CN105624304A - 一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法 - Google Patents

一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及幼鱼性腺mRNA原位杂交技术，具体的说是一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。取洗涤后样品经过量浓度为4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于-20℃保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30％蔗糖沉降；上述沉降样品经OCT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的标记。本发明的实施能够清晰地描述牙鲆相关基因在性腺中的定位(mRNA水平)，取得了突破性的进展。

Description

一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法
技术领域
本发明涉及幼鱼性腺mRNA原位杂交技术，具体的说是一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。
背景技术
牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。牙鲆具有雄鱼比雌鱼生长快、个体大的特点，牙鲆已逐步在性别决定与分化研究领域成为海水经济鱼类模式物种，研究其性别决定与分化的机制，确定性别决定与分化相关的基因，并以此为基础，对其实施性别控制，具有重要的理论和实践意义。通过牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交可以解析性别决定和分化相关基因的表达模式及相互关系，但是牙鲆幼鱼早期性腺较小、分离困难，而性腺组织较大时期难以直接进行性腺原位杂交，使得该技术难以应用。因此建立牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，对于牙鲆性别决定和分化相关规律的阐述具有重要的意义；另外本发明在其它鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
发明内容
本发明在于提供一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法：
1)取洗涤后样品经过量浓度为4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于-20℃保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；
2)上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30％蔗糖沉降；
3)上述沉降样品经OCT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的标记。
所述样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长<60.0mm的取其整个腹部；幼鱼全长>60.0mm直接剥离性腺，取样后无RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用。
所述经固定后保存的腹部样品去除多余内脏；经固定后保存的性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成约5mm。
具体待做原位杂交前，将上述固定后保存样品进行进一步处理(腹部样品尽量去除多余内脏，性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成5mm左右大小)，以获得原位杂交样品；
将原位杂交样品依次经体积比3：2和2：3的，浓度为100％甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min，复水处理后用过量的无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37℃处理消化10-30min，消化后经过量的4％PFA溶液再固定20-60min，再固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后样品在过量预杂交液中于50-70℃预杂交2-5h。
所述无RNA酶的1×PBST缓冲液成分为：136.89mMNaCl，2.67mMKCl，8.24mMNa2HPO4，1.76mMKH2PO4，0.1(v)％Tween-20，由无RNA酶水配置，PH7.4。
所述预杂交液为50(v)％去离子甲酰胺，25(v)％20×SSC(生工，中国)，50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0.1(v)％Tween-20，1M的柠檬酸460μl，加无RNA酶的水定容至50ml。
所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓度为1-2ng/μl，再将其置于80℃变性30min，变性后，待用。
所述探针为RNA探针，是以在性腺内表达基因的cDNA为模板构建探针载体，在体外转录合成的带有地高辛标记的、并与该基因的核苷酸序列互补结合的一段单链cRNA分子。其中，nr5a2、nr0b1、cyp19a、dmrt1、foxl2等性腺发育相关基因均可用来构建并合成RNA探针。
样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长<60.0mm的取其整个腹部；幼鱼全长>60.0mm直接剥离性腺，取样后无RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用。
所述预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜，然后依次于50-70℃下用过量的体积比为1:1的不含肝素和酵母tRNA的预杂交液和2×SSC的混合液洗涤30-60min，洗涤后用过量2×SSC洗涤30-60min，再用含0.1CHAPS的0.2×SSC洗涤两次，每次30-60min；最后在室温下用MAB溶液洗涤5-10min。
所述杂交处理洗涤后样品用封闭液于室温下水平摇床封闭2-4h，而后加入碱性磷酸酶抗体在4℃孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30％蔗糖沉降。
所述封闭液为含10％羊血清、2％封闭剂的1×MAB。
本发明具有如下优点：
本发明在牙鲆幼鱼中运用性腺mRNA原位杂交的技术结合杂交后冰冻切片的方法来获得相关基因在不同性腺发育时期的表达模式，解决了牙鲆幼鱼早期性腺较小、分离困难，而性腺组织较大时期难以直接进行性腺原位杂交的难题，将有助于进一步阐述牙鲆性别决定和分化的相关规律；另外本发明在其它鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例提供的牙鲆nr5a2基因在幼鱼(全长<60.0mm)性腺中的mRNA原位表达的示意图。其中，nr5a2在全长4cm牙鲆幼鱼(人工雌核发育诱导牙鲆，用雌二醇诱导)性腺中的表达模式，箭头所指位置是性腺。
图2为本发明实施例提供的牙鲆cyp19a基因在幼鱼(全长>60.0mm)卵巢中的原位表达的示意图。其中，牙鲆cyp19a基因在卵巢中的表达模式，星号所指位置是卵原细胞，短箭头所指位置是滤泡细胞，长箭头所指位置是卵母细胞。
图3为本发明实施例提供的牙鲆dmrt1基因在幼鱼(全长>60.0mm)精巢中的原位表达的示意图。其中，牙鲆dmrt1基因在精巢中的表达模式，长箭头所指位置是精母细胞，短箭头所指位置是支持细胞。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明的实验步骤。
本发明解决了牙鲆幼鱼性腺原位杂交困难的问题，包括幼鱼早期性腺过小难于解剖获取和性腺组织较大时期难于直接进行性腺原位杂交的问题，本发明的实施能够清晰地描述牙鲆相关基因在性腺中的定位(mRNA水平)，取得了突破性的进展；另外本发明在其它鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
实施例1
1.取样，洗样。
样品为一条全长小于60.0mm的幼鱼取其整个腹部样品；将样品用无RNA酶的1×PBS缓冲液(1×PBS缓冲液成分为136.89mMNaCl，2.67mMKCl，8.24mMNa2HPO4；1.76mMKH2PO4,由无RNA酶水配置，PH7.4)漂洗；
2.固定。洗涤以后的上述样品置于无RNA酶离心管中，样品与浓度为4％的PFA按体积为1:10混合，而后颠倒混匀以后，平放于4℃，固定10h。所述PFA由4gPFA溶解于100ml无RNA酶的1×PBS缓冲液得到。
3.长期保存。将上述固定处理的样品用100％甲醇溶液漂洗两次，而后置换于4％PFA溶液中，置于-20℃长期保存。
4.解剖。将上述固定后保存样品尽量去除多余内脏进行进一步处理，以获得原位杂交样品。
5.复水。将上述获得原位杂交样品依次经体积比3：2和2：3的，浓度为100％甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理30min；洗涤后再用100％1×PBST洗涤四次，每次30min。
6.蛋白酶K消化。经上述复水后得样品用蛋白酶K(10μg/ml)于37℃处理15min。
7.再固定。经上述消化后样品用4％PFA溶液漂洗一次，再用4％PFA溶液于室温水平摇床上再固定60min。
8.洗涤。固定处理后在用100％无RNA酶PBST漂洗一次，而后再用100％无RNA酶PBST洗涤五次，每次10min。
9.预杂交。上述洗涤后样品及400μl预杂交液加入至1.5ml无RNA酶离心管，于65℃杂交炉进行预杂交，预杂交4h。
所述预杂交液(以50ml为例)：50(v)％去离子甲酰胺，25(v)％20×SSC(生工，中国)，50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0.1(v)％Tween-20，1M的柠檬酸460μl，加无RNA酶水至50ml。
10.杂交：用预杂交液将探针稀释至终浓度2ng/μl，80℃变性30min；每1.5ml离心管中加入洗涤后所有样品，再加入200μl变性好的探针，于65℃杂交过夜。
构建nr5a2探针载体的引物序列如下：
F:5’-AAGATCCTGGCGTACCTG-3’
R:5’-ACTCGCTCTTTGTCCTTCA-3’
11.杂交后洗涤。
1)杂交处理后于65℃下用过量的50(v)％50(v)％预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)：50(v)％2×SSC混合液洗涤一次，60min；
2)65℃下用过量的2×SSC洗涤一次，60min；
3)65℃下用过量的含0.1CHAPS的0.2×SSC洗涤两次，每次60min；
4)室温下用1×MAB溶液(1×MAB溶液为100mM马来酸，150mMNaCl，pH7.5)洗涤一次，10min。
12.封闭。洗涤后每管加入500μl封闭液(封闭液为1×MAB中加入10％羊血清，2％封闭剂(Roche,美国)，室温下封闭4h。
13.抗体孵育。封闭后加入一抗(按照1:2000用封闭液进行稀释)，4℃孵育过夜。
14.洗涤。
1)抗体孵育后用100％PBST缓冲液快速漂洗1次；
2)快速漂洗后再用100％PBST缓冲液洗涤6次，每次30min；
3)洗涤后用过量的碱性磷酸盐缓冲液(碱性磷酸盐缓冲液为0.1MTris,pH9.5；50mMMgCl2；0.1MNaCl,0.1％Tween-20)洗2次，每次10min；
15.显色。洗涤后用BCIP/NBT避光显色，每30min解剖镜下观察显色反应；
16.终止显色。待样品出现较强紫色杂交信号时，终止显色，终止显色后用过量1×PBST缓冲液漂洗数次，漂洗后再用过量4％PFA溶液固定10h，之后用100％PBST缓冲液漂洗数次。
17.蔗糖沉降。将步骤16的样品经移至含30％蔗糖的1×PBS中至沉降；
18.沉降后按照现有方式用OCT包埋，而后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原定杂交的标记(参见图1)。
由图1可见nr5a2在牙鲆原始性腺中有所表达。
实施例2
1.取样，洗样。
样品为一条全长大于60.0mm的幼鱼直接剥离性腺样品，将样品用无RNA酶的1×PBS缓冲液(1×PBS缓冲液成分为136.89mMNaCl，2.67mMKCl，8.24mMNa2HPO4；1.76mMKH2PO4,由无RNA酶水配置，PH7.4)漂洗；
2.固定。洗涤以后的上述样品置于无RNA酶离心管中，样品与浓度为4％的PFA按体积为1:10混合，而后颠倒混匀以后，平放于4℃，固定10h。
3.长期保存。将上述固定处理的样品用100％甲醇溶液漂洗两次，而后置换于4％PFA溶液中，置于-20℃长期保存。
4.解剖。将上述固定后保存样品进行进一步处理(性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成5mm左右大小)，以获得原位杂交样品。
5.复水。将上述获得原位杂交样品依次经体积比3：2和2：3的，浓度为100％甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理30min；洗涤后再用100％PBST洗涤四次，每次30min。
6.蛋白酶K消化。经上述复水后得样品用蛋白酶K(10μg/ml)于37℃处理15min。
7.再固定。经上述消化后样品用4％PFA溶液漂洗一次，再用4％PFA溶液于室温水平摇床上再固定60min。
8.洗涤。固定处理后在用100％无RNA酶PBST漂洗一次，而后再用100％无RNA酶PBST洗涤五次，每次10min。
9.预杂交。上述洗涤后样品及400μl预杂交液加入至1.5ml无RNA酶离心管，于65℃杂交炉进行预杂交，预杂交4h。
所述预杂交液(以50ml为例)：50(v)％去离子甲酰胺，25(v)％20×SSC(生工，中国)，50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0.1(v)％Tween-20，1M的柠檬酸460μl，加无RNA酶水至50ml。
10.杂交：用预杂交液将探针稀释至终浓度2ng/μl，80℃变性30min；每1.5ml离心管中加入洗涤后所有样品，再加入200μl变性好的探针，于65℃杂交过夜。
探针为cyp19a探针或dmrt1探针
构建cyp19a探针载体的引物序列如下：
F:5’-TGTGTCTCTCTGGAAAAAGATACGC-3’
R:5’-AGGATGATGTTTGTGCCCTTTGGTA-3’
构建dmrt1探针载体的引物序列如下：
F:5’-ACAAGGACAAGCAGAGCAGGCAGG-3’
R:5’-CGATGGTGGTGTTGATGGAGAAGTC-3’
11.杂交后洗涤。
1)杂交处理后于65℃下用过量的50(v)％50(v)％预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)：50(v)％2×SSC混合液洗涤一次，60min；
2)65℃下用过量的2×SSC洗涤一次，60min；
3)65℃下用过量的含0.1CHAPS的0.2×SSC洗涤两次，每次60min；
4)室温下用1×MAB溶液(1×MAB溶液为100mM马来酸，150mMNaCl，pH7.5)洗涤一次，10min。
12.封闭。洗涤后每管加入500μl封闭液(1×MAB中加入10％羊血清，2％封闭剂(Roche,美国)，室温下封闭4h。
13.抗体孵育。封闭后加入一抗(按照1:2000用封闭液进行稀释)，4℃孵育过夜。
14.洗涤。
1)抗体孵育后用100％PBST缓冲液快速漂洗1次；
2)快速漂洗后再用100％PBST缓冲液洗涤6次，每次30min；
3)洗涤后用过量的碱性磷酸盐缓冲液(碱性磷酸盐缓冲液为0.1MTris,pH9.5；50mMMgCl2；0.1MNaCl,0.1％Tween-20)洗2次，每次10min；
15.显色。洗涤后用BCIP/NBT避光显色，每30min解剖镜下观察显色反应；
16.终止显色。达到理想色度后，终止显色，终止显色后用过量1×PBST缓冲液漂洗数次，漂洗后再用过量4％PFA溶液固定10h，之后用100％PBST缓冲液漂洗数次。
17.蔗糖沉降。将步骤16的样品经移至含30％蔗糖的1×PBS中至沉降；
18.沉降后用OCT包埋，而后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原定杂交的标记(参见图2或3)。
由图2可见cyp19a在牙鲆卵巢卵母细胞中表达量较强，在滤泡细胞和卵原细胞也有表达。
由图3可见dmrt在牙鲆精巢支持细胞和精母细胞处均有表达。

Claims (9)

1.一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：
1)取洗涤后样品经过量浓度为4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于-20℃保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；
2)上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30％蔗糖沉降；
3)上述沉降样品经OCT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的标记。
2.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长<60.0mm的取其整个腹部；幼鱼全长>60.0mm直接剥离性腺，取样后无RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用。
3.按权利要求1或2所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述经固定后保存的腹部样品去除多余内脏；
或，经固定后保存的性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成约5mm。
4.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：将原位杂交样品依次经体积比3：2和2：3的，浓度为100％甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min，复水处理后用过量的无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37℃处理消化10-30min，消化后经过量的4％PFA溶液再固定20-60min，再固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后样品在过量预杂交液中于50-70℃预杂交2-5h。
5.按权利要求4所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述预杂交液为50(v)％去离子甲酰胺，25(v)％20×SSC，50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0.1(v)％Tween-20，1M的柠檬酸460μl，加无RNA酶的水定容至50ml。
6.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓度为1-2ng/μl，再将其置于80℃变性30min，变性后，待用。
7.按权利要求1、4或6所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜，然后依次于50-70℃下用过量的体积比为1:1的不含肝素和酵母tRNA的预杂交液和2×SSC的混合液洗涤30-60min，洗涤后用过量2×SSC洗涤30-60min，再用含0.1％CHAPS的0.2×SSC洗涤两次，每次30-60min；最后在室温下用MAB溶液洗涤5-10min。
8.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述杂交处理洗涤后样品用封闭液于室温下水平摇床封闭2-4h，而后加入碱性磷酸酶抗体在4℃孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30％蔗糖沉降。
9.按权利要求8所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述封闭液为含10％羊血清、2％封闭剂的1×MAB。
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