CN105017399A - 日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫无机焦磷酸酶(SjPPase)重组抗原蛋白，是可以催化无机焦磷酸盐(PPi)水解生成磷酸盐的蛋白(其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示)。本发明还公开了上述重组抗原蛋白的制备方法，包括日本血吸虫SjPPase编码基因序列的扩增、重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化步骤。此外，本发明还公开了日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白在筛选SjPPase抑制剂中的应用。

Description

日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白；此外，本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。

背景技术

日本血吸虫病是由于人或哺乳动物感染日本血吸虫引起的一种人畜共患的寄生虫病，主要分布在中国南部地区、菲律宾和印度尼西亚。尽管在中国已经有超过50年的血吸虫病防治史，但是日本血吸虫病仍然是目前中国重要的公共卫生问题之一，主要在我国7省110县市区流行，仍然有79万患者，受威胁人口6500万。

日本血吸虫童虫到成虫的发育阶段在哺乳动物宿主体内完成，该过程中童虫生长较快、发育为成虫的历时较短。而后，其长期的寄生给宿主带来一系列的病理反应。因此，日本血吸虫童虫的发育不仅是血吸虫完善自己的过程，而且是宿主发生病理性变化的推动性因素。无机焦磷酸酶(PPase，inorganic pyrophosphatase)是一种与日本血吸虫童虫发育相关的蛋白质类催化剂，可以催化一分子无机焦磷酸盐(PPi，inoraganic pyrophosphate)水解生成两分子无机磷酸盐(Pi，inorganic phosphate)。与无催化剂的情况相比，PPase可使PPi的水解速率提高至原来的10¹⁰倍。PPi是许多生物大分子(如DNA、RNA、蛋白质等)合成过程中的副产物，PPi的快速水解反应为这些生物大分子合成反应的正向进行形成一个热力学的推动力，加速了生物大分子的合成，进而推动日本血吸虫童虫的发育。此外，保持PPase的活性对于发育阶段日本血吸虫细胞内PPi的消除至关重要，PPi的累积不仅会导致发育不能持续正常进行，而且会引起细胞的自噬。综上所述，SjPPase可作为日本血吸虫的潜在药物靶点，但是目前该酶的研究方向集中于基因的发现和各虫期该基因转录和表达水平的研究。尚未有采用基因工程的方法来表达日本血吸虫无机焦磷酸酶的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于日本血吸虫SjPPase基因PCR扩增的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供该日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供上述日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的用途。

本发明首先通过生物信息学技术和分子生物学技术分析并获得了日本血吸虫SjPPase的编码基因序列(如SEQ ID NO：2所示)。然后通过对日本血吸虫SjPPase基因进行扩增，将所得产物与质粒载体pET-28a(+)通过In-Fusion克隆构建重组质粒pET-28a(+)-SjPPase，转化至DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR和测序鉴定；小量抽提测序成功的pET-28a(+)-SjPPase重组质粒，将其转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，加入核酸裂解液裂解细菌，离心后保留上清与沉淀；本发明将上述离心后上清相继用Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化，最终得到高纯度的重组蛋白SjPPase，完成了SjPPase基因的体外克隆表达及纯化。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一个方面是提供一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。该重组抗原蛋白可催化无机焦磷酸盐(PPi)水解生成磷酸盐，分子量为M_r36 000。

本发明第二个方面是提供了一对用于日本血吸虫SjPPase基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：

上游：5′-AATGGGTCGCGGATCCatgtcggttgaacgtggg-3′(如SEQ ID NO：3所示)；

下游：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGttaaatattcgtattacaaaaatgcc-3′(如SEQ ID NO：4所示)。

本发明第三个方面提供了一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjPPase基因序列的扩增，SjPPase基因扩增的具体序列如SEQ ID NO:2所示(用PCR技术从含有目的基因的日本血吸虫cDNA中获得日本血吸虫SjPPase的DNA片段)；

2)日本血吸虫SjPPase重组质粒的构建和鉴定：用pET-28a(+)载体构建日本血吸虫SjPPase重组表达质粒pET-28a(+)-SjPPase；

3)将pET-28a(+)-SjPPase重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白SjPPase；

4)Ni-NTA亲和层析和DEAE阴离子交换层析纯化表达产物重组蛋白：将菌体裂解、离心后的上清相继用Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱进行纯化，获得高纯度的表达产物重组蛋白SjPPase。

步骤1)具体为：以日本血吸虫cDNA作为模板，设计SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5.0min；95℃变性30sec；55℃退火30sec，72℃延伸1.0min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

步骤2)具体为：分别使用内切酶Xho I和BamH I酶切pET-28a(+)载体，根据步骤1)所得的PCR产物和酶切后的pET-28a(+)载体的浓度，使用In-Fusion克隆方法连接，构建成SjPPase编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjPPase；将此重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，进行菌落PCR鉴定及测序鉴定。

步骤3)具体为：抽提重组质粒pET-28a(+)-SjPPase，通过热激法将步骤2)测序无误后的pET-28a(+)-SjPPase重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂(例如，异丙基硫代半乳糖苷IPTG)继续培养；最后收取菌体；在上述菌体中加入核酸裂解液裂解细菌(例如，BugBuster蛋白抽提剂)，离心后保留上清与沉淀，由Western-blot鉴定结果。

步骤4)具体为：将步骤3)裂解后上清相继用Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。

本发明第四个方面提供了一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白在筛选SjPPase抑制剂中的应用，所述筛选SjPPase抑制剂的方法包括如下步骤：固定pH值、温度、底物浓度以及反应时间，进行日本血吸虫SjPPase重组蛋白不同抑制剂(NaF、IDP、MDP)的筛选。

实验证明，本发明的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白具有较强的酶学活性，温度为60℃时，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性最高。pH为7.0时，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性最高。在筛选SjPPase抑制剂实验中证明，如图5C所示，随着3种抑制剂浓度的增加，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的相对酶学活性都迅速下降。其中Mg²⁺络合剂NaF对SjPPase的酶学活性影响最为剧烈，其次是底物类似物MDP、IDP。采用本发明方法制得的本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白纯度高，特异性高，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中日本血吸虫SjPPase基因的PCR扩增结果示意图。

图1中，M：DNA分子量标准；1：SjPPase。

图2是实施例1中pET-28a(+)-SjPPase重组质粒及其菌落PCR鉴定结果示意图。图2中，M：DNA分子量标准；1-6：pET-28a(+)-SjPPase。

图3是实施例1中日本血吸虫SjPPase重组蛋白的Western-blot鉴定结果示意图。图3中，M：蛋白分子量标准；1：裂解后PBS重悬沉淀；2：裂解后上清。

图4是实施例1中日本血吸虫SjPPase重组蛋白的纯化结果示意图。图4中，M：蛋白分子量标准；1：Ni-NTA亲和层析柱洗脱收集液；2：DEAE阴离子交换层析柱流出收集液。

图5是实施例2、3中不同条件下日本血吸虫SjPPase重组蛋白的相对酶学活性示意图。图5中，A：pH-相对活性图；B：温度-相对活性图；C：抑制剂-相对活性图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备

1材料

1.1日本血吸虫成虫cDNA

来自于中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所的日本血吸虫cDNA文库。

1.2宿主菌株大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)分别来自于天根生化科技有限公司和Novagen公司。

1.3主要试剂和工具酶

1.4主要溶液的配制

1.4.1 Ni-NTA亲和层析柱bufferA和bufferB

	bufferA	bufferB
			Tris-HCl(mM)PH7.4	20	20
NaCl(mM)	300	300
			咪唑(mM)	10	500
甘油(v/v)	10％	10％

1.4.2 DEAE阴离子交换层析柱bufferA和bufferB

	bufferA	bufferB
			Tris-HCl(mM)PH8.0	20	20
EDTA(mM)	5	5
			NaCl(mM)	50	500
甘油(v/v)	10％	10％

2方法

2.1日本血吸虫SjPPase基因的扩增与克隆

2.1.1 SjPPase基因的PCR扩增

根据报道的SjPPase基因的序列(AAW25943.1，如SEQ ID NO:2所示)，利用上海英骏生物技术有限公司引物设计软件设计一对特异性引物，特异性引物中大写字母分别为与酶切载体末端同源的16个碱基，其中单下划线表示的分别是酶切位点Xho I和BamH I酶切位点。特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列如下：

上游：5′-AATGGGTCGCGGATCCatgtcggttgaacgtggg-3′(如SEQ ID NO：3所示)；

下游：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGttaaatattcgtattacaaaaatgcc-3′(如SEQ ID NO：4所示)。

以日本血吸虫成虫cDNA作为模板，进行PCR扩增。反应条件为95℃预变性5.0min；95℃变性30sec；55℃退火30sec，72℃延伸1.0min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。2×Taq PCR MasterMix购自天根生物科技有限公司。反应体系为25.0μl，具体为2×TaqPCR MasterMix 12.5μl；P F(上游引物)(10mM)1μl；P R(下游引物)(10mM)1μl；SjcDNA(DNA模板)1μl；Nuclease-free water(无核酸酶水)9.5μl。

2.1.2日本血吸虫SjPPase基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjPPase的构建和鉴定

分别使用内切酶Xho I和BamH I酶切pET-28a(+)空载质粒，根据所得的PCR产物和酶切后的pET-28a(+)空载质粒的浓度，使用In-Fusion克隆方法连接，构建成SjPPase编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjPPase。具体步骤如下：

1)取5μl PCR反应产物，加入2μl Clonging Enhancer(克隆促进剂)，购自Clontech公司；

2)将上一步中的混合物放入PCR仪中，37℃孵育15min，80℃孵育15min；

3)使用In-Fusion克隆方法连接PCR产物和酶切后的pET-28a(+)空载质粒。反应条件为37℃孵育15min；50℃孵育15min；取出放冰上，待转化使用。In-Fusion酶购自Clontech公司。反应体系为10.0μl，具体为5x In-Fusion Reaction Buffer(In-Fusion反应缓冲液)2.0μl；In-Fusion Enzyme(In-Fusion酶)1.0μl；Vector(载体)2.0μl(～100ng)；Insert(插入片段)2.0μl；dH₂O(蒸馏水)(根据需要)3.0μl；

将连接后的重组质粒pET-28a(+)-SjPPase通过热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，进行菌落PCR鉴定及测序鉴定。将菌落PCR鉴定正确的菌样送华大基因公司进行测序分析。将测序正确的pET-28a(+)-SjPPase重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。

2.2日本血吸虫SjPPase的重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化

2.2.1日本血吸虫SjPPase的重组质粒在大肠杆菌中的表达、Western-blot鉴定

具体步骤如下：

1)将重组菌接种于10ml LB液体培养基(Kan⁺,50μg/ml)中，于37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀＝0.6；

2)向试管中加入5μl IPTG(1M)，使其终浓度为0.5mM，继续震荡培养(37℃,200rpm)4h；

3)将诱导表达后的菌液，5000rpm，离心5min，去上清，向细胞沉淀中加入BugBuster蛋白抽提剂充分悬浮沉淀后，置于摇床上，室温震荡1h，使菌体充分裂解(每克沉淀湿重加5ml BugBuster蛋白抽提剂)；

4)菌体裂解液，12,000rpm离心1min，将离心后上清保存于干净的EP管中，沉淀用100μl PBS重悬，取5μl裂解后上清和PBS重悬后沉淀。

5)分别将上述裂解后的上清和PBS重悬后沉淀经SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上；

6)将膜剪成条状置于2.5％BSA中封闭2h(PBST溶解)，用PBST漂洗PVDF膜3次，每次5min；

7)将一抗(Penta·His·Ab)和PBST按一定比例稀释(1:2000)，置于摇床上反应1h，用PBST漂洗PVDF膜3次，每次5min；

8)将二抗(Goat-a-Mouse IgG-HRP)和PBST按一定比例(1:2000)稀释，置于摇床上反应1h，用PBST漂洗PVDF膜3次，每次5min；

9)按比例配好显色液(DAB:PBS:30％H₂O₂＝2mg:3ml:0.9μl)，将漂洗后的PVDF膜放入含显色液的托盘里显色，待出现目的条带，立即用PBS漂洗终止反应，并用滤纸吸干。

2.2.2日本血吸虫重组蛋白SjPPase的纯化

1)将2.2.1中裂解、离心后的上清用0.22μm滤膜进行过滤；

2)用Ni-NTA亲和层析柱的buffer A平衡该层析柱，将上述过滤后的上清过Ni-NTA亲和层析柱，最后用该层析柱的buffer B洗脱，收集洗脱液。用SDS-PAGE鉴定洗脱液的纯度；

3)将经Ni-NTA亲和层析柱初步纯化得到的含有SjPPase重组蛋白的洗脱液透析至DEAE阴离子交换层析柱的bufferA中，将透析后组分过DEAE阴离子层析柱，收集流出液。最后用该层析柱的buffer B洗脱，收集洗脱液。用SDS-PAGE鉴定流出液的纯度，并测定吸光度计算蛋白浓度。

3结果

3.1日本血吸虫SjPPase基因的扩增与克隆

3.1.1 SjPPase基因的PCR扩增

以日本血吸虫成虫cDNA作为模板，进行PCR扩增，扩增出864bp与预期长度一致的目的片段(见图1)，表明成功扩增出SjPPase基因。

3.1.2日本血吸虫SjPPase基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjPPase的构建和鉴定

目的基因片段与酶切后的pET-28a(+)空载质粒通过In-Fusion克隆方法连接，构建成重组质粒pET-28a(+)-SjPPase，经菌落PCR及测序鉴定，菌落PCR结果(见图2)及测序结果均与目的基因片段大小相符，表明重组表达质粒构建成功。

3.2日本血吸虫SjPPase的重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化

3.2.1日本血吸虫SjPPase的重组质粒在大肠杆菌中的表达、Western-blot鉴定

Western-blot分析结果(见图3)显示，重组蛋白SjPPase可被His的抗体特异性识别，在分子量36kDa处呈现明显表达条带，大小与预期结果相符，且杂带较少。从图中可以看出，该蛋白的表达既有可溶形式也有不可溶形式，但以可溶成分为主。

3.2.2日本血吸虫重组蛋白SjPPase的纯化

如图4所示，经Ni-NTA亲和层析柱初步纯化后的重组蛋白SjPPase在36kDa处出现一清晰条带，与目的蛋白符合，但在该条带下面还有三个较为明显的杂带。经DEAE阴离子交换层析柱纯化后的重组蛋白SjPPase，纯度进一步提高。通过BIO-RAD公司的Image Lab3.0凝胶图形分析软件分别对经Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化后的重组蛋白SjPPase进行了相对定量分析，显示目的条带的纯度分别为85.7％和97.4％。

实施例2日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶学活性分析

1材料

1.1日本血吸虫SjPPase重组蛋白

来自于实施例1中纯化获得的日本血吸虫SjPPase重组蛋白。

1.2主要试剂

试剂名称	试剂来源
		BCA蛋白质定量试剂盒	天根
K4PPi	国药
		1-氨基-2-萘酚-4-磺酸	悦耳
SDS	SIGMA
		钼酸铵	国药
其它试剂	均为国产分析纯试剂

2方法

日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活分析是通过测定一定催化时间内SjPPase重组蛋白催化PPi水解成Pi的浓度来计算。测定不同温度和PH条件以了解不同条件对日本血吸虫SjPPase重组蛋白酶活的影响。具体步骤如下：

2.1温度对日本血吸虫SjPPase重组蛋白酶活的影响

1)固定pH为8.0，底物PPi浓度为1mM，反应时间定为3min，温度设置为4、10、16、24、37、50、60、70℃这8个温度。PPi水解反应(实验组)体系为50μl，具体为K₄PPi(2.5mM)20μl；SjPPase重组蛋白(0.01μg/μl)20μl；Mg²⁺(25mM)10μl。

2)对照组为以上各温度条件下反应体系中不加入日本血吸虫SjPPase重组蛋白，用等量的反应buffer替代。PPi水解反应(对照组)体系为50μl，具体为K₄PPi(2.5mM)20μl；Buffer20μl；Mg²⁺(25mM)10μl。

3)利用比色法进行Pi的浓度检测。

2.2 pH对日本血吸虫SjPPase重组蛋白酶活的影响

1)固定反应温度为37℃，底物PPi浓度为1mM，反应时间为3min，pH设置为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5这13个pH值。PPi水解反应体系为50μl，具体为K₄PPi(2.5mM)20μl；SjPPase重组蛋白(0.01μg/μl)20μl；Mg²⁺(25mM)10μl。

2)对照组为以上各pH条件下反应体系中不加入日本血吸虫SjPPase重组蛋白，用等量的反应buffer替代。PPi水解反应体系为50μl，具体为K₄PPi(2.5mM)20μl；Buffer20μl；Mg²⁺(25mM)10μl。

3)利用比色法进行Pi的浓度检测。

3结果

3.1温度对日本血吸虫SjPPase重组蛋白酶活的影响

如图5B所示，温度为4-60℃时，日本血吸虫SjPPase重组蛋白随着温度的升高，其酶学活性缓慢上升；温度为60-70℃时，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性急速下降。温度为60℃时，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性最高。

3.2 pH对日本血吸虫SjPPase重组蛋白酶活的影响

如图5A所示，pH4.5-5.5之间日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性较小；pH5.5-7.0之间日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性变化剧烈，随着pH增加，其活性不断上升；pH7.0-10.5之间日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性呈缓慢下降趋势。pH为7.0时，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的酶活性最高。

实施例3日本血吸虫SjPPase重组蛋白抑制剂的筛选

1材料

1.1日本血吸虫SjPPase重组蛋白

来自于实施例1中纯化获得的日本血吸虫SjPPase重组蛋白。

1.2主要试剂

试剂名称	试剂来源
		BCA蛋白质定量试剂盒	天根
K4PPi	国药
		1-氨基-2-萘酚-4-磺酸	悦耳
SDS	SIGMA
		钼酸铵	国药

IDP	SIGMA
		MDP	SIGMA
NaF	国药
		其它试剂	均为国产分析纯试剂

2方法

1)固定反应温度为37℃、pH为8.0，底物PPi浓度为1mM，反应时间为3min，抑制剂包括底物类似物IDP及MDP，Mg²⁺离子络合剂NaF，3种抑制剂的浓度设置都为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM。PPi水解反应体系为50μl，具体为SjPPase重组蛋白(0.01μg/μl)20μl；Mg²⁺(25mM)10μl；PPi(5mM)10μl；抑制剂10μl。

2)对照组为反应体系中不加抑制剂，并用等量反应buffer替代。PPi水解反应体系为50μl，具体为SjPPase重组蛋白(0.01μg/μl)20μl；Mg²⁺(25mM)10μl；PPi(5mM)10μl；Buffer10μl。

3)利用比色法进行Pi的浓度检测。

3结果

如图5C所示，随着3种抑制剂浓度的增加，日本血吸虫SjPPase重组蛋白的相对酶学活性都迅速下降。其中Mg²⁺络合剂NaF对SjPPase的酶学活性影响最为剧烈，其次是底物类似物MDP、IDP。图5C中虚线与每种抑制剂浓度-活性曲线的交点所对应的横坐标值为相对活性为50％时的抑制剂浓度，即该抑制剂的IC50(一种表征抑制剂活性的重要参数，表示使酶活性达到无抑制剂存在时活性一半的抑制剂浓度)。NaF的IC50为1.92mM，MDP的IC50为3.72mM，IDP的IC50为4.97mM。

Claims (10)

1.一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于日本血吸虫SjPPase基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为：

上游：5′-AATGGGTCGCGGATCCatgtcggttgaacgtggg-3′，如SEQ ID NO：3所示；

下游：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGttaaatattcgtattacaaaaatgcc-3′，如SEQ ID NO：4所示。

3.一种如权利要求1所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjPPase编码基因序列扩增，SjPPase编码基因扩增的具体序列如SEQ IDNO:2所示；

2)日本血吸虫SjPPase重组质粒的构建和鉴定，采用的重组质粒载体为：pET-28a(+)载体；

3)将重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白；

4)用Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化表达产物重组蛋白。

4.如权利要求3所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：设计SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以日本血吸虫成虫cDNA为模板进行PCR扩增。

5.如权利要求4所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应条件为95℃预变性5.0min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.0min，30个循环；72℃延伸10min，最后保存于4℃。

6.如权利要求3所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将质粒载体pET-28a(+)经Xho I和BamH I双酶切；根据步骤1)所得的PCR产物和酶切后的pET-28a(+)载体的浓度进行In-Fusion连接，构建成SjPPase编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjPPase；将此重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，将菌液进行PCR鉴定及测序鉴定。

7.如权利要求3所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：通过热激法将步骤2)测序无误后的pET-28a(+)-SjPPase重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养；最后收取菌体；在上述菌体中加入核酸裂解液裂解细菌，离心后保留上清与沉淀，由Western-blot鉴定结果。

8.如权利要求3所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：将步骤3)裂解后上清相继用Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。

9.一种如权利要求1所述的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白在筛选SjPPase抑制剂中的应用，其特征在于，所述筛选SjPPase抑制剂的方法为：固定pH值、温度、底物浓度以及反应时间，进行日本血吸虫SjPPase重组蛋白不同抑制剂的筛选。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述不同抑制剂为NaF、IDP、MDP。