ES2826480T3

ES2826480T3 - Métodos para predecir la utilidad de neoantígenos para inmunoterapia

Info

Publication number: ES2826480T3
Application number: ES17726208T
Authority: ES
Inventors: Mathias Vormehr; Ugur Sahin; Barbara Schrörs; Martin Löwer; Sebastian Boegel
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech RNA Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech RNA Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2037-05-10
Also published as: IL262680B2; HRP20201671T1; MX2022007902A; RU2018137721A; EP3792628A3; IL262680A; MA43794A; WO2017194610A1; CN109073637A; PL3455625T3; EP3455625B1; JP2022081492A; EP3792628A2; MD3455625T2; SI3455625T1; IL262680B1; HUE052240T2; AU2022209286A1; RS61071B1; EP3792628B1

Abstract

Un método para predecir la utilidad de un neoantígeno asociado al cáncer o un neoepítopo del mismo que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas del cáncer para inmunoterapia anticancerosa, comprendiendo el método determinar la distribución o localización del neoantígeno que comprende determinar en una base de datos informática si el neoantígeno está localizado o es abundante en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo, en el que la localización o abundancia del neoantígeno o un ácido nucleico que lo codifica, o un neoepítopo del neoantígeno en el citosol y/o dentro de exosomas in vivo indica que el neoantígeno o neoepítopo del mismo es útil para inmunoterapia contra el cáncer, en el que el procesamiento y la presentación del neoantígeno en la ruta del MHC I da como resultado el reconocimiento de complejos formados por el MHC I y neoepítopos del neoantígeno por células T CD8+.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para predecir la utilidad de neoantígenos para inmunoterapia

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método para predecir si un neoantígeno o un neoepítopo del mismo asociado al cáncer que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de cáncer es útil para la inmunoterapia contra el cáncer.

Antecedentes de la invención

La evolución del sistema inmune dio como resultado vertebrados en una red altamente eficaz con base en dos tipos de defensa: la inmunidad innata y la adaptativa. En contraste con el antiguo sistema inmune innato evolutivo que se basa en receptores invariantes que reconocen patrones moleculares comunes asociados con patógenos, la inmunidad adaptativa se basa en receptores de antígenos altamente específicos en las células B (linfocitos B) y células T (linfocitos T) y la selección clonal. Mientras que las células B generan respuestas inmunes humorales mediante la secreción de anticuerpos, las células T median las respuestas inmunitarias celulares que conducen a la destrucción de células reconocidas.

Las células T juegan un papel central en la inmunidad mediada por células en seres humanos y animales. El reconocimiento y la unión de un antígeno particular está mediado por los receptores de células T expresados en la superficie de las células T. El receptor de células T (TCR) de una célula T puede interactuar con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y presentados en la superficie de las células objetivo. La unión específica del TCR desencadena una cascada de señales dentro de la célula T que conduce a la proliferación y diferenciación en una célula T efectora madura. Para poder dirigirse a una amplia variedad de antígenos, los receptores de las células T deben tener una gran diversidad.

La inmunoterapia específica de antígeno tiene como objetivo mejorar o inducir respuestas inmunitarias específicas en pacientes para controlar enfermedades infecciosas o malignas. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores condujo a una amplia colección de objetivos adecuadas para la inmunoterapia. Las células que presentan péptidos inmunogénicos (epítopos) derivados de estos antígenos se pueden dirigir específicamente mediante estrategias de inmunización activas o pasivas. La inmunización activa tiende a inducir y expandir células T específicas de antígeno en el paciente, que son capaces de reconocer y destruir específicamente las células enfermas. Por el contrario, la inmunización pasiva se basa en la transferencia adoptiva de células T, que se expandieron y, opcionalmente, modificaron genéticamente in vitro (terapia adoptiva de células T; ACT).

Las vacunas de tumores tienen como objetivo inducir respuestas inmunitarias específicas de tumores endógenos mediante inmunización activa. Se pueden usar diferentes formatos de antígenos para la vacunación de tumores, incluidas células enfermas completas, proteínas, péptidos o vectores inmunizantes tales como ARN, ADN o vectores virales que se pueden aplicar directamente in vivo o in vitro pulsando las DC después de la transferencia al paciente.

La inmunoterapia basada en ACT puede definirse ampliamente como una forma de inmunización pasiva con células T previamente sensibilizadas que se transfieren a receptores no inmunes o al huésped autólogo después de la expansión ex vivo desde bajas frecuencias de precursores hasta números de células clínicamente relevantes. Un enfoque que supera las limitaciones de ACT es la transferencia adoptiva de células T autólogas reprogramadas para expresar un TCR reactivo al tumor de especificidad definida durante un cultivo ex vivo de corto tiempo seguido de reinfusión en el paciente.

El descubrimiento de múltiples antígenos asociados a patógenos y tumores ha proporcionado la base para conceptos de inmunoterapia específicos de antígeno. Los antígenos asociados a tumores (TAA) son proteínas inusuales que se expresan en las células tumorales debido a su inestabilidad genética, que tienen una expresión nula o limitada en células normales. Estos TAA pueden conducir al reconocimiento específico de células malignas por parte del sistema inmune.

Los cánceres pueden surgir de la acumulación de mutaciones genómicas y cambios epigenéticos, de los cuales una fracción puede tener un papel causal. Además de los antígenos asociados a tumores, los cánceres humanos portan un promedio de 100-120 mutaciones no sinónimas, de las cuales muchas son objetivo de las vacunas. Más del 95% de las mutaciones en un tumor son únicas y específicas del paciente. El número de mutaciones somáticas que cambian las proteínas, que pueden dar como resultado epítopos de células T específicas de tumores, está en el intervalo de 30 a 400. Las mutaciones se consideran objetivos ideales para la inmunoterapia del cáncer. Como neoepítopos con estricta falta de expresión en cualquier tejido sano, se espera que sean seguros y puedan eludir los mecanismos centrales de tolerancia. Recientemente, se ha propuesto un enfoque de inmunoterapia personalizado dirigido al espectro de mutaciones individuales (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)).

A pesar del creciente número de estructuras objetivo atractivas para enfoques inmunoterapéuticos, la definición de epítopos adecuados para inmunoterapia sigue siendo un desafío. Por lo tanto, existe la necesidad de un modelo para predecir si un epítopo, en particular un neoepítopo, inducirá una inmunidad eficaz y, por lo tanto, será útil en inmunoterapia.

En el presente documento se muestra que los antígenos y epítopos inmunogénicos están fuertemente representados en ciertos compartimentos subcelulares.

Se sabe que una respuesta inmune contra antígenos tumorales, en particular antígenos tumorales mutados, no se efectúa por las propias células tumorales sino más bien por las células presentadoras de antígeno, en particular las células dendríticas, que reciben el antígeno tumoral liberado por las células tumorales. También se sabe que para lograr una respuesta inmune efectiva, el antígeno tumoral liberado que es captado por las células presentadoras de antígeno debe procesarse y presentarse por el MHC de clase II para la inducción de una respuesta inmune CD4 (presentación exógena) o por MHC de clase I para la inducción de una respuesta inmune CD8 (presentación cruzada). Para la última respuesta inmune, se requiere la existencia de una respuesta inmune CD4 contra el mismo o diferente antígeno tumoral administrado a la misma célula presentadora de antígeno (Bennett et al., J. Exp. Med. 186, 65-70 (1997)).

Sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que la localización celular de un antígeno en células enfermas tales como células tumorales determina si el antígeno será captado y presentado por las células presentadoras de antígeno. Los exosomas liberados de las células enfermas, tales como las células tumorales, contienen ARNm, proteínas y complejos de péptidos MHC y, por lo tanto, pueden transferir estos componentes a las células presentadoras de antígeno. Los exosomas se producen por invaginación y, por lo tanto, contienen además de moléculas de membrana endocítica principalmente componentes citosólicos. Por lo tanto, se cree que los componentes citosólicos, tales como las proteínas, están enriquecidos en exosomas y pueden transferirse a las células presentadoras de antígeno. Los exosomas también pueden transferir ARNm de forma productiva, que puede traducirse en las células que absorben el ARN. Así, sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que los péptidos o polipéptidos que están incluidos en los exosomas, en particular péptidos o proteínas citosólicos, o péptidos o polipéptidos cuyo ARN codificante está incluido en los exosomas son particularmente útiles para inmunoterapia porque los exosomas son captados por las células presentadoras de antígeno y los péptidos y proteínas (opcionalmente después de la traducción del ARN codificante) son presentados por las células presentadoras de antígeno. Los exosomas son por tanto portadores de transporte para los péptidos, proteínas o ARN a las células presentadoras de antígeno y protegen los péptidos, proteínas o ARN contra la degradación por proteasas y ribonucleasas. Alternativamente, es posible que las células presentadoras de antígeno capten péptidos y proteínas como complejos con otras moléculas tales como anticuerpos a través de un mecanismo dependiente del receptor.

Türeci et al., (Clin. Cancer Res. 22 (8), 1885-1896 (2016)) se ocupa de las vacunas individualizadas contra el cáncer que explotan los neoepítopos basados en mutaciones.

Descripción de la invención

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método para predecir la utilidad de un neoantígeno o un neoepítopo del mismo asociado al cáncer que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas del cáncer para inmunoterapia contra el cáncer, comprendiendo el método

determinar la distribución o localización del neoantígeno que comprende determinar en una base de datos computacional si el neoantígeno está localizado o es abundante en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo, en el que la localización o abundancia del neoantígeno o un ácido nucleico que lo codifica, o un neoepítopo del neoantígeno en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo indica que el neoantígeno o neoepítopo del mismo es útil para inmunoterapia contra el cáncer,

en el que el procesamiento y presentación del neoantígeno en la ruta del MHC I da como resultado el reconocimiento de complejos formados por MHC I y neoepítopos del neoantígeno por células T CD8+.

En una realización, una o más modificaciones de aminoácidos se deben a mutaciones somáticas específicas del cáncer.

Resumen de otros aspectos de la divulgación

En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para predecir la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma expresada por células enfermas para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar la distribución o localización de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína.

Opcionalmente, el método comprende determinar si la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o un fragmento de la proteína está localizado o es abundante en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo.

Opcionalmente, la localización o abundancia de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína en el citosol y/o dentro de los exosomas indica que la proteína o un fragmento de la misma es útil para inmunoterapia.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para predecir la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma expresada por células enfermas para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar si la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por células presentadoras de antígeno, preferiblemente células presentadoras de antígeno profesionales.

Opcionalmente, la presentación cruzada de la proteína o un fragmento de la misma por células presentadoras de antígeno indica que la proteína o fragmento de la misma es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, determinar si la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno comprende determinar si la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o un fragmento de la proteína está localizado o es abundante en el citosol y/o dentro de exosomas in vivo.

Opcionalmente, la localización o abundancia de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína en el citosol y/o dentro de los exosomas indica que la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno.

Opcionalmente, determinar si la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por células presentadoras de antígeno comprende determinar una respuesta de anticuerpo existente a la proteína o un fragmento de la misma.

Opcionalmente, una respuesta de anticuerpo existente a la proteína o un fragmento de la misma indica que la proteína 0 un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno.

Opcionalmente, determinar si la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno comprende determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une a la actina F. Opcionalmente, la unión de la proteína o un fragmento de la misma a la actina F indica que la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno.

Opcionalmente, determinar si la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno comprende determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une al ARN.

Opcionalmente, la unión de la proteína o un fragmento de la misma al ARN indica que la proteína o un fragmento de la misma se presenta de forma cruzada por las células presentadoras de antígeno.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en el presente documento, el fragmento de proteína está presente dentro de los exosomas como un complejo de péptido del MHC, preferiblemente en la superficie de los exosomas. Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, la localización o abundancia de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína en el citosol indica el procesamiento y la presentación de la proteína en la ruta del MHC I, preferiblemente de las células enfermas. Opcionalmente, el procesamiento y la presentación de la proteína en la ruta del MHC I da como resultado el reconocimiento de complejos formados por MHC 1 y fragmentos de la proteína por células T CD8+.

Opcionalmente, en todos los aspectos de la divulgación, la localización o abundancia de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína dentro de los exosomas, indica la acumulación de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína en células presentadoras de antígeno, preferiblemente células presentadoras de antígeno profesionales. Opcionalmente, la acumulación de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína en las células presentadoras de antígeno indica el procesamiento y presentación de la proteína en la ruta del MHC I y/o MHC II, preferiblemente de las células presentadoras de antígeno. Opcionalmente, el procesamiento y la presentación de la proteína en la ruta del MHC I da como resultado el reconocimiento de complejos formados por MHC I y fragmentos de la proteína por células T CD8+.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para predecir la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma expresada por células enfermas para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar uno o más de los siguientes:

(a) determinar una respuesta de anticuerpos existente a la proteína o un fragmento de la misma,

(b) determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une a la actina F, y/o

(c) determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une al ARN.

Opcionalmente, una respuesta de anticuerpo existente a la proteína o un fragmento de la misma indica que la proteína o un fragmento de la misma es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, la unión de la proteína o un fragmento de la misma a la actina F indica que la proteína o un fragmento de la misma es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, la unión de la proteína o un fragmento de la misma al ARN indica que la proteína o un fragmento de la misma es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en el presente documento, la proteína o un fragmento de la misma comprende una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad. Opcionalmente, la modificación de aminoácidos se debe a una mutación somática específica de la enfermedad.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, la enfermedad es cáncer y la inmunoterapia es inmunoterapia anticancerosa.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, el fragmento de proteína es un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad por su utilidad en inmunoterapia, comprendiendo el método las etapas de: (i) identificar proteínas expresadas por células enfermas, comprendiendo cada proteína al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, y

(ii) determinar la distribución o localización de una proteína identificada en (i) o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína, y

(iii) repetir la etapa (ii) para al menos una proteína adicional identificada en (i).

Opcionalmente, la etapa (ii) comprende determinar si la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o un fragmento de la proteína está localizada o es abundante en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo.

Opcionalmente, la localización o abundancia de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína en el citosol y/o dentro de los exosomas indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia.

(ii) determinar si una proteína identificada en (i) o un fragmento de la proteína es presentado de forma cruzada por células presentadoras de antígeno, preferiblemente células presentadoras de antígeno profesionales, y

Opcionalmente, la presentación cruzada de la proteína o un fragmento de la misma por células presentadoras de antígeno indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia.

(ii) determinar para una proteína identificada en (i) o un fragmento de la proteína uno o más de los siguientes:

(c) determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une al ARN, y

Opcionalmente, una respuesta de anticuerpo existente a la proteína o un fragmento de la misma indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, la unión de la proteína o un fragmento de la misma a la actina F indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, la unión de la proteína o un fragmento de la misma al ARN indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad está compuesta por un fragmento de proteína que es un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, el método se usa en la fabricación de una vacuna. Opcionalmente, la vacuna se deriva de una o más proteínas o fragmentos de las mismas o una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se predice que son útiles para inmunoterapia.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para proporcionar una vacuna que comprende la etapa de: identificar una o más proteínas o fragmentos de las mismas o una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se predice que son útiles para la inmunoterapia mediante el método de cualquiera de los aspectos descritos en este documento. Opcionalmente, el método comprende además la etapa de: proporcionar una vacuna que comprende un péptido o polipéptido que comprende una o más proteínas o fragmentos de las mismas o una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se predice que son útiles para inmunoterapia, o un ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una vacuna producida de acuerdo con el método de cualquiera de los aspectos descritos en este documento.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, la indicación de la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma expresada por células enfermas para inmunoterapia indica que la proteína o un fragmento de la misma tras la administración (opcionalmente en el formato del ácido nucleico codificante) será inmunogénica.

Opcionalmente, en todos los aspectos descritos en este documento, un fragmento de proteína descrito en este documento es un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial (por ejemplo, la predicción de unión al MHC indica que el fragmento de proteína se unirá al MHC). Opcionalmente, el péptido de unión al MHC es un péptido modificado que es un fragmento de una proteína modificada.

Opcionalmente, las modificaciones de aminoácidos en proteínas o péptidos se identifican mediante la identificación de mutaciones no sinónimas en una o más regiones codificantes de proteínas.

Opcionalmente, las modificaciones de aminoácidos se identifican secuenciando parcial o completamente el genoma o transcriptoma de una o más células tales como una o más células cancerosas y opcionalmente una o más células no cancerosas e identificando mutaciones en una o más regiones codificantes de proteína. Opcionalmente, dichas mutaciones son mutaciones somáticas. Opcionalmente, dichas mutaciones son mutaciones cancerosas.

Opcionalmente, en particular para proporcionar una vacuna personalizada para un paciente tal como un paciente con cáncer, la modificación o modificaciones están presentes en dicho paciente y los métodos descritos en este documento se realizan para dicho paciente. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona una vacuna que se puede obtener usando los métodos descritos en este documento. Las vacunas preferidas se describen en este documento.

Una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable y puede comprender opcionalmente uno o más adyuvantes, estabilizadores, etc. La vacuna puede estar en forma de vacuna terapéutica o profiláctica.

Otro aspecto se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un paciente, que comprende administrar al paciente una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación.

Otro aspecto se refiere a un método de tratamiento de un paciente que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un agente inmunoterapéutico descrito en el presente documento tal como una vacuna usando los métodos de acuerdo con la divulgación; y

(b) administrar dicho agente inmunoterapéutico al paciente.

Otro aspecto se refiere a un método de tratamiento de un paciente que comprende administrar un agente inmunoterapéutico descrito en el presente documento, tal como una vacuna, al paciente.

Opcionalmente, el paciente es un paciente con cáncer y la vacuna es una vacuna contra el cáncer, tal como una vacuna cuya administración proporciona neoepítopos específicos del cáncer.

En aspectos adicionales, la divulgación proporciona las vacunas descritas en el presente documento para su uso en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, en particular para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

Los tratamientos del cáncer descritos en este documento pueden combinarse con resección quirúrgica y/o radiación y/o quimioterapia tradicional.

Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.

Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "Glosario multilingüe de términos biotecnológicos: (Recomendaciones de la IUPAC)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, c H-4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía en el campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que le siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende" implican la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas aunque en algunas realizaciones dicho otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pueden ser excluidos, es decir, el objeto consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas establecidos. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o claramente sea contradicho por el contexto. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado de hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento.

Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplos de expresiones (por ejemplo, "tal como"), proporcionados en el presente documento están destinados simplemente a ilustrar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención reivindicada. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de ningún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta memoria descriptiva. Nada de lo aquí mencionado debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho de anteceder a dicha divulgación en virtud de una invención anterior.

La presente divulgación prevé la inmunoterapia de enfermedades, en particular enfermedades cancerosas mediante la utilización de una proteína o un fragmento de proteína presente en las células enfermas como un marcador y que se dirige a las células enfermas. En particular, las células enfermas pueden ser el objetivo mediante el direccionamiento a un fragmento de una proteína presentada en la superficie de las células enfermas en el contexto del MHC. La inmunoterapia de acuerdo con la presente divulgación debe realizarse mediante enfoques inmunoterapéuticos activos y/o pasivos.

Específicamente, la presente divulgación tiene como objetivo definir proteínas adecuadas o fragmentos de las mismas para inmunoterapia. Una vez que se ha identificado una proteína adecuada, esta proteína o un fragmento de la misma (opcionalmente como parte de un polipéptido más grande) o un ácido nucleico que codifica la proteína o fragmento (opcionalmente como parte de un polipéptido más grande) puede usarse como vacuna para potenciar o inducir una respuesta inmune contra la proteína o un fragmento de la misma, en particular induciendo y/o activando células efectoras apropiadas tales como células T que reconocen la proteína o un fragmento de la misma (en particular cuando se presentan en el contexto del MHC) a través de un receptor apropiado (tal como un receptor de células T o receptor de células T artificial). Alternativa o adicionalmente, se pueden administrar células efectoras tales como células T que reconocen la proteína o un fragmento de la misma (en particular cuando se presenta en el contexto del MHC) a través de un receptor apropiado (tal como receptor de células T o receptor de células T artificial). Sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que la proteína o un fragmento de la misma que se predice como útil en inmunoterapia por la presente divulgación tiene una alta probabilidad de ser captada por las células presentadoras de antígeno y presentada por las células presentadoras de antígeno, en particular mediante presentación cruzada, dando así finalmente como resultado una respuesta inmune eficaz contra las células enfermas que expresan la proteína o un fragmento de la misma. El alcance de la presente invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Las proteínas definidas como útiles o adecuadas para inmunoterapia también se denominan "antígenos" en el presente documento. Los fragmentos de proteínas definidos como útiles o adecuados para inmunoterapia también se denominan "epítopos" en el presente documento.

Los enfoques inmunoterapéuticos descritos en este documento incluyen la inmunización con:

i) proteína o péptido (nativo o modificado), ii) ácido nucleico que codifica proteína o péptido, iii) células recombinantes que codifican proteína o péptido, iv) virus recombinantes que codifican proteína o péptido y v) células presentadoras de antígeno pulsadas con proteína o péptido (nativo o modificado) o transfectado con ácidos nucleicos que codifican proteínas o péptidos.

Los enfoques inmunoterapéuticos descritos en este documento también incluyen la transferencia de:

vi) receptores de células T que reconocen proteínas o péptidos, y vii) células efectoras (tales como células T) que codifican receptores que reconocen proteínas o péptidos, en particular cuando se presentan en el contexto del MHC.

Las proteínas y los fragmentos preferidos se expresan de una manera específica de la enfermedad, por ejemplo, son antígenos o epítopos asociados a la enfermedad (por ejemplo, la presencia de una proteína o células que expresan una proteína es característica de la enfermedad) y/o comprenden una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, por ejemplo, son neoantígenos o neoepítopos asociados a enfermedades. Preferiblemente, una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se debe a una o más mutaciones somáticas específicas de la enfermedad. Preferiblemente, una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad es una modificación de aminoácidos específica de cáncer y una mutación somática específica de una enfermedad es una mutación somática específica de cáncer. Por tanto, una vacuna presenta preferiblemente modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad/mutaciones somáticas específicas de la enfermedad de un paciente y preferiblemente tras la administración proporciona uno o más neoepítopos basados en mutaciones. Por tanto, la vacuna puede comprender un péptido o polipéptido que comprende uno o más neoepítopos basados en mutaciones, o un ácido nucleico que codifica dicho péptido o polipéptido. Opcionalmente, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se identifican identificando mutaciones somáticas específicas de la enfermedad, por ejemplo, secuenciando ADN y/o ARN genómico de tejido enfermo o una o más células enfermas.

La etapa de identificar modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad y/o identificar mutaciones somáticas específicas de la enfermedad se puede realizar antes o después de los métodos descritos en este documento para predecir la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma expresada por células enfermas para inmunoterapia. Preferiblemente, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad y/o las mutaciones somáticas específicas de la enfermedad se determinan primero en una muestra enferma de un paciente y esto va seguido de una predicción de la utilidad de la proteína que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad o de un fragmento del mismo que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad para inmunoterapia de acuerdo con los métodos descritos en este documento. Una vez identificadas, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad (respectivamente proteínas que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad o fragmentos de las mismas que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad) también pueden seleccionarse y/o clasificarse por su utilidad en inmunoterapia de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

El término "exosomas" se refiere a vesículas derivadas de células que están presentes en fluidos biológicos, que incluyen sangre, orina y medio de cultivo de cultivos celulares. Los exosomas se liberan de la célula cuando los cuerpos multivesiculares se fusionan con la membrana plasmática o se liberan directamente de la membrana plasmática. Los exosomas contienen varios constituyentes moleculares de su célula de origen, incluidas proteínas y ARN. Aunque la composición de la proteína exosomal varía con la célula y el tejido de origen, la mayoría de los exosomas contienen un conjunto común de moléculas de proteína conservadas evolutivamente. Los exosomas pueden transferir moléculas de una célula a otra a través del tráfico de vesículas de membrana, lo que influye en el sistema inmune, como las células dendríticas y las células B, y puede desempeñar un papel funcional en la mediación de las respuestas inmunitarias adaptativas a patógenos y tumores.

Como se usa en el presente documento, el término "citosol" se refiere a la porción del citoplasma que no está dentro de las subestructuras de la célula unidas a la membrana.

El término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "polipéptido" o "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en el presente documento.

El término "modificación" con respecto a péptidos, polipéptidos o proteínas se refiere a un cambio de secuencia en un péptido, polipéptido o proteína en comparación con una secuencia parental tal como la secuencia de un péptido, polipéptido o proteína de tipo silvestre. El término incluye variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y variantes de sustitución de aminoácidos, preferiblemente variantes de sustitución de aminoácidos. Todos estos cambios de secuencia pueden potencialmente crear nuevos epítopos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones al terminal amino y/o carboxilo de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.

Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan porque se elimina al menos un residuo en la secuencia y se inserta otro residuo en su lugar.

Una modificación o un péptido modificado puede derivarse de una proteína que comprende una modificación.

El término "derivado" significa que una entidad particular, en particular una secuencia peptídica particular, está presente en el objeto del que se deriva. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

Las proteínas descritas en el presente documento comprenden preferiblemente una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad. Opcionalmente, estas una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad están ubicadas dentro de epítopos o epítopos potenciales de la proteína. Por tanto, las proteínas preferidas descritas en este documento son neoantígenos que comprenden preferiblemente uno o más neoepítopos. De manera similar, un fragmento de proteína preferido descrito en este documento es un fragmento de una proteína que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, en el que preferiblemente una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad están ubicadas dentro del fragmento de la proteína. Por tanto, un fragmento de proteína preferido descrito en este documento es un neoepítopo.

El término "neoantígeno" se refiere a un péptido o proteína que incluye una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con el péptido o proteína parental. Por ejemplo, el neoantígeno puede ser un neoantígeno asociado a un tumor, en el que el término "neoantígeno asociado a un tumor" incluye un péptido o proteína que incluye modificaciones de aminoácidos debido a mutaciones específicas del tumor.

El término "mutación específica de enfermedad" se refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de una célula enferma pero ausente en el ácido nucleico de una célula normal correspondiente, es decir, no enferma.

El término "mutación específica de tumor" o "mutación específica de cáncer" se refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de un tumor o célula cancerosa pero ausente en el ácido nucleico de una célula correspondiente normal, es decir, no tumoral o no cancerosa. Los términos "mutación específica de tumor" y "mutación de tumor" y los términos "mutación específica de cáncer" y "mutación de cáncer" se usan indistintamente en este documento.

El término "respuesta inmune" se refiere a una reacción del sistema inmune tal como a organismos inmunogénicos, tales como bacterias o virus, células o sustancias. El término "respuesta inmune" incluye la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. Preferiblemente, la respuesta inmune está relacionada con una activación de células inmunes, una inducción de la biosíntesis de citocinas y/o la producción de anticuerpos.

Se prefiere que la respuesta inmune inducida por las composiciones descritas en este documento comprenda las etapas de activación de células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y/o macrófagos, presentación de un antígeno o fragmento del mismo por dichas células presentadoras de antígeno y activación de células T citotóxicas debido a esta presentación.

“Inducir una respuesta inmune” puede significar que no hubo respuesta inmune antes de la inducción, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmune antes de la inducción y después de la inducción se potencia dicha respuesta inmune. Por tanto, "inducir una respuesta inmune" también incluye "potenciar una respuesta inmune". Preferiblemente, después de inducir una respuesta inmune en un sujeto, dicho sujeto está protegido contra el desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o la condición de la enfermedad mejora induciendo una respuesta inmune. Por ejemplo, se puede inducir una respuesta inmune contra un antígeno expresado en un tumor en un paciente que padece una enfermedad cancerosa o en un sujeto que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Inducir una respuesta inmune en este caso puede significar que la condición de enfermedad del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.

Los términos "respuesta inmune celular" y "respuesta celular" o términos similares se refieren a una respuesta inmune dirigida a células caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I o clase II que involucra células T o linfocitos T que actúan como "colaboradoras" o "asesinas". Las células T colaboradoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central en la regulación de la respuesta inmune y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan células enfermas como las células cancerosas, evitando la producción de más células enfermas. Preferiblemente, la presente divulgación implica la estimulación de una respuesta de CTL antienfermedad contra células enfermas que expresan uno o más antígenos asociados a enfermedad y que presentan preferiblemente tales antígenos asociados a enfermedad con MHC de clase I, particularmente una respuesta de CTL antitumoral contra células tumorales que expresan uno o más antígenos expresados en tumores y preferiblemente que presentan tales antígenos expresados en tumores con MHC de clase I.

El término "antígeno" o "inmunógeno" cubre cualquier sustancia, preferiblemente un péptido o proteína, que es un objetivo de una respuesta inmune y/o que provocará una respuesta inmune. En particular, un "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que reacciona específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). El término "antígeno" comprende cualquier molécula que comprenda al menos un epítopo tal como un epítopo de células T. Preferiblemente, un antígeno es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que preferiblemente es específica para el antígeno o las células que expresan el antígeno. Puede usarse cualquier antígeno adecuado, que sea candidato para una reacción inmune, en el que la reacción inmune es preferiblemente una reacción inmune celular. El antígeno es presentado preferiblemente por una célula, preferiblemente por una célula presentadora de antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, lo que da como resultado una reacción inmune contra el antígeno. Un antígeno es preferiblemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Dichos antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivarse de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral. Un antígeno puede corresponder a un producto de origen natural, por ejemplo, una proteína viral o una parte de la misma. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido de superficie, es decir, un polipéptido que se presenta de forma natural en la superficie de una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor. El antígeno puede provocar una respuesta inmune contra una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor.

El término "antígeno asociado a enfermedad" se utiliza en su sentido más amplio para referirse a cualquier antígeno asociado con una enfermedad. Un antígeno asociado a una enfermedad es una molécula que contiene epítopos que estimularán el sistema inmune de un huésped para producir una respuesta inmune específica del antígeno celular y/o una respuesta de anticuerpos humorales contra la enfermedad. Por tanto, el antígeno asociado a la enfermedad puede usarse con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades se asocian preferiblemente con infección por microbios, típicamente antígenos microbianos, o asociados con cáncer, típicamente tumores.

El término "patógeno" se refiere a material biológico patógeno capaz de causar una enfermedad en un organismo, preferiblemente un organismo vertebrado. Los patógenos incluyen microorganismos como bacterias, organismos eucariotas unicelulares (protozoos), hongos al igual que virus.

Los términos "epítopo", "péptido antigénico", "epítopo antigénico", "péptido inmunogénico" y "péptido de unión al MHC" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o un fragmento de un compuesto inmunológicamente activo que es reconocido por el sistema inmune, por ejemplo, que es reconocido por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC. Un epítopo de una proteína comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. Un epítopo puede unirse a moléculas del MHC tales como moléculas del MHC en la superficie de una célula y, por tanto, puede ser un "péptido de unión al MHC" o "péptido antigénico".

El término "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas del MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que está presente en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígeno o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto autoantígenos (fragmentos de péptidos de la propia célula) como no autoantígenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T. Las porciones inmunogénicas preferidas se unen a una molécula del MHC de clase I o clase II. Como se usa en el presente documento, se dice que una porción inmunogénica se "une a" una molécula del MHC de clase I o clase II si tal unión es detectable usando cualquier ensayo conocido en la técnica. El término "péptido de unión al MHC" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC de clase I y/o del MHC de clase II. En el caso de complejos del MHC de clase I/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente de 8 a 10 aminoácidos de longitud, aunque los péptidos más largos o más cortos pueden ser eficaces. En el caso de complejos del MHC de clase II/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente una longitud de 10-25 aminoácidos y en particular una longitud de 13-18 aminoácidos, aunque los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces. Preferiblemente, una molécula del MHC es una molécula de HLA.

Si un péptido es parte de una entidad más grande que comprende secuencias adicionales, por ejemplo, de una secuencia de vacuna o polipéptido, y se presentará después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido producido por procesamiento tiene una longitud que es adecuada para unirse a una molécula del MHC, en particular una molécula del MHC de clase I, y que es preferiblemente de 7-30 aminoácidos de longitud tal como 7-20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 7-12 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia del péptido que se presentará después del procesamiento se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno o polipéptido usado para la vacunación, es decir, su secuencia corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a un fragmento del antígeno o polipéptido.

Por tanto, un péptido de unión al MHC comprende opcionalmente una secuencia que corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a un fragmento de un antígeno.

Como se usa en este documento, el término "neoepítopo" se refiere a un epítopo que no está presente en una referencia, tal como una célula normal no enferma (por ejemplo, no cancerosa) o de línea germinal, sino que se encuentra en células enfermas (por ejemplo, células cancerosas ). Esto incluye, en particular, situaciones en las que se encuentra en una célula normal no enferma o de línea germinal un epítopo correspondiente, sin embargo, debido a una o más mutaciones en una célula enferma, la secuencia del epítopo se cambia para dar como resultado el neoepítopo.

Como se usa en este documento, el término "epítopo de células T" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC en una configuración reconocida por un receptor de células T. Normalmente, los epítopos de células T se presentan en la superficie de una célula presentadora de antígeno.

Un epítopo de célula T se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente por la presentación del antígeno tal como células enfermas, en particular células cancerosas. Preferiblemente, un epítopo de células T es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I y preferiblemente es capaz de estimular un linfocito T citotóxico sensible al antígeno (CTL).

Opcionalmente, una vacuna comprende un epítopo adecuado para la vacunación de un organismo objetivo. Un experto en la materia sabrá que uno de los principios de la inmunobiología y la vacunación se basa en el hecho de que se produce una reacción inmunoprotectora frente a una enfermedad al inmunizar un organismo con una vacuna, que es inmunológicamente relevante con respecto a la enfermedad que va a ser tratada. Un antígeno se selecciona del grupo que comprende un antígeno propio y un antígeno no propio. Un antígeno no propio es preferiblemente un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno fúngico, un alérgeno o un antígeno parasitario. Se prefiere que el antígeno comprenda un epítopo que sea capaz de provocar una respuesta inmune en un organismo objetivo. Por ejemplo, el epítopo puede provocar una respuesta inmune contra una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor.

Opcionalmente, el antígeno no propio es un antígeno bacteriano. Opcionalmente, el antígeno provoca una respuesta inmune contra una bacteria que infecta a animales, incluidos aves, peces y mamíferos, incluidos animales domesticados. Preferiblemente, la bacteria contra la que se desencadena la respuesta inmune es una bacteria patógena.

Opcionalmente, el antígeno no propio es un antígeno viral. Un antígeno viral puede ser, por ejemplo, un péptido de una proteína de la superficie del virus, por ejemplo, un polipéptido de cápside o un polipéptido de espiga. Opcionalmente, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un virus que infecta a animales, incluidos aves, peces y mamíferos, incluidos animales domesticados. Preferiblemente, el virus contra el que se desencadena la respuesta inmune es un virus patógeno.

Opcionalmente, el antígeno no propio es un polipéptido o una proteína de un hongo. Opcionalmente, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un hongo que infecta a animales, incluidos aves, peces y mamíferos, incluidos animales domesticados. Preferiblemente, el hongo contra el que se desencadena la respuesta inmune es un hongo patógeno.

Opcionalmente, el antígeno no propio es un polipéptido o proteína de un parásito eucariota unicelular. Opcionalmente, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un parásito eucariota unicelular, preferiblemente un parásito eucariota unicelular patógeno. Los parásitos eucariotas unicelulares patógenos pueden ser, por ejemplo, del género Plasmodium, por ejemplo, P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale, del género Leishmania, o del género Trypanosoma, por ejemplo, T. cruzi o T. brucei.

Opcionalmente, el no autoantígeno es un polipéptido alergénico o una proteína alergénica. Una proteína alergénica o un polipéptido alergénico es adecuado para la inmunoterapia con alérgenos, también conocida como hiposensibilización.

Opcionalmente, el antígeno es un autoantígeno, particularmente un antígeno tumoral. Los antígenos tumorales y su determinación son conocidos por los expertos en la técnica.

El término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a tumor" se refiere a proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas específicas de desarrollo, por ejemplo, el antígeno tumoral puede ser en condiciones normales expresadas específicamente en el tejido del estómago, preferiblemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de línea germinal, y se expresan o expresan de manera aberrante en uno o más tumores o tejidos cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa preferiblemente no más de 3, más preferiblemente no más de 2. Los antígenos tumorales incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos del tipo celular, es decir, proteínas que se encuentran en condiciones normales específicamente expresados en un determinado tipo de célula en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en los testículos y algunas veces en la placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. El antígeno tumoral está asociado preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o solo rara vez se expresa en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno tumoral o la expresión aberrante del antígeno tumoral identifica células cancerosas. El antígeno tumoral expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa, es preferiblemente una proteína propia en dicho sujeto. Preferiblemente, el antígeno tumoral se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmune no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son accesibles o solo difícilmente accesibles por el sistema inmune. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral es idéntica entre el antígeno tumoral que se expresa en tejidos normales y el antígeno tumoral que se expresa en tejidos cancerosos.

Ejemplos de antígenos tumorales que pueden ser útiles son p53, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas, tales como CLAUDINA-6, CLAUDINA-18.2 y CLAUDINA-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferiblemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT. Los antígenos tumorales particularmente preferidos incluyen CLAUDINA-18.2 (CLDN18.2) y CLAUDINA-6 (CLDN6).

El término "inmunogenicidad" se refiere a la efectividad relativa para inducir una respuesta inmune que se asocia preferiblemente con tratamientos terapéuticos, tales como tratamientos contra cánceres. Como se usa en este documento, el término "inmunogénico" se refiere a la propiedad de tener inmunogenicidad. Por ejemplo, el término "modificación inmunogénica" cuando se usa en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína se refiere a la efectividad de dicho péptido, polipéptido o proteína para inducir una respuesta inmune causada por y/o dirigida contra dicha modificación. Preferiblemente, el péptido, polipéptido o proteína no modificados no induce una respuesta inmune, induce una respuesta inmune diferente o induce un nivel diferente, preferiblemente un nivel más bajo, de respuesta inmune.

El término "inmunogenicidad" o "inmunogénico" se refiere preferiblemente a la efectividad relativa para inducir una respuesta inmune biológicamente relevante, en particular una respuesta inmune que es útil para la vacunación. Por lo tanto, preferiblemente, una modificación de aminoácido o un péptido modificado es inmunogénico si induce una respuesta inmune contra la modificación objetivo en un sujeto, respuesta inmune que puede ser beneficiosa para fines terapéuticos o profilácticos.

Como se usa en este documento, el término "predecir la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma para inmunoterapia" se refiere a una predicción de si la proteína o uno o más fragmentos de la misma tales como epítopos, en particular epítopos de células T, serán útiles para inducir una respuesta inmune o direccionar una respuesta inmune. Si se predice que una proteína tal como un antígeno asociado a una enfermedad es útil para inmunoterapia, por ejemplo, se pueden usar epítopos de dicha proteína para vacunación como se describe en el presente documento o se pueden administrar células efectoras dirigidas a un epítopo de dicha proteína. Preferiblemente, una proteína cuya utilidad para la inmunoterapia ha de predecirse de acuerdo con la divulgación se expresa en células enfermas de un paciente.

Un epítopo de células T puede estar presente en una vacuna como parte de una entidad más grande tal como una secuencia de vacuna y/o un polipéptido que comprende más de un epítopo de células T. El péptido o epítopo de células T presentado se produce siguiendo un procesamiento adecuado. Además, los epítopos de células T pueden modificarse en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de TCR o para la unión al MHC. Dichos epítopos de células T modificados pueden considerarse inmunológicamente equivalentes. Preferiblemente, un epítopo de células T cuando se presenta por MHC y es reconocido por un receptor de células T es capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, expansión clonal de las células T que porta al receptor de células T reconociendo específicamente el complejo péptido/MHC. Preferiblemente, un epítopo de células T comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente con la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por el MHC de clase I y/o clase II.

El "procesamiento de antígenos" o "procesamiento" se refiere a la degradación de un péptido, polipéptido o proteína en productos de proceso, que son fragmentos de dicho péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, la degradación de un polipéptido en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas del MHC para su presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígeno, a células T específicas.

Los antígenos restringidos de clase II se derivan en gran medida de proteínas exógenas que entran en las células presentadoras de antígeno a través de la ruta endocítica y se procesan en el compartimiento endosómico. Por el contrario, los antígenos reconocidos por los CTL efectores restringidos de clase I normalmente se derivan de proteínas sintetizadas endógenamente. Por lo tanto, las proteínas exógenas no pueden proporcionar determinantes antigénicos para los CTL efectores restringidos de clase I a menos que se introduzcan directamente en el citoplasma de las células objetivo.

El término "presentación cruzada" se refiere a la capacidad de las células presentadoras de antígeno para captar, procesar y presentar antígenos extracelulares con moléculas del MHC de clase I a células T CD8 (células T citotóxicas). El cebado cruzado describe la estimulación de células T CD8+ citotóxicas no modificadas mediante este proceso. Las células presentadoras de antígeno capaces de presentación cruzada son principalmente células dendríticas, pero también se ha demostrado que los macrófagos, los linfocitos B y las células endoteliales sinusoidales pueden hacerlo.

Se ha demostrado que se produce un cebado cruzado para proteínas virales y antígenos tumorales. Esto ha llevado a la propuesta de que el cebado cruzado puede proporcionar al sistema inmune un mecanismo por el cual puede detectar y responder a virus tropicales tisulares que no infectan las APC profesionales. En ausencia de tal mecanismo, los virus podrían escapar a la inmunovigilancia evitando APC profesionales. Este mecanismo también proporciona al sistema inmune un medio para reconocer los neoantígenos expresados por células tumorales de reciente aparición. Al igual que los antígenos extraños exógenos, los autoantígenos exógenos pueden entrar en la vía de presentación de clase I.

Las "células presentadoras de antígeno" (APC) son células que presentan fragmentos peptídicos de antígenos proteicos en asociación con moléculas del MHC en su superficie celular. Algunas APC pueden activar células T específicas de antígeno.

Las células presentadoras de antígeno profesionales son muy eficaces para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula del MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas del MHC de clase II - antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Entonces, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, que conduce a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígeno profesionales.

Los principales tipos de células presentadoras de antígeno profesionales son las células dendríticas, que tienen el intervalo más amplio de presentación de antígenos, y son probablemente las células presentadoras de antígeno, macrófagos, células B y ciertas células epiteliales activadas más importantes. Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de las vías de presentación de antígenos del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral. Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que se pueden usar como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígeno con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor de Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de las moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T, tales como el MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB). La maduración de las células dendríticas se conoce como el estado de activación de las células dendríticas en el que dichas células dendríticas presentadoras de antígeno conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por las células dendríticas inmaduras produce tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de las células dendríticas por CD40L, y sustancias liberadas de las células que sufren una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden obtener cultivando células de médula ósea in vitro con citocinas, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

Las células presentadoras de antígeno no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II necesarias para la interacción con células T no modificadas; estas se expresan solo tras la estimulación de las células presentadoras de antígeno no profesionales por ciertas citocinas tales como IPNy.

Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula que presenta un antígeno" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula enferma, por ejemplo, una célula cancerosa, o una célula presentadora de antígeno que presenta un antígeno o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo, por procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, en particular moléculas del MHC de clase I. De manera similar, los términos "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" denotan una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I. La presentación de un antígeno por una célula puede efectuarse transfectando la célula con un ácido nucleico como el ARN que codifica el antígeno.

Por "fragmento de un antígeno que se presenta" o expresiones similares se entiende que el fragmento puede ser presentado por MHC de clase I o clase II, preferiblemente MHC de clase I, por ejemplo, cuando se agrega directamente a las células presentadoras de antígeno. Opcionalmente, el fragmento es un fragmento que es naturalmente presentado por células que expresan un antígeno.

"Célula objetivo" significará una célula que es un blanco para una respuesta inmune tal como una respuesta inmune celular. Las células objetivo incluyen células que presentan un antígeno, es decir, un fragmento de péptido derivado de un antígeno, e incluyen cualquier célula indeseable, tal como una célula cancerosa. Preferiblemente, la célula objetivo es una célula que expresa un antígeno como se describe en el presente documento y presenta preferiblemente dicho antígeno con MHC de clase I.

El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o una proteína, el término "porción" de la misma puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferiblemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos el 80% y lo más preferiblemente al menos 90% de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, si la porción es una fracción discontinua, dicha fracción discontinua se compone de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más partes de una estructura, siendo cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede estar compuesta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, preferiblemente no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en la que cada parte preferiblemente comprende al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.

Los términos "parte" y "fragmento" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura preferiblemente comprende una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo, péptido o proteína es preferiblemente inmunológicamente equivalente al epítopo, péptido o proteína del que se deriva. Una "parte" de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos preferiblemente comprende, preferiblemente consta de al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 94%, al menos 96%, al menos 98%, al menos 99% de toda la estructura o secuencia de aminoácidos.

El término "célula efectora", "célula efectora inmune" o "célula inmunorreactiva" se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmune. Una "célula inmunorreactiva" preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o un fragmento peptídico del mismo (por ejemplo, un epítopo de células T) y mediar una respuesta inmune. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, secretan anticuerpos, reconocen células cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T colaboradoras, células T que infiltran tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferiblemente, las células inmunorreactivas son células T, preferiblemente células T CD4+ y/o CD8+.

Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un fragmento de péptido del mismo con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas del MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células cancerosas. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un fragmento de péptido del mismo sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (célula T CD4+) que porta receptores que reconocen un antígeno o un fragmento de péptido del mismo en el contexto de moléculas del m Hc de clase II, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis de células mediada por perforina. La capacidad de respuesta de CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, sobrerregulación de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígeno. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar usando un informador artificial que indique con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Dichos CTL que reconocen un antígeno o un fragmento de antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan "CTL sensibles al antígeno" en el presente documento. Si la célula es una célula B, dicha capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.

Los términos "célula T" y "linfocito T" se utilizan indistintamente en el presente documento e incluyen células T colaboradoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales, por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T colaboradoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T colaboradoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas del MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). Una vez activados, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmune activa.

Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+ porque expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas de péptidos separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a-TCR y p-TCR. Las células T y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T y6, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 6. Este grupo de células T es mucho menos común (2% del total de células T) que las células T ap.

El término "receptor de antígeno" incluye receptores de origen natural tales como receptores de células T así como receptores modificados, que confieren una especificidad arbitraria tal como la especificidad de un anticuerpo monoclonal sobre una célula efectora tal como una célula T. De esta manera, se puede generar un gran número de células T específicas de antígeno para la transferencia de células adoptivas. Por lo tanto, un receptor de antígeno puede estar presente en las células T, por ejemplo, en lugar de o además del propio receptor de células T de las células T. Tales células T no requieren necesariamente el procesamiento y la presentación de un antígeno para el reconocimiento de la célula objetivo, sino que pueden reconocer preferiblemente con especificidad cualquier antígeno presente en una célula objetivo. Preferiblemente, dicho receptor de antígeno se expresa en la superficie de las células. Las células T que comprenden un receptor de antígeno modificado están comprendidas por el término "célula T" como se usa en este documento. Específicamente, el término "receptor de antígeno" incluye receptores artificiales que comprenden una sola molécula o un complejo de moléculas que reconocen, es decir, se unen a, una estructura objetivo (por ejemplo, un antígeno) en una célula objetivo, tal como una célula cancerosa (por ejemplo, mediante la unión de un sitio de unión a antígeno o dominio de unión a antígeno a un antígeno expresado en la superficie de la célula objetivo) y puede conferir especificidad a una célula efectora tal como una célula T que expresa dicho receptor de antígeno en la superficie celular. Preferiblemente, el reconocimiento de la estructura objetivo por un receptor de antígeno da como resultado la activación de una célula efectora que expresa dicho receptor de antígeno. Un "receptor de antígeno" puede ser un "receptor de antígeno quimérico (CAR)", "receptor de célula T quimérico" o "receptor de célula T artificial".

El antígeno puede ser reconocido por un receptor de antígeno a través de cualquier dominio de reconocimiento de antígeno (en el presente documento también denominado simplemente "dominios") capaz de formar un sitio de unión a antígeno tal como a través de porciones de unión a antígeno de anticuerpos y receptores de células T que pueden residir en la misma o diferentes cadenas de péptidos. Opcionalmente, los dos dominios que forman un sitio de unión al antígeno se derivan de una inmunoglobulina. Alternativamente, los dos dominios que forman un sitio de unión al antígeno se derivan de un receptor de células T. Particularmente preferidos son los dominios variables de anticuerpos, tales como fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales y dominios variables de receptores de células T, en particular cadenas simples alfa y beta de TCR. De hecho, casi cualquier cosa que se una a un objetivo determinado con alta afinidad se puede utilizar como dominio de reconocimiento de antígenos.

La primera señal de activación de las células T se proporciona mediante la unión del receptor de las células T a un péptido corto presentado por el MHC en otra célula. Esto asegura que solo se active una célula T con un TCR específico para ese péptido. La célula compañera suele ser una célula presentadora de antígeno, tal como una célula presentadora de antígeno profesional, generalmente una célula dendrítica en el caso de respuestas no modificadas, aunque las células B y los macrófagos pueden ser APC importantes.

Una molécula es capaz de unirse a una objetivo si tiene una afinidad significativa por dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" se mide a menudo mediante la constante de disociación de equilibrio (K^d). Una molécula no es (sustancialmente) capaz de unirse a un objetivo si no tiene una afinidad significativa por dicho objetivo y no se une significativamente a dicho objetivo en ensayos estándar.

Los linfocitos T citotóxicos pueden generarse in vivo mediante la incorporación de un antígeno o un fragmento de péptido del mismo en células presentadoras de antígeno in vivo. El antígeno o un fragmento de péptido del mismo se puede representar como proteína, tal como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno puede procesarse para producir un compañero de péptido para la molécula del MHC, mientras que puede presentarse un fragmento del mismo sin necesidad de procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si estos pueden unirse a moléculas del MHC. En general, es posible la administración a un paciente mediante inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también puede llevarse a cabo intranodalmente en un ganglio linfático (Maloy et al.,. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303). Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por linfocitos T citotóxicos autólogos que luego se propagan.

La activación específica de células T CD4+ o CD8+ puede detectarse de diversas formas. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas) o la generación de actividad citolítica. Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación específica de las células T es la detección de la proliferación de las células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación específica de las células T es la detección de la generación de actividad citolítica.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente, tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente, exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico, tal como la inducción de una respuesta inmune humoral y/o celular, la fuerza y/o duración de la reacción inmune inducida, o la especificidad de la reacción inmune inducida. El término "inmunológicamente equivalente" se usa preferiblemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicas de un péptido usado para inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos cuando se expone al sistema inmune de un sujeto induce una reacción inmune que tiene la especificidad de reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia.

El término "funciones efectoras inmunes" incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmune que dan como resultado, por ejemplo, la destrucción de células tumorales o la inhibición del crecimiento tumoral y/o la inhibición del desarrollo tumoral, incluida la inhibición de diseminación tumoral y metástasis. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T colaboradora (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un fragmento de antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase II por receptores de células T, la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL, el reconocimiento de un antígeno o un fragmento de antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase I por receptores de células T, la eliminación de las células presentadas en el contexto de las moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, y destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígenos.

En general, las proteínas que son expresadas por células enfermas se evalúan con respecto a su utilidad en inmunoterapia. Se puede usar una proteína con utilidad prevista para inmunoterapia para proporcionar una vacuna que comprende la proteína o uno o más fragmentos peptídicos de la misma, en particular uno o más péptidos de unión al MHC (potencial) de la proteína.

El término "distribución" se refiere a un estado de localización. El término "determinar la distribución o localización", en particular, comprende una determinación o predicción del estado de localización, por ejemplo, una determinación o predicción de la localización subcelular o abundancia de un péptido, proteína o ácido nucleico tal como una determinación o predicción de si un péptido, proteína o ácido nucleico está localizado o es abundante en el citosol y/o dentro de exosomas in vivo.

Los términos como "predecir", "que predice" o "predicción" se relacionan con la determinación de una probabilidad.

La predicción de la utilidad de una proteína o un fragmento de la misma expresada por células enfermas para inmunoterapia puede comprender uno o más de los siguientes: (i) determinar la distribución o localización de la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o de un fragmento de la proteína, tal como determinar si la proteína o un ácido nucleico que la codifica, o un fragmento de la proteína está localizada o es abundante en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo, (ii) determinar si la proteína o un fragmento de la misma es presentada en forma cruzada por células presentadoras de antígeno, preferiblemente células presentadoras de antígeno profesionales, (iii) determinar una respuesta de anticuerpo existente a la proteína o un fragmento de la misma, (iv) determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une a la actina F, (v) determinar si la proteína o un fragmento de la misma se une al ARN. Opcionalmente, la determinación de si una proteína o un ácido nucleico que la codifica, o un fragmento de la proteína está localizada o es abundante dentro de los exosomas in vivo, se realiza obteniendo una muestra de fluidos extracelulares, aislando exosomas, por ejemplo mediante centrifugación diferencial, aislando proteínas o ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante electroforesis en gel e identificando dicha proteína o un fragmento de la misma, por ejemplo, mediante espectrometría de masas, ELISA, citometría de flujo, matriz de anticuerpos o transferencia Western o identificación de un ácido nucleico que codifica dicha proteína, por ejemplo, mediante microarreglos, secuenciación de ARN o RT-PCR. Alternativamente, la determinación de si una proteína o un ácido nucleico que lo codifica, o un fragmento de la proteína está localizado o es abundante dentro de los exosomas in vivo, se realiza extrayendo la información de una base de datos recolectando datos de experimentos como se describe en esta sección anterior como por ejemplo, ExoCarta (Keerthikumar, S, et al., J. Mol. Biol. 428, 688 (2016)).

Opcionalmente, la determinación de una respuesta de anticuerpo existente se puede realizar usando SEREX. SEREX significa identificación serológica de antígenos mediante clonación de expresión recombinante y es un método para identificar antígenos tumorales mediante el cribado de anticuerpos de sueros de pacientes para el reconocimiento de una biblioteca de fagos transducidos con ADNc derivado de tumores. Esta técnica utiliza una biblioteca de presentación en fagos para expresar una gran variedad de antígenos potenciales de un paciente. Los antígenos se transfieren a una superficie bidimensional que permite su mapeo a clones específicos. La superficie se incuba con sueros de pacientes autólogos. Los clones inmunorreactivos se localizan, cultivan y secuencian (Sahin, U, et al., PNAS 92, 11810 (1995)).

La presente divulgación también puede comprender la ruptura de secuencias de proteínas en fragmentos apropiados para la unión del MHC y determinar las puntuaciones para la unión de los fragmentos a una o más moléculas del MHC. Las salidas pueden clasificarse y pueden consistir en una lista de péptidos y sus puntuaciones previstas, lo que indica su probabilidad de unión. En general, las proteínas son particularmente útiles para la inmunoterapia si contienen uno o más péptidos de unión al MHC (potencial).

Los métodos descritos en este documento se pueden realizar para un paciente, tal como un paciente con cáncer, por ejemplo, en una muestra de tumor de un paciente, tal como un paciente con cáncer.

Una proteína o un fragmento de proteína descrito en el presente documento contiene preferiblemente al menos una modificación de aminoácido. Las modificaciones de aminoácidos cuya utilidad para la inmunoterapia se va a determinar o que se van a seleccionar y/o clasificar de acuerdo con su inmunogenicidad predicha pueden resultar de mutaciones en el ácido nucleico de una célula. Tales mutaciones pueden identificarse mediante técnicas de secuenciación conocidas.

Opcionalmente, las mutaciones son mutaciones somáticas específicas de cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer que pueden determinarse identificando diferencias de secuencia entre el genoma, exoma y/o transcriptoma de una muestra de tumor y el genoma, exoma y/o transcriptoma de un espécimen no tumorigénico.

Una muestra de tumor se refiere a cualquier muestra tal como una muestra corporal derivada de un paciente que contiene o se espera que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido tal como sangre, una muestra de tejido obtenida del tumor primario o de metástasis tumorales o cualquier otra muestra que contenga células tumorales o cancerosas. Preferiblemente, una muestra corporal es sangre y se determinan mutaciones somáticas específicas de cáncer o diferencias de secuencia en una o más células tumorales circulantes (CTC) contenidas en la sangre. Alternativamente, una muestra de tumor se relaciona con uno o más células tumorales o cancerosas aisladas, tal como las células tumorales circulantes (CTC) o una muestra que contiene una o más células tumorales o cancerosas aisladas, tal como las células tumorales circulantes (CTC).

Una muestra no tumoral se refiere a cualquier muestra tal como una muestra corporal derivada de un paciente u otro individuo que preferiblemente es de la misma especie que el paciente, preferiblemente un individuo sano que no contiene o no se espera que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido tal como sangre o una muestra de un tejido no tumorigénico.

La divulgación puede implicar la determinación de la firma de mutación del cáncer de un paciente. El término "firma de mutación del cáncer" puede referirse a todas las mutaciones de cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente o puede referirse solo a una parte de las mutaciones cancerosas presentes en una o más células cancerosas de un paciente. Por consiguiente, la presente divulgación puede implicar la identificación de todas las mutaciones específicas del cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente o puede implicar la identificación de solo una parte de las mutaciones específicas del cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente. Generalmente, los métodos descritos en este documento proporcionan la identificación de una serie de mutaciones que proporcionan un número suficiente de modificaciones o proteínas modificadas para ser incluidas en los métodos descritos en este documento.

Preferiblemente, las mutaciones identificadas son mutaciones no sinónimas, preferiblemente mutaciones no sinónimas de proteínas expresadas en un tumor o célula cancerosa.

Opcionalmente, las mutaciones somáticas específicas de cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el genoma, preferiblemente el genoma completo, de una muestra de tumor. Por lo tanto, la divulgación puede comprender identificar la firma de mutación del cáncer del genoma, preferiblemente el genoma completo de una o más células cancerosas. Opcionalmente, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación de cáncer de todo el genoma.

Opcionalmente, las mutaciones somáticas específicas de cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el exoma, preferiblemente en todo el exoma, de una muestra de tumor. Por lo tanto, la divulgación puede comprender identificar la firma de mutación del cáncer del exoma, preferiblemente el exoma completo de una o más células cancerosas. Opcionalmente, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación de cáncer en todo el exoma.

Opcionalmente, las mutaciones somáticas específicas de cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el transcriptoma, preferiblemente el transcriptoma completo, de una muestra de tumor. Por lo tanto, la divulgación puede comprender identificar la firma de mutación del cáncer del transcriptoma, preferiblemente el transcriptoma completo de una o más células cancerosas. Opcionalmente, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación de cáncer en todo el transcriptoma.

Opcionalmente, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer o identificar diferencias de secuencia comprende la secuenciación de una sola célula de una o más, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más células cancerosas. Por lo tanto, la divulgación puede comprender identificar una firma de mutación de cáncer de dichas una o más células cancerosas. Opcionalmente, las células cancerosas son células tumorales circulantes. Las células cancerosas, tales como las células tumorales circulantes, pueden aislarse antes de la secuenciación de células individuales.

Opcionalmente, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer o identificar diferencias de secuencia implica el uso de secuenciación de próxima generación (NGS).

Opcionalmente, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer o identificar diferencias de secuencia comprende secuenciar el ADN genómico y/o el ARN de la muestra de tumor.

Para revelar mutaciones somáticas específicas de cáncer o diferencias de secuencia, la información de secuencia obtenida de la muestra de tumor se compara preferiblemente con una referencia tal como la información de secuencia obtenida de la secuenciación de ácidos nucleicos tales como ADN o ARN de células normales no cancerosas tal como células de línea germinal que pueden obtenerse del paciente o de un individuo diferente. Opcionalmente, el ADN de la línea germinal genómica normal se obtiene a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

El término "genoma" se refiere a la cantidad total de información genética en los cromosomas de un organismo o una célula.

El término "exoma" se refiere a parte del genoma de un organismo formado por exones, que son porciones codificantes de genes expresados. El exoma proporciona el modelo genético utilizado en la síntesis de proteínas y otros productos genéticos funcionales. Es la parte más funcionalmente relevante del genoma y, por lo tanto, es más probable que contribuya al fenotipo de un organismo. Se estima que el exoma del genoma humano comprende el 1,5% del genoma total (Ng, PC et al., PLoS Gen., 4 (8): 1-15, 2008).

El término "transcriptoma" se refiere al conjunto de todas las moléculas de ARN, incluyendo ARNm, ARNr, ARNt y otro ARN no codificante producido en una célula o una población de células. El transcriptoma significa el conjunto de todas las moléculas de a Rn producidas en una célula, una población de células, preferiblemente una población de células cancerosas, o todas las células de un individuo dado en un momento determinado.

Un "ácido nucleico" es preferiblemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), más preferiblemente ARN, lo más preferiblemente ARN transcrito in vitro (ARN TIV) o ARN sintético. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas recombinantemente y sintetizadas químicamente. Un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria y lineal o covalentemente cerrada circularmente. Puede aislarse un ácido nucleico. El término "ácido nucleico aislado" significa que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y la separación por electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Puede emplearse un ácido nucleico para la introducción en, es decir, la transfección de células, en particular, en forma de a Rn que puede prepararse mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN puede modificarse antes de la aplicación mediante la estabilización de las secuencias, la protección y la poliadenilación.

El término "material genético" se refiere a un ácido nucleico aislado, ya sea ADN o ARN, una sección de una doble hélice, una sección de un cromosoma o el genoma completo de un organismo o célula, en particular su exoma o transcriptoma.

El término "mutación" se refiere a un cambio o diferencia en la secuencia de ácido nucleico (sustitución, adición o eliminación de nucleótidos) en comparación con una referencia. Una "mutación somática" puede ocurrir en cualquiera de las células del cuerpo, excepto en las células germinales (esperma y óvulo) y, por lo tanto, no se transmite a los niños. Estas alteraciones pueden (pero no siempre) causar cáncer u otras enfermedades. Preferiblemente, una mutación es una mutación no sinónima. El término "mutación no sinónima" se refiere a una mutación, preferiblemente una sustitución de nucleótidos, que da como resultado un cambio de aminoácido tal como una sustitución de aminoácido en el producto de traducción.

El término "mutación" incluye mutaciones puntuales, Indeles, fusiones, cromotripsis y ediciones de ARN.

El término "Indel" describe una clase de mutación especial, definida como una mutación que da como resultado una inserción y eliminación colocalizada y una ganancia o pérdida neta de nucleótidos. En las regiones codificantes del genoma, a menos que la longitud de un indel sea un múltiplo de 3, producen una mutación por desplazamiento de marco. Los indeles se pueden contrastar con una mutación puntual; en la que un Indel inserta y elimina nucleótidos de una secuencia, una mutación puntual es una forma de sustitución que reemplaza uno de los nucleótidos.

Las fusiones pueden generar genes híbridos formados a partir de dos genes previamente separados. Puede ocurrir como resultado de una translocación, eliminación intersticial o inversión cromosómica. A menudo, los genes de fusión son oncogenes. Los genes de fusión oncogénicos pueden conducir a un producto génico con una función nueva o diferente a la de los dos compañeros de fusión. Alternativamente, un protooncogén se fusiona con un promotor fuerte y, por lo tanto, la función oncogénica se establece para que funcione mediante una sobrerregulación causada por el promotor fuerte del compañero de fusión secuencia arriba. Las transcripciones de fusión oncogénicas también pueden ser causadas por eventos de empalme trans o de lectura completa.

El término "cromotripsis" se refiere a un fenómeno genético por el cual regiones específicas del genoma se rompen y luego se unen mediante un solo evento devastador.

El término "edición de ARN" se refiere a procesos moleculares en los que el contenido de información en una molécula de ARN se altera mediante un cambio químico en la composición de la base. La edición de ARN incluye modificaciones de nucleósidos tales como desaminaciones de citidina (C) a uridina (U) y adenosina (A) a inosina (I), así como adiciones e inserciones de nucleótidos sin plantilla. La edición de ARN en los ARNm altera eficazmente la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada para que difiera de la predicha por la secuencia de ADN genómico.

El término "firma de mutación del cáncer" se refiere a un conjunto de mutaciones que están presentes en las células cancerosas en comparación con las células de referencia no cancerosas.

Se puede usar una "referencia" para correlacionar y comparar los resultados de una muestra de tumor. Normalmente, la "referencia" puede obtenerse sobre la base de una o más muestras normales, en particular muestras que no se ven afectadas por una enfermedad cancerosa, obtenidas de un paciente o de uno o más individuos diferentes, preferiblemente individuos sanos, en particular individuos de la misma especie. Una "referencia" se puede determinar empíricamente analizando un número suficientemente grande de muestras normales.

Puede usarse cualquier método de secuenciación adecuado para determinar mutaciones, prefiriéndose las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS). Los métodos de secuenciación de tercera generación podrían sustituir a la tecnología NGS en el futuro para acelerar la etapa de secuenciación del método. Para fines de aclaración: los términos "secuenciación de próxima generación" o "NGS" se refieren a todas las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que, en contraste con la metodología de secuenciación "convencional" conocida como química de Sanger, leen plantillas de ácido nucleico aleatoriamente en paralelo a lo largo de todo el genoma mediante rompimiento del genoma completo en pequeños pedazos. Dichas tecnologías NGS (también conocidas como tecnologías de secuenciación masivamente paralela) pueden entregar información de la secuencia de ácidos nucleicos de un genoma completo, exoma, transcriptoma (todas las secuencias transcritas de un genoma) o metiloma (todas las secuencias metiladas de un genoma) en períodos de tiempo muy cortos, por ejemplo dentro de 1-2 semanas, preferiblemente dentro de 1-7 días o más preferiblemente dentro de menos de 24 horas y permitir, en principio, enfoques de secuenciación de células individuales. Se pueden utilizar múltiples plataformas NGS que están disponibles comercialmente o que se mencionan en la literatura, por ejemplo, las descritos en detalle en Zhang et al., 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; o en Voelkerding et al., 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Ejemplos no limitativos de tales tecnologías/plataformas NGS son

1) La tecnología de secuenciación por síntesis conocida como pirosecuenciación implementada por ejemplo, en el Secuenciador de genoma GS-FLX 454MR de la empresa 454 Life Sciences asociada a Roche, (Branford, Connecticut) descrito por primera vez en Ronaghi et al., 1998: "A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. Esta tecnología utiliza una PCR en emulsión en la que las perlas de unión a ADN monocatenarias se encapsulan mediante agitación vigorosa en micelas acuosas que contienen reactivos de PCR rodeados de aceite para la amplificación por PCR en emulsión. Durante el proceso de pirosecuenciación, la luz emitida por las moléculas de fosfato durante la incorporación de nucleótidos se registra cuando la polimerasa sintetiza la hebra de ADN.

2) Los enfoques de secuenciación por síntesis desarrollados por Solexa (ahora parte de Illumina Inc., San Diego, California) que se basan en terminadores de colorante reversibles e implementados por ejemplo, en el Analyzer GenomeMR de Illumina/Solexa y en el HiSeq 2000 Genome AnalyzerMR de Illumina. En esta tecnología, los cuatro nucleótidos se agregan simultáneamente en fragmentos de racimo cebados con oligo en canales de celdas de flujo junto con la ADN polimerasa. La amplificación de puente extiende las cadenas de grupos con los cuatro nucleótidos marcados con fluorescencia para la secuenciación.

3) Enfoques de secuenciación por ligadura, por ejemplo, implementado en la plataforma SOLidMR de Applied Biosystems (ahora Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). En esta tecnología, un grupo de todos los posibles oligonucleótidos de una longitud fija se marca de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se hibridan y se ligan; la ligadura preferencial por ADN ligasa para emparejar secuencias da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica mediante PCR en emulsión. La perla resultante, cada una de las cuales contiene solo copias de la misma molécula de ADN, se deposita en un portaobjetos de vidrio. Como segundo ejemplo, la plataforma PolonatorMR G.007 de Dover Systems (Salem, New Hampshire) también emplea un enfoque de secuenciación por ligación mediante el uso de una PCR en emulsión basada en perlas y ordenada al azar para amplificar fragmentos de ADN para secuenciación paralela.

4) Tecnologías de secuenciación de una sola molécula, tales como por ejemplo, la implementada en el sistema PacBio RS de Pacific Biosciences (Menlo Park, California) o en la plataforma HeliScopeMR de Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). La característica distintiva de esta tecnología es su capacidad para secuenciar moléculas simples de ADN o ARN sin amplificación, definida como secuenciación de ADN en tiempo real de una sola molécula (SMRT). Por ejemplo, HeliScope utiliza un sistema de detección de fluorescencia de alta sensibilidad para detectar directamente cada nucleótido a medida que se sintetiza. Un enfoque similar basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se ha desarrollado en Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Otras técnicas de molécula única basadas en fluorescencia son de U.S. Genomics (GeneEngineMR) y Genovoxx (AnyGeneMR).

5) Nanotecnologías para la secuenciación de una sola molécula en las que se utilizan diversas nanoestructuras que están por ejemplo, dispuestas en un chip para monitorear el movimiento de una molécula de polimerasa en una sola hebra durante la replicación. Ejemplos no limitativos de enfoques basados en nanotecnologías son la plataforma GridONMR de Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido), las plataformas de secuenciación de nanoporos asistida por hibridación (HANSMR) desarrolladas por Nabsys (Providence, Rhode Island), y la plataforma patentada de secuenciación de ADN basada en ligasa con tecnología de nanoesferas de ADN (DNB) denominada ligadura combinatoria de sonda-anclaje (cPALMR).

6) Tecnologías basadas en microscopía electrónica para secuenciación de una sola molécula, por ejemplo, las desarrolladas por LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) y Halcyon Molecular (Redwood City, California). 7) Secuenciación de semiconductores de iones que se basa en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN. Por ejemplo, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) utiliza una matriz de alta densidad de pozos micromecanizados para realizar este proceso bioquímico de forma masivamente paralela. Cada pozo contiene una plantilla de ADN diferente. Debajo de los pozos hay una capa sensible a los iones y debajo de ella un sensor de iones patentado.

Preferiblemente, las preparaciones de ADN y ARN sirven como material de partida para NGS. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse fácilmente a partir de muestras tales como material biológico, por ejemplo, de tejidos tumorales incrustados en parafina recién congelados en forma ultrarrápida o fijados en formalina (FFPE) o partir de células recién aisladas o de CTC que están presentes en la sangre periférica de los pacientes. El ADN o a Rn genómico no mutado normal puede extraerse de tejido somático normal, sin embargo, se prefieren las células de la línea germinal. El ADN o ARN de la línea germinal se puede extraer de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en pacientes con neoplasias malignas no hematológicas. Aunque los ácidos nucleicos extraídos de tejidos FFPE o células individuales recién aisladas están muy fragmentados, son adecuados para aplicaciones de NGS.

En la literatura se describen varios métodos de NGS dirigidos para la secuenciación del exoma (para una revisión, véase, por ejemplo, Teer y Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51), todos los cuales pueden usarse. Muchos de estos métodos (descritos, por ejemplo, como captura del genoma, partición del genoma, enriquecimiento del genoma, etc.) utilizan técnicas de hibridación e incluyen enfoques de hibridación basados en matrices (por ejemplo, Hodges et al., 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) y basadas en líquidos (por ejemplo, Choi et al., 2009: Proc. Natl.

Acad. Sci USA 106, 19096-19101). También hay disponibles kits comerciales para la preparación de muestras de ADN y la posterior captura del exorna: por ejemplo, Illumina Inc. (San Diego, California) ofrece el kit de preparación de muestras de ADN TruSeqMR y el kit de enriquecimiento de exornas Exome Enrichment Kit TruSeqMR

Con el fin de reducir el número de hallazgos falsos positivos en la detección de mutaciones somáticas específicas de cáncer o diferencias de secuencia al comparar, por ejemplo, la secuencia de una muestra de tumor con la secuencia de una muestra de referencia tal como la secuencia de una muestra de línea germinal, se prefiere determinar la secuencia en réplicas de uno o ambos tipos de muestras. Por lo tanto, se prefiere que la secuencia de una muestra de referencia, tal como la secuencia de una muestra de línea germinal, se determine dos veces, tres veces o más. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de una muestra de tumor se determina dos veces, tres veces o más. También puede ser posible determinar la secuencia de una muestra de referencia, tal como la secuencia de una muestra de línea germinal y/o la secuencia de una muestra de tumor más de una vez, determinando al menos una vez la secuencia en el ADN genómico y determinando al menos una vez la secuencia en ARN de dicha muestra de referencia y/o de dicha muestra tumoral. Por ejemplo, al determinar las variaciones entre réplicas de una muestra de referencia, tal como una muestra de línea germinal, se puede estimar la tasa esperada de mutaciones somáticas de falso positivo (FDR) como una cantidad estadística. Las repeticiones técnicas de una muestra deben generar resultados idénticos y cualquier mutación detectada en esta "comparación igual contra igual" es un falso positivo. En particular, para determinar la tasa de descubrimiento falso para la detección de mutaciones somáticas en una muestra de tumor en relación con una muestra de referencia, se puede usar una repetición técnica de la muestra de referencia como referencia para estimar el número de falsos positivos. Además, varias métricas relacionadas con la calidad (por ejemplo, cobertura o calidad de SNP) se pueden combinar en una única puntuación de calidad utilizando un enfoque de aprendizaje automático. Para una variación somática determinada, se pueden contar todas las demás variaciones con una puntuación de calidad superior, lo que permite clasificar todas las variaciones en un conjunto de datos.

El término "ARN" se refiere a una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótido. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ARN" comprende ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado, tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado de forma recombinante, tal como ARN modificado, que se diferencia del ARN natural por adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el o los extremos de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos de ARN de origen natural.

El término "ARN" incluye y preferiblemente se refiere a "ARNm". El término "ARNm" significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que se genera utilizando una plantilla de ADN y codifica un péptido o polipéptido. Normalmente, un ARNm comprende una 5'-UTR, una región codificante de proteína, una 3'-UTR y opcionalmente una cola de poli (A). El ARNm solo posee una vida media limitada en células e in vitro. El ARNm se puede generar mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. El experto en la materia conoce la metodología de transcripción in vitro. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.

La estabilidad y la eficacia de traducción del ARN se pueden modificar según se requiera. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse y su traducción aumentada mediante una o más modificaciones que tienen efectos estabilizadores y/o un aumento de la eficiencia de traducción del ARN. Tales modificaciones se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP2006/009448. Para aumentar la expresión del ARN utilizado, puede modificarse dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresados, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresados, para aumentar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y para realizar una optimización de codones y, por lo tanto, mejorar la traducción en las células.

El término "modificación" en el contexto del ARN utilizado incluye cualquier modificación de un ARN que no esté presente de forma natural en dicho ARN.

Opcionalmente, el ARN utilizado no tiene 5'-trifosfatos sin protección. La eliminación de tales 5'-trifosfatos sin protección se puede lograr tratando el ARN con una fosfatasa.

El ARN puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en el ARN utilizado, la 5-metilcitidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Alternativa o adicionalmente, en el ARN utilizado se sustituye la pseudouridina parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina.

Opcionalmente, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con un protector de 5' o análogo de protector de 5'. El término " de protector de 5'" se refiere a una estructura protectora que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARNm mediante un enlace trifosfato inusual 5' a 5'. Opcionalmente, esta guanosina se metila en la posición 7. El término "protector de 5' convencional" se refiere a un protector de 5' de ARN de origen natural, preferiblemente al protector de 7-metilguanosina (m7G). El término "protector de 5'" incluye un análogo de protector de 5' que se asemeja a la estructura de protección del ARN y está modificada para poseer la capacidad de estabilizar el ARN y/o mejorar la traducción del ARN si está unido al mismo, preferiblemente in vivo y/o en un célula.

La provisión de un ARN con un protector de 5' o un análogo de protector de 5' puede lograrse mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN en presencia de dicho protector de 5' o análogo de protector de 5', en el que dicho protector de 5' se incorpora cotranscripcionalmente en la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante transcripción in vitro, y el protector de 5' puede unirse al ARN postranscripcionalmente usando enzimas de protección, por ejemplo, enzimas de protección del virus vaccinia.

El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN utilizado puede ser una extensión o truncamiento de la cola de poli(A) que se produce naturalmente o una alteración de las regiones 5' o 3' no traducidas (UTR), tal como la introducción de una UTR que no está relacionado con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente con o la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tal como alfa 2-globina, alfa1-globina, betaglobina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

El ARN que tiene una secuencia de poli-A sin enmascarar se traduce de manera más eficaz que el ARN que tiene una secuencia de poli-A enmascarada. El término "cola de poli(A)" o "secuencia de poli-A" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que típicamente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia de poli-A sin enmascarar" significa que la secuencia de poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia de poli-A y no va seguida de nucleótidos distintos de A ubicados en el extremo 3', es decir, secuencia abajo, de la secuencia de poli-A. Además, una secuencia de poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficiencia de traducción óptimas del ARN.

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia de poli-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. Se prefiere especialmente que la secuencia de poli-A tenga una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado, se puede desenmascarar la secuencia de poli-A.

Además, la incorporación de una región 3' no traducida (UTR) en la región 3' no traducida de una molécula de ARN puede dar como resultado una mejora en la eficacia de la traducción. Se puede lograr un efecto sinérgico incorporando dos o más de dichas regiones 3' no traducidas. Las regiones 3' no traducidas pueden ser autólogas o heterólogas al ARN en el que se introducen. Opcionalmente, la región 3' no traducida se deriva del gen de la p-globina humana.

Una combinación de las modificaciones descritas anteriormente, es decir, la incorporación de una secuencia de poli-A, desenmascarando una secuencia de poli-A y la incorporación de una o más regiones 3' no traducidas, tiene una influencia sinérgica sobre la estabilidad del ARN y aumento de la eficiencia de la traducción.

El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. La vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tenga una vida media larga se exprese durante un período de tiempo prolongado.

Por supuesto, si se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos descritos anteriormente aumentando la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN.

El término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos, polipéptidos o proteínas, por ejemplo, por transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos, polipéptidos o proteínas. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

El término expresión también incluye una "expresión aberrante" o "expresión anormal". "Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa que la expresión se altera, preferiblemente aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una determinada proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de expresión se refiere a un aumento de al menos un 10%, en particular al menos un 20%, al menos un 50% o al menos un 100% o más. Opcionalmente, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.

El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa principalmente en la mucosa gástrica y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en un grado significativo en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, tal como los testículos, se expresa específicamente en células de la mucosa gástrica. Opcionalmente, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente en condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejido u órganos, pero preferiblemente en no más de 3 tipos de tejido u órganos diferentes. En este caso, el antígeno tumoral se expresa específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa en condiciones normales preferiblemente en una extensión aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.

El término "transcripción" se refiere a un proceso, en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. El término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en el que el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema sin células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcripciones. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y están englobados por el término "vector". El ARN usado es preferiblemente ARN transcrito in vitro (ARN TIV) y puede obtenerse mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferiblemente, la transcripción in vitro está controlada por un promotor T7 o SP6. Puede obtenerse una plantilla de ADN para la transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc se puede obtener mediante transcripción inversa de ARN.

El término "traducción" se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido, polipéptido o proteína.

Las secuencias de control de la expresión o las secuencias reguladoras, que pueden estar unidas funcionalmente con un ácido nucleico, pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas "funcionalmente" si están unidas covalentemente, de modo que la transcripción o traducción de la secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia codificante se va a traducir en una proteína funcional, con enlace funcional de una secuencia reguladora con la secuencia codificante, la inducción de la secuencia reguladora conduce a una transcripción de la secuencia codificante, sin provocar un cambio de marco de lectura en la secuencia codificante o incapacidad de la secuencia codificante para traducirse en la proteína o péptido deseado.

El término "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora" comprende promotores, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control, que controlan la transcripción de un ácido nucleico o la traducción del ARN derivado. Opcionalmente, se pueden controlar las secuencias reguladoras. La estructura precisa de las secuencias reguladoras puede variar dependiendo de la especie o dependiendo del tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas, que están implicadas en el inicio de la transcripción o traducción, tales como Caja TATA, secuencia de protección, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras secuencia arriba.

Preferiblemente, el ARN que se va a expresar en una célula se introduce en dicha célula. Opcionalmente, el ARN que se va a introducir en una célula se obtiene mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiado.

Términos tales como "ARN capaz de expresarse" y "ARN que codifica" se usan indistintamente en este documento y con respecto a un péptido o polipéptido particular significa que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido. Preferiblemente, el ARN puede interactuar con la maquinaria de traducción celular para proporcionar el péptido o polipéptido que es capaz de expresar.

Términos tales como "transferir", "introducir" o "transfectar" se usan indistintamente en este documento y se refieren a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, en particular ARN en una célula. La célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo. La administración de un ácido nucleico se logra como ácido nucleico desnudo o en combinación con un reactivo de administración. Preferiblemente, la administración de ácidos nucleicos se realiza en forma de ácidos nucleicos desnudos. Preferiblemente, el ARN se administra en combinación con sustancias estabilizantes tales como inhibidores de RNasa. La presente divulgación también prevé la introducción repetida de ácidos nucleicos en las células para permitir una expresión sostenida durante períodos de tiempo prolongados.

Las células se pueden transfectar con cualquier portador con el que se pueda asociar ARN, por ejemplo, formando complejos con el ARN o formando vesículas en las que el ARN está encerrado o encapsulado, lo que da como resultado una mayor estabilidad del ARN en comparación con el ARN desnudo. Los portadores que son útiles incluyen, por ejemplo, portadores que contienen lípidos tales como lípidos catiónicos, liposomas, en particular liposomas catiónicos y micelas y nanopartículas. Los lípidos catiónicos pueden formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente. Puede usarse cualquier lípido catiónico.

Preferiblemente, la introducción de ARN que codifica un péptido o polipéptido en una célula, en particular en una célula presente in vivo, da como resultado la expresión de dicho péptido o polipéptido en la célula. Opcionalmente, se prefiere el direccionamiento de los ácidos nucleicos a células particulares. Opcionalmente, un portador que se aplica para la administración del ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) exhibe una molécula de direccionamiento. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo que es específico para una proteína de la membrana de superficie en la célula objetivo o un ligando para un receptor en la célula objetivo puede incorporarse en el portador de ácido nucleico o puede unirse al mismo. En caso de que el ácido nucleico sea administrado por liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de superficie que está asociada con la endocitosis pueden incorporarse en la formulación del liposoma para permitir el direccionamiento y/o absorción. Dichas proteínas abarcan proteínas de la cápside de fragmentos de las mismas que son específicas para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteínas que están internalizadas, proteínas que se dirigen a una ubicación intracelular, etc.

El término "célula" o "célula huésped" es preferiblemente una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, orgánulos o material genético. Una célula intacta es preferiblemente una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente, dicho término se refiere a cualquier célula que pueda transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insectos). El ácido nucleico exógeno se puede encontrar dentro de la célula (i) libremente disperso como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o ADN mitocondrial. Se prefieren particularmente las células de mamífero, tales como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. Opcionalmente, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o macrófago.

Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferiblemente el péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico.

El término "expansión clonal" se refiere a un proceso en el que se multiplica una entidad específica. El término se usa preferiblemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

Términos tales como "reducir" o "inhibir" se refieren a la capacidad de provocar una disminución general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y más preferiblemente del 75% o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos tales como "aumentar", "mejorar", "promover" o "prolongar" se refieren preferiblemente a un aumento, mejora, promoción o prolongación en aproximadamente al menos un 10%, preferiblemente al menos un 20%, preferiblemente al menos un 30% , preferiblemente al menos un 40%, preferiblemente al menos un 50%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 100%, preferiblemente al menos un 200% y en particular al menos un 300%. Estos términos también pueden referirse a un aumento, mejora, promoción o prolongación desde cero o un nivel no medible o no detectable hasta un nivel de más de cero o un nivel que es medible o detectable.

La presente divulgación proporciona vacunas tales como vacunas contra el cáncer diseñadas sobre la base de proteínas preferiblemente modificadas o fragmentos de proteínas o modificaciones de aminoácidos que se predice que son útiles en inmunoterapia mediante los métodos descritos en este documento.

El término "vacuna" se refiere a una preparación farmacéutica (composición farmacéutica) o producto que tras la administración induce una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune celular, que reconoce y ataca a un patógeno o una célula enferma tal como una célula cancerosa. Se puede usar una vacuna para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. El término "vacuna contra el cáncer personalizada" o "vacuna contra el cáncer individualizada" se refiere a un paciente de cáncer particular y significa que una vacuna contra el cáncer se adapta a las necesidades o circunstancias especiales de un paciente de cáncer individual.

Opcionalmente, una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una o más modificaciones de aminoácidos o uno o más péptidos modificados que se predice que son útiles en inmunoterapia mediante los métodos descritos en este documento o un ácido nucleico, preferiblemente ARN, que codifica dicho péptido o polipéptido.

Las vacunas contra el cáncer proporcionadas de acuerdo con la divulgación cuando se administran a un paciente proporcionan preferiblemente uno o más epítopos de células T adecuados para estimular, cebar y/o expandir células T específicas para las células enfermas del paciente, tal como el tumor del paciente. Las células T se dirigen preferiblemente contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos de las células T. Las vacunas descritas en este documento son preferiblemente capaces de inducir o promover una respuesta celular, preferiblemente actividad de células T citotóxicas, contra una enfermedad cancerosa caracterizada por la presentación de uno o más neoantígenos asociados a tumores con MHC de clase I. Una vacuna dirigida a mutaciones específicas del cáncer será específica para el tumor del paciente.

Una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación se refiere a una vacuna que cuando se administra a un paciente proporciona preferiblemente uno o más epítopos de células T, tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más y preferiblemente hasta 60, hasta 55, hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 epítopos de células T, que incorporan modificaciones de aminoácidos o péptidos modificados predichos por ser inmunogénicos por los métodos descritos en este documento. Dichos epítopos de células T también se denominan "neoepítopos" en el presente documento. La presentación de estos epítopos por las células de un paciente, en particular las células presentadoras de antígeno, preferiblemente da como resultado que las células T se dirijan a los epítopos cuando se unen al MHC y, por lo tanto, al tumor del paciente, preferiblemente el tumor primario, así como las metástasis tumorales, que expresan antígenos de los cuales los epítopos de células T se derivan y presentan los mismos epítopos en la superficie de las células tumorales.

Los métodos descritos en este documento pueden comprender la etapa adicional de determinar la usabilidad de las modificaciones de aminoácidos identificadas o péptidos modificados para la vacunación contra el cáncer. Por lo tanto, las etapas adicionales pueden involucrar uno o más de los siguientes: (i) evaluar si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por MHC conocidos o predichos, (ii) probar in vitro y/o in silico si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por el MHC, por ejemplo, probar si las modificaciones son parte de secuencias peptídicas que se procesan y/o presentan como epítopos presentados por el MHC, y (iii) probar in vitro si los epítopos modificados previstos, en particular cuando están presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, cuando están flanqueadas por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en la proteína de origen natural, y cuando se expresan en células presentadoras de antígeno son capaces de estimular células T tales como células T del paciente que tienen la especificidad deseada. Cada una de dichas secuencias flanqueantes puede comprender 3 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo extremo terminal N y/o el extremo terminal C.

Los péptidos modificados determinados de acuerdo con la divulgación pueden clasificarse por su usabilidad como epítopos para la vacunación contra el cáncer. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación comprende un proceso analítico manual o informático en el que los péptidos modificados identificados se analizan y seleccionan por su usabilidad en la vacuna respectiva que se va a proporcionar. Preferiblemente, dicho proceso analítico es un proceso basado en algoritmos computacionales. Preferiblemente, dicho proceso analítico comprende determinar y/o clasificar los epítopos de acuerdo con una predicción de su capacidad de ser inmunogénicos.

Los neoepítopos identificados de acuerdo con la divulgación y proporcionados por una vacuna de la divulgación están preferiblemente presentes en forma de un polipéptido que comprende dichos neoepítopos tales como un polipéptido poliepitópico o un ácido nucleico, en particular ARN, que codifica dicho polipéptido. Además, los neoepítopos pueden estar presentes en el polipéptido en forma de una secuencia de vacuna, es decir, presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, flanqueado por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en la proteína de origen natural. Cada una de dichas secuencias flanqueantes puede comprender 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo en el extremo terminal N y/o el extremo terminal C. Por lo tanto, una secuencia de vacuna puede comprender 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos. Opcionalmente, los neoepítopos y/o secuencias de vacuna se alinean en el polipéptido de un extremo al otro.

Opcionalmente, los neoepítopos y/o secuencias de vacuna están espaciados por enlazadores, en particular enlazadores neutros. El término "enlazador" se refiere a un péptido añadido entre dos dominios peptídicos tales como epítopos o secuencias de vacunas para conectar dichos dominios peptídicos. No existe una limitación particular con respecto a la secuencia del enlazador. Sin embargo, se prefiere que la secuencia enlazadora reduzca el impedimento estérico entre los dos dominios peptídicos, esté bien traducida y apoye o permita el procesamiento de los epítopos. Además, el enlazador debería tener pocos elementos de secuencia inmunogénica o ninguno. Los enlazadores preferiblemente no deberían crear neoepítopos no endógenos tales como los generados a partir de la sutura de unión entre neoepítopos adyacentes, que podrían generar reacciones inmunes no deseadas. Por lo tanto, la vacuna poliepitópica debería contener preferiblemente secuencias enlazadoras que sean capaces de reducir el número de epítopos de empalme no deseados de unión al MHC. Hoyt et al., (EMBO J. 25 (8), 1720-9, 2006) y Zhang et al., (J. Biol. Chem., 279 (10), 8635-41, 2004) han demostrado que las secuencias ricas en glicina perjudican el procesamiento proteasómico y, por lo tanto, el uso de secuencias enlazadoras ricas en glicina actúa para minimizar el número de péptidos que contienen enlazador que pueden ser procesados por el proteasoma. Además, se observó que la glicina inhibía una fuerte unión en las posiciones del surco de unión al MHC (Abastado et al., J. Immunol. 151 (7), 3569-75, 1993). Schlessinger et al., (Proteins, 61 (1), 115-26, 2005) habían descubierto que los aminoácidos glicina y serina incluidos en una secuencia de aminoácidos dan como resultado una proteína más flexible que es más eficientemente traducida y procesada por el proteasoma, lo que permite un mejor acceso a los neoepítopos codificados. Cada enlazador puede comprender 3 o más, 6 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 amino ácidos. Preferiblemente, el enlazador está enriquecido en aminoácidos glicina y/o serina. Preferiblemente, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de los aminoácidos del enlazador son glicina y/o serina. Preferiblemente, un enlazador está compuesto sustancialmente por los aminoácidos glicina y serina. Opcionalmente, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos (GGS)^a(GSS)^b(GGG)^c(SSG)^d(GSG)^een la que a, b, c, d y e es independientemente un número seleccionado entre 0, 1, 2 , 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 y en la que a b c d e son diferentes de 0 y preferiblemente son 2 o más, 3 o más, 4 o más o 5 o más. Opcionalmente, el enlazador comprende una secuencia como se describe en el presente documento que incluye las secuencias del enlazador descritas en los ejemplos tales como la secuencia GGSGGGGSG.

Preferiblemente, un polipéptido que incorpora uno o más neoepítopos tales como un polipéptido poliepitópico se administra a un paciente en forma de ácido nucleico, preferiblemente ARN tal como ARN sintético o transcrito in vitro, que puede expresarse en células de un paciente tal como células presentadoras de antígeno para producir el polipéptido. La presente divulgación también prevé la administración de uno o más polipéptidos multiepitópicos que para el propósito de la presente divulgación están comprendidos por el término "polipéptido poliepitópico", preferiblemente en forma de un ácido nucleico, preferiblemente ARN tal como ARN sintético o transcrito in vitro, que puede expresarse en células de un paciente, tales como células presentadoras de antígeno, para producir uno o más polipéptidos. En el caso de una administración de más de un polipéptido multiepitópico, los neoepítopos proporcionados por los diferentes polipéptidos multiepitópicos pueden ser diferentes o superponerse parcialmente. Una vez presente en las células de un paciente, tal como las células presentadoras de antígeno, el polipéptido de acuerdo con la divulgación se procesa para producir los neoepítopos identificados de acuerdo con la divulgación. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación proporciona preferiblemente epítopos presentados por el MHC de clase I que son capaces de provocar una respuesta de células T colaboradoras CD8⁺contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por el MHC. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación también puede proporcionar epítopos presentados por el MHC de clase II que son capaces de provocar una respuesta de células T CD4⁺contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por el MHC. Además, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación puede proporcionar uno o más neoepítopos (incluidos neoepítopos conocidos y neoepítopos identificados de acuerdo con la divulgación) así como uno o más epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas del cáncer pero que son expresados por células cancerosas y preferiblemente induciendo una respuesta inmune contra las células cancerosas, preferiblemente una respuesta inmune específica del cáncer.

La vacuna proporcionada de acuerdo con la divulgación puede ser una vacuna recombinante.

El término "recombinante" significa "elaborado mediante ingeniería genética". Preferiblemente, una "entidad recombinante" tal como un polipéptido recombinante no se produce de forma natural, y preferiblemente es el resultado de una combinación de entidades tales como secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que no se combinan en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido recombinante puede contener varias secuencias de aminoácidos tales como neoepítopos o secuencias de vacunas derivadas de diferentes proteínas o diferentes porciones de la misma proteína fusionadas, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos o enlazadores apropiados.

El término "de origen natural", como se usa en este documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno y presentan un fragmento del mismo. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas. Los agentes y composiciones descritos en este documento también pueden usarse para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en este documento.

El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad se suele interpretar como una afección médica asociada con signos y síntomas específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, tal como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, tal como enfermedades autoinmunes. En los seres humanos, "enfermedad" se utiliza a menudo de manera más amplia para referirse a cualquier condición que cause dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o la muerte del individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades generalmente afectan a las personas no solo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida y la personalidad.

El término "normal" se refiere al estado sano o las condiciones en un sujeto o tejido sano, es decir, condiciones no patológicas, en las que "saludable" significa preferiblemente no canceroso.

El término "enfermedad asociada con un antígeno" o "enfermedad que implica un antígeno" se refiere a cualquier enfermedad que implica un antígeno, por ejemplo, una enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno o células que expresan un antígeno. La enfermedad que involucra un antígeno puede ser una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune o una enfermedad cancerosa o simplemente cáncer. Como se mencionó anteriormente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

"Enfermedad que implica células que expresan un antígeno" significa que se detecta la expresión del antígeno en células de un tejido u órgano enfermo. La expresión en las células de un tejido u órgano enfermo puede aumentar en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos un 10%, en particular al menos un 20%, al menos un 50%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 500%, al menos un 1.000%, al menos un 10.000% o incluso más. Opcionalmente, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. Las enfermedades que involucran o están asociadas con células que expresan un antígeno incluyen enfermedades cancerosas.

El término "enfermedad infecciosa" se refiere a cualquier enfermedad que puede transmitirse de un individuo a otro o de un organismo a otro, y está causada por un agente microbiano (por ejemplo, un resfriado común). Las enfermedades infecciosas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana o una enfermedad parasitaria, enfermedades que son causadas por un virus, una bacteria y un parásito, respectivamente. En este sentido, la enfermedad infecciosa puede ser, por ejemplo, hepatitis, enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia o gonorrea), tuberculosis, VIH/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), difteria, hepatitis B, hepatitis C, cólera, síndrome respiratorio agudo grave (SARS), gripe aviar y la influenza.

El término "enfermedad autoinmune" se refiere a cualquier enfermedad en la que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, el sistema inmune) a algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmune pierde su capacidad de reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como si fuera propio y lo ataca como si fuera extraño. Las enfermedades autoinmunes se pueden clasificar en aquellas en las que predominantemente se afecta un órgano (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis autoinmune) y aquellas en las que el proceso de la enfermedad autoinmune se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es causada por células T que atacan las envolturas que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto resulta en pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Las enfermedades autoinmunes son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, lupus, esclerosis múltiple, artritis reumática, anemia hemolítica, tiroiditis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis, diabetes, esclerodermia, psoriasis y similares.

Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren o describen la condición fisiológica en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de dichos cánceres incluyen cáncer de hueso, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (CNS), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma hipofisario. El término "cáncer" también comprende metástasis de cáncer.

El término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, células tumorigénicas o células tumorales) que preferiblemente forman una hinchazón o una lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y, por lo general, forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigna, premaligna o maligna.

Los términos "cáncer" y "enfermedad cancerosa" se usan de manera intercambiable con los términos "tumor" y "enfermedad tumoral".

Por "metástasis" se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportadas por la sangre, infiltración de órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o un tumor metastásico, en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. Opcionalmente, el término "metástasis" se refiere a "metástasis distante" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.

Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario está formado por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.

El término "células tumorales circulantes" o "CTC" se refiere a células que se han desprendido de un tumor primario o metástasis tumorales y circulan en el torrente sanguíneo. Las CTC pueden constituir semillas para el crecimiento posterior de tumores adicionales (metástasis) en diferentes tejidos. Las células tumorales circulantes se encuentran en frecuencias del orden de 1-10 CTC por mL de sangre entera en pacientes con enfermedad metastásica. Se han desarrollado métodos de investigación para aislar CTC. Se han descrito varios métodos de investigación en la técnica para aislar CTC, por ejemplo, técnicas que utilizan el hecho de que las células epiteliales expresan comúnmente la proteína de adhesión celular EpCAM, que está ausente en las células sanguíneas normales. La captura inmunomagnética basada en perlas implica el tratamiento de muestras de sangre con anticuerpos contra EpCAM que se han conjugado con partículas magnéticas, seguido de la separación de las células marcadas en un campo magnético. A continuación, las células aisladas se tiñen con un anticuerpo contra otro marcador epitelial, citoqueratina, así como un marcador de leucocitos común CD45, para distinguir las CTC raras de los glóbulos blancos contaminantes. Este enfoque robusto y semiautomático identifica CTC con un rendimiento promedio de aproximadamente 1 CTC/mLy una pureza del 0,1% (Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). Un segundo método para aislar las CTC utiliza un dispositivo de captura de CTC a base de microfluidos que implica hacer fluir sangre completa a través de una cámara incrustada con 80.000 micropostes que se han vuelto funcionales al recubrir con anticuerpos contra EpCAM. A continuación, las CTC se tiñen con anticuerpos secundarios contra citoqueratina o marcadores específicos de tejido, tales como PSA en el cáncer de próstata o HER2 en el cáncer de mama, y se visualizan mediante escaneo automático de micropostes en múltiples planos a lo largo de coordenadas tridimensionales. Los chips de CTC son capaces de identificar células tumorales circulantes positivas para citoqueración en pacientes con un rendimiento medio de 50 células/mL y una pureza que oscila entre el 1 y el 80% (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). Otra posibilidad para aislar CTC es usar la prueba de células tumorales circulantes (CTC) CellSearchMR de Veridex, LLC (Raritan, NJ) que captura, identifica y cuenta CTC en un tubo de sangre. El sistema CellSearchMR es una metodología aprobada por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) para el recuento de CTC en sangre completa que se basa en una combinación de etiquetado inmunomagnético y microscopía digital automatizada. Existen otros métodos para aislar las CTC descritas en la bibliografía, todos los cuales se pueden usar junto con la presente divulgación.

Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona se ve afectada nuevamente por una condición que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento satisfactorio de dicha enfermedad y vuelve a desarrollar dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como recaída o recurrencia. Sin embargo, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. Por lo tanto, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de una enfermedad o afección induciendo, potenciando o suprimiendo una respuesta inmune. Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmune se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen una respuesta inmune se clasifican como inmunoterapias de supresión. El término "inmunoterapia" incluye inmunización antigénica o vacunación antigénica, o inmunización tumoral o vacunación tumoral. El término "inmunoterapia" también se refiere a la manipulación de respuestas inmunes de manera que las respuestas inmunes inapropiadas se modulan en otras más apropiadas en el contexto de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumática, alergias, diabetes o esclerosis múltiple.

Los términos "inmunización" o "vacunación" describen el proceso de administrar un antígeno a un individuo con el propósito de inducir una respuesta inmune, por ejemplo, por razones terapéuticas o profilácticas.

El término "tratamiento terapéutico" o simplemente "tratamiento" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la vida útil de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o severidad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que previamente ha tenido una enfermedad.

El término "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refiere a cualquier tratamiento destinado a prevenir la aparición de una enfermedad en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se utilizan en el presente documento de forma intercambiable.

Los términos "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención y/o tratamiento de la aparición y/o propagación de una enfermedad, por ejemplo, tumor, en un individuo. Por ejemplo, una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, mediante la administración de una composición descrita en este documento, puede proteger al individuo receptor del desarrollo de un tumor. Por ejemplo, una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, al administrar una composición descrita en este documento, puede detener el desarrollo de una enfermedad, por ejemplo, conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de un tumor. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento del tumor, en particular una interrupción del progreso del tumor, que preferiblemente conduce a la eliminación del tumor. Una administración terapéutica de una inmunoterapia puede proteger al individuo, por ejemplo, de la diseminación o metástasis de tumores existentes.

El término "individuo" o "sujeto" se refiere a vertebrados, particularmente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos son humanos, primates no humanos, mamíferos domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, etc., así como animales en cautiverio tales como animales de zoológicos. El término "sujeto" también se refiere a vertebrados no mamíferos tales como aves (particularmente aves domesticadas tales como pollos, patos, gansos, pavos) y peces (particularmente peces de cultivo, por ejemplo, salmón o bagre). El término "animal" como se usa en este documento también incluye humanos. Preferiblemente, el término "paciente" se refiere a un individuo enfermo.

Los agentes descritos en el presente documento se pueden administrar en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada. El término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz o una sal del mismo, preferiblemente junto con excipientes farmacéuticos tales como tampones, conservantes y modificadores de tonicidad. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un individuo. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como formulación farmacéutica. La composición farmacéutica se puede administrar de forma local o sistémica.

El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente se distribuya ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolle un efecto biológico. Se prefiere que la administración sea por administración parenteral.

El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica o administración intraarterial, pero no se limita a las mismas.

Preferiblemente, la composición descrita en este documento se administra al tejido muscular, tal como el músculo esquelético. La administración intramuscular, tal como mediante inyección intramuscular, es por tanto la vía de administración preferida.

La administración se puede lograr de varias formas. Opcionalmente, la composición de acuerdo con la presente divulgación se administra mediante inyección. Preferiblemente, la inyección se realiza mediante una aguja. La inyección sin aguja se puede utilizar como alternativa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender al menos un adyuvante. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que, cuando se administran en combinación con un antígeno o péptido antigénico a un individuo, prolongan, potencian o aceleran una respuesta inmune. Se asume que los adyuvantes ejercen su actividad biológica por uno o más mecanismos, incluido un aumento de la superficie del antígeno, una prolongación de la retención del antígeno en el cuerpo, un retraso en la liberación del antígeno, el direccionamiento del antígeno a los macrófagos, aumento de la absorción del antígeno, mejora del procesamiento del antígeno, estimulación de la liberación de citocinas, estimulación y activación de células inmunes tales como células B, macrófagos, células dendríticas, células T y activación inespecífica de células inmunes. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones oleosas (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tales como alumbre), productos bacterianos (tales como la toxina de Bordetella pertussis) o complejos inmunoestimulantes. Los ejemplos de adyuvantes incluyen saponinas, adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, tocoferol o alumbre, pero no se limitan a ellos.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación se aplica generalmente en una "cantidad farmacéuticamente eficaz" y en "una preparación farmacéuticamente aceptable".

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad también puede ser el retraso del inicio o una prevención del inicio de dicha enfermedad o dicha afección. Una cantidad eficaz de las composiciones descritas en este documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la afección fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de las composiciones descritas en este documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas por una vía de administración diferente, más localizada).

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, portadores y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación comprenden uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente" pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

El término "diluyente" se refiere a un agente diluyente y/o adelgazante. Además, el término "diluyente" incluye uno cualquiera o más de suspensiones y/o medios de mezcla fluidos, líquidos o sólidos.

El término "portador" se refiere a uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para administración a un ser humano. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación del componente activo. Preferiblemente, los componentes portadores son líquidos estériles tales como agua o aceites, incluidos los que se derivan de aceite mineral, animal o plantas, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. También se pueden usar soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerina como compuestos portadores acuosos.

Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de portadores adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

Los portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticos pueden seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender como, o además de, el portador o portadores, excipiente o excipientes o diluyente o diluyentes, cualquier aglutinante o aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, o agente o agentes recubrimiento y/o agente o agentes de solubilización. Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

Opcionalmente, la composición es una composición acuosa. La composición acuosa puede comprender opcionalmente solutos, por ejemplo, sales. Opcionalmente, la composición está en forma de composición liofilizada. Se puede obtener una composición liofilizada, liofilizando una composición acuosa respectiva.

Los agentes y composiciones proporcionados en este documento pueden usarse solos o en combinación con otros regímenes terapéuticos tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

La presente invención se describe en detalle y se ilustra mediante las figuras y ejemplos, que se utilizan sólo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir la utilidad de un neoantígeno asociado al cáncer o un neoepítopo del mismo que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas del cáncer para inmunoterapia anticancerosa, comprendiendo el método

determinar la distribución o localización del neoantígeno que comprende determinar en una base de datos informática si el neoantígeno está localizado o es abundante en el citosol y/o dentro de los exosomas in vivo,

en el que la localización o abundancia del neoantígeno o un ácido nucleico que lo codifica, o un neoepítopo del neoantígeno en el citosol y/o dentro de exosomas in vivo indica que el neoantígeno o neoepítopo del mismo es útil para inmunoterapia contra el cáncer,

en el que el procesamiento y la presentación del neoantígeno en la ruta del MHC I da como resultado el reconocimiento de complejos formados por el MHC I y neoepítopos del neoantígeno por células T CD8+.

2. El método de la reivindicación 1, en el que una o más modificaciones de aminoácidos se deben a mutaciones somáticas específicas del cáncer.