CN107868834A

CN107868834A - 一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量pcr检测引物组及方法

Info

Publication number: CN107868834A
Application number: CN201711260546.0A
Authority: CN
Inventors: 陈叶雨; 刘亚; 龙治海; 林珏; 龚全; 赖见生; 杜军; 宋明江
Original assignee: FISHERIES INSTITUTE SICHUAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: FISHERIES INSTITUTE SICHUAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: CN107868834B

Abstract

本发明公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组及方法。该引物组包括SOX9引物对、FST引物对、DF引物对或β‑actin引物对。该检测方法包括以下步骤：提取待测达氏鲟样品RNA，以总RNA作为模板，合成待测达氏鲟样品cDNA；以待测达氏鲟样品cDNA为模板，加入上述达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组，进行实时荧光定量PCR检测，根据琼脂糖凝胶电泳结果和扩增产物溶解曲线检测扩增产物。本发明实时定量PCR目的基因及内参基因的引物、定量PCR检测方法不仅适用于达氏鲟，也可用于同属亲缘关系相近的其余鲟鱼，为今后鲟鱼性别鉴定，性别决定基因及性别决定机制的研究提供依据。

Description

一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组及方法。

背景技术

达氏鲟(Acipenser dabryanus)俗称长江鲟，隶属鲟形目、鲟科、鲟属，是我国长江流域特有淡水定居种类。近年来，由于过度捕捞、栖息地破坏以及环境污染等元素，达氏鲟的野生种群急剧下降。自1982年以来，长江流域所捕获的达氏鲟仅有150尾左右，而自1995年后，长江流域葛洲坝下游已经没有野生达氏鲟的报道。所以，达氏鲟于1988年被列为国家一级重点保护动物，后被世界自然与资源保护联盟红色名录列为极度濒危物种，具有较高的经济价值和科研价值。达氏鲟的性成熟年龄较长，雄性为4～7龄，雌性为6～8龄。

鲟鱼没有第二性征，外部特征不足以进行性别鉴别，而且鲟鱼性成熟时间较长，性成熟年龄一般都在5龄以上。这对于野生鲟鱼资源的保护、增殖及其人工养殖业的发展带来了极大的困难。因此，性别鉴别成为鲟鱼野生资源保护及人工养殖过程中的热点和焦点问题。一般来讲，获得鲟鱼性别相关信息通常是进行解剖，取出性腺进行观察或者组织切片鉴定，这样既浪费时间而且其准确性受到个体大小及性腺发育阶段的影响。

实时荧光定量PCR是对特定核酸序列进行准确定量的方法，它不仅操作简便、快速高效，还具有极高的灵敏性、重复性和特异性。该技术已被广泛应用于分子生物学研究的各个领域。目前，现有技术中还没有通过定量PCR分析达氏鲟性腺差异基因表达情况的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组及方法，本发明通过定量PCR对达氏鲟进行性腺差异基因表达情况的分析，将有利于今后通过分子技术鉴定达氏鲟性别，同时为今后达氏鲟性别决定基因的研究及性别决定机制的探索奠定理论基础。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组，包括SOX9引物对、FST引物对、DF引物对或β-actin引物对；其中，

所述SOX9引物对包括引物SOX9-F和引物SOX9-R，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示；

所述FST引物对包括引物FST-F和引物FST-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

所述DF引物对包括引物DF-F和引物DF-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；

所述β-actin引物对包括引物β-actin-F和引物β-actin-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

本发明还公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测达氏鲟样品RNA，以总RNA作为模板，合成待测达氏鲟样品cDNA；

(2)以待测达氏鲟样品cDNA为模板，加入上述的达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组，进行实时荧光定量PCR检测，根据琼脂糖凝胶电泳结果和扩增产物溶解曲线检测扩增产物；

当检测结果中SOX9、FST、DF或β-actin有预期溶解曲线，表明该待测样品中含有SOX9、FST、DF或β-actin成分；如果不出现预期扩增曲线，则不含上述SOX9、FST、DF或β-actin成分。

进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green qPCRMaster Mix 10μL，引物SOX9-F 0.5μL，引物SOX9-R 0.5μL，或者引物FST-F 0.5μL，引物FST-R 0.5μL，或者引物DF-F 0.5μL，引物DF-R 0.5μL，或者引物β-actin-F 0.5μL，引物β-actin-R 0.5μL，待测达氏鲟样品模板1.0μL；RNase Free Water 8.0μL。

进一步地，所述荧光定量PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，70～95℃采集信号，40个循环。

本发明还公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上述的达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明提供的实时定量PCR目的基因及内参基因的引物、定量PCR检测方法不仅适用于达氏鲟，也可用于同属亲缘关系相近的其余鲟鱼，为今后鲟鱼性别鉴定，性别决定基因及性别决定机制的研究提供依据。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明SOX9基因实时荧光定量PCR熔解曲线；

图2是本发明FST基因实时荧光定量PCR熔解曲线；

图3是本发明DF基因实时荧光定量PCR熔解曲线；

图4是本发明内参基因β-actin实时荧光定量PCR熔解曲线。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1目的检测基因和内参基因的选择：

1、达氏鲟样品收集及RNA提取：

从四川省水产研究所挑选健康、性腺已分化的达氏鲟，解剖取其性腺鉴定其性别，剩余样品进行total RNA的提取，具体步骤如下：(1)将达氏鲟性腺组织约30mg放入预冷的研钵中，利用液迅速研磨成粉末，放入1.5mL离心管中，并加入1mLTRIzol；(2)离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min；(3)4℃，12,000r/min离心10min，吸取上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min；(5)4℃，12，000r/min离心10min，弃去上清，小心吸去剩余异丙醇；(6)加入1mL 75％的乙醇，充分洗涤沉淀，4℃，7，500r/min离心1min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该步骤；(7)室温晾干乙醇，加入20μL DEPC处理水使RNA充分溶解；(8)取1uL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用紫外分光光度仪检测RNA浓度和质量。

2、cDNA第一链合成：以步骤1所述总RNA作为模板，使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA，作为后续定量PCR的模版，步骤如下：

(1)将试剂盒中各组分融化、混匀、离心、储存在冰上。

(2)在无菌、无RNase的离心管中加入以下个成分：Total RNA 6μL；Oligo(DT)₁₈primer 1μL；Nuclease-free Water 5uL。

(3)按顺序加入以下组分：5×Raction Buffer 4μL；Ribolock^TmRNase Inhibitor1μL；10mM dNTP Mix 2μL；RevertAid^Tm M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL。

(4)温和混匀，离心。

(5)42℃温浴60min。

(6)70℃热激5min。

根据转录组测序结果，利用FPKM法筛选转录组文库中差异表达基因。利用文献已报道的与性别决定相关的基因作为目的基因，在达氏鲟性腺文库中共筛选到48个相对应的基因。其中，性腺差异表达基因(Sex determining region Y-box 9，SOX9)(SEQ ID NO.1所示)、卵泡抑素(Follistatin，FST)(SEQ ID NO.2所示)和分化因子(Differentiationfactor，DF)(SEQ ID NO.3所示)在达氏鲟雌、雄性腺转录组中表达量差异显著，因此作为定量PCR的目的检测基因，肌动蛋白β-actin(SEQ ID NO.4所示)作为内参基因。

实施例2达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测方法的建立：

1、引物设计：

根据SOX9、FST和DF在转录组unigene基因的序列，使用Primei5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物，内参基因β-actin也根据转录组unigene结果设计引物，引物情况如下表1所示：

表1适用于荧光定量PCR检测的特异性引物

琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的长度与预计产物长度一致，测序确定为所检测的目的基因(SEQ ID NO.1-4所示)，如图1-4所示，从图1可以看出，SOX9基因的熔解曲线为单一的峰，说明引物具有很好的特异性，引物可用。从图2可以看出，FST基因的熔解曲线为单一的峰，说明引物具有很好的特异性，引物可用。从图3可以看出，DF基因的熔解曲线为单一的峰，说明引物具有很好的特异性，引物可用。从图4可以看出，β-actin基因的熔解曲线为单一的峰，说明引物具有很好的特异性，引物可用。说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测。

2、采用实施例1中1的方法对待测达氏鲟样品进行收集和RNA提取；

3、采用实施例1中2的方法制备cDNA模板：

4、配制实时荧光PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应体系设置如下：SYBR Green qPCR Master Mix 10μL；引物SOX9-F 0.5μL，引物SOX9-R 0.5μL(或者，引物FST-F 0.5μL，引物FST-R 0.5μL，或者，引物DF-F 0.5μL，引物DF-R 0.5μL，或者，引物β-actin-F 0.5μL，引物β-actin-R 0.5μL)，cDNA1.0μL；RNase Free Water 8.0μL。

实时荧光定量PCR反应程序设置如下：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，70～95℃采集信号，40个循环。

以cDNA为模板，采用上述达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组，进行实时荧光定量PCR检测，扩增基因。

5、进行实时荧光PCR反应：

实时荧光定量PCR采用Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行。以上述(1)中引物为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复。

6、判断标准：

样品扩增产物溶解曲线显示单峰，且扩增产物经测序为目标序列(SEQ ID NO.1-4所示)，则样本中扩增出了相应的基因。

综上所述，本发明开发出了3个达氏鲟雌雄性腺差异表达基因的特异性qPCR引物及一个内参基因β-actin的qPCR引物，在达氏鲟组织样品中扩增产物溶解曲线显示单峰，引物可用，为今后达氏鲟性别决定基因的研究及性别决定机制的探索奠定了基础。

实施例3定量PCR结果统计：

下表2为SOX9，DF和FST三个基因在定量PCR和转录组测序中的表达量结果对比。

计算公式如下：

ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(β-actin基因)

ΔΔCt＝ΔCt(雄性样本)-ΔCt(雌性样本)

以2^-ΔΔCt数值表示目的基因的相对表达量。

表2转录组测序与定量PCR的结果对比

FPKM为转录组测序的表达量，qPCR为定量PCR的表达量；T：精巢；O：卵巢。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川省农业科学院水产研究所

<120> 一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测方法

<130> 2017

<141> 2017-12-04

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 342

<212> DNA

<213> 性腺差异表达基因(SOX9)

<400> 1

atgcggtttc ccaggtgctg aagggctatg actggaccct ggtacccatg cccgtgcggg 60

tgaacggaag cagcaaaaac aagcctcacg ttaagagacc aatgaatgcg ttcatggtgt 120

gggctcaggc tgccaggaga aagctggcag accagtaccc gcatcttcac aacgcagagc 180

tcagcaaaac actcgggaaa ctttggagat tgctcaacga aggcgagaag cgtcccttcg 240

ttgaagaggc agagagactg agggtgcagc acaagaaaga ccaccccgat tacaagtacc 300

agccgaggag aaggaagtct gtgaagaacg ggcagaatga ag 342

<210> 2

<211> 470

<212> DNA

<213> 卵泡抑素(follistatin)

<400> 2

tgtatggaag atcacagagc acaggctggt aattgctggc tacaacaggg caaaaacgga 60

aggtgtcagg ttctatacat gactgggctg agccgggaag aatgttgcgg aagcgggagg 120

ctgggaacgt cctggaccga ggaagacgtg ccgaacagta cgctttttag gtggatgatc 180

ttcaatggtg gagctccaca ctgtacacca tgcaaagaaa cctgcgacaa cgtagactgc 240

ggtttaggca aaaggtgcaa aatgaacaag aggaacaaac ctcgctgcgc ctgcgcgccc 300

gactgttcca acgttacttg gaaggggcct gtgtgtggat ccgatgggaa gacctacaaa 360

gacgagtgta ccttgctgaa ggccagatgc aaagggcacc cagaccttga agttcaatac 420

cagggcaaat gcaaaaaaac ctgccgggat gttctctgtc cgggcagttc 470

<210> 3

<211> 249

<212> DNA

<213> 分化因子(differentiation factor)

<400> 3

gcaagccgag tgcctccagc agatcaaagg ggttttcaca caagatctgt cgtacagctt 60

ggatcgcatg actgcccagg agcacctgct gaagtctgtt ctcctctact cgtttgagag 120

agcacccatg gctcctgttg tgtctgtctg tcatgtgcat ctcagtgagc aagcggctcc 180

tgatgagcaa gtctgctcga gcgcccagga ctccttccgc ttccacatcc gaatggagag 240

gaggaccag 249

<210> 4

<211> 181

<212> DNA

<213> 肌动蛋白(β-actin)

<400> 4

gaccgaggca cccctgaacc ccaaggctaa cagagagaag atgacgcaga taatgtttga 60

gaccttcaac actccagcca tgtatgtggc cattcaggcg gtgctgtccc tgtacgcctc 120

tggacgtacc actggtattg tcatggactc tggtgatggg gtcacacaca cagtgcccat 180

c 181

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atgcggtttc ccaggtgctg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cttcattctg cccgttcttc ac 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tgtatggaag atcacagagc acag 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gaactgcccg gacagagaac 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gcaagccgag tgcctccag 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ctggtcctcc tctccattcg 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gaccgaggca cccctgaac 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

gatgggcact gtgtgtgtga c 21

Claims

1.一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组，其特征在于，包括SOX9引物对、FST引物对、DF引物对或β-actin引物对；其中，

所述SOX9引物对包括引物SOX9-F和引物SOX9-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

所述FST引物对包括引物FST-F和引物FST-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示；

所述DF引物对包括引物DF-F和引物DF-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示；

所述β-actin引物对包括引物β-actin-F和引物β-actin-R，其核苷酸序列分别如SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

2.一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)以待测达氏鲟样品cDNA为模板，加入权利要求1所述的达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组，进行实时荧光定量PCR检测，根据琼脂糖凝胶电泳结果和扩增产物溶解曲线检测扩增产物；

3.根据权利要求2所述的达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green qPCR Master Mix 10μL，引物SOX9-F 0.5μL，引物SOX9-R 0.5μL，或者引物FST-F 0.5μL，引物FST-R 0.5μL，或者引物DF-F 0.5μL，引物DF-R 0.5μL，或者引物β-actin-F 0.5μL，引物β-actin-R 0.5μL，待测达氏鲟样品模板1.0μL；RNase Free Water 8.0μL。

4.根据权利要求2所述的达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，70～95℃采集信号，40个循环。

5.一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组。