CN107232180B - 一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液、制备及其应用方法 - Google Patents

一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液、制备及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种山羊细管冻精制作方法，属于畜禽冷冻精液制作技术领域，特别是涉及山羊细管冻精的制作方法。所述的山羊细管冻精制作方法具体步骤为：1.冷冻稀释液的准备；2.采精和镜检；3.稀释；4.分装；5.平衡；6.冷冻；7.解冻和复检。本发明的细管冻精制作方法操作简便快捷、无需复杂仪器设备，在鲜精品质满足要求的情况下，经冷冻解冻的细管冻精活率不低于0.35，不仅能满足人工授精对冻精的活率要求，还能充分提高公羊的利用率，突破动物寿命的限制，实现公羊精液的长期保存，极大限度的促进山羊冷冻精液的应用和推广。

Description

一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液、制备及其应用 方法
技术领域
本发明涉及用于一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液及其制备方法，属于畜禽繁殖技术领域，用于高温气候环境下山羊精液人工授精或常温稀释保存。
背景技术
山羊精液冷冻保存技术目前虽然已进入生产应用阶段，但冷冻精液人工授精受胎率不高仍是限制山羊冷冻精液进行生产和推广的重要因素之一。在生产实践中，山羊精液常温稀释保存和鲜精人工授精技术仍广泛应用。影响山羊精液常温稀释保存效果的因素主要包括温度、酸碱度以及稀释比例和稀释方法等，其中高温应激对精液稀释保存的危害尤为显著。在高温湿热的环境条件，从山羊附睾射出的精液极易发生热应激反应，精子的代谢和运动加快，消耗大量的代谢基质；热应激反应往往还伴随着氧化应激的发生，在山羊精液常温保存过程中，酸性代谢产物和活性氧(ROS)含量增加，从而导致有效保存时间和精子活力大大降低缩短。因此，提高精液抗应激反应能力，对延长精液保存时间和提高精子活力有重要意义。如CN 104304236 B、CN 103518703 B分别公开了一种翘嘴红鲌和猪精液稀释液。在高温湿热的气候环境下，精子运动和代谢加强，精子的受精能力降低更为显著。因此，研发一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液及其制备方法，在延长山羊精液保存时间的同时，能缓解环境应急对山羊精液造成的不利影响，将极大限度的促进热区饲养条件下山羊精液常温保存和鲜精人工授精的应用和推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液，所述稀释液的成分包括：Tris45-50g/L、葡萄糖6-10g/L、柠檬酸20-25g/L、谷氨酸钠1-2g/L、SDS 0.2-0.5g/L、青链霉素各80-100万单位、精氨酸1.5-2.0g/L和谷氨酰胺2.5-3.5g/L。所述的一种用于缓解高温应激的山羊精液稀的制备方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)无菌条件下，向850mL蒸馏水中加入Tris 45-50g g、葡萄糖6-10g、柠檬酸20-25g、谷氨酸钠1-2g和SDS 0.2-0.5g，充分溶解并混合均匀，再加入青链霉素各80-100万单位，蒸馏水定容至1L，0.22μm孔径无菌滤器过滤，备用；
(2)无菌条件下，按比例准确称取精氨酸1.5-2.0g和谷氨酰胺2.5-3.5g溶解于8-10ml蒸馏水中，充分溶解20min以上，超声混匀，0.22μm孔径无菌滤器过滤，-20℃避光保存备用；
(3)使用时，将步骤(2)的贮液放于室温化冻后，与步骤(1)稀释液混合均匀，获得所述用于缓解高温应激的山羊精液稀释液。
进一步的，所述步骤(1)保存温度为2-5℃。
进一步的，所述步骤(2)保存期限为4-6周。
进一步的，步骤(3)所述山羊精液稀释液2-5℃保存。
进一步的，所述精液稀释液的使用方法：将精液稀释液预热至35-37℃，再与山羊精液进行混合，低倍稀释时，按照精液与稀释液体积比1:(1至2)混合；高倍稀释时，先按照精液与稀释液体积比1:(1至2)进行第一次稀释，平衡后再进行第二次稀释。
本发明的有益效果是：本发明的用于缓解高温应激的山羊精液稀释液，所述精液稀释液包含谷氨酰胺和精氨酸，作为条件必需氨基酸不仅提供精子代谢必须的营养成分，还能作为抗氧化物质或质膜保护剂，维持精液中抗氧化剂的储备，提高精液抗应激反应能力，清除精液在高温应激环境条件下生成的酸性代谢产物和ROS，用于缓解高温应激环境对山羊精液保存的不利影响。本发明的山羊精液稀释液和现有的精液稀释液相比，能更好适应热区高温湿热的气候环境，起到延长精液保存时间、提高精子活力的效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明实施方式不局限于此。
实施例
一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液，成分包括：Tris45.43g/L、葡萄糖7.39g/L、柠檬酸23.83g/L、谷氨酸钠1.69g/L、SDS0.3g/L、青链霉素各100万单位、精氨酸1.74g/L和谷氨酰胺2.93g/L。
所述山羊精液稀释液的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下，向850mL蒸馏水中加入Tris 45.43g、葡萄糖7.39g、柠檬酸23.83g、谷氨酸钠1.69g和SDS 0.3g，充分溶解并混合均匀，再加入青链霉素各100万单位，蒸馏水定容至1L，0.22μm孔径无菌滤器过滤，备用；
(2)无菌条件下，按比例准确称取精氨酸1.74g和谷氨酰胺2.93g溶解于8-10ml蒸馏水中，充分溶解20min以上，超声混匀，0.22μm孔径无菌滤器过滤，-20℃避光保存备用；
(3)使用时，将步骤(2)的贮液放于室温化冻后，与步骤(1)稀释液混合均匀，获得所述用于缓解高温应激的山羊精液稀释液。
上述精液稀释液的使用方法，将上述精液稀释液预热至37℃，再与山羊精液进行混合，低倍稀释时，按照精液与稀释液体积比1:1-2混合；高倍稀释时，先按照精液与稀释液体积比1:1-2进行第一次稀释，平衡后再进行第二次稀释。
对比例
一种山羊精液稀释液，成分包括：Tris葡萄糖、柠檬酸、谷氨酸钠、SD和青链霉素。无菌条件下，将Tris 45.43g、葡萄糖7.39g、柠檬酸23.83g、谷氨酸钠1.69g和SDS 0.3g，充分溶解并混合均匀，再加入青链霉素各100万单位，蒸馏水定容至1L。
将上述精液稀释液预热至37℃，再与山羊精液进行混合，低倍稀释时，按照精液与稀释液体积比1:1-2混合；高倍稀释时，先按照精液与稀释液体积比1:1-2进行第一次稀释，平衡后再进行第二次稀释。
对比例和实施例试验地点在海南儋州，环境温度34℃、相对湿度98％，采用电刺激法采集5只海南黑山羊种公羊精液，均分两份，分别将对比例和实施例的精液稀释液预温后按照体积比1:2的比例混合稀释，37℃保存，比较测定保存0h、6h、12h、24h和48h测定精子活力和存活时间。
精子活力检测步骤如下：
分别取不同时间点的稀释精液5ul滴于37℃预热的载玻片上，盖上盖玻片，10×20倍显微镜下进行检测；每份精子活力在5个不同视野中进行评估，5个连续评估值的平均值作为最后的精子活力值，计算公式如下：
精子活力＝(直线前向运动精子数/精子总数)×100％。
(2)顶体完整率的测定：
分别取不同时间点取精液50μl制作精子涂片，自然风干，水平摆放于染色架上，用4％的多聚甲醛固定15min→蒸馏水洗5次×3min/次→晾干→滴加吉姆萨染色液2ml/片染色90min后→水洗蒸馏水洗5次×5min/次→晾干→10×100倍显微镜镜检，精子顶体呈紫色，且包围精子头前部的为顶体完整的精子，计算公式如下：
顶体完整率＝(体完整的精子数/精子总数)×100％；
将经过稀释后的海南黑山羊精液精子活力和顶替完整率，结果见表1和表2。
表1精子活力和存活时间
分组 0h 6h 12h 24h 累计存活时间
实施例 90％ 55％ 23％ 10％ >24h
对比例 83％ 30％ 5％ 0 <24
表2精子顶体完整率
分组 0h 6h 12h 24h
实施例 62％ 38％ 24％ 10％
对比例 56％ 25％ 9％ 3％
从表1和表2可以，实施例添加缓解热应激成分精氨酸和谷氨酰胺，在高温湿热的气候条件下采精海南黑山羊精液，经对比稀释后精液保存时间延长、精子活力提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液，其特征在于，所述稀释液的成分包括：Tris45-50g/L、葡萄糖6-10g/L、柠檬酸20-25g/L、谷氨酸钠1-2g/L、SDS 0.2-0.5g/L、青链霉素各80-100万单位、精氨酸1.5-2.0g/L和谷氨酰胺2.5-3.5g/L。
2.根据权利要求1中所述的一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液 的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)无菌条件下，向850mL蒸馏水中加入Tris 45-50g g、葡萄糖6-10g、柠檬酸20-25g、谷氨酸钠1-2g和SDS 0.2-0.5g，充分溶解并混合均匀，再加入青链霉素各80-100万单位，蒸馏水定容至1L，0.22μm孔径无菌滤器过滤，备用；
(2)无菌条件下，按比例准确称取精氨酸1.5-2.0g和谷氨酰胺2.5-3.5g溶解于8-10ml蒸馏水中，充分溶解20min以上，超声混匀，0.22μm孔径无菌滤器过滤，-20℃避光保存备用；
(3)使用时，将步骤(2)的贮液放于室温化冻后，与步骤(1)稀释液混合均匀，获得所述用于缓解高温应激的山羊精液稀释液。
3.根据权利要求2所述的一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液 的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)保存温度为2-5℃。
4.根据权利要求2所述的一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液 的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)保存期限为4-6周。
5.根据权利要求2所述的一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液 的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述山羊精液稀释液2-5℃保存。
6.根据权利要求1和2所述的一种用于缓解高温应激的山羊精液稀释液的使用方法，其特征在于，所述精液稀释液的使用方法：将精液稀释液预热至35-37℃，再与山羊精液进行混合，低倍稀释时，按照精液与稀释液体积比1:(1至2)混合；高倍稀释时，先按照精液与稀释液体积比1:(1至2)进行第一次稀释，平衡后再进行第二次稀释。
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