CN118165957A - 一种重组核酸酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了重组核酸酶及其应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的任一种所示；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的任一种所示的氨基酸序列具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％序列同一性的序列。本发明的重组核酸酶在较宽温度范围(4‑40℃)，较宽pH范围(5.5‑10)和较宽NaCl离子浓度(250mM‑1000mM)条件下，仍保有良好的非特异性核酸切割活性，可显著降低在上述溶液中核酸的含量并降低由大量核酸所致的溶液粘度增加。

Description

一种重组核酸酶及其应用
技术领域
本发明涉及核酸酶技术领域，尤其涉及一种重组核酸酶及其应用。
背景技术
目前，在市场上广泛使用的非特异性核酸酶是Merck公司的它是一种来源于粘质沙雷氏菌Serratia Marcescen的基因工程改造的酶。它可以降解所有形式的DNA和RNA，包括单链、双链、线状、环状、天然以及变性的核酸，将它们消化成3-8个碱基长度的5-单磷酸寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性，其最佳活性温度为37℃，广泛用于作为各类科学研究以及疫苗、蛋白、多糖类制药工业的酶制剂，去除样本或制品中的核酸残留，提升样本纯度和制品生物功效。该酶70℃加热10分钟或者65℃加热20分钟可使其失活，金属离子螯合剂可以抑制其活性。德国c-LEcta GmbH公司的在另外的芽孢杆菌中产生，而美国RiboSolutions公司的CyanaseTM核酸酶衍生自另外一种微生物，它们都与性能相近。主要缺点是包括不能通过高温有效失活、低温条件下酶活性很低以及对反应体系中增加的盐离子浓度耐受度极为有限。为了弥补Benzonase的上述缺点，市场上开发出了三款衍生自嗜冷微生物和嗜盐微生物的非特异性核酸酶，希望可以在低于37℃甚至在冷藏条件下(4℃-8℃)，在较宽的盐浓度和较宽的pH范围下维持较好的酶活性，且在一定温度下发生不可逆的酶失活，增加其安全性。这三款产品分别是日本宝生物(Takara)公司的CryonaseTM、挪威AecticZymes公司的HL-SAN以及波兰布里特有限公司的Ppr核酸酶。它们的问题在于在某些条件下对高盐、低温以及低pH耐受较差或者酶活性维持对Mg2+浓度要求较高导致对金属螯合剂过于敏感。
宿主DNA残留污染在工业生产重组蛋白类或细胞与基因治疗(CGT)药物以及用于诊断、治疗及科学研究的酶的过程中是一个非常重要和亟需解决的问题。例如在基于核酸的诊断中，如果要保持良好的灵敏度和特异性以及无假阳性结果，对于体系中外源DNA的含量要求极高。作为医药用途的治疗性蛋白、疫苗等产品生产工艺中对宿主DNA残留的要求极为严格，根据产品使用量的不同，一般控制在10pg-10ng/剂的范围，而且这些药品通常对温度及其敏感，为了最大程度保持样品的生物学活性，样品处理的工艺过程通常在25℃甚至在4℃低温条件下进行。用于基因和细胞疗法的病毒载体也需要有效去除病毒包装过程中质粒DNA和宿主细胞DNA的残留。且这些值由世界卫生组织(WHO)、美国食品药品管理局(FDA),欧洲药品管理局(EMEA)以及中国药品监督管理局(NMPA)等监管机构严格规定和监管。
用于去除核酸污染的理想工具是非特异性核酸酶，且其应满足在低温(4℃-25℃)、宽pH范围(5.5-10.0)以及常用纯化工艺(下游提纯处理)的高盐和/或含有添加剂条件下保持高活性。且该核酸酶应可以在对被纯化的生物制品安全的温度条件下失活。
国际专利WO2006095769描述了一种来自西瓦氏菌(psychrophilic strain ofShewanellasp.)的具有内切核酸酶活性的多肽，西瓦氏菌是嗜冷微生物，在低温下展现出较高的酶活性。利用它可去除蛋白溶液中存在的核酸并降低蛋白质提取物的黏度。但是它失活需要70℃孵育30分钟(doi:10.3389/fbioe.2015.00148)，这对核酸酶处理后的生物样品去除核酸酶活性非常不利，因为很多生物样品在70℃孵育30分钟均已失活。
国际专利WO2013/121228提出了一种来自于杀鲑别弧菌(Aliivibriosalmonicida)的非特异性内切核酸酶及其活性片段，并命名为HL-SAN。其在低温条件下(25℃及以下)除了pH＝8.5左右外，酶活性均较差。
国际专利WO2021/049960描述了一种来自深海发光杆菌(Photobacteriumprofundum)的非特异性内切核酸酶，并命名为Ppr。其最适酶活性需要50-150mM MgCl2存在，尤其是在6℃冷藏条件下，需要500mM NaCl和100mM MgCl2存在才能保持最佳酶活性。如此高的Mg2+浓度证明该酶对金属螯合剂非常敏感，且增加了的MgCl2给下游纯化和目标蛋白质生物学活性带来了一定的不确定性。
正因为上述核酸酶仍存在各种不足，因此有必要开发宽温度、宽pH范围、宽离子浓度耐受的、热不稳定且高效低成本的内切核酸酶。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种重组核酸酶及其应用，其是一种在宽温度、宽pH范围、宽离子浓度下高活性的非特异性热不稳定且高效低成本的内切核酸酶。
本发明涉及一种核酸酶的定向筛选方法，包括通过生物信息学和卷积神经网络来获得定向优化的杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶变体。该定向筛选方法以已有的核酸酶序列一级结构分子描述符作为训练集，构建卷积神经网络模型；构建与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶具有至少50％同一性的随机序列库，并输入上述卷积神经网络模型以预测活性序列。
本发明一实施方式中，该定向筛选方法包括：1)筛选与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶同一性大于60％的序列，进行交叉比对并对氨基酸残基进行结构叠合聚类分析；2)根据序列同一性和氨基酸残基结构匹配的结果，将序列分为骨架区和可变区，然后将可变区的序列拆分为包含单氨基酸、双氨基酸、三氨基酸、四氨基酸、五氨基酸等五类短序列；3)通过随机序列生长和组合的方式，在骨架区基础上组合装配可变区的短序列，建立一个包含随机序列的潜在序列库，并与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶(WP_044583181.1)序列具有满足一定的同一性(50％<同一性<85％)；4)计算已有核酸酶序列((https://www.rcsb.org/3d-sequence/2PU3？assemblyId＝1))一级结构分子描述符并做归一化处理后作为训练集，对包含输入层、隐藏层和输出层的卷积神经网络进行预训练，隐藏层包含4个卷积层和2个池化层，输出层为密集连接层；5)对步骤3)得到的潜在序列库中的序列计算一级结构分子描述符并做归一化处理，使用步骤4训练好的模型进行预测，根据预测值选出最可能具核酸酶活力的前5条序列，如表2中所示，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。并对这5条序列进行溶解性预测，以及表达水平和酶活性检测。
本发明第一方面，提供一种重组核酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10中的任一种所示；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的任一种所示的氨基酸序列具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％同一性的序列。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶为非特异性核酸内切酶。所述重组核酸酶对核酸的序列没有严格要求，可以非特异性地降解几乎所有形式的核酸。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶的底物包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA、RNA-DNA杂交体、以及基因组DNA中的任一种或几种。该底物还可以为包含脱氧次黄苷、脱氧尿苷或羟甲基脱氧尿苷等碱基衍生物的核酸。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能将核酸完全消化成杂交限度以下的2-5个碱基长度的寡核苷酸。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在温度(4～50℃)或者pH值(5.0～10.0)范围内具有核酸降解活性。比如，本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在低温(4℃)时，仍具有较好的活性。比如，本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在pH(5.5～10.0)时，具有很好的活性。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在低pH(5.5)时，具有较好的酶解活性。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶可耐受一定浓度的盐离子(0～1.5M)。所述重组核酸酶在盐离子浓度0～1.5M范围内具有核酸降解活性。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在盐离子(0～1.0M)时，具有很好的酶解活性。所述重组核酸酶在高盐(1.0M)时，仍具有很好的酶解活性。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在Mg2+浓度0-80mM范围内具有核酸降解活性，所述重组核酸酶在Mg2+浓度5-60mM范围内，具有很好的核酸降解活性，所述重组核酸酶不必在Mg2+(0mM)激活下，仍能具有很好的酶解活性。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶可耐受一定浓度的抑制剂，所述抑制剂包括但不限于NaCl(0.25～1.5M)、尿素(0～8M)、盐酸胍(0～6M)、硫酸铵(0～0.2M)、咪唑(0～0.5M)。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶适用于多种培养基或缓冲液。所述培养基或缓冲液包括RPMI1640、MEM、DMEM、CD-CHO、PBS、TBS、Tris-HCl、NaCl、MgCl2。本发明的重组核酸酶在多种培养基或缓冲液中均具有酶活性。比如在RPMI1640培养基、MEM、DMEM、CD-CHO等培养基均具有酶活性。又比如在PBS缓冲液、TBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液中均具有酶活性。
本发明一实施方式中，相较于耐高盐HL-SAN核酸酶，所述重组核酸酶可耐受更低浓度的盐离子，在250mM和500mM有显著活性，且耐更宽的pH(5.5-10)范围和温度范围(4～50℃)。
本发明一实施方式中，所述重组核酸酶还包括标签、信号肽、前导肽和/或核定位序列。优选地，所述标签包括His-或HQ-标签。本发明一实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列为Mkyllptaaagllllaaqpama(SEQ ID NO.2)。
本发明第二方面，提供编码上述重组核酸酶的多核苷酸。
本发明一实施方式中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％序列同一性的序列。
本发明第三方面，提供含有上述多核苷酸或表达上述重组核酸酶的生物材料。
本发明一实施方式中，所述生物材料包括核酸构建体、表达载体、宿主细胞。
本发明一实施方式中，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列，所述多核苷酸在一个或多个控制序列作用下在宿主细胞中的表达。
本发明一实施方式中，所述控制序列包括但不限于启动子、终止子。
本发明一实施方式中，所述启动子包括但不限于lac、tac、trp、trc、CMV、EF1α、H1、T7、SV40、pMC1、PGK。优选地，所述启动子为T7启动子。
本发明一实施方式中，所述终止子包括但不限于T0、T7、rrnB、SV40、hGH、BGH、rbGlob。优选地，所述终止子为T7终止子。
本发明一实施方式中，所述表达载体包括所述多核苷酸或核酸构建体。本发明一实施方式中，所述表达载体可由所述多核苷酸和控制序列连接在一起获得。本发明一实施方式中，所述表达载体可包括一个或多个限制位点以允许所述多核苷酸在此类位点处的插入或取代。本发明一实施方式中，所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入所述表达载体中而表达所述核酸酶。
本发明一实施方式中，所述表达载体可以是经DNA重组程序并且可以引起所述核苷酸表达的任何载体，例如，质粒或病毒。本发明一实施方式中，所述质粒或病毒包括但不限于质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pET32a、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060、pAMβ1、AAV、腺病毒载体、慢病毒载体等。
本发明一实施方式中，所述表达载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。所述选择性标记提供了包括抗生素抗性基因、重金属抗性基因、营养标记基因、生化标记基因等。比如氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、四环素抗性基因(Tetr)、链霉素抗性基因(Strr)、氯霉素抗性基因(Cmlr)、G418抗性基因(G418r)、铜抗性基因(Cur)、锌抗性基因(Znr)、镉抗性基因(Cdr)、色氨酸合成酶基因(TRP1)、尿嘧啶合成酶基因(URA3)、亮氨酸合成酶基因(LEU2)、组氨酸合成酶基因(HIS4)、β-半乳苷酶基因(lacZ)、葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)、二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase,DHFR)等。
本发明一实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于细菌、真菌、病毒、哺乳动物细胞或植物细胞。
本发明第四方面，提供含有上述重组核酸酶、多核苷酸和/或生物材料的组合物。
本发明一实施方式中，所述组合物还可以含有以下任一种或几种其他酶，包括DNA聚合酶、蛋白酶、磷酸酶、T4 PNK、RNA酶H、脱氧核苷酸激酶。
本发明一实施方式中，所述组合物还可以包括缓冲液、镁离子、鸟嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、ATP、钠离子、表面活性剂中的一种或几种。所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、PBS(磷酸盐缓冲液)、TE缓冲液等。
本发明第五方面，提供包括上述核酸酶、多核苷酸、生物材料、组合物的试剂盒。
本发明第六方面，提供上述核酸酶、多核苷酸、生物材料、组合物、试剂盒在制备以下任一种用途试剂中的应用，1)药物纯化，优选所述药物包括病毒载体、重组蛋白；2)提升基因分析灵敏度，优选所述基因分析包括PCR、qPCR、3SR、SDA、NGS、LAR/LCR和LAMP；3)降低蛋白裂解液粘度，优选所述蛋白裂解液包括细胞、组织、微生物的蛋白裂解液；4)裂解或降解核酸，所述核酸包括DNA或RNA。
本发明第七方面，提供一种生产上述重组核酸酶的方法，该方法包括培养上述宿主细胞，及从培养物收集所述重组核酸酶。
本发明第八方面，提供一种裂解或降解核酸的方法，包括在核酸中加入所述重组核酸酶、多核苷酸、组合物、生物材料或试剂盒。
本发明一实施方式中，所述核酸包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA、RNA-DNA杂交体、以及基因组DNA。
本发明第九方面，提供一种从样品中去除核酸的方法，包括在样品中加入所述核酸酶、多核苷酸、组合物、生物材料或试剂盒。
本发明一实施方式中，所述样品是生物大分子样品。所述样品包含核酸、蛋白质、病毒载体、碳水化合物、聚合物或脂质。本发明一实施方式中，所述样品包含双链核酸、目的DNA:RNA双链体或重组产生的蛋白质，特别是酶、疫苗、疫苗接种抗原、抗体以及其他治疗性蛋白质。本发明一实施方式中，所述样品是核酸扩增反应或逆转录反应的反应物。本发明一实施方式中，所述核酸扩增反应选自PCR、qPCR、3SR、SDA、NGS、LAR/LCR和LAMP。本发明一实施方式中，所述样品包括用于蛋白分析的样品，所述蛋白分析包括ELISA、柱层析、二维电泳和印迹分析。本发明一实施方式中，所述样品包括CAR-T细胞治疗中慢病毒载体(LV)、基因治疗中腺病毒载体(AdV)和腺相关病毒载体(AAV))。
本发明第十方面，提供一种降低蛋白裂解液粘度的方法，所述方法包括在所述蛋白裂解液中加入所述核酸酶、多核苷酸、组合物、生物材料或试剂盒。所述蛋白裂解液包括细胞、组织和/或微生物的蛋白裂解液。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明的热不稳定的重组核酸酶，在大分子药物(如疫苗、抗体、病毒颗粒等)纯化过程中或者其他如PCR、细胞与干细胞治疗等过程中所使用的缓冲液处于盐离子和/或添加剂存在条件下，在较宽温度范围(4-40℃)，较宽pH范围(5.5-10)和较宽NaCl离子浓度(250mM-1000mM)条件下，仍保有良好的非特异性核酸切割活性，可显著降低在上述溶液中核酸的含量并降低由大量核酸所致的溶液粘度增加。
该核酸酶可用于基因和细胞治疗用病毒载体(包括CAR-T细胞治疗中慢病毒载体(LV)、基因治疗中腺病毒载体(AdV)和腺相关病毒载体(AAV))的纯化工艺中；还可用于纯化重组蛋白，特别是各种酶、疫苗、疫苗接种抗原、抗体以及其他治疗性蛋白质纯化工艺中；此外，还可用于净化PCR、qPCR、3SR、SDA、NGS、LAR/LCR和LAMP反应性试剂以及混合物中用于降低干扰核酸(包括DNA和RNA)，提升相关基因分析的灵敏度和特异性的用途。或用于降低细胞、组织、微生物等蛋白裂解液样品的粘度等(可以用于化学破菌而省去超声仪或高压均质机，或者结合化学破菌大幅度减少超声仪或高压均质机的工作负荷)。
附图说明
图1为筛选的与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶同源性大于60％的序列；
图2为利用pET32a表达载体构建S1P2重组核酸酶表达质粒图谱；
图3为不同pH值条件下S1P2重组核酸酶的活性图；
图4为不同Mg2+值条件下S1P2重组核酸酶的活性图
图5为不同温度条件下S1P2重组核酸酶的活性图；
图6为37℃条件下S1P2和HL-SAN核酸酶的比较图；
图7为25℃条件下S1P2和HL-SAN核酸酶的比较图；
图8为4℃条件下S1P2和HL-SAN核酸酶的比较图；
图9为S1P2核酸酶对大肠杆菌破碎后的黏度影响结果图；
图10为S1P2核酸酶降解大肠杆菌基因组DNA结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
“His-标签”是指典型地包含至少6个组氨酸残基的多组氨酸标签，其可以添加到N-或C-末端上。His标签在本领域已知用于例如蛋白质纯化，但也可以用于改进低pH值下的溶解度。类似地，如本领域已知的，“HQ-标签”(即组氨酸-谷氨酰胺标签)也可以用于纯化。
术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
术语“微生物”通常意指通过显微镜可见的小的生物。微生物通常以单细胞或细胞集落的形式存在。一些微生物可能是多细胞的。微生物包括原核生物(例如，细菌和古生菌)和真核生物(例如，一些真菌、藻类、原生动物)。在本文中，病毒可以被认为是微生物。
术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(EMBOSS的BLOSUM62版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
实施例1核酸酶的定向筛选和优化方法
针对提高非特异性核酸酶对温度、pH和盐离子强度耐受性提升的优化目标，本发明通过生物信息学和卷积神经网络来获得定向优化的杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶变体。利用protein-protein Blast功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)将NCBI数据库中杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶(WP_044583181.1)同源性大于60％的序列挑选出来，并将其进行序列比对，见图1和表1。
表1同源性大于60％的内切核酸酶序列
该方法的具体技术方案包括以下步骤：
步骤1：将初始序列进行交叉比对并对氨基酸残基进行结构叠合聚类分析。
步骤2：根据序列同一性和氨基酸残基结构匹配的结果，将序列分为骨架区和可变区，骨架区作为保守序列(图1序列对比中黄色覆盖的序列)，可变区作为碎片化序列，然后将可变区的序列拆分为包含单氨基酸、双氨基酸、三氨基酸、四氨基酸、五氨基酸等五类短序列。
骨架区序列基础氨基酸包含如下氨基酸或氨基酸组合，括号内数字为多肽的氨基酸位置：
P(3)/F(6)/AK(9,10)/IY(16,17)/D(19)/SFYCGC(23-28)/I(30)/W(32)/KK(35,36)/G(38)/P(40)/L(42)/CGY(45-47)/RKQ(50-52)/RA(55,56)/RIEWEH(58-63)/VPA(65-67)/FG(70-71)/W(77)/W(80)/M(95)/D(98)/HNL(100-102)/P(104)/GE(107,108)/NGDR(110-113)/N(115)/F(118)/W(121)/G(126)/YGQC(129-132)/F(138)/PP(145,146)/G(151)/IAR(153-155)/Y(157)/YM(159,160)/Y(164)/L(168)/Q(172)/LM(175,176)/AW(178,179)/WEC(188-190)/RD(192,193)/R(195)/Q(200)/N(204)/C(211)。
可变区序列基础氨基酸包含：
AP/SS/AVK/HPT/QV/WQ/HQ/QC/QD/GRKNC/DK/FK/EA/NGN/KVD/RRAD/SR/QE/RQ/QYP/IA/NH。
步骤3：通过随机序列生长和组合的方式，在骨架区基础上组合装配碎片区的短序列，建立一个包含随机序列的潜在序列库，该库中的序列长度为213-216个氨基酸，并与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶(WP_044583181.1)序列具有满足一定条件的同源性(50％<同源性<85％)。
步骤4：通过文献调研和RCSB-PDB数据库获取具有Mg2+结合能力和核酸催化切割能力的核酸酶序列(https://www.rcsb.org/3d-sequence/2PU3？assemblyId＝1)并计算一级结构分子描述符，再经过归一化处理后作为训练集，对包含输入层、隐藏层和输出层的卷积神经网络进行预训练，隐藏层包含4个卷积层和2个池化层，输出层为密集连接层。
步骤5：对步骤3得到的潜在序列库中的序列计算一级结构分子描述符并做归一化处理，使用步骤4训练好的模型进行预测，根据预测值选出最可能具核酸酶活力的前5条序列(见表2)。利用线上蛋白质溶解性预测工具(https://www.novopro.cn/tools/prot-sol.html；doi:10.1093/bioinformatics/btx345)进行候选核酸酶的溶解性。用Alphafold2预测筛选出的结构与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶(WP_044583181.1)的相似度，选出四条最优序列进行表达并检测其酶活。
表2筛选的5条序列
实施例2S1P2重组核酸酶表达质粒的构建
利用pET32a表达载体构建S1P2重组核酸酶表达质粒，如图2所示。其中，S1P2氨基酸序列(SEQ ID NO:1)如表2所示，PelB信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:2)为Mkyllptaaagllllaaqpama，长度22AA；带有TEV蛋白裂解位点的His标签(SEQ ID NO:3)序列为Asmehhhhhhgsenlyfqs，长度19AA。
编码pelB-His-TEVsite-S1P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，长度783bp。pET32a-pelB-His-TEVsite-S1P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，长度6162bp。
实施例3大肠杆菌菌种的获得及S1P2重组核酸酶的表达
大肠杆菌重组菌株的获得：为了获得大肠杆菌BL21(DE3)的pET32a-pelB-His-TEVsite-S1P2重组菌株。使用金斯瑞合成的pET32a-pelB-His-TEVsite-S1P2质粒进行BL21(DE3)的转化。挑取单克隆鉴定后得到在LB培养基中BL21(DE3)的pET32a-pelB-His-TEVsite-S1P2重组菌株，用于S1P2核酸酶的表达。
S1P2重组核酸酶的表达：将过夜活化的菌液(1:50)接入装有LB培养基的锥形瓶中，在30℃待OD600＝0.4-0.5时，加入IPTG终浓度为0.2mM，18℃诱导20-22h。菌液4℃12000r/min离心10min，将菌液沉淀用buffer(25mM Tris-HCl PH7.5,0.5M NaCl,5mMMgCl2,10mM咪唑)洗2遍，称量湿重，5-10ml/g buffer重悬，加PMSF，防止蛋白降解，超声破碎350w，超声开2s，关4s。超声30min，每10分钟换新的冰。12000r/min离心10min，除去不可溶蛋白，将蛋白上清通过0.45um滤膜进行过滤。
S1P2重组核酸酶的纯化：利用亲和层析镍柱进行纯化，将样品固定到镍柱上，通过25mM Tris-HCl PH7.5,0.5M NaCl,5mM MgCl2,300mM咪唑将S1P2核酸酶洗脱下来，可利用60mM咪唑进行洗杂。从镍柱上洗脱下来的S1P2核酸酶样品进一步通过SEC分子筛(选择G200)来提纯，然后超滤浓缩，最终获得纯度98％以上S1P2核酸酶。将获得的S1P2用nanodrop利用摩尔消光系数和分子量进行浓度的测定，最终将酶储存在50％(v/v)(25mMTris-HCl PH7.5,0.5M NaCl,5mM MgCl2),50％(v/v)Glycerol,0.01％(v/v)Tween 20，冷冻在-20℃。
实施例4不同条件下S1P2重组核酸酶酶活影响
1、S1P2重组核酸酶酶活特性检测方法：核酸酶加入1ml小牛胸腺DNA(50ug/mL)(溶于25mM Tris-HCl PH8.5,0.5M NaCl,5mM MgCl2),37℃孵育30min，快速加入4％高氯酸终止反应(4％高氯酸至2％高氯酸最终浓度来终止反应)，冰上放置60min，14000r/min离心10min后测定OD260nm值(通过离心将未降解的DNA沉淀分离，通过测定OD260nm来确认上清液中小于10bp的游离核苷酸和寡核苷酸片段的含量)。以不加酶液的空白作为对照。在上述条件固定时间生成的核苷酸量在260nm处的吸光值差值为1.0时的酶量定义为一个酶活力单位。
2、S1P2重组核酸酶最适缓冲液pH条件的确定
为了确定核酸酶的最佳pH，按照步骤1所述方式进行反应，在0M、0.25M、0.5M、0.75M、1M的反应混合物中加入1U酶(pH 5.5-10)。结果如图3所示。由结果可知，S1P2核酸酶在250mM NaCl浓度下pH 8.5的缓冲液中展现最高活性。
3、S1P2重组核酸酶最适Mg2+的确定
为了确定核酸酶的最佳Mg2+，按照步骤1所述方式进行反应，在0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、50mM、60mM、80mM、100mM、150mM、200mM的反应混合物中加入1U酶(25mM Tris-HCl PH8.5,0.5M NaCl,37℃)。结果如图4所示。由结果可知，S1P2核酸酶在10mM Mg2+浓度的缓冲液中展现最高活性，5-60Mm Mg2+浓度为最适区间，并且0mM Mg2+浓度下仍具有一定的酶活性(34％)。
4、各种添加剂对S1P2重组核酸酶酶活性潜在影响的确认
为了确定在纯化工艺中对反应缓冲液中常见离子组分的耐受范围，按照步骤1所述方式，在不同抑制剂溶液中(NaCl、尿素、盐酸胍、硫酸铵、咪唑)反应，如表3所示。由结果可知，S1P2在如下浓度下均有一定活性。
表3不同抑制剂溶液的浓度
5、S1P2重组核酸酶的热失活温度
为了确定核酸酶在各温度下的活性，按照步骤1所述方式进行反应，在不同温度下(4-50℃)的反应混合物中加入1U酶。结果如图5所示。由结果可知，S1P2核酸酶大约在35℃，25mM Tris-HCl PH8.5,0.5M NaCl,5mM MgCl2的缓冲液中展现最高活性。
6、S1P2和HL-SAN核酸酶的比较
在以下条件下进行S1P2、HL-SAN的酶活的确定。不同温度(4℃、25℃、37℃)，不同NaCl浓度(0-1M)，不同pH(5,5-10)，在25mM Tris-HCl，5mM MgCl2。对比耐高盐HL-SAN，S1P2在低盐时有一定活性，在250mM和500mM有显著活性，且耐更宽的pH范围，分别如图6(37℃)，图7(25℃)和图8(4℃)所示。其中，图6a、图6b、图6c、图6d、图6e、图6f、图6g、图6h的pH值分别为5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、10；图7a、图7b、图7c、图7d、图7e、图7f、图7g、图7h的pH值分别为5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、10；图8a、图8b、图8c、图8d、图8e、图8f、图8g、图8h的pH值分别为5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、10。
7、S1P2核酸酶在不同培养基和常用缓冲液PBS、TBS中酶活性的情况
在37℃下，按照步骤1所述方式进行反应，不同培养基和缓冲液中的活性确定，结果如表4所示。
表4不同培养基和缓冲液中的酶活
8、S1P2核酸酶可显著降低大肠杆菌破碎后的黏度
将pET28a构建的重组大肠杆菌(0.2g)悬浮于细胞裂解缓冲液(25mM Tris-HCl250mM NaCl 5mM MgCl2 25mg/ml溶菌酶中，浓度为0.4g/L)，然后将细胞裂解物与S1P2在4℃孵育1h，12000r/min离心2min，对照不加酶，如图9所示为离心后拍照结果，A为含30US1P2核酸酶的裂解液，B为不含核酸酶的裂解液。
9、S1P2核酸酶可降解大肠杆菌基因组DNA
提取pET28a构建的重组大肠杆菌中基因组DNA，1U S1P2核酸酶加入1000ng gDNA(50ng/ul)(溶于25mM Tris/HCl PH8.5,5mM MgCl2)和不同NaCl浓度，37℃孵育30min，对照在不加酶的情况下37℃孵育30min。快速跑1％琼脂糖凝胶，在120V电压下进行分离，持续35min。拍照结果如图10所示。由结果可知，S1P2核酸酶在不同NaCl浓度下，均可降解大肠杆菌基因组DNA。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQ ID NO.1：S1P2氨基酸序列见表2：S1P2
SEQ ID NO.2：PelB信号肽氨基酸序列(长度：22AA)
SEQ ID NO.3：带有TEV蛋白裂解位点的His标签(长度：19AA)
SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.5：pET32a-pelB-His-TEVsite-S1P2(长度：6162bp)

Claims (10)

1.一种重组核酸酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10中的任一种所示；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的任一种所示的氨基酸序列具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％同一性的序列；
优选地，所述重组核酸酶为非特异性核酸内切酶；
优选地，所述重组核酸酶的底物包括单链、双链、线性和环状DNA和/或RNA、RNA-DNA杂交体、以及基因组DNA中的任一种或几种；
优选地，所述重组核酸酶在温度4～50℃或者pH值5.0～10.0范围内具有核酸降解活性；
优选地，所述重组核酸酶在盐离子浓度0～1.5M范围内具有核酸降解活性；
优选地，所述重组核酸酶在Mg2+浓度0～80M范围内具有核酸降解活性；
优选地，所述重组核酸酶在一定浓度抑制剂作用下具有核酸降解活性；
优选地，所述抑制剂包括NaCl、尿素、盐酸胍、硫酸铵、咪唑；进一步优选，所述抑制剂的浓度为0～8M尿素、0～6M盐酸胍、0～0.2M硫酸铵、0～0.5M咪唑；
优选地，所述重组核酸酶在培养基或缓冲液中具有核酸降解活性；
优选地，所述培养基或缓冲液包括RPMI1640、MEM、DMEM、CD-CHO、PBS、TBS、Tris-HCl、NaCl、MgCl2；
优选地，所述重组核酸酶还包括标签、信号肽、前导肽和/或核定位序列；
优选地，所述标签包括His-或HQ-标签；
优选地，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述重组核酸酶的多核苷酸。
3.含有权利要求2所述多核苷酸或表达权利要求1所述重组核酸酶的生物材料，
优选地，所述生物材料包括核酸构建体、表达载体、宿主细胞；
优选地，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列，所述多核苷酸在一个或多个控制序列作用下在宿主细胞中的表达；
优选地，所述控制序列包括但不限于启动子、终止子；
优选地，所述表达载体包括所述多核苷酸或核酸构建体；
优选地，所述表达载体包括质粒或病毒；
优选地，所述表达载体包括一个或多个选择性标记；优选地，所述选择性标记包括抗生素抗性基因、重金属抗性基因、营养标记基因、生化标记基因；
优选地，所述宿主细胞包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物细胞或植物细胞。
4.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述重组核酸酶、权利要求2所述多核苷酸和/或权利要求3所述生物材料；
优选地，所述组合物还可以含有以下任一种或几种其他酶，DNA聚合酶、蛋白酶、磷酸酶、T4 PNK、RNA酶H、脱氧核苷酸激酶；
优选地，所述组合物还包括缓冲液、镁离子、鸟嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、ATP、钠离子、表面活性剂中的一种或几种；更优选，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、PBS、TE缓冲液。
5.包括权利要求1所述重组核酸酶、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述生物材料、权利要求4所述组合物的试剂盒。
6.包括权利要求1所述重组核酸酶、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述生物材料、权利要求4所述组合物、权利要求5所述试剂盒在制备以下任一种用途试剂中的应用，1)药物纯化，优选所述药物包括病毒载体、重组蛋白；2)提升基因分析灵敏度，优选所述基因分析包括PCR、qPCR、3SR、SDA、NGS、LAR/LCR和LAMP；3)降低蛋白裂解液粘度，优选所述蛋白裂解液包括细胞、组织、微生物的蛋白裂解液；4)裂解或降解核酸，所述核酸包括DNA或RNA。
7.一种生产重组核酸酶的方法，其特征在于：包括培养权利要求3所述宿主细胞，及从培养物收集所述重组核酸酶；
或者通过定向筛选方法，包括以已有的核酸酶序列一级结构分子描述符作为训练集，构建卷积神经网络模型；构建与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶具有至少50％同一性的随机序列库，并输入上述卷积神经网络模型以预测活性序列，得到所述重组核酸酶。
8.一种裂解或降解核酸的方法，其特征在于：包括在核酸中加入权利要求1所述重组核酸酶、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述生物材料、权利要求4所述组合物、权利要求5所述试剂盒；
优选地，所述核酸包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA、RNA-DNA杂交体、以及基因组DNA。
9.一种从样品中去除核酸的方法，其特征在于：包括在样品中加入权利要求1所述重组核酸酶、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述生物材料、权利要求4所述组合物、权利要求5所述试剂盒；
优选地，所述样品包含蛋白质，更有选所述蛋白质包括双链核酸、目的DNA:RNA双链体或重组产生的蛋白质；进一步优选酶、疫苗、疫苗接种抗原、抗体以及其他治疗性蛋白质；
优选地，所述样品包括病毒载体，更优选所述病毒载体包括CAR-T细胞治疗中慢病毒载体(LV)、基因治疗中腺病毒载体(AdV)和腺相关病毒载体(AAV))；
优选地，所述样品包括核酸扩增反应或逆转录反应的反应物；更优选所述核酸扩增反应选自PCR、qPCR、3SR、SDA、NGS、LAR/LCR和LAMP；
优选地，所述样品包括用于蛋白分析的样品，更优选地，所述蛋白分析包括ELISA、柱层析、二维电泳和印迹分析。
10.一种降低蛋白裂解液粘度的方法，其特征在于：所述方法包括在所述蛋白裂解液中加入权利要求1所述重组核酸酶、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述生物材料、权利要求4所述组合物、权利要求5所述试剂盒；
优选地，所述蛋白裂解液包括细胞、组织和/或微生物的蛋白裂解液。
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