CN101825532A - 一种鱼类胚胎染色体制片方法 - Google Patents

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涉及到遗传工程的一种鱼类胚胎染色体制片方法，它是将原肠中期至原肠晚期的鱼卵取出100-200粒后用鱼用生理盐水清洗两次除去卵膜和卵黄后加入含有秋水仙素的1640培养液进行细胞培养，再用击打的方法使细胞混匀，最后加入固定剂固定后让其干燥直至用染色母液染色。本发明克服了传统方法费时费力，不能批量制作的缺陷，提高了制片结果的稳定性和诱导率的准确性，为鱼类的遗传育种和品种改良提供了可靠的保证。

Description

一种鱼类胚胎染色体制片方法
技术领域
本发明涉及到遗传工程，特别是涉及到鱼类胚胎染色体标本的制作方法。
背景技术
把生物工程的新技术用于鱼类的遗传育种和品种改良，是渔业上的一个发展方向，特别是多倍体诱导等以染色体为操作对象的鱼类细胞工程，已展示出广阔的应用前景。目前，鱼类胚胎期倍性检测的方法主要有单胚胎制片法和混合胚胎制片法。单胚胎制片法的优点是可以准确鉴定单个胚胎倍性，不足之处是操作精细、费时费力，当需要鉴定的胚胎数量很多时，这种方法的应用受到了限制，如计算诱导率时至少需30个以上的胚胎，传统的混合胚胎制片方法可以解决大规模制片的问题，但取样时需要将每个鱼卵剥卵膜、去卵黄，操作非常不便，比较费时，而且取样的囊胚期和原肠期是胚胎死亡的高峰期，由于取样时间过长会导致样品大量死亡，它不仅影响制片结果的稳定性，甚至导致实验失败。
发明内容
本发明的目的是提出一种快速稳定的鱼类胚胎染色体制片方法，它是一种简单、快速、稳定且能批量生产的鱼类胚胎染色体标本的制作方法。
本发明的技术方案是以如下的方式实现的：
本发明的操作方法是：
(1)取样：最佳取样时间为鱼类原肠中期至原肠晚期，过早或过迟都会影响制片效果，取样数量为取鱼卵100-200粒，数量过多将不利于卵黄的清除，影响染色效果，所取的鱼卵都要发育良好，尽量剔除其中的坏卵，样品取好后放入10ml烧杯中，用0.75％生理盐水清洗两次，清洗时用大口吸管吹打，尽量除去表面污物；
(2)细胞培养、收集；样品清洗后，将生理盐水倒掉，再加入3-5ml含10微克/毫升秋水仙素的1640细胞培养液处理45-60分钟，处理期间用镊子每次可将多个鱼卵一起夹破，使胚胎细胞游离出来，鱼卵全部夹破后用吸管吹打成悬液，再用吸管将胚胎细胞转移到5ml的离心管中，转管时用100目的筛绢网过滤，除去其中的卵膜和部分的卵黄物质，然后补加1640细胞培养液至5ml，处理过程中，每隔20分钟用吸管吹打一次，处理结束后离心，离心速度为700-1000rpm/min，时间为4-5分钟；
(3)低渗：离心结束后，轻轻吸取上清液倒掉，仅留0.3-0.6ml细胞沉淀，然后再将沉淀击打均匀，击打方法为左手握紧心管，右手食指用力击打离心管底部，利用离心管中液体的回旋力将细胞冲散混匀，再加入4-5ml0.0375mol/L氯化钾低渗溶液并吸打均匀，静置20-30分钟后低渗结束并加入0.5-1ml固定沉淀剂，其固定剂为甲醇与冰乙酸按体积比3∶1配制，再用吸管吹打均匀后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为5分钟；
(4)固定：先吸取离心管中的上清液倒掉后留下的0.2-0.5ml沉淀加入0.1-0.5ml固定剂，将沉淀按照上述击打方法击打均匀，击打时用力要适度，不可过大，以免细胞破裂，再加2-3ml甲醇与冰乙酸按体积比3∶1配制的固定剂，用吸管吹打均匀，静置20分钟后离心，其离心速度为1000rpm/min，时间为5-6分钟，再吸取上清液倒掉后重复固定操作一次；
(5)滴片：固定操作结束后，吸取上清液倒掉，将离心管中的0.1-0.3ml沉淀按照上述击打方法击打均匀，再加入重新按甲醇与冰乙酸按体积比3∶1配制的固定剂至0.5ml刻度处，吹打均匀，取冷冻玻片使之成40-45°角，吸取细胞悬液在冷冻玻片上滴2-3滴，并轻轻吹动，使细胞散开，待其自然干燥；
(6)染色：Giemsa染色。
本发明的优点是：
1、本发明在取样方法上不需要剥卵膜、去卵黄，操作简单高效，大大缩短了取样时间，保证了各个处理组的同步取样和同步制片，克服了传统方法费力、费时，不能批量制作的缺点；
2、本发明取样时间缩短、胚胎细胞的存活率大大提高，保证制片结果的稳定性和诱导性的准确性；
3、本发明用1640细胞培养液取代生理盐水进行细胞培养，大大提高了胚胎细胞细胞存活率，其细胞混匀方法用击打取代吸管吹打，不仅快速简单，节省了时间，且细胞混匀的效果更好。
具体实施方式
参看下述实施例，对本发明作进一步说明。
实施例：
用具和试剂：5ml锥形刻度离心管，吸管，大口吸管，镊子，冷冻玻片，10ml烧杯，RPMI 1640细胞培养液，鱼用生理盐水：0.75％氯化钠溶液，秋水仙素溶液100微克/毫升，低渗溶液：0.0375mol/L氯化钾溶液，固定剂：甲醇和冰醋酸按体积比3∶1混匀，Giemsa染色母液。
其操作方法如下：
(1)取样：取黄颡鱼鱼卵100粒，放入10ml烧杯中，用0.75％鱼用生理盐水清洗两次，清洗时用大口吸管吹打，除去表面污物；
(2)细胞培养和收集：样品清洗完毕后，将鱼用生理盐水倒掉，再加入4ml含10微克/毫升秋水仙素的1640细胞培养液，处理60分钟，处理期间用镊子将多个鱼卵一起夹破，使胚胎细胞游离出来，鱼卵全部然夹破后用大口吸管吹打成悬液，处理过程中，每隔20分钟用大口吸管吹打一次，处理结束后再用吸管将胚胎细胞转移到5ml的离心管中，转管时用100目的筛绢网过滤，除去其中的卵膜和部分的卵黄物质，然后在离心管中补加细胞培养液至5ml后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为5分钟；
(3)低渗：离心结束后，轻轻吸取上清液倒掉，仅留0.5ml细胞沉淀，将左手握紧离心管，右手食指用力击打离心管底部，使离心管中的细胞冲散混匀，再加入4ml0.0375mol/L氯化钾低渗溶液，静置25分钟后低渗结束并加入0.5ml固定剂，用吸管吸打均匀后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为5分钟；
(4)固定：吸取离心管中上清液倒掉，加入0.1ml固定剂后将离心管中的0.2ml沉淀按照上述击打方法击打均匀，击打时用力要适度，不可过大，以免细胞破裂，再在离心管中加入3ml固定剂并吹打均匀，静置20分钟后离心，其离心速度为1000rpm/min，时间为6分钟，然后将固定重复操作一次；
(5)滴片：两次固定操作结束后，再将离心管中的0.15ml沉淀按照上述击打方法击打均匀后加入新配制的甲醇和冰醋酸按体积比3∶1混匀的固定剂至0.5ml刻度处，并吹打均匀，取冷冻玻片使之成45°角，吸取细胞悬液在冷冻玻片上滴2-3滴，并轻轻吹动，使细胞散开，待其自然干燥；
(6)染色：用Giemsa母液染色。

Claims (1)

1.涉及遗传工程的一种鱼类胚胎染色体制片方法，其特征是：
(1)取样：取样时间为鱼类原肠中期至原肠晚期，取样量为发育良好的鱼卵100-200粒，放入10ml烧杯中，用0.75％的鱼用生理盐水清洗两次，清洗时用大口吸管吹打，尽量除去表面污物；
(2)细胞培养和收集：样品清洗完毕后，倒掉鱼用生理盐水，加入3-5ml含10μg/ml秋水仙素的1640细胞培养液处理45-60分钟，处理期间用镊子每次将多个鱼卵夹破，使胚胎细胞游离出来，鱼卵全部夹破后用吸管吹打成悬液，再用吸管将悬液转移到5ml的离心管中，转管时用100目的筛绢网过滤除去卵膜和卵黄，然后补加细胞培养液至5ml，处理期间，每20分钟用吸管吹打一次，结束后离心，离心速度为700-1000rpm/min，时间为4-5分钟；
(3)低渗：离心结束后，吸除上清液，仅留0.3-0.5ml细胞沉淀击打均匀，击打方法为左手握紧离心管，右手食指用力击打离心管底部将细胞冲散混匀，再加入4-5ml 0.0375mol/L氯化钾低渗液，吸打均匀，静置20-30分钟后，加入0.5-1ml固定剂，其固定剂为甲醇与水乙酸按体积比3∶1配制，再用吸管吹打均匀后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为5分钟；
(4)固定：吸除上清液，加入0.1-0.5ml固定剂，将0.2-0.5ml沉淀按照上述击打方法击打均匀，再加2-3ml固定剂吹打均匀，静置20分钟后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为6分钟。重复固定操作一次；
(5)滴片：两次固定操作结束后，吸除上清液，将0.1-0.3ml沉淀按照上述击打方法击打均匀，加入0.5-1ml重新按甲醇与水乙酸按体积比3∶1配制的固定剂吹打均匀，取冷冻玻片使之成40-45°角，吸取细胞悬液在冷冻玻片上滴2-3滴，并轻轻吹动，使细胞铺散开，待其自然干燥；
(6)染色：Giemsa染色。
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