CN113331175A - 一种利用l-精氨酸提高公猪精液常温保存效果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用L‑精氨酸提高公猪精液常温保存效果的方法，本发明利用含有L‑精氨酸的稀释液对猪精液在常温状态进行保存，提高了猪精液保存品质，延长了精液的保存时间，保存的猪精子活力高、质量好，从而有利于提高优良种公猪利用率，并获得高受胎率；同时所述稀释液制作方法简单、使用方便，便于大规模推广应用。

Description

一种利用L-精氨酸提高公猪精液常温保存效果的方法
技术领域
本发明涉及猪繁殖技术领域，特别涉及一种公猪精液常温保存稀释液配方。
背景技术
传统的猪生产中，猪的繁殖主要采用自然繁殖技术，但其生产效率低下，母猪受精率低，种公猪的利用率低、生产成本高。采用人工授精技术可以显著提高良种公猪的利用率、克服公母猪体格大小的差异、充分利用杂种优势、阻断繁殖过程中疾病的传播，节约生产成本、提高经济效益，便于进行集约化、规模化、专业化的养猪生产。在人工受精中需要首先采集精液，新鲜精液经采集后，受到温度变化、能量消耗、保存时间延长等因素影响，精子活率会明显降低。随着猪的人工授精给规模化企业带来的效益不断增加，猪精液的保存越来越受到重视。
精液的保存分为常温保存(17℃)、低温保存(4℃)和冷冻保存(-196℃)。由于猪精子结构的特性，即猪精子中胆固醇/磷脂的比例低、不饱和脂肪酸的比例高，使得猪精子对低温冷打击与活性氧自由基非常敏感，因此在猪精液的保存过程中，通常采用常温保存方法。尽管“猪常温精液”(GB23238-2009)可以在活力60％的情况下保存超过72小时的时间，但对于猪集约化、规模化、专业化生产而言，该活力水平仍无法满足目前实际生产的需要。同时延长猪精液的保存时间也有助于进一步推广猪人工受精技术，但随着保存时间的延长，猪精子产生的活性氧自由基会逐渐增多，而过量的活性氧自由基会损伤精子，导致精子活率等降低，影响保存品质。
在精液保存过程中，通常由稀释液的组成成分、渗透压、pH值及精液的稀释倍数、保存温度共同决定精液的保存效果。稀释液主要成分包括能量物质、抗氧化剂、缓冲液、抗菌剂等。目前国内外研制的稀释液配方主要有以下几种：柠檬酸钠-糖类、Tris-柠檬酸-糖类和EDTA二钠-柠檬酸钠-糖类。不同配方的稀释液在具体成分组成上存在差异，对精子的保护效果也不相同。
精氨酸是一种碱性氨基酸，是精子蛋白的主要成分，也是一种抗氧化物质及合成肌酸的前体物质。精氨酸分为L-精氨酸、D-精氨酸和DL-精氨酸。有报道在猪精液低温保存稀释液配方中添加L-精氨酸，但当保存至一周时，精子活力仅有43.64％(许春荣等.L－精氨酸对猪精液低温保存效果的影响.西北农业学报.2014，,23(11):12-16.)，精子活力大幅降低，不利于扩大良种公畜站人工授精的辐射范围及提高优良种公猪的利用率，从而无法满足猪生产实际需要。
商品化稀释液Modena相比于其他稀释液一定程度上延长了精液的保存时间，但Modena稀释液中缺乏抗氧化物质，对于精液保存过程中精子产生的活性氧自由基不能很好的清除，不利于精液的保存。此外，在保存过程中，精子会不断地消耗能量，当能量供应不足时，精子会迅速死亡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用L-精氨酸提高公猪精液常温保存效果的方法，通过使用含有L-精氨酸的稀释液对猪精液起到良好的常温保存效果。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
一种猪精液常温保存稀释液，该常温保存稀释液的成分包括25.0～30.0g/L的葡萄糖、2.0～2.7g/L的EDTA二钠、6.5～7.5g/L的柠檬酸钠、2.5～3.5g/L的柠檬酸、0.5～1.5g/L的碳酸氢钠、5.0～6.0g/L的Tris、50～150万IU/L的青霉素、50～150万IU/L的链霉素、20～60万IU/L的多黏菌素和2.5～5.0mmol/L的L-精氨酸。
优选的，所述常温保存稀释液的pH为6.9～7.3。
优选的，所述常温保存稀释液的成分包括27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、1.0g/L的碳酸氢钠、5.65g/L的Tris、100万IU/L的青霉素、100万IU/L的链霉素、40万IU/L的多黏菌素和5.0mmol/L的L-精氨酸。
一种猪精液常温保存方法，包括以下步骤：
将上述常温保存稀释液与猪精液混合后于15℃～20℃下进行保存。
优选的，所述混合具体包括以下步骤：将采集的新鲜猪精液用所述常温保存稀释液进行稀释，并将猪精子的密度稀释至0.5～1.0×108个/mL。
优选的，所述常温保存稀释液在与新鲜猪精液混合前预先加热至37～38.5℃(例如，与新鲜猪精液等温)。
优选的，所述新鲜猪精液的精子活率在80％以上。
优选的，所述保存的时间至少为7天。
优选的，所述常温保存稀释液与猪精液混合完成后于保存期间每间隔8～12小时混匀一次，以防止精子沉降，影响保存效果。
本发明的有益效果体现在：
本发明将一定配比的L-精氨酸与葡萄糖、EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris、青霉素、链霉素、多黏菌素组合，形成了能够高效保存猪精液的稀释液，通过添加L-精氨酸可使猪精子在常温条件下处于更高活力状态，能更有效的维持质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位、ATP含量，以及降低猪精子内活性氧自由基(ROS)浓度和脂质氧化损伤程度(LPO含量)，从而使猪精子在维持较高活力的同时延长猪精液常温保存时间。实验结果表明，本发明的稀释液可以使猪精液在常温下存放一周后活力仍达到75％以上，有效解决鲜精人工授精的时效性问题。同时利用该稀释液进行猪精液保存的操作简单方便，便于大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
本发明以满足良种公畜站在扩大对周边企业、养殖户(场)的人工授精辐射范围中的精液保存需求为出发点，通过对稀释液中能量供应和抗氧化成分的筛选和配比优化，研制出能高效保存猪精液(在常温下保存一周以上)的稀释液配方，与商用稀释液(例如，Modena稀释液)相比，可以更好的克服采精时限及输精地点远近不同等实际情况对充分发挥良种公猪利用率、实现良种资源共享的不利影响。
(一)猪精液常温保存稀释液配制
稀释液配方成分及含量：27.5g/L的D-葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、1.0g/L的碳酸氢钠、5.65g/L的Tris、100万IU/L的青霉素、100万IU/L的链霉素、40万IU/L的多黏菌素和5mmol/L的L-精氨酸。
按含量称取上述稀释液配方各成分并与双蒸水充分混匀后定容至1L，即得到猪精液常温保存稀释液，pH值约为7.2。
本发明稀释液中葡萄糖作为能量物质为精子生命活动进行供能，以维持猪精液保存过程中较高的精子活力和精子活率，EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠和Tris作为缓冲物质(其中，EDTA二钠是一种螯合剂，柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠和Tris无毒性，且具有pH调节及良好的缓冲稳定性)，使猪精液在保存过程中维持恒定的pH值以及渗透压，进而维持猪精子质膜完整率和顶体完整率。在此基础上，本发明稀释液中按配比添加的L-精氨酸具有较强的抗氧化、抗衰老和防止细胞凋亡等作用，可以显著提高常温保存后猪精子的质膜完整率、顶体完整率以及线粒体膜电位、ATP含量，并降低猪精子内活性氧自由基(ROS)浓度以及脂质氧化损伤程度(LPO含量)，提高精子运动性能以及精子膜脂流动性，从而提高精子活力。同时，本发明稀释液中除了含有青霉素和链霉素这两种抗生素，还添加有多黏菌素作为破坏细菌细胞壁并在细菌细胞的繁殖期发挥杀菌作用的活性成分，可以有效控制猪精液中细菌的菌落数量并且对精子无毒害作用，从而提高了精子的活率。
(二)猪鲜精常温保存方法
鲜精采集及质量评定：采用手握法或自动采精法采集成年健康种公猪精液，在37℃下对精子的活率及密度进行检测。
将鲜精样品用Modena稀释液进行等比例稀释后在显微镜250倍视野下初步观察精子的活率及其他精子运动参数，并用计算机辅助分析系统(CASA)进行检测。将鲜精样品用Modena稀释液稀释50～100倍后在血球计数板上计算精子密度。
鲜精样品的精子活率≥80％，且精子密度≥2×108个/mL时，鲜精可以保存。
常温保存：根据所采鲜精(温度为37℃)体积及精子密度，加入(一)中配制的稀释液(预热至37℃)，直至使精子密度为0.5～1.0×108个/mL，然后进行分装，保存在17℃环境中一周以上，保存期间每隔12小时颠倒混匀一次，保存期间可根据具体情况反复用于人工授精。
(三)猪精液保存后的质量评定
精子活率、活力及其他运动参数测定：取1mL样品(例如，经过常温保存的精液)在37℃下孵育10min，之后取10μL样品在250倍显微镜视野下用计算机辅助分析系统(CASA)测定精子活率、活力及其他精子运动参数(主要包括精子直线运动速率和曲线运动速率)；测定时选取5个以上不同的视野，每个视野内的精子数在200个以上且分布均匀，进行检测。
精子质膜完整率的检测(检测采用SYBR-14/PI荧光染料法)：将样品37℃孵育10min，取100μL样品，加入0.3μL的SYBR-14染液，混匀后在37℃下孵育5min，再加入0.3μL的PI染液，混匀后避光在荧光显微镜200倍镜下取5个以上视野拍照，每个视野内精子数大于200个，计数精子质膜完整情况，统计精子质膜完整率。
精子顶体完整率的检测：取20μL样品均匀涂抹于载玻片上，自然风干，置于无水甲醇中固定10min，置于空气中自然风干；取20μL的FITC-PNA工作液，均匀涂抹于载玻片上，保证覆盖样品，再将载玻片置于湿盒内，37℃下避光孵育30min，用PBS清洗载玻片2～3次，洗去浮色后避光在荧光显微镜200倍镜下随机取5个以上视野拍照，每个视野内精子数大于200个，计数精子顶体完整情况，统计精子顶体完整率。
精子线粒体膜电位的检测(采用试剂盒荧光探针JC-1，检测精子的线粒体活性)：取100μL样品，1000g/min离心5min，去上清，用Modena稀释液重悬后重复离心操作两次，在重悬样品中加入配制好的JC-1工作液(加入体积根据试剂盒说明书操作即可)，在37℃恒温箱中孵育20min，取出后放入预冷的4℃离心机中，5000g/min离心5min，去上清，加入Modena稀释液重悬后重复该离心操作两次，使用多功能酶标仪检测，检测时使用的波长为488/525、525/590，检测全程避光操作。
精子内ATP含量的检测(采用ATP含量检测试剂盒)：取100μL样品，3000g/min离心5min，去上清，用Modena稀释液重悬后重复离心操作两次，加入一定体积的ATP裂解液进行重悬、振荡；使用超声破碎仪在冰上裂解精子；裂解后在4℃下进行离心(12000g/min、离心5min)，在黑色96孔板中加入一定体积的ATP检测工作液及一定体积精子裂解离心后的上清，使用多功能酶标仪检测ATP浓度，并检测BCA浓度，试验全程避光操作；ATP含量＝ATP浓度/BCA浓度。
精子内活性氧自由基(ROS)水平的检测(采用ROS含量检测试剂盒)：取100μL样品，加入200μL的Modena稀释液，混匀后800g/min离心5min，去上清，按试剂盒说明书加入一定体积的ROS工作液(DCFH-DA)，37℃水浴中孵育20min，每隔3～5min混匀一次，孵育后1000g/min离心5min，去上清，使用Modena稀释液重悬后重复离心操作两次，使用多功能酶标仪进行检测，检测时使用的荧光波长为488/525，试验全程避光操作。
精子内脂质氧化损伤程度(LPO含量)的检测(采用BODIPY 581/591C11染色法)：取100μL样品，加入200μL的Modena稀释液，混匀后800g/min离心5min，去上清，避光环境下，加入BODIPY 581/591C11工作液，37℃水浴30min，水浴后800g/min离心5min，去上清，使用Modena稀释液重悬后重复离心操作两次，使用多功能酶标仪进行检测，检测时使用的波长为488/525、590/635。
(四)猪精液常温保存实例
采用手握法采集共计18只健康成年(1～3周岁)杜洛克、长白、大白种公猪的精液，在37℃下对采集的新鲜精液的精子活率、活力及密度进行检测，从而对每只公猪的精液进行质量评定。结果参见表1，所采集种公猪鲜精精子密度在2.0～4.0×108个/mL范围内，精子活率在85％～95％范围内。
利用(二)中保存方法将猪精液保存一周(将鲜精稀释至精子密度为0.5×108个/mL，完成混合后保存至17℃冰箱)，以Modena稀释液作为实验对照，对鲜精保存质量进行了比较。
结果显示(表1)，利用本发明的稀释液常温保存猪精液一周后精子活力仍可达到75％以上(明显高于60％)，质膜完整率达79％以上，顶体完整率达80％以上，线粒体膜电位及ATP含量均明显高于实验对照，ROS及LPO水平均明显低于实验对照，其中ROS水平维持在7.0(5×104个精子)以下，LPO水平维持在45％以下。
表1.稀释液对种公猪精液常温保存的影响
Modena稀释液 本发明稀释液
动物数量(头) 18 18
鲜精活力(％) 80～88 80～88
鲜精活率(％) 85～95 85～95
鲜精密度(×10<sup>8</sup>个/mL) 2.0～4.0 2.0～4.0
保存后活力(％) 66.56±0.57 75.68±0.29
保存后活率(％) 81.68±0.29 86.78±0.90
保存后质膜完整率(％) 69.69±0.90 79.38±0.24
保存后顶体完整率(％) 78.18±0.91 83.02±1.15
保存后线粒体膜电位(红/绿) 1.86±0.05 2.21±0.05
保存后ATP含量(μmol/g) 1.57±0.07 2.00±0.015
保存后ROS水平(5×10<sup>4</sup>个精子) 11.50±0.13 6.78±0.27
保存后LPO水平(％) 53.16±2.28 44.57±1.73
结果表明，本发明的稀释液相比于Modena稀释液，在猪精液保存过程中可以显著改善精液的抗氧化能力，清除精液保存过程中产生的过多的氧自由基；此外，相较于Modena稀释液，本发明的稀释液可以显著增加保存过程中精子的ATP含量，从而保证了精子在保存过程有充足的能量供应，为延长精液的保存时间提供了可靠的基础。可见，本发明的稀释液不仅解决了猪精液保存过程精子的氧化损伤的问题，降低了猪精子的氧化损伤程度；而且保证在保存过程中精子有足够的能量供应。
总之，本发明所公开的稀释液配方对于种公猪精液常温保存具有良好的效果，不仅精液保存时间长，而且能有效提高精子活率、质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、ATP含量，降低精子ROS水平、LPO水平，使猪鲜精在常温下存放一周后精子活力仍可达到75％以上，完全满足猪精液长途运输要求以及良种公畜站扩大人工授精辐射范围的需求，有利于提高人工授精生产效率，提高优良品种种公猪利用率并获得高受胎率，减少疾病的传播、实现良种资源共享、保护地方品种猪的延续。同时稀释液配方简单、易配制，便于大规模推广应用以改善猪精液常温保存效果，使猪生产更加规模化、专业化、集约化。

Claims (9)

1.一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：该常温保存稀释液包括25.0～30.0g/L的葡萄糖、2.0～2.7g/L的EDTA二钠、6.5～7.5g/L的柠檬酸钠、2.5～3.5g/L的柠檬酸、0.5～1.5g/L的碳酸氢钠、5.0～6.0g/L的Tris、50～150万IU/L的青霉素、50～150万IU/L的链霉素、20～60万IU/L的多黏菌素和2.5～5.0mmol/L的L-精氨酸。
2.根据权利要求1所述一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述常温保存稀释液的pH为6.9～7.3。
3.根据权利要求1所述一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述常温保存稀释液包括27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、1.0g/L的碳酸氢钠、5.65g/L的Tris、100万IU/L的青霉素、100万IU/L的链霉素、40万IU/L的多黏菌素和5.0mmol/L的L-精氨酸。
4.一种猪精液常温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
将稀释液与猪精液混合后于15℃～20℃下进行保存；所述稀释液包括25.0～30.0g/L的葡萄糖、2.0～2.7g/L的EDTA二钠、6.5～7.5g/L的柠檬酸钠、2.5～3.5g/L的柠檬酸、0.5～1.5g/L的碳酸氢钠、5.0～6.0g/L的Tris、50～150万IU/L的青霉素、50～150万IU/L的链霉素、20～60万IU/L的多黏菌素和2.5～5.0mmol/L的L-精氨酸。
5.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述混合具体包括以下步骤：将采集的新鲜猪精液用所述稀释液进行稀释，将猪精子的密度稀释至0.5～1.0×108个/mL。
6.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述稀释液在与猪精液混合前预先加热至37～38.5℃。
7.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述猪精液的精子活率在80％以上。
8.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述保存的时间至少为7天。
9.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述稀释液与猪精液混合完成后于保存期间每间隔8～12小时混匀一次。
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