接产物。如果添加的补充腺苷的数目少于在DD中dT的数目，这不干扰连接和随后的步骤。如果补充A的数目较大，那么为了发生具体和靶有效连接，3’尾的多余部分不需要完全杂交于DD的剩余5’部分。
实施例4：活瓣设计
如在实施例3a中设计环化的检测器寡核苷酸，但其中UD在5’端处具有另外的多聚A CP5序列：
在DO与靶序列的杂交以后，将DO的UR’(以上下划线)杂交于靶UR，但多聚A序列仍然是未杂交活瓣，如图5a所示。可以用活瓣内切核酸酶，如Fen-1，来处理复合物，以除去多聚A和邻近的杂交的碱基。如在图1的步骤(b0)中可以延伸杂交于邻近的DR的DR’，然后连接于UR’区。
可替换地，DR’可以具有非互补部分(CP3)，如以下下划线的单C：
其可以杂交和填充由内切核酸酶留下的间隙，如图5d所示。在连接以后，形成无切口双链复合物，如在图5e中。可以线性化，如果需要，以及扩增环化结构，如早先图4所示。
以上提供的标题仅旨在方便在文件内的导览而不应该用来表征相比与另一部分的文本的一个部分的含义。技术人员会理解，另外的实施方式是在本发明的范围内。本发明仅限定于以下权利要求；来自说明书或其它实施例的限制不应导入权利要求。

Claims (15)

1.一种用于在样品中检测靶核酸序列的方法，其中靶序列具有下游区(DR)和上游区(UR)，所述方法包括
(a)使所述样品接触
具有互补下游区(DR’)的下游检测器寡核苷酸(DD)以及
具有互补上游区(UR’)的上游检测器寡核苷酸(UD)，
从而允许所述检测器特异性地杂交于所述靶核酸；
(bl)如果所述DR’和UR’的两者均特异性地杂交于靶序列的所述DR和UR，则连接所述DR’和UR’；以及
(b2)将杂交复合物暴露于至少一种降解单链但不显著降解双链的核酸酶，其中所述DD或UD的至少一种配置为抵抗所述核酸酶，
从而，通过所述核酸酶来降解非特异性地杂交的DD和UD；
从而，连接产物指示在所述样品中存在所述靶序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在液相中进行步骤(a)、步骤(b1)、或两者；或其中在所述靶核酸附接至固体表面时，进行步骤(a)或步骤(b1)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过将试剂加入和前述步骤相同的反应容器来进行步骤(a)、(b1)、或(b2)的至少一个。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是微小RNA或其部分，其中可选地在步骤(a)之前所述微小RNA是3’-多腺苷酸化的并且所述DD具有邻近所述DR’的聚T区。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸酶具有3’-至-5’活性；或具有5’-至-3’活性；或消化5’活瓣。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下任意项
(c)灭活所述核酸酶；
(d)扩增所述连接产物；或
其中通过至少一种核苷酸分离所述DR和UR，
(b0)使用所述样品作为模板来延伸所述DR’。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过具有第二互补区(DR2’或UR2’)配置所述下游检测器(DD)或所述上游检测器(UD)的至少一个，从而所述DR2’或UR2’可以特异性地杂交至所述靶序列的DR2或UR2。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述DD具有在所述DR’的下游的第一扩增区(P1)，并且所述UD具有在所述UR’的上游的第二扩增区(Ρ2’)。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤(a)中提供用于高丰度靶序列(HAT)的具有DR2、DR2’、UR2、或UR2’的一部分的衰减子寡核苷酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述衰减子(i)具有DR2的一部分和DR的一部分或(ii)具有UR的一部分和UR2的一部分。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，(i)通过5’-外切核酸酶阻断基团配置所述DD，(ii)通过3’-外切核酸酶阻断基团配置所述UD，
或(i)和(ii)的两者。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述阻断基团是固相。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，通过具有杂交于DR2保护器寡核苷酸的5’-端DR2’区配置DD；或其中，通过具有杂交于UR2保护器寡核苷酸的3’-端UR2’序列配置UD。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，当杂交至所述靶序列时，通过形成环化结构配置至少一种检测器寡核苷酸。
15.一种用于进行权利要求1所述的方法的试剂盒，包含用于靶序列和至少一种核酸酶的检测器；可选地进一步包含连接酶；或可选地进一步包含用于在所述试剂盒中的酶的反应缓冲剂的成分，其中所述成分适合添加用于在和所述方法的前述步骤相同容器中的酶反应。
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013106807A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Curry John D Scalable characterization of nucleic acids by parallel sequencing
US20230313309A1 (en) * 2014-09-08 2023-10-05 BioSpyder Technologies, Inc. Methods for Nucleic Acid Sequence Detection
US10683534B2 (en) 2015-01-27 2020-06-16 BioSpyder Technologies, Inc. Ligation assays in liquid phase
US11091810B2 (en) * 2015-01-27 2021-08-17 BioSpyder Technologies, Inc. Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
US11118216B2 (en) * 2015-09-08 2021-09-14 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis by joining barcoded polynucleotide probes
US20190323074A1 (en) 2017-01-05 2019-10-24 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As Quantifying dna sequences
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
SG11202106138SA (en) * 2018-12-10 2021-07-29 Combinati Incorporated Microfluidic array for sample digitization
WO2020123319A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020236939A2 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Paradigm Diagnostics Tissue preparation using nuclease
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP4219754B1 (en) 2019-12-23 2024-05-15 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
ES2960777T3 (es) * 2021-03-18 2024-03-06 Genomill Health Oy Métodos para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos en muestras diluidas o no purificadas
FI4060050T3 (fi) * 2021-03-18 2023-05-04 Genomill Health Oy Erittäin herkät menetelmät nukleiinihappojen tarkkaan rinnakkaiseen kvantifiointiin
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
EP4215619A1 (en) * 2022-01-21 2023-07-26 Genomill Health Oy Methods for sensitive and accurate parallel quantification of nucleic acids

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1500710A1 (en) * 2002-05-08 2005-01-26 ARKRAY, Inc. Method of detecting target nucleic acid
US20050026166A1 (en) * 2002-12-09 2005-02-03 Wanli Bi Concurrent enzymatic polynucleotide synthesis and detectable signal generation
WO2006071582A2 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 Applera Corporation Methods, compositions, and kits for forming self-complementary polynucleotides
US20060246475A1 (en) * 2005-01-21 2006-11-02 Third Wave Technologies Compositions and methods for increased dynamic range detection of nucleic acids
WO2008094902A2 (en) * 2007-01-29 2008-08-07 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
EP1975254A1 (en) * 2006-01-20 2008-10-01 Olympus Corporation Method of detecting nucleotide sequence with an intramolecular probe
WO2011041411A2 (en) * 2009-09-29 2011-04-07 Case Western Reserve University Method for detecting single nucleotide polymorphisms
WO2012158967A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-22 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
WO2014036743A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Genesky Diagnostics (Suzhou) Inc. Method for multiplex nucleic acid analysis
WO2014149599A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Ariosa Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225324A (en) * 1987-04-24 1993-07-06 Bioscience International, Inc. Diagnostics for mycobacteria in public health, medical, and veterinary practice
US4988617A (en) * 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US7045289B2 (en) * 1991-09-09 2006-05-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of RNA Sequences
SE9400522D0 (sv) * 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
JP4040087B2 (ja) * 1995-05-05 2008-01-30 アプレラ コーポレイション Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬
US5914230A (en) * 1995-12-22 1999-06-22 Dade Behring Inc. Homogeneous amplification and detection of nucleic acids
CA2255774C (en) 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US20030083273A1 (en) * 1999-04-20 2003-05-01 Tod M. Woolf Antisense oligomers
US6368801B1 (en) * 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
US7361489B2 (en) * 2001-10-15 2008-04-22 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Nucleic acid amplification methods
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20070065816A1 (en) * 2002-05-17 2007-03-22 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
DK1633888T3 (da) * 2003-06-17 2009-07-13 Keygene Nv Midler og fremgangsmåde til påvisning af målnucleotidsekvenser under anvendelse af ligeringsassays med forbedrede oligonucleotidprobepar
WO2006095941A1 (en) * 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
US7368242B2 (en) * 2005-06-14 2008-05-06 Affymetrix, Inc. Method and kits for multiplex hybridization assays
US8314220B2 (en) * 2007-01-26 2012-11-20 Agilent Technologies, Inc. Methods compositions, and kits for detection of microRNA
CA2622649C (en) * 2007-03-09 2018-04-24 Riken Nucleic acid amplification method using primer exhibiting exciton effect
US20090203531A1 (en) * 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
WO2011143659A2 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 Fluidigm Corporation Nucleic acid isolation methods
CA2834976C (en) 2011-05-04 2016-03-15 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements
GB201116131D0 (en) * 2011-09-19 2011-11-02 Epistem Ltd Probe
JP2015508655A (ja) * 2012-02-14 2015-03-23 コーネル ユニバーシティー 組み合わせたヌクレアーゼ反応、連結反応、およびポリメラーゼ反応を用いて核酸配列、発現、またはコピー変化を相対的に定量するための方法
KR101984700B1 (ko) * 2012-11-19 2019-05-31 삼성전자주식회사 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
EP3312295A1 (en) * 2013-03-19 2018-04-25 Directed Genomics, LLC Enrichment of target sequences
EP3004367A4 (en) 2013-06-07 2017-02-22 Athena Diagnostics Inc. Molecular barcoding for multiplex sequencing
US9957550B2 (en) 2014-09-08 2018-05-01 BioSpyder Technologies, Inc. Attenuators
US9938566B2 (en) 2014-09-08 2018-04-10 BioSpyder Technologies, Inc. Profiling expression at transcriptome scale
US10683534B2 (en) 2015-01-27 2020-06-16 BioSpyder Technologies, Inc. Ligation assays in liquid phase

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1500710A1 (en) * 2002-05-08 2005-01-26 ARKRAY, Inc. Method of detecting target nucleic acid
US20050026166A1 (en) * 2002-12-09 2005-02-03 Wanli Bi Concurrent enzymatic polynucleotide synthesis and detectable signal generation
WO2006071582A2 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 Applera Corporation Methods, compositions, and kits for forming self-complementary polynucleotides
US20060246475A1 (en) * 2005-01-21 2006-11-02 Third Wave Technologies Compositions and methods for increased dynamic range detection of nucleic acids
EP1975254A1 (en) * 2006-01-20 2008-10-01 Olympus Corporation Method of detecting nucleotide sequence with an intramolecular probe
WO2008094902A2 (en) * 2007-01-29 2008-08-07 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
WO2011041411A2 (en) * 2009-09-29 2011-04-07 Case Western Reserve University Method for detecting single nucleotide polymorphisms
WO2012158967A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-22 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
WO2014036743A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Genesky Diagnostics (Suzhou) Inc. Method for multiplex nucleic acid analysis
WO2014149599A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Ariosa Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张曼夫: "《生物化学》", 31 August 2002, 中国农业大学出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6768706B2 (ja) 2020-10-14
GB201614871D0 (en) 2016-10-19
AU2016211632B2 (en) 2021-03-11
EP3250703A1 (en) 2017-12-06
GB201707052D0 (en) 2017-06-14
CA2975088A1 (en) 2016-08-04
GB2542929B (en) 2017-08-02
GB2547369A (en) 2017-08-16
PT3250703T (pt) 2022-09-19
AU2016211632A2 (en) 2017-08-31
DK3250703T3 (da) 2022-06-27
AU2016211632B9 (en) 2021-03-25
SG11201706086XA (en) 2017-08-30
AU2016211632A1 (en) 2017-08-24
EP3250703A4 (en) 2018-08-01
ES2922645T3 (es) 2022-09-19
JP2018503403A (ja) 2018-02-08
US20160222447A1 (en) 2016-08-04
GB2542929A (en) 2017-04-05
EP3250703B1 (en) 2022-06-08
WO2016123154A1 (en) 2016-08-04
EP4134441A1 (en) 2023-02-15
US9856521B2 (en) 2018-01-02

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