JP6493209B2

JP6493209B2 - 核酸増幅法

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Description

本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法に関する。本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。

ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。

一方、ＰＣＲは、色素やタンパク質、糖類などの夾雑物の影響を受けやすく、夾雑物が反応を阻害することが知られている（非特許文献１）。通常、生体試料中の遺伝子を増幅する場合は、ＤＮＡの精製が必要とされている。しかし、ＤＮＡの精製は、精製の操作は煩雑で、かつ、時間を要し、操作中にコンタミネーションを生じる危険性がある。また、試料中の目的核酸含量が少ない場合には、回収することができない場合もあった。これらのことから、生体試料中の目的核酸を簡便かつ効率的に増幅する方法が求められていた。

ＷＯ２００７／００４６５４英国特許第６３３３１５８号米国特許第６９４６２７３号特許第３８９１３３０号特許第４３９５３７７号特表２００６−５０７０１２

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２，ｐ４８５−４９３（２００１）

そこで、本発明は標的核酸の効率的な増幅法を提供することを目的とする。より詳細には、生体試料中の目的核酸を、精製工程を経ることなく直接増幅することを可能にする核酸増幅法を提供する。
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在する遺伝子の増幅に適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。

前記目的を達成するための本発明の核酸増幅方法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを用い、生体試料中のＤＮＡを、精製工程を経ることなく増幅することを特徴とする前記核酸増幅方法である。

すなわち、本発明者は生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応させる核酸増幅法において、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを用いることで、生体由来の夾雑物が多量に存在しても、さらには血液や爪のような生体試料をＰＣＲ反応液に直接添加しても、ＰＣＲが可能になることを見いだし、本発明を成すに至ったのである。

ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは比較的、ＰＣＲの阻害に強いことは知られていたが、過剰な阻害物質が混在する反応条件では増幅が見られないことがあった。
一方、ＤＮＡ複製に関与する因子の一つである増殖核抗原（ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ））と呼ばれる一群の物質が存在する。ＰＣＮＡをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに添加すると核酸増幅の時間が短縮できること（特許文献１）や、プライマーエクステンション試験で伸長性が向上し、核酸増幅でも比較的長めのターゲットを増幅できること（特許文献２）が知られている。しかし、阻害物質が多く含まれた条件でＰＣＮＡがそのような効果を示した例は知られていない。
このように、ＰＣＮＡが、阻害物質が多く含まれた条件で作用することは知られておらず、また、ＰＣＮＡの添加がポリメラーゼの阻害物質への耐性（クルード耐性）を上げることは知られていなかった。そして、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを用い、生体試料中のＤＮＡを精製工程を経ることなく増幅した例も知られていない。

代表的な本願発明は以下の通りである。
［項１］
精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
［項２］
生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである、項１に記載の核酸増幅法。
［項３］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである、項１または項２に記載の核酸増幅法。
［項４］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼである、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項５］
ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である、項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項６］
ＰＣＮＡが、配列２１または２２における（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項７］
ＰＣＮＡが、配列２１または２２における１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項８］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに減少した塩基類似体検出活性を有する変異体である、項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項９］
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかで示されるものであることを特徴とする、項８に記載の核酸増幅法。
（ａ）配列番号１または配列番号２（Ｐｆｕの野生型配列に相当）で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列である。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
［項１０］
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する変異体である、項８または９に記載の核酸増幅法。
［項１１］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する変異体である、項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項１２］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列のＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変である、項１１に記載の核酸増幅法。
［項１３］
項１〜１２のいずれかに記載の、核酸増幅反応を行うための試薬。
［項１４］
項１〜１２のいずれかに記載の、核酸増幅反応を行うための試薬を含むキット。

本発明によって、ＤＮＡ精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに時間・コストを削減することができる。また、ファミリーＢに属するポリメラーゼを使用することで正確に遺伝子を増幅することができる。この手法は研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる。

ＰＣＮＡ変異体の評価ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅ＰＣＮＡ添加による糞便からの増幅ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅ＰＣＮＡ添加による爪、髪、口腔粘膜からの増幅ＰＣＮＡの多量体形成に関するアミノ酸領域を示す図本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた糞便存在下からの増幅評価

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。

（１）［本発明の特徴］
本発明における核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーＢに属するポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする。

（２）［精製工程を経ないこと］
本発明における核酸増幅法においては、精製工程を経ていない生体試料内の核酸を精製することなく増幅する。精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法がある。

本発明における核酸増幅法は、生体試料をこれらの精製法をとることなく、核酸増幅反応液に添加し増幅する方法である。
本発明において「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられる。
臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。

（３）［生体試料］
本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。

（４）［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。

（５）［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＧＢ−Ｄ、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＷｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓＮｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。

なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

また、前記ＤＮＡポリメラーゼに、後述の、３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域の改変、および／または、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いても良い。

（６）ＰＣＮＡ
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡ（本明細書では、ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎとも言う。）は、ＰＣＲ増強因子の一種である。前記ＰＣＮＡとしては、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。

本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡとしては、さらに好ましくはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＧＢ−Ｄ、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＷｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号２１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓＮｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。

また、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、配列番号２１または配列番号２２の７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものがあげられるが、これに限定されない。

さらに、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする変異体であってもよい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＤＮＡにロードするとは、ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを示し、通常はＲＦＣと呼ばれる因子と共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。単独でＤＮＡにロードする変異体とは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。

ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（配列番号２１）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（配列番号２２）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。

上記および下記において、配列番号２１または配列番号２２を例にして説明したことは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図１１で示したように配列番号２１および２２に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号２１の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。

単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる、
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、または
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。

たとえば、配列番号２１の１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したものなどが挙げられる。
本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシンが挙げられる。好ましくはアルギニンである。

より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体が例示されるほか、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうかは、ＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ＰＣＮＡ変異体を添加し、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと増幅量を比較することで、単独でＤＮＡにロードできるかを確認することができる。野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと比べて優れた増幅量を得ることができる。

本発明において「ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか」の評価（増幅増強活性の評価）は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含んだ０．２ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１ＵＫＯＤＤＮＡポリメラーゼＶ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を野生型ＰＣＮＡを添加したもの、またはＰＣＮＡを添加していないものと比較することで単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡかどうかを評価することができる。単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。

（７）核酸増幅法
本発明の核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、ＰＣＮＡを反応液中に含んでいることを除いて、特に限定されない。

ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能な方法としては、典型的にはＰＣＲが挙げられるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。

本発明の方法において、ＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示すが、これに限定されるものではない。
精製していない生体試料から得た増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
（ｅ）ＰＣＮＡ
を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、ＰＣＲ増強因子（後述）、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。
また、ＤＮＡポリメラーゼに、後述の、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いる場合は、ｄＵＴＰなどの塩基類似体をＤＮＡ合成基質として用いることが可能である。

上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。

（８）核酸増幅法を実行するための試薬、キット
本発明の核酸増幅法を実行するための試薬、キットは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、および、ＰＣＮＡを反応液中に含み、それ以外の構成は特に限定されない。適用する核酸増幅法も特に限定されない。

核酸増幅法としてＰＣＲを行う場合、本発明の試薬、キットとして、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む構成が例示できるが、これに限定されない。
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
（ｅ）ＰＣＮＡ

前記試薬、キットは、必要に応じて、さらに、その他の試薬類、たとえばＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。

以下、本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼについて、説明を追加する。

（９）［ＤＮＡポリメラーゼの改変（Ｉ）３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域の改変］
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
３‘−５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸である。本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１〜１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。

なお、「配列番号１に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。

上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号１または配列番号２における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。
より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。
なお、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号１または配列番号２におけるＨ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。

なお、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼを生成する方法や、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を解析する方法は公知であり、例えば、米国特許第６９４６２７３号（特許文献３）に開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法は、特許第３８９１３３０号（特許文献４）等に記載されている。

（１０）［ＤＮＡポリメラーゼの改変（ＩＩ）減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製する改変］
本発明の核酸増幅法に用いるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。

このようなファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性を有する変異体としては、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示できる。
具体的には、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。ウラシルやイノシンへの結合能力が低い古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ｄＵＴＰの存在下のＰＣＲでもファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号８）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。

本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のうち少なくとも１つに改変を加えたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、すなわち、（ａ）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列で示されるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体である。

上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、以下の（ｂ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一（好ましくは８５％以上同一であり、さらに好ましくは９０％以上同一であり、さらに好ましくは９５％以上同一であり、さらに好ましくは９８％以上同一であり、さらに好ましくは９９％以上同一である）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、以下の（ｃ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。

ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。

なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。

本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。
配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡＤａｔａｂａｎｋｏｆＪａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、より好ましくは、配列番号１または配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。
ここで、例えばＹ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。

より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の改変である。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。

本発明における減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、配列番号１または配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される２つ以上のアミノ酸を改変したものでも良い。具体的には、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられ、好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。

なお、特許文献１または２には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。

（１１）
上記（８）および（９）に例示したＤＮＡポリメラーゼの改変をもとに、本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼとして、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の（１）−（４）のいずれかの改変を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるわけではない。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨまたはＶ９３Ｋのいずれか

（１２）［塩基類似体検出活性の評価方法］
本発明における塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。塩基類似体は典型的にはウラシルである。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ〜２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。

減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、および鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。ただし、野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。

本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。

（１３）アミノ酸改変の導入方法
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。

アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。

上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。

上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

（１４）［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは以下のように活性を測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭＫＣｌ，１ｍＭジチオスレイトール，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０，５０％グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ塩化マグネシウム１５ｍＭジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ

（実施例１）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号２３）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例２）
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号２４）（ｐＰｆｕＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１に示す。

（実施例３−１）
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１１）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例３−２）
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１２）（ｐＰｆｕ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例３−１、および３−２で作製したプラスミドは表２および表３に示す。

（実施例４）
改変型耐熱性ＰＣＮＡの作製
実施例１および２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。

（実施例５）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例３−１および３−２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。

上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、前記の（１３）に記載の［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］に従い行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。

（実施例６）
ＰＣＮＡの評価
ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードできるかを確認するため、実施例１で作製したＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ）を用いてｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、上記（６）で示した増幅増強活性の測定方法に従い、Ｈｕｍａｎ β−グロビンの１．３ｋｂを増幅することで比較した。この際、ＤＮＡポリメラーゼには、実施例３−１で作製したＫＯＤＶ９３Ｋ変異体を用いた。なお、上述のとおり、Ｍ７３Ｌ変異を野生型に相当するものとみなす。
ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、およびを０．２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３及び１４）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図１は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａの計７種である。
今回用いたＫＯＤＶ９３Ｋ変異体はｄＵＴＰの阻害を受けて増幅量が少ない。ＰＣＮＡ添加なしやＭ７３Ｌ変異体ではほとんどバンドが確認されなかったが、他のＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の添加でしっかりとしたバンドが確認された。ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡがＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる。

一方、実施例２で作製したＰｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）を用いて上記と同様の実験を行った。その結果、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、他のＰｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）の添加でしっかりとしたバンドが確認された。

（実施例７）
ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
反応液に添加する血液量を変えて、様々なＰＣＮＡ変異体の添加でクルード（血液）耐性を評価した。比較には、ＰＣＮＡの添加なしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）を用い、ＨＢｇの３．６ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＤＮＡポリメラーゼには、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−を用いた。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４、酵素液（ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−）を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１７および１８）、１ＵのＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して８％になるように加え、ＰＣＮＡなしと様々な濃度のＰＣＮＡ変異体（０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ）を添加したものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、４分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図２は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を８％になるよう反応液を調製して、種々のＰＣＮＡ変異体を０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａの計４種である。各写真の０．５、１、２、４は添加されたＰＣＮＡの量（μｇ）を示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なし、Ｍ７３Ｌの変異体では４μｇ添加しても血液から直接増幅が確認されないところ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａの変異体は０．５μｇ添加すれば血液が８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図２）。多量体形成に関わる部位に変異を入れ単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、ＰＣＲ反応系に添加すればクルード耐性が上がることが示される。

（実施例８）
市販（古細菌由来）酵素とＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する酵素にもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ（タカラバイオ製）、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（タカラバイオ製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬ（タカラバイオ製）のポリメラーゼを用い、血液、反応液に対して８％存在下でＨＢｇの３．６ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１７および１８）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、４分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図３は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬの計４種である。各写真の１はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、２はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ、３はＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、４はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬの結果を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬではＰＣＮＡ添加なしで血液１６％から直接増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加することでしっかりとしたバンドが確認された。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐではＰＣＮＡ添加なしで血液１６％から直接増幅がみられたが、ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加することで増幅量が大幅に向上することが確認された（図３）。ＰＣＮＡ変異体を添加すればクルード（血液）耐性が上がり、増幅できなかったものが増幅できた。また、増幅量が血液の阻害によって抑えられていたものが、ＰＣＮＡ変異体の添加によって改善され増幅量が増えたことが示された。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬはファミリーＢに属する古細菌由来のポリメラーゼで調製されている。ＰＣＮＡ変異体はＫＯＤポリメラーゼだけでなく、様々なファミリーＢに属するポリメラーゼに効果があることが示された。

（実施例９）
ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼの変異体にＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤＨ１４７Ｅ変異体、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ＭＫＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＫＯＤ変異体のＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１５および１６）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃ ３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−ＴａｑＨｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭｄＮＴＰｓ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図４は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２、４、８、１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤＨ１４７Ｅ変異体、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼの計４種である。
各写真の１、２、８、１６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤＨ１４７Ｅ、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは植物ライセートを８％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図４）。同様にＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋでも、ＰＣＮＡなしでは４％の植物ライセートで阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが４％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された。ＰＣＮＡ変異体はＫＯＤＤＮＡポリメラーゼの変異体にも効果があることが示された。
一方、ファミリーＢに属するポリメラーゼではないＴａｑポリメラーゼではＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性の変化は見られなかった。ＴａｑポリメラーゼにはＰＣＮＡ変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。

（実施例１０）
市販のファミリーＢに属する酵素とＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
市販されている様々なファミリーＢに属する酵素にもＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、ＫＯＤＤａｓｈ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬを用い、ｒｂｃＬ１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ＭＫＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＰＣＲは、それぞれ添付のＢｕｆｆｅｒを用い、推奨の反応液中に１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１５および１６）と、植物ライセートを反応液に対して１％、２％、４％、６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図５は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を１、２、４、６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−、ＫＯＤＤａｓｈ、ｐｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬの計３種である。
各写真の１、２、４、６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−では植物ライセートを１％以上で、ＫＯＤＤａｓｈ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬでは２％以上で阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが４％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図５）。

（実施例１１）
ＰＣＮＡ添加による糞便からの増幅
ＰＣＮＡの添加でクルード（糞便）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用い、ＨＢｇの３．６ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４、酵素（ＫＯＤ −ＰＬＵＳ−）を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１７および１８）、５ｎｇヒトゲノム、１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０．２％、０．４％、０．８％、１．６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、４分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図６は、ヒトゲノムからＨＢｇ３．６ｋを増幅する反応液に阻害物質である糞便を０％、０．２％、０．４％、０．８％、１．６％の割合になるよう添加し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７ＡありなしでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−である。
各写真の０、０．２、０．４、０．８、１．６は添加された糞便の割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−では糞便を０．２％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは糞便が０．４％含まれていてもバンドが確認された（図６）。ＰＣＮＡ変異体は糞便の阻害にも耐性能を向上させる効果があることが示された。

（実施例１２）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９および２０）、２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図７は、試料として血液を用い、ｄＵＴＰを含む反応液に血液を０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％の割合になるよう添加して、ＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの添加ありなしでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋでは血液を１０％添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図７）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。

（実施例１３）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
図７と同様、ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄを用い、ＨＢｇの１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＰｆｕ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３および１４）、２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．０２％、０．２％、０．５％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＰｆｕ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図８は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を０．０２％、０．２％、０．５％、２％、５％、１０％になるよう反応液を調製して、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体および、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＰｆｕ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしでは阻害がかかり血液から増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図８）。図７と同様、ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。

（実施例１４）
ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ＭＫＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１５および１６）、２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃ ３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−ＴａｑＨｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図９は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２、４、８、１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼの計２種である。
各写真の１、２、８、１６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは植物ライセートを４％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図９）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰを含む反応液でも効果があることが示された。
一方、ファミリーＢに属するポリメラーゼではないＴａｑポリメラーゼではＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性の変化は見られなかった。ＴａｑポリメラーゼにはＰＣＮＡ変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。

（実施例１５）
体組織（爪、髪、口腔粘膜）からのＰＣＲ
爪や髪、口腔粘膜を鋳型に、ＰＣＲができるかを検討した。爪は爪きりで切断した一片を、髪は１本を、５０ｍＭＮａＯＨ１８０μｌに添加し、９５℃１０分の熱処理で破砕を行い、その後、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μｌを加え中和した上清を鋳型として用いた。口腔粘膜は綿棒で採取した粘膜を２００μｌの水に懸濁したものを鋳型として用いた。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ（野生型）とＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９および２０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル１μｌを用いた。また、各反応液にＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲｓｙｓｔｅｍＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図１０は、試料として爪、髪、口腔粘液を用い、種々のＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の存在下で行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ（野生型）、ＫＯＤの変異体２種（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の計３種である。各写真の左側がｄＴＴＰを用いた場合、右側がｄＵＴＰを用いた場合である。１レーンは爪を試料とした場合、２レーンは髪、３レーンは口腔粘膜である。それそれの「＋」レーンは、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の存在下であり、「−」はＰＣＮＡなしであることを示す。
結果、野生型のＫＯＤＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰ存在下で増幅が確認されないところ、減少した塩基類似体検出活性を持つＫＯＤＹ７Ａ／Ｖ９３ＫやＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体ではｄＵＴＰ存在下でもバンドが確認された（図１０）。そこにＰＣＮＡを添加した結果、添加していないものと比べ増幅量が向上していることが確認された。

ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、体組織（爪、髪、口腔粘膜）からの増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。またこれらに、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）を添加すると、上記と同様、増幅量の向上が確認できた。

実施例１６
糞便からの増幅
ｄＵＴＰ、糞便存在下で遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子約７００ｂｐの増幅の違いをＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩを用いたリアルタイムＰＣＲ、および融解曲線で比較した。ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にはＰＣＲ増強因子としてＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものも実施した。

阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤＤａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２５および２６）、２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１／３００００ＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩ、ＫＯＤ抗体と混合した０．４Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃ １０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。ＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａは上記反応系に１００ｎｇ加え、ＰＣＮＡなしのものと比較した。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−ＴａｑＨｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×Ｔａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ別添タイプ）、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、４ｍＭＭｇＳＯ_４、１／３００００ＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩ、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃ １０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。
それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、８０℃後半に出現する目的ピークを確認した。

実施例１６のＣｑ値を表４に示す。

表４はｄＵＴＰ、糞便存在下で行ったリアルタイムＰＣＲのＣｑ値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０のデフォルト設定）を示す。Ｎ．Ｄ．は増幅が見られず、Ｃｑ値が求められなかったことを示す。
結果、Ｔａｑポリメラーゼでは０．５％の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは２．５％の糞便を添加しても増幅が確認された。また、ＰＣＮＡありなしを比較すると、ＰＣＮＡを添加したものの方が、Ｃｑ値が小さく、優れたＰＣＲ効率を示していることがわかった。

図１２は、ｄＵＴＰ、糞便存在下でＰＣＲを用い、得られた増幅産物の融解曲線解析の結果を示す。用いたポリメラーゼはＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、Ｔａｑポリメラーゼの計３種である。
１はＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄの結果を、２はＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものの結果を、３はＴａｑポリメラーゼの結果を示す。
結果、ＫＯＤＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤではｄＵＴＰ、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、２．５％を添加しても、目的ピークを確認することができた。ＰＣＮＡを添加したものでも同様に、２．５％の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Ｔａｑポリメラーゼでは０．２５％の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された（図１２）。

ＫＯＤの他の変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。

またＰＣＮＡも、ＫＯＤ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡＭ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べＰＣＲ効率の向上が確認できた。

ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

精製工程を経ていない、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、及びウイルスからなる群から選択される生体試料を核酸増幅反応液に添加し、該生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、下記（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチドからなるＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）８２、８４および１０９番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３９、１４３および１４７番目のアミノ酸残基群
生体試料が、血液、唾液、白血球、植物ライセート、糞便、爪、髪、及び口腔粘膜からなる群から選択されるいずれかである請求項１に記載の核酸増幅法。
ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である、請求項１または２に記載の核酸増幅法。
ＰＣＮＡが、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｂ１）から（ｂ４）のいずれかの変異体である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
（ｂ１）１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの
（ｂ２）８２番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの
（ｂ３）１４７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの
（ｂ４）１０９番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの
ＰＣＮＡ変異体が、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｂ１）または（ｂ２）のいずれかのアミノ酸に置換された変異体である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
（ｂ１）１４３番目のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに置換された変異体
（ｂ２）１４７番目のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに置換された変異体