CN110819696B - 一种dna探针的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种DNA探针的制备方法及其用途，即将载有目标序列的质粒通过酶切线性化后，通过荧光标记获得特殊的DNA探针。将获得的DNA探针进行荧光原位杂交检测，具有杂交信号强，背景杂信号弱等优势，适用于表达细胞中目标序列的定性、定量及相对定位等检测方面的应用。

Description

一种DNA探针的制备方法及其用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种DNA探针的制备方法及其用途。
背景技术
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入宿主细胞(如细菌、动植物细胞等)，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
哺乳动物细胞是目前生物制药产业中常用的宿主细胞，其中最常用的是中华仓鼠卵巢(Chinese-hamster ovary,CHO)细胞。通过把外源目的基因稳定整合到CHO细胞基因组上的高表达位点，实现重组蛋白的高产。为了进一步提高靶基因的表达水平，人们常常通过采用二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)缺陷型CHO细胞系，在甲氨蝶呤的存在下，驱动载体DHFR基因带动外源基因扩增。然而在重组蛋白大规模生产阶段，由于不能持续使用甲氨蝶呤，获得扩增的外源基因面临减少或丢失的风险，因此检测外源基因在CHO细胞基因组的整合状态成为必要要求。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)作为基因工程的重要手段，是一种直观、灵敏、特异、安全的基因检测和定位技术，被广泛应用于细胞遗传学分析、遗传病诊断、基因图谱绘制等研究领域。随着生物制药产业的发展，FISH也逐渐被应用于检测工程细胞株中外源基因的定位整合情况。作为检测外源基因整合的方法，FISH较PCR、qPCR、Southern blot、Northern blot等方法更为直观，并可实现精确定位。这对研究外源基因的位置效应、提高外源基因的表达效率具有重要意义。
探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键：用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。因此，为实现外源基因在表达用宿主细胞(如CHO细胞)中的定量、定性、定位检测，需要合适的DNA探针及相应的荧光原位杂交方法。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种DNA探针的制备方法，用于目标序列在表达用细胞中的定性、定量及相对定位分析检测。DNA探针的具体制备方法如下：
(1)质粒DNA提取：将质粒中含目标序列的菌液经过培养后，进行质粒DNA提取；
(2)酶切：用限制性内切酶对提取的质粒DNA进行酶切使之线性化；
(3)纯化及定量：对步骤(2)的酶切产物进行纯化，并对线性化的质粒DNA进行定量；
(4)荧光标记：对线性化质粒DNA进行荧光标记，获得DNA探针。
上述DNA探针以载有目标序列的质粒经过荧光标记制备而得，相比于以PCR扩增片段(PCR模板为载有目标序列的质粒)进行荧光标记制备而得的DNA探针，能更真实反映目标序列在细胞中的转染情况。
上述DNA探针的制备过程中，采用限制性内切酶将质粒DNA进行线性化后再进行荧光标记，能提高DNA探针的荧光标记效率和标记量，进而提高目标序列在表达用细胞中的检出强度。
作为优选，步骤(1)中的目标序列为编码融合蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为优选，步骤(1)中的质粒DNA中含有卡那霉素抗性基因；步骤(2)中的限制性内切酶为FspI。
卡那霉素抗性基因是一种应用广泛的抗性基因，在多种克隆载体或表达载体上都含有此抗性基因。卡那霉素抗性基因的核苷酸序列可以从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载，具体序列如SEQ ID NO：2所示。
上述DNA探针的制备过程中，采用特殊的限制性内切酶将质粒DNA进行线性化，酶切后的质粒DNA不会自连，避免DNA探针在后续的FISH检测过程中因自连而影响检测结果。
作为优选方式，在DNA探针的制备方法中，步骤(4)中所述荧光标记的方法为随机引物法；所述荧光标记的试剂为Biotin-16-dUTP，荧光标记时，带标记的dUTP与dTTP的加入比例为1:1～2:1，更优选的带标记的dUTP与dTTP的加入比例为2:1。
申请人在研究中发现：在荧光标记过程中，提高带标记的dUTP的量，会使更多带信号的dUTP取代正常dTTP的位置，使得FISH后期的信号放大有足够的位点进行染色，提高杂交信号强度；但不能继续提高带标记的dUTP的量，否则检测效果不佳，可能是因为带上了标记dUTP所占空间比例比正常dTTP大，过高的比例会使探针合成受阻不能形成完整的探针，从而影响检测结果。
本发明的另一个目的是提供一种通过上述DNA探针的制备方法制备而成的DNA探针。
本发明的另一个目的是提供一种上述DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的用途。所述的目标序列可以是编码一种蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白，也可以是编码两种及以上蛋白的核苷酸序列。所述的表达用细胞为细菌细胞、动物细胞或植物细胞。
作为优选方式，DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的用途，其检测包括以下步骤：
a.染色体玻片的制备：用秋水仙素处理细胞，经过低渗、固定处理后，制备获得染色体玻片；
b.DNA探针的制备：制备方法如上所述，获得DNA探针；
c.杂交：对DNA探针进行变性处理，对染色体玻片进行变性及脱水处理，将变性的DNA探针滴于已变性并脱水的玻片标本上，进行杂交，获得杂交标本；
d.荧光染色及信号放大：在杂交标本上依次加入荧光素标记的亲和素、生物素化的亲和素抗体、荧光素标记的亲和素分别进行反应，获得杂交信号放大的杂交标本，然后对杂交标本滴加与上述荧光素标记颜色不同的染色体复染剂进行复染；
e.荧光显微镜观察：将复染后的杂交玻片置于荧光显微镜下观察。
作为优选方式，上述用途的检测步骤中，染色体玻片的制备包括以下内容：
a1.收集用秋水仙素处理后的细胞；
a2.低渗处理：将收集的细胞用氯化钾溶液进行低渗处理；
a3.一次固定：将低渗后的细胞中加入固定液进行一次固定处理，一次固定后离心收集细胞；
a4.二次固定：将一次固定处理后的细胞中加入固定液进行二次固定处理，二次固定后离心收集细胞；
a5.染色体玻片制备：将二次固定处理后的细胞中加入固定液配制成细胞悬液，将细胞悬液滴于载玻片中央，晾干，即获得染色体玻片；
上述细胞为中华仓鼠卵巢细胞(即CHO细胞)。
在重组蛋白质表达方面，CHO细胞是经常使用的细胞系。并且，基于大规模表达中多方面的需要对原始CHO细胞进行改造，从而得到了一系列针对特定表达目的的用于重组蛋白生产的衍生CHO细胞系，例如用于无血清培养等，这些都是在重组蛋白质表达领域公知的。本申请中涉及的CHO细胞可以为原始CHO细胞，也可以为针对特定表达目的而进行改造的衍生CHO细胞系。
作为优选方式，上述用途的检测步骤中，固定液为甲醇与冰醋酸以体积比3:1混合的溶液；一次固定处理的方法为：在37℃下固定处理10min；二次固定处理的方法为：在37℃下固定处理10min。
上述检测步骤中，对CHO细胞进行两次固定，尤其对每次固定的时间进行优化，获得染色体铺展、形态效果更佳的染色体玻片，方便后期的荧光显微镜观察。
作为优选方式，上述检测步骤中，荧光素标记的亲和素为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链霉亲和素；生物素化的亲和素抗体为生物素化的抗链霉亲和素，染色体复染剂为DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)。如此优选方式，在荧光显微镜下观察时，染色体被DAPI标记发蓝色荧光，经FITC标记的DNA探针所在位置发出绿色荧光，具有更佳的信号放大效果，荧光显微镜观察效果好。
本发明提供的目标序列在表达用细胞中的检测方法，以载有目标基因的质粒通过酶切线性化后，通过荧光标记获得特殊的DNA探针，进行荧光原位杂交检测，具有杂交信号强，背景杂信号弱等优势，适用于目标序列在细胞中的定性、定量及相对定位等检测方面的应用。尤其适用于含编码融合蛋白基因的目标序列在表达用CHO细胞中的定性、定量及相对定位等检测应用。
附图说明
图1为实施例1中，实验组1获得的染色体玻片在显微镜下的结构图；
图2为实施例1中，实验组2获得的染色体玻片在显微镜下的结构图；
图3为实施例2中，实验组3获得的DNA探针，进行FISH检测时获得的FISH杂交融合图；
图4为实施例2中，实验组4获得的DNA探针，进行FISH检测时获得的FISH杂交融合图；
图5为实施例3中，实验组5获得的DNA探针，进行FISH检测时获得的FITC染色图；
图6为实施例3中，实验组6获得的DNA探针，进行FISH检测时获得的FITC染色图；
上述附图均为100倍物镜下的视图。
具体实施方式
现通过以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
1.1物料
Figure BDA0001764888890000041
Figure BDA0001764888890000051
1.2仪器
设备名称 型号 生产厂家
细胞CO2培养箱 MCO-15AC SANYO
超净工作台 AirTech 苏净
细胞计数仪 CoulterVi-CELL<sup>TM</sup>XR 贝克曼
离心机 SIGMA1-14 SIGMA
水浴锅 DRP-9162 上海森信
荧光显微镜 IX-51 OLYMPUS
1.3溶液配制：
低渗液(0.075M KCl溶液)：称取2.795g KCl，加超纯水500ml搅拌溶解，放置4℃保存备用。
固定液：甲醇与冰醋酸以体积比3:1混合，现用现配。
变性液(体积分数70％甲酰胺/2×SSC)：取35ml甲酰胺，5ml 20×SSC，10m1水混合，放置4℃保存备用。
洗脱液I(体积分数50％甲酰胺/2×SSC)：取100ml甲酰胺，20ml 20×SSC，80ml水混合，放置4℃保存备用。
杂交液：5ml去离子甲酰胺，2ml 50％硫酸葡聚糖，1ml 20×SSC，2ml超纯水，放置4℃保存备用。
洗脱液II：50ml 20×SSC，加水至500mL，加Tween20500μl混匀，放置4℃保存备用。
封闭液：5％BSA 3ml，20×SSC 0.5ml，ddH2O 1.5ml，Tween205μl混合，放置4℃保存备用。
秋水仙素储液：配制浓度为1mg/ml的储液，分装，放置-20℃保存备用。
实施例1：染色体玻片的不同制备方法
方法：用秋水仙素处理细胞，经过低渗处理后，采用不同的固定方法进行染色体玻片的制备。
实验组1：
a1.接种CHO细胞于6孔板(细胞活率不小于92％，接种密度8×105，2mL/孔，另多添加300μl培养基/孔)，置于37℃震荡培养箱16-18h后加入秋水仙素使其终浓度为0.5μg/ml，摇匀置37℃培养箱继续培养3～6h，终止培养收集细胞；
a2.低渗处理：将6孔板其中三孔细胞倒入10ml的刻度离心管内，平衡离心、离心速度1000rpm/min，时间5min。小心吸去上清，加入8ml预热37℃的低渗液，用吸管将现溶物打匀，置37℃水浴15～20min；
a3.一次固定：低渗后，立即加入2ml新配的固定液，颠倒混匀，37℃放置10min，平衡离心、离心速度1000rpm/min，时间10min；
a4.二次固定：离心后弃上清，留下管底的细胞，缓慢加入固定液约1ml并轻轻打匀，再加入3ml固定液，37℃水浴10分钟；平衡离心、离心速度1000rpm/min，时间10min；
a5.离心后弃上清，预留0.5ml固定液，轻轻吹匀，将细胞悬液滴1-2滴于每一张预冷的载玻片中央，随即吹气让细胞悬液流下玻片，晾干，室温放置24h，备用，即获得染色体玻片；该染色体玻片在显微镜下的结构图如图1所示。
实验组2：
a1.接种CHO细胞于6孔板(细胞活率不小于92％，接种密度8×105，2mL/孔，另多添加300μl培养基/孔)，置于37℃震荡培养箱16-18h后加入秋水仙素使其终浓度为0.5μg/ml，摇匀置37℃培养箱继续培养3～6h，终止培养收集细胞；
a2.低渗处理：将6孔板其中三孔细胞倒入10ml的刻度离心管内，平衡离心、离心速度1000rpm/min，时间5min。小心吸去上清，加入8ml预热37℃的低渗液，用吸管将现溶物打匀，置37℃水浴15～20min；
a3.一次固定：低渗后，立即加入2ml新配的固定液，颠倒混匀，37℃放置10min，平衡离心、离心速度1000rpm/min，时间10min；
a4.离心后弃上清，预留0.5ml固定液，轻轻吹匀，将细胞悬液滴1-2滴于每一张预冷的载玻片中央，随即吹气让细胞悬液流下玻片，晾干，室温放置24h，备用，即获得染色体玻片；该染色体玻片在显微镜下的结构图如图2所示。
结果：实验组1的染色体铺展、形态效果更佳，方便后期的荧光显微镜观察；实验组2的染色体皱缩，不利于后期的荧光显微镜观察。说明染色体玻片的制备方法，尤其是固定处理方法的不同，对染色体的铺展、形态效果等影响较大，从而影响目标序列在表达用细胞中的检测。
实施例2：不同DNA探针，在表达用细胞中目标序列的检测的用途中产生的结果
实验组3：用PCR扩增片段制备DNA探针
b1.质粒DNA提取：将质粒中含抗卡那霉素基因的菌液添加到含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒DNA提取试剂盒(如OMEGA的Plasmid mini kit)进行质粒D NA提取；所述质粒上含有的目标序列为如SEQ ID NO：1所示的序列；
b2.PCR扩增：以提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物；
引物为：
P1 5’-GCTGAATGGCAAGGAGTA-3’
P2 5’-GCTGTAGAGGAAGAAGGAG-3’
反应体系为：
Figure BDA0001764888890000071
Figure BDA0001764888890000081
反应程序为：
温度 时间
1:95℃ 2min
2:95℃ 30sec
3:58℃ 30sec
4:72℃ 60sec
2-4循环35次
5：72℃ 5min
b3.纯化及定量：将上述的PCR产物使用纯化试剂盒(如QIAGEN的PCRPurification Kit)进行纯化，并通过OD值的测定对PCR扩增片段进行浓度测定；
b4.荧光标记：按照标记试剂盒(如Roche公司的Random Primed DNALabelingKit)的使用说明，取300μg～500μg线性化质粒Biotin-16-dUTP(Roche)进行探针标记，37℃孵育16～20h，之后65℃10min终止反应，-20℃保存备用，即获得DNA探针。
实验组4：用线性化后的质粒制备DNA探针
b1.质粒DNA提取：将质粒中含抗卡那霉素基因的菌液添加到含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒DNA提取试剂盒(如OMEGA的Plasmid mini kit)进行质粒D NA提取；所述质粒上含有的目标序列为如SEQ ID NO：1所示的序列；
b2.酶切：使用FspI限制性内切酶对提取质粒进行过夜酶切使之线性化；
b3.纯化及定量：将上述的酶切产物使用纯化试剂盒(如QIAGEN的PCRPurification Kit)对酶切后产物进行纯化，并通过OD值的测定对线性化的质粒DNA进行浓度测定；
b4.荧光标记：按照标记试剂盒(如Roche公司的Random Primed DNALabelingKit)的使用说明，取300μg～500μg线性化质粒Biotin-16-dUTP(Roche)进行探针标记，37℃孵育16～20h，之后65℃10min终止反应，-20℃保存备用，即获得DNA探针。
将实验组3制备得到的DNA探针，在表达用细胞中目标序列的检测的应用，具体的检测方法为：
a.染色体玻片的制备：与实验组1相同；
b.DNA探针的制备：与实验组3相同；
c.杂交：具体操作如下：
c1.DNA探针变性：将实验组3获得的DNA探针与鲑鱼精DNA和杂交液混合后，在沸水浴中变性10min，然后立即冰浴5～10min；
c2.染色体玻片变性及脱水：取出制备好的染色体玻片，将其浸在78～80℃的变性液中变性5min。然后立即取放入冰预冷的2×SSC中3min，然后按顺序将标本经体积分数70％、90％和100％冰预冷的乙醇梯度脱水，每次5min，然后空气干燥。
c3.杂交：将变性的DNA探针200μl滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜。将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。将已杂交的标本放置于已预热43～50℃的洗脱液I中洗涤2次，每次5min，然后在已预热43～50℃的2×SSC中洗涤2次，每次5min，然后在室温的2×SSC中洗涤1次，时间2min，获得杂交标本；
d.荧光染色及信号放大：在载玻片的杂交标本上加80μl封闭液，再加100μl FITC-Str eptavidin(biolegend公司)于标本上，用盖玻片覆盖，37℃避光温育40～60min；然后去掉盖玻片，将标本放入已预热43～50℃的洗脱液II中洗涤2次，每次5min，再加30μlBioti nylated anti-streptavidin(vector公司)于标本上，用盖玻片覆盖，37℃避光温育40～60min；然后去掉盖玻片，将标本放入已预热43～50℃的洗脱液II中洗涤2次，每次5min；再加100μl FITC-Streptavidin(biolegend公司)于标本上，用盖玻片覆盖，37℃避光温育40～60mi n；然后去掉盖玻片，将标本放入已预热43～50℃的2×SSC中洗涤1，5min取50～100μl DAP I/抗淬灭剂溶液(如Millipore公司的DAPI/Antifade Solution)滴加在玻片标本上复染，盖上预先用乙醇清洗的盖玻片，即完成荧光染色及信号放大；
f.荧光显微镜观察：将复染后的杂交玻片置于荧光显微镜下，先用可见光源找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源观察，染色体被DAPI标记发蓝色荧光，经FITC标记的DNA探针所在位置发出绿色荧光。
获得的FISH杂交融合图如图3所示。
将实验组4制备得到的DNA探针，在表达用细胞中目标序列的检测的应用，具体的检测方法为：
a.染色体玻片的制备：与实验组1相同；
b.DNA探针的制备：与实验组4相同；
c.杂交：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同；
d.荧光染色及信号放大：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同；
e.荧光显微镜观察：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同。获得的FISH杂交融合图如图4所示。
结果：与图3相比，图4中显示的杂交信号更强，满足FISH检测结果的分析与判断。图3采用的DNA探针是以PCR扩增片段制备而成，杂交信号弱，影响目标序列在表达用细胞中的检出强度。图4采用的DNA探针是以线性化的质粒制备而成，不仅杂交信号强，满足目标序列在表达用细胞中的定性、定量及相对定位分析，而且能真实反映含有目的基因的线性化质粒在CHO细胞的转染情况，可作为亚克隆细胞筛选的杂交探针。
实施例3：不同制备方法获得的DNA探针，在表达用细胞中目标序列的检测的用途中产生的结果
方法：提取质粒DNA，通过酶切线性化后，经过纯化及定量，添加比例不同的标记dUTP与标记dTTP进行荧光标记，获得不同的DNA探针。
实验组5：采用生物素标记的dUTP与dTTP的添加比例为1:1，制备获得DNA探针。具体步骤如下：
b1.质粒DNA提取：将质粒中含抗卡那霉素基因的菌液添加到含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒DNA提取试剂盒进行质粒DNA提取；
b2.酶切：使用FspI限制性内切酶对提取质粒进行过夜酶切使之线性化；
b3.纯化及定量：将上述的酶切产物使用纯化试剂盒(如QIAGEN的PCRPurification Kit)对酶切后产物进行纯化，并通过OD值的测定对线性化的质粒DNA进行浓度测定；
b4.荧光标记：按照标记试剂盒(如Roche公司的Random PrimedDNALabeling Kit)的使用说明，取300μg～500μg线性化质粒Biotin-16-dUTP(Roche)进行探针标记，其中，生物素的标记dUTP与dTTP的添加比例为1:1，37℃孵育16～20h，之后65℃10min终止反应，-20℃保存备用，即获得DNA探针。
实验组6：采用生物素标记的dUTP与dTTP的添加比例为2:1，制备获得DNA探针。其余操作步骤与实验组5相同。
将实验组5制备得到的DNA探针，在表达用细胞中目标序列的检测的应用，具体的检测方法为：
a.染色体玻片的制备：与实验组1相同；
b.DNA探针的制备：与实验组5相同；
c.杂交：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同；
d.荧光染色及信号放大：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同；
e.荧光显微镜观察：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同。获得的FITC染色结果如图5所示。
将实验组6制备得到的DNA探针，在表达用细胞中目标序列的检测的应用，具体的检测方法为：
a.染色体玻片的制备：与实验组1相同；
b.DNA探针的制备：与实验组6相同；
c.杂交：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同；
d.荧光染色及信号放大：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同；
e.荧光显微镜观察：与上述将实验组3制备得到的DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测的应用所采用的方法相同。获得的FITC染色结果如图6所示。
结果：图5与图6相比，生物素标记的dUTP与dTTP的比例为2:1时，FITC染色结果观察，杂交信号更强。由此可见，在DNA探针的制备方法中，荧光标记时标记dUTP与标记dTTP的加入比例，影响DNA探针的质量，影响目标序列在表达用细胞中的检出强度，当生物素标记的dUTP与dTTP的比例为1:1～2:1时，均能实现目标序列在表达用细胞中的定性、定量及定位检测，当生物素标记的dUTP与dTTP的比例为2:1时，效果更佳。
序列表
<110> 成都康弘生物科技有限公司
<120> 一种DNA探针的制备方法及其用途
<130> 成都康弘生物科技有限公司
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ggtagacctt tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60
agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120
tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180
ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240
aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300
gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360
tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420
aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480
aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540
acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600
gaaaaacctt ttgttgcttt tggaagtggc atggaatctc tggtggaagc cacggtgggg 660
gagcgtgtca gaatccctgc gaagtacctt ggttacccac ccccagaaat aaaatggtat 720
aaaaatggaa taccccttga gtccaatcac acaattaaag cggggcatgt actgacgatt 780
atggaagtga gtgaaagaga cacaggaaat tacactgtca tccttaccaa tcccatttca 840
aaggagaagc agagccatgt ggtctctctg gttgtgtatg tcccaccggg cccgggcgac 900
aaaactcaca catgcccact gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 960
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1020
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1080
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1140
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1200
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1260
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1320
caggtcagcc tgacctgcct agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1380
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aaggccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1440
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1500
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1560
tccctgtctc cgggtaaa 1578
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 60
ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 120
ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 180
atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 240
cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 300
cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 360
atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 420
aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 480
tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca 540
tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 600
tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 660
atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 720
accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 780
gccttcttga cgagttcttc tgaattatta 810

Claims (3)

1.一种DNA探针在表达用细胞中目标序列的检测中的用途，其特征在于：
所述检测包括以下步骤：
a.染色体玻片的制备：用秋水仙素处理表达用细胞，经过低渗、固定处理后，制备获得染色体玻片；
b.DNA探针的制备，包括以下步骤：
(1)质粒DNA提取：将质粒中含目标序列的菌液经过培养后，进行质粒DNA提取；
(2)酶切：用限制性内切酶对提取的质粒DNA进行酶切使之线性化；
(3)纯化及定量：对步骤(2)的酶切产物进行纯化，并对线性化的质粒DNA进行定量；
(4)荧光标记：对线性化质粒DNA进行荧光标记，获得DNA探针；
所述步骤(1)中所述目标序列含有编码融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQID NO：1所示；步骤(2)中所述限制性内切酶为FspI；步骤(4)中所述荧光标记的方法为随机引物法；所述荧光标记的试剂为Biotin-16-dUTP，所述荧光标记时，带标记的dUTP与dTTP的加入比例为2:1；
c.杂交：对DNA探针进行变性处理，对染色体玻片进行变性及脱水处理，将变性的DNA探针滴于已变性并脱水的玻片标本上，进行杂交，获得杂交标本；
d.荧光染色及信号放大：在杂交标本上依次加入荧光素标记的亲和素、生物素化的亲和素抗体、荧光素标记的亲和素分别进行反应，获得杂交信号放大的杂交标本，然后对杂交标本滴加染色体复染剂进行复染；
e.荧光显微镜观察：将复染后的杂交玻片置于荧光显微镜下观察；
其中所述染色体玻片的制备进一步包括以下内容：
a1.收集用秋水仙素处理后的表达用细胞；
a2.低渗处理：将收集的细胞用氯化钾溶液进行低渗处理；
a3.一次固定：将低渗后的细胞中加入固定液进行一次固定处理，一次固定后离心收集细胞；
a4.二次固定：将一次固定处理后的细胞中加入固定液进行二次固定处理，二次固定后离心收集细胞；
a5.染色体玻片制备：将二次固定处理后的细胞中加入固定液配制成细胞悬液，将细胞悬液滴于载玻片中央，晾干，即获得染色体玻片；所述细胞为中华仓鼠卵巢细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的固定液为甲醇与冰醋酸以体积比3:1混合的溶液；所述一次固定处理的方法为：在37℃下固定处理10min；所述二次固定处理的方法为：在37℃下固定处理10min。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的用途，其特征在于，所述的荧光素标记的亲和素为异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素；所述的生物素化的亲和素抗体为生物素化的抗链霉亲和素；所述的染色体复染剂为DAPI。
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