ES2890424T3 - Selección de neoepítopos como objetivos específicos de enfermedad para terapia con eficacia mejorada - Google Patents

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Abstract

Un método para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de la enfermedad en un alelo en un gen (alelo mutado) como objetivo específico de la enfermedad que comprende determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias del alelo mutado que codifica el neoepítopo, en el que un número de copias del alelo mutado que es mayor que 2 indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad, en el que la enfermedad es cáncer y en el que cuanto mayor es el número de copias del alelo mutado, mayor es la idoneidad del neoepítopo como un objetivo específico de la enfermedad.

Description

DESCRIPCIÓN
Selección de neoepítopos como objetivos específicos de enfermedad para terapia con eficacia mejorada
Campo técnico
La presente enseñanza se refiere a métodos para determinar la idoneidad de un neoepítopo específico de enfermedad como un objetivo específico de enfermedad y el uso de tales neoepítopos adecuados identificados en inmunoterapia dirigida específicamente al tejido enfermo de un paciente, tal como tejido tumoral, que expresa uno o más de los neoepítopos adecuados identificados.
Antecedentes
El cáncer es una causa principal de mortalidad y representa 1 de cada 4 de todas las muertes. El tratamiento del cáncer se ha basado tradicionalmente en la ley de los promedios, que funciona mejor para el mayor número de pacientes. Sin embargo, debido a la heterogeneidad molecular del cáncer, a menudo menos del 25% de las personas tratadas se benefician de las terapias aprobadas. La medicina individualizada basada en el tratamiento personalizado de los pacientes se considera una posible solución a las bajas eficacias y los altos costes de innovación en el desarrollo de fármacos.
Las inmunoterapias personalizadas contra el cáncer están emergiendo como un avance potencial en el tratamiento del cáncer con el potencial de transformar el estándar de atención para los millones de pacientes con cáncer diagnosticados anualmente en todo el mundo. El aspecto unificador de las inmunoterapias personalizadas contra el cáncer es permitir que el sistema inmunológico se dirija a las anomalías genéticas (mutaciones) exclusivas del cáncer de un paciente. Tales mutaciones específicas de la enfermedad pueden codificar neoepítopos, que son objetivos específicos de la enfermedad. Las anomalías genéticas más prevalentes que afectan a los genomas del cáncer y que pueden usarse como objetivos específicos de la enfermedad para inmunoterapias personalizadas son las variaciones de un solo nucleótido (SNV) no sinónimas. Por lo tanto, la identificación precisa y exhaustiva de las SNV de un paciente en las regiones codificantes del genoma es una etapa crítica en el proceso de producción de inmunoterapias personalizadas contra el cáncer.
Sin embargo, como se describe en el presente documento, conocer la identidad de la mutación específica de la enfermedad es solo una parte del panorama. Más bien, el perfil genético completo de una mutación requiere el conocimiento del número exacto de copias del gen que contienen la mutación en la célula enferma, por ejemplo, en la célula tumoral (incluidos los alelos de tipo silvestre y mutado), el número de copias del alelo mutado en la célula tumoral (denominado aquí cigosidad de la mutación) y el grado de subclonalidad de la mutación en una muestra de células enfermas, tal como una muestra tumoral. De hecho, las variaciones en el número de copias que se producen en las células enfermas son un componente importante de la variación genética en las células enfermas en la mayoría de las indicaciones de enfermedad. Además, el alcance de las variaciones del número de copias, la identidad de los genes afectados por las variaciones del número de copias y la composición genética precisa de las variaciones del número de copias es única para cada individuo y puede variar ampliamente de un individuo a otro. Véase, en general, Shlien y Malkin, 2009, Genome Med. 1:62; Yang et al., 2013, Cell 153: 919-929. El conocimiento preciso de estas características genéticas puede ser fundamental para seleccionar mutaciones que, cuando se direccionen, sean inmunes a escapar del tumor y, por lo tanto, tengan el potencial de conferir un control total del tumor.
Para maximizar la eficacia de las inmunoterapias personalizadas contra el cáncer y conferir un control tumoral duradero para la mayoría de los pacientes tratados, las terapias deben eludir de alguna manera la capacidad de los tumores para escapar de la vigilancia inmunológica, por ejemplo, silenciando la expresión del objetivo mutado, por ejemplo, eliminando el gen. Sin abordar este problema, las inmunoterapias corren el riesgo de recaída ya que la inmunoterapia no puede direccionarse a mutaciones si no se expresan, por ejemplo, eliminadas del genoma. La selección de neoepítopos adecuados que mejoren el control de tumores beneficiaría a todos los enfoques de inmunoterapia personalizados que se dirigen a los neoepítopos, sin importar cómo se implementen.
La técnica anterior sugirió que probablemente no hay forma de predecir epítopos relevantes con absoluta certeza. Türeci et al. 2016 (Clinic. Cancer Res. 22: 1885-1896) sugirió hacer uso de un poliepítopo para aumentar la probabilidad de que se incluya un epítopo adecuado (véase la página 1890, segunda columna, primer párrafo de Türeci et al., 2016). Además, el documento de la técnica anterior Castle et al., 2014 (Scientific Reports 4: 1-6) se ocupa de la cuestión general de establecer si existe o no una correlación entre la frecuencia de los alelos de mutación de ADN y la frecuencia de alelos de mutación de ARN. Finalmente, el documento de la técnica anterior WO2012/159754 describe un análisis de variación del número de copias usado para identificar posibles neoepítopos. Sin embargo, ninguno de estos documentos de la técnica anterior enseña a determinar la idoneidad de un neoepítopo para direccionarse a una célula enferma basándose en el número de copias de los alelos que codifican el neoepítopo.
Existe una necesidad en la técnica de formas para seleccionar neoepítopos resultantes de mutaciones específicas de la enfermedad que den como resultado un mejor control tumoral.
Descripción
Resumen
La presente enseñanza proporciona formas de superar las deficiencias en el estado de la técnica proporcionando métodos para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de una enfermedad en un gen como objetivo específico de la enfermedad a partir de la cual un tejido enfermo no puede escapar fácilmente de la vigilancia inmunológica, que en el caso del cáncer dará como resultado un mejor control del tumor. Una vez que se han identificado los neoepítopos adecuados, tales epítopos adecuados pueden usarse como objetivos específicos de la enfermedad para inducir una respuesta inmune específica en un paciente que padece la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad puede ser cáncer y potencialmente el tumor primario, así como las metástasis tumorales que expresan el neoepítopo adecuado pueden direccionarse para un tratamiento más eficaz.
La presente enseñanza se refiere a un método para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de enfermedad en un alelo en un gen (alelo mutado) como objetivo específico de enfermedad que comprende determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias del alelo mutado que codifica el neoepítopo. Como se usa en este documento, el número de copias también se puede denominar cigosidad de modo que, por ejemplo, cuando el número de copias del alelo mutado es 4, el alelo mutado tiene una cigosidad de 4. Como se usa en este documento, un alelo es un sitio en el genoma que tiene una identidad de nucleótidos específica, cuya identidad puede ser la misma en las copias materna y paterna del genoma (genotipo homocigoto) o la identidad puede ser diferente en las copias materna y paterna del genoma (genotipo heterocigoto). Un alelo mutado es un alelo que, debido a una mutación específica de una enfermedad, tiene una identidad diferente de ese sitio en un genoma normal correspondiente, por ejemplo, un genoma de una célula no enferma del mismo individuo (genoma emparejado), preferiblemente de una célula no enferma del mismo tipo de tejido que la célula enferma. Un neoepítopo adecuado como objetivo específico de enfermedad (neoepítopo adecuado) como se usa en este documento es un neoepítopo, que cuando es dirigido por el sistema inmunológico, es menos probable que tenga su expresión subregulada o silenciada (por ejemplo, debido a eliminación) por el tejido enfermo de manera que es menos probable que el tejido enfermo pueda escapar a una respuesta, preferiblemente una respuesta inmunológica generada contra el neoepítopo mediante, por ejemplo, la vacunación contra el neoepítopo o la administración de células inmunes que pueden direccionarse (unirse) al neoepítopo. En una realización, el número de copias del alelo mutado puede ser el mismo que el número de copias del gen que comprende el alelo mutado, de modo que la presente enseñanza también se refiere a un método para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de una enfermedad en un gen como objetivo específico de enfermedad que comprende determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias del gen que tiene la mutación específica de enfermedad.
En una realización, un alto número de copias del alelo o gen mutado que tiene la mutación específica de la enfermedad indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad, de manera que cuanto mayor sea el número de copias del alelo o gen mutado que tiene la mutación específica de la enfermedad, mayor es la idoneidad del neoepítopo como un objetivo específico de la enfermedad. En una realización, cuando el número de copias del alelo o gen mutado que tiene la mutación específica de la enfermedad en la célula enferma es mayor de 2, esto indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad. En una realización, donde el número de copias del gen que tiene la mutación específica de la enfermedad es mayor que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o es mayor que 100, esto indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad.
En los casos en los que no todas las copias del gen, en las que al menos una copia tiene el alelo mutado, tienen la mutación, es preferible que muchas copias del gen tengan el alelo mutado, es decir, es preferible que una fracción mayor en lugar de una fracción menor de las copias del gen tengan el alelo mutado (cigosidad fraccional mayor en lugar de menor). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el alelo mutado se encuentra en una fracción alta de copias del gen del cual al menos una copia tiene el alelo mutado (cigosidad fraccional), en la que la cigosidad fraccional es la proporción del número de copias del alelo mutado (cigosidad del alelo mutado) sobre el número total de copias del sitio del nucleótido al que se asigna el alelo mutado, en particular a un genoma de referencia o un genoma de tipo silvestre correspondiente o un genoma emparejado, es decir, genoma de tipo silvestre del mismo individuo. Cuanto mayor sea la cigosidad fraccional de las copias del alelo mutado, mayor será la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad. Preferiblemente, la cigosidad fraccional puede ser mayor que 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 0,95, y más preferiblemente la cigosidad fraccional es 1, es decir, que todas las copias del gen en la célula enferma tienen el alelo mutado. En los casos en los que la cigosidad fraccional es 1, no hay copias de tipo silvestre del gen de modo que la célula enferma no pueda volver a expresar el epítopo de tipo silvestre correspondiente. Como se usa en este documento, una fracción de 1 es cuando la hipótesis de que la configuración genética del alelo/gen mutado, por ejemplo, el número de copias, cigosidad, es el mismo, no puede ser refutada por los datos, es decir, es estadísticamente consistente.
Se sabe que el tejido enfermo, tal como los tumores, puede ser heterogéneo en su composición genética y expresión génica, de modo que es posible que no todas las células enfermas en el tejido enfermo tengan el mismo número de copias de un gen y/o del gen del que al menos una copia tiene el alelo mutado (número total de copias del gen) y/o copias del gen que tiene el alelo mutado, mucho menos la mutación específica de la enfermedad en sí. Por lo tanto, es preferible que el número de copias, por ejemplo, del alelo mutado y/o la cigosidad fraccional y/o el número total de copias del sitio de nucleótidos al que se asigna el alelo mutado, sea el mismo o similar en un alta fracción de células enfermas en lugar de una baja fracción de células enfermas en el tejido enfermo (una fracción clonal alta en lugar de baja). Cuanto mayor sea la fracción de células enfermas que tengan el mismo número de copias o un número similar, por ejemplo, del alelo mutado y/o la cigosidad fraccional y/o el número total de copias del sitio del nucleótido al que se asigna el alelo mutado, mayor será la idoneidad del neoepítopo como un objetivo específico de la enfermedad. Por ejemplo, la fracción clonal puede ser al menos 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o al menos 0,9. En una realización preferida, todas las células enfermas en el tejido enfermo tienen el mismo o similar número de copias, es decir, la fracción clonal es 1, es decir, es estadísticamente consistente. Como se usa en este documento, el mismo número de copias o similar abarca el mismo número de copias o un número de copias dentro del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o menos del número de copia, por ejemplo, número de copias o número de copias absoluto con o sin corrección de errores.
Preferiblemente, una fracción clonal de una mutación puede ser dada por la fracción de células enfermas que tienen la misma o similar configuración genética de la mutación, en la que una configuración genética de la mutación comprende el número total de copias del sitio nucleotídico a que se asigna la mutación y el número de copias del alelo mutado. Se dice que una característica se fija en la población de células enfermas si la característica está presente en todas las células enfermas en un grado que no puede ser refutado estadísticamente por los datos disponibles. Preferiblemente, una fracción clonal de 1 significa que la configuración genética de la mutación está fijada en la población de células enfermas. Preferiblemente, la configuración genética de una mutación se fija en la población de células enfermas si la mutación se fija en la población de células enfermas y la CNV que afecta al sitio que codifica la mutación se fija en la población de células enfermas. Preferiblemente, si se determina que una mutación para la cual el número total de copias del sitio del nucleótido al que se asigna la mutación es 2 y está en una región equilibrada del genoma enfermo (tumor) se fija en la población de células enfermas, entonces la configuración genética de la mutación es fija.
El gen en el que se encuentra la mutación específica de la enfermedad puede estar potencialmente en cualquier gen del genoma. Un tipo preferido de gen en el que se encuentra una mutación que da como resultado un neoepítopo adecuado es un gen cuya expresión da como resultado la transformación de la célula en un fenotipo canceroso o cuya falta de expresión da como resultado que una célula cancerosa pierda su fenotipo canceroso, es decir, una gen cuya expresión contribuye a la progresión tumoral. Estos genes se conocen como genes impulsores. Se conocen bien ejemplos de genes impulsores para muchos tipos de tumores. Por ejemplo, una lista de 291 genes impulsores del cáncer de alta confianza que actúan sobre 3.205 tumores de 12 tipos de cáncer diferentes se describe en Tamborero et al., 2013, Comprehensive identification of mutational cancer driver genes across 12 tumor types, Scientific Reports 3: 2650. Se han identificado más genes impulsores utilizando los métodos descritos en Youn et al., 2011, Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies, Bioinformatics 27 (2): 175-181, en Sakoparnig et al., 2015, Identification of constrained cancer driver genes based on mutation timing, PLoS Comput. Biol. 11 (1): e1004027, y en Forbes et al., 2008, Current protocols in human genetics, 10-11. La mutación específica de la enfermedad en el gen impulsor puede contribuir o no al fenotipo canceroso. Preferiblemente, cada copia del gen impulsor que se encuentra en la célula enferma tiene la mutación específica de la enfermedad. También preferiblemente, todas las células del tejido enfermo son células enfermas en las que cada copia del gen impulsor tiene la mutación específica de la enfermedad.
Otro tipo preferido de gen es un gen esencial. En una realización, un gen esencial es un gen, que cuando se silencia o se reduce su expresión (por ejemplo, al ser eliminado), al menos da como resultado un crecimiento deficiente o una aptitud reducida de la célula, preferiblemente una célula enferma. Dichos genes se denominan aquí genes esenciales. En una realización, un gen esencial es un gen en el que hay una reducción de al menos un 10% en el crecimiento o una capacidad reducida de la célula enferma donde el gen está silenciado o tiene su expresión reducida en comparación con una célula en la que el gen no está silenciado ni reducida la expresión. En una realización, la reducción en el crecimiento o la reducción de la aptitud es al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% o al menos 95%, lo más preferiblemente el silenciamiento o expresión reducida del gen esencial da como resultado la letalidad de la célula enferma. Preferiblemente, cada copia del gen esencial que se encuentra en la célula enferma tiene la mutación específica de la enfermedad.
Los genes esenciales son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una lista de genes esenciales en humanos (por ejemplo, en líneas celulares humanas o inferidos de otros organismos) se describe en Liao et al., 2008, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 105: 6987-6992 y en Georgi et al., 2013, PLoS Genetics 9 (5): e1003484, así como ortólogos correspondientes en otros organismos eucariotas como el ratón (Liao et al., 2007, Trends Genet. 23: 378 -381), mosca de la fruta (Spradling et al., 1999, Genetics 153: 135-177), C. elegans (Kamath et al., 2003, Nature 421: 231-237), pez cebra (Amsterdam et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 101: 12792-12797), Arabidopsis thaliana (Tzafrir et al., 2004, Plant Physiol. 135: 1206-1220), levadura (Kim et al., 2010, Nat. Biotechnol. 28 : 617-623) y así sucesivamente. Una lista de genes esenciales derivados de líneas celulares de cáncer humano se describe en Wang et al., 2015, Science 350: 1096-1101, y se puede encontrar una lista de genes esenciales en la base de datos de genes esenciales, DEG5.0 (Zhang et al. al., 2009, Nucleic Acids Res. 37: D455-D458).
Además, se puede generar empíricamente una lista de genes esenciales cuya eliminación/silenciamiento reduce significativamente la aptitud de una cohorte de líneas celulares a partir de múltiples tejidos sanos y/o líneas celulares cancerosas, cuyas líneas celulares pueden derivarse de donantes o de la paciente. La eliminación/silenciamiento de genes se puede realizar experimentalmente utilizando diversas técnicas de biología molecular como la tecnología CRISPR, la interferencia de ARN, etc., en la que se determina la supervivencia o aptitud de la célula con y sin expresión del supuesto gen esencial. También se puede determinar experimentalmente una lista de genes esenciales a partir de células o de una línea celular o se puede obtener una lista de genes esenciales mediante enfoques bioinformáticos. Las células o líneas celulares pueden ser células enfermas o líneas celulares (células o líneas celulares tumorales) o células o líneas celulares no enfermas (sanas/normales), y pueden obtenerse de donantes o del paciente que padece la enfermedad. Preferiblemente, las células o líneas celulares no enfermas son del mismo tipo de tejido que la célula enferma, y más preferiblemente del mismo paciente. En realizaciones en las que la enfermedad es cáncer, las células o líneas celulares pueden obtenerse del tumor primario o de cualquier metástasis, si está presente. Además, una lista de genes esenciales puede ser esencialmente la misma que el conjunto mínimo de genes expresados en una amplia variedad de tejidos del cuerpo. Por ejemplo, un gen esencial es un gen que se expresa en una amplia variedad de tejidos diferentes y se expresa con un umbral de RPKM (lecturas mínimas por kilobase de transcripción por millón de lecturas asignadas) superior a 0, preferiblemente superior a 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25. Esta lista de genes esenciales se puede obtener analizando los datos de expresión de ARN (por ejemplo, secuenciación de ARN) obtenidos de un panel de muestras de células obtenidas de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más tejidos diferentes. Además, si se dispone de una línea de células tumorales del paciente, los genes en los que todas las copias contienen una mutación que codifica un neoepítopo se pueden eliminar de uno en uno y se pueden medir las tasas de crecimiento de cada línea celular modificada. Dicha medición/análisis se puede realizar mediante métodos de alto rendimiento conocidos en la técnica, que permiten el cribado de al menos un gen a la vez, preferiblemente muchos genes a la vez, con el fin de evaluar su efecto sobre la aptitud de una célula enferma o no enferma. Dichos métodos también permiten la detección de combinaciones de genes sintéticas enfermas o letales, que se describen a continuación. Brevemente, se puede usar una biblioteca de líneas celulares, a cada línea celular le falta un gen, para probar la eliminación de uno o más genes candidatos de manera que se pueda determinar el efecto sobre la célula de la eliminación de los genes.
La presente enseñanza se refiere además a un método para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de la enfermedad en un gen como objetivo específico de la enfermedad que comprende determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias del gen, es decir, determinar el número de copias de un gen en el que al menos una copia del gen tiene una mutación específica de la enfermedad. En los casos en los que un gen tiene un alto número de copias en una célula enferma, tal como una célula tumoral, por ejemplo, debido a una amplificación focal, es muy probable que el gen sea un gen impulsor. Por tanto, un elevado número de copias de un gen indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad, y cuanto mayor es el número de copias del gen, mayor es la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad. Por ejemplo, un número alto de copias puede ser un número de copias mayor que 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o mayor que 100. Un número alto de copias también puede ser un número de copias que sea al menos un 50% mayor que el número de copias del gen en una célula no enferma correspondiente. Un número alto de copias también puede ocurrir cuando el número de copias del gen en el que al menos una copia tiene la mutación específica de la enfermedad es al menos 2x, 3x, 5x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, o al menos 100x mayor que el número de copias del gen en una célula no enferma correspondiente. Debido a las variaciones del número de copias que también pueden estar presentes en el genoma normal, el número de copias del gen en el genoma normal no es necesariamente dos. Además, se sabe que las amplificaciones focales se observan con más frecuencia en determinadas enfermedades que en otras, como en el glioblastoma, en el que el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico a menudo se amplifica focalmente, por lo que esta realización es muy adecuada para su uso en esas enfermedades.
Además, es preferible que el número de copias del gen sea el mismo o similar en una fracción alta de células enfermas en lugar de una fracción baja de células enfermas, de modo que cuanto mayor sea la fracción de células enfermas que tengan el mismo o similar número de copias, mayor será la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad. En una realización preferida, todas las células enfermas en el tejido enfermo tienen el mismo o similar número de copias del gen en el que al menos una copia tiene la mutación específica de la enfermedad, es decir, la fracción clonal es 1. Como se usa en el presente documento, el mismo o similar número de copias incluye el mismo número de copias o un número de copias dentro del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o menos del número de copia, por ejemplo, número de copias o número de copias absoluto con o sin corrección de errores.
Además, el gen que tiene un alto número de copias, en el que al menos una copia tiene una mutación específica de la enfermedad que da como resultado un neoepítopo, preferiblemente puede ser un gen cuya expresión da como resultado la transformación de la célula en un fenotipo canceroso o cuya falta de expresión da como resultado que una célula cancerosa pierda su fenotipo canceroso, es decir, un gen impulsor como los genes impulsores conocidos en la técnica, o puede ser un gen esencial, por ejemplo, un gen que cuando se silencia o su expresión se reduce, al menos da como resultado un crecimiento deficiente o aptitud reducida de la célula enferma.
La presente enseñanza también se refiere a un método para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de la enfermedad en un gen como objetivo específico de la enfermedad que comprende determinar, en una célula enferma o una población de células enfermas, si el gen tener la mutación específica de la enfermedad es un gen esencial. En una realización, el gen esencial es un gen que cuando se silencia o se reduce su expresión (por ejemplo, por eliminación del gen), al menos da como resultado un crecimiento deficiente o una aptitud reducida de la célula enferma. En esta realización, donde el gen es un gen esencial y todas las copias del gen esencial tienen la mutación específica de la enfermedad (cigosidad fraccional de 1) indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo preferible específico de la enfermedad. En una realización, un gen esencial es un gen que se expresa en una amplia variedad de tejidos diferentes y se expresa con un umbral de RPKM (lecturas mínimas por kilobase de transcripción por millón de lecturas asignadas) mayor que 0, preferiblemente mayor que 0,1, 0,5,1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25. Preferiblemente, todas las copias del gen esencial contienen la mutación. Además, es preferible que una gran fracción de células enfermas contenga copias del gen esencial en el que todas las copias del gen esencial tienen la mutación específica de la enfermedad (una fracción clonal alta en lugar de baja), de modo que cuanto mayor sea la fracción de células enfermas que contienen copias del gen esencial en las que todas las copias del gen esencial tienen la mutación específica de la enfermedad, mayor es la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad. En una realización más preferida, todas las células enfermas en el tejido enfermo tienen el gen esencial en el que todas las copias del gen esencial tienen la mutación específica de la enfermedad, es decir, la fracción clonal es 1.
Se sabe que ciertos genes, cuando se silencian individualmente o cuando su expresión se reduce individualmente, pueden tener solo un pequeño efecto, si lo hay, sobre la aptitud o la capacidad de crecimiento de la célula enferma. Sin embargo, se ha observado que cuando dos de estos genes han sido silenciados o cuando cada una de sus expresiones se ha reducido puede resultar en un deterioro del crecimiento mucho más fuerte, hasta la letalidad. Estas combinaciones genéticas se denominan letales sintéticas o enfermas/deterioradas sintéticas. Véase Nijman, 2011, Synthetic lethality: General principles, utility and detection using genetic screens in human cells, FEBS Lett. 585: 1-6 para una discusión sobre genes letales sintéticos y genes de enfermedad sintéticos y métodos para identificar tales genes. Dado que ambos genes son necesarios para que la célula sobreviva, es poco probable que la célula silencie o reduzca la expresión de ambos genes. Por tanto, una combinación adecuada de neoepítopos como objetivos específicos de la enfermedad puede resultar de mutaciones específicas de la enfermedad en al menos dos genes, genes que juntos son sintéticamente letales o sintéticamente enfermos. En vista de ello, la presente enseñanza se refiere además a un método para determinar la idoneidad de una combinación de al menos dos neoepítopos que resultan de mutaciones específicas de la enfermedad en al menos dos genes como una combinación de objetivos específicos de la enfermedad que comprende determinar si una combinación de al menos dos genes que tienen cada uno una mutación específica de la enfermedad son genes sintéticamente letales o sintéticamente enfermos. Cuando la combinación de al menos dos genes da como resultado un fenotipo letal sintético o enfermo sintético, esto indica que los neoepítopos resultantes son una combinación adecuada de objetivos específicos de la enfermedad. En una realización preferida, la enfermedad sintética da como resultado al menos un efecto mayor sobre el crecimiento/aptitud celular que lo que se esperaría del efecto aditivo de la eliminación/expresión reducida de cada gen individualmente. Este enfoque se ve favorecido cuando hay un número elevado de neoepítopos adecuados, ya que cuanto mayor es el número de neoepítopos, mayor es el número de combinaciones que pueden ser sintéticas enfermas o letales. Por ejemplo, 10 mutaciones corresponden a 45 combinaciones posibles, 100 mutaciones corresponden a 4.950 combinaciones y 1.000 mutaciones corresponden a aproximadamente 500.000 combinaciones. En ciertas realizaciones, al menos dos genes tienen cada uno una cigosidad fraccional mayor en lugar de una menor, preferiblemente una cigosidad fraccional de 1, y/o cada uno tiene una fracción clonal mayor en lugar de menor, preferiblemente una fracción clonal de 1, ambas en células enfermas y células enfermas en el tejido enfermo. Como se usa en este documento, cada neoepítopo encontrado en una combinación de neoepítopos adecuados se considera cada uno como un neoepítopo adecuado para los propósitos de la presente enseñanza.
Como se menciona en el presente documento, el número de copias del gen ya sea en la célula enferma o no enferma, puede ser el número de copias relativo, pero es preferiblemente el número de copias absoluto, y más preferiblemente es el número de copias absoluto normalizado frente a una ploidía, por ejemplo, la ploidía del genoma de la célula enferma, es decir, el número de copias del genoma. Incluso más preferiblemente, el número de copias relativo, absoluto y normalizado tiene corregidos los errores.
Cuando se estima el número absoluto de copias, por ejemplo de un alelo o gen mutado o su cigosidad, la estimación puede ser inexacta y es deseable corregir el número absoluto de copias para tener en cuenta las fuentes de error. En realizaciones donde se usa la secuenciación de próxima generación para obtener información de secuencia de genomas y exomas, las fuentes de error pueden incluir: una tendencia en la pureza estimada de la muestra de tejido enfermo, tal como una muestra de tumor, una tendencia en cualquier parámetro estimado requerido para derivar la pureza y/o números absolutos de copias, errores estocásticos debido a la cobertura finita de la muestra que se está secuenciando, capacidad de detección limitada debido a una pureza baja, una fracción clonal baja, y así sucesivamente.
En una realización en la que el número de copias absoluto se determina usando segmentos heterocigotos equilibrados que contienen un SNP heterocigoto, como el que se describe en la solicitud de patente PCT internacional titulada "Tumor Modeling Based on Primary Balanced Heterozygous Segments" presentada en la misma fecha, un error en el número absoluto de copias de un segmento puede propagarse a otros parámetros estimados, como el número absoluto de copias del alelo mutado, por ejemplo, un SNV, que codifica un neoepítopo, la cigosidad del alelo mutado, la fracción clonal, etc. Dado que tales parámetros estimados más adelante tienen implicaciones clínicas para determinar la idoneidad de un neoepítopo como un objetivo específico de enfermedad para un paciente como se describe en este documento, es deseable corregir errores en el número absoluto de copias para obtener el valor más exacto del número absoluto de copias. Además, dado que las mutaciones que codifican los neoepítopos se pueden priorizar por su idoneidad para ser incluidas en una vacuna que se administrará al paciente utilizando los criterios discutidos aquí, y porque una fracción de cigosidad de 1 es cualitativamente mejor que una fracción de cigosidad menor que 1, en particular, cuando el gen que contiene la mutación es un gen esencial, es beneficioso tener las estimaciones más precisas de los números absolutos de copias y cualquier parámetro derivado del mismo.
En una realización preferida, al número absoluto de copias de un alelo mutado, por ejemplo, un SNV, y/o la cigosidad de un SNV pueden corregírsele los errores. En una realización, al número absoluto de copias de un SNV se le corrigen en primer lugar los errores, y luego se corrige la cigosidad del SNV para reflejar el número de copias absoluto con corrección de errores del SNV. Una vez que se corrige el error del número absoluto de copias del SNV y/o la cigosidad del SNV, la estimación de la fracción clonal también se puede corregir para reflejar los números absolutos de copias con corrección de errores, incluida la determinación de si la fracción clonal es estadísticamente consistente con un valor de 1.
El número absoluto de copias de un SNV viene dado preferiblemente por el número absoluto de copias del segmento al que se asigna el SNV. Los números absolutos de copias de todos los segmentos, por ejemplo, en el genoma enfermo del tumor, pueden corregírsele los errores, incluido el número absoluto de copias del SNV. Una vez que se corrigen los errores de los números absolutos de copias de todos los segmentos de un genoma, se puede calcular una ploidía con corrección de errores basándose en los números absolutos de copias con corrección de errores de los segmentos, por ejemplo, en el genoma enfermo del tumor.
En una realización específica, si al número absoluto de copias de un SNV se le corrigen los errores de manera que el nuevo número absoluto de copias difiera del número absoluto de copias original, esto puede tomarse como una indicación de que el número absoluto estimado de copias del SNV es no fiable.
Un ejemplo de corrección de errores de números absolutos de copias de segmentos es la corrección de errores por paridad, que comprende corregir un número de copias absoluto impar de un segmento a un número de copias absoluto par si el segmento está en una región equilibrada. Una región equilibrada es una región en el genoma enfermo del tumor, por ejemplo, en la que los alelos materno y paterno dentro de la región experimentaron una amplificación igual (equilibrada), o los alelos materno y paterno no experimentaron ninguna amplificación en absoluto.
La decisión de corregir el error del número de copias absoluta impar del segmento al número de copias absoluta par más cercano o al número de copias absoluta par más cercano puede depender de la asignación de lecturas de enfermedad y lecturas normales al segmento, y la comparación con los límites predichos que definen el número absoluto de copias de un segmento. Cuando una lectura normal es una lectura perteneciente a la muestra normal secuenciada, y una lectura de enfermedad es una lectura perteneciente a la muestra enferma secuenciada. En particular, cuando la enfermedad es cáncer, una lectura de tumor es una lectura perteneciente a la muestra del tumor secuenciada.
Por ejemplo, en una corrección de error de paridad del primer tipo, si CNmut es el número absoluto de copias en el genoma enfermo del segmento al que se asigna la mutación, el número absoluto de copias de un segmento que se predice que tiene un valor de CNmut, puede corregirse a CNmut 1 si r > pésimo, y a CNmut -1 si r < pésimo, en la que r es la tasa de recuento de lectura de segmento de enfermedad sobre el normal (la relación del número de enfermedad, por ejemplo, lecturas del tumor que se asignan al segmento), en el que pésimo es el límite de decisión predicho, cuyo valor depende también de la pureza de la muestra de tejido enfermo, por ejemplo, muestra de tumor.
Un número de copias específico de alelo de un segmento es el número de copias en el genoma enfermo del alelo materno o del alelo paterno del segmento. Cuando el segmento contiene un SNP heterocigoto (segmento heterocigoto), el SNP heterocigoto se puede utilizar para determinar el número de copias específico del alelo del segmento. Puede asignarse un segmento heterocigoto a un nodo preferido, en el que un nodo puede definirse como una combinación única de un número absoluto de copias del segmento heterocigoto y un número de copias específico del alelo del segmento heterocigoto. Incluso los nodos son un subconjunto de nodos para los que el número absoluto de copias del segmento es par. Si un segmento heterocigoto contiene más de un SNP heterocigoto, el grupo de dos o más SNP heterocigotos puede estar representado por un solo miembro del grupo, o se pueden promediar las frecuencias alélicas de todos los miembros del grupo, o se puede tomar una mediana, siempre que la frecuencia alélica de cada SNP heterocigoto se calcule de forma coherente para el alelo que tiene el número mayor o menor de copias en el genoma enfermo.
Una corrección de error de paridad del primer tipo de un segmento heterocigoto puede implicar encontrar el nodo par más probable que corresponda al segmento heterocigoto, por ejemplo, basándose en un marco de máxima probabilidad dada la enfermedad medida (por ejemplo, un tumor) lee y lecturas normales que se asignan al segmento.
En una corrección de error de paridad del segundo tipo, se identifican los segmentos ascendentes y descendentes más cercanos que no requieren corrección de errores de paridad, preferiblemente dentro de 10 Mb, 5 Mb, 1 Mb del segmento que contiene el SNV. Si el número absoluto de copias de los segmentos ascendentes y descendentes más cercanos son idénticos, entonces el número absoluto de copias del segmento que contiene el SNV se cambia al número absoluto de copias del segmento más cercano. Generalmente, se prefiere la corrección de errores de paridad del segundo tipo a la corrección de errores de paridad del primer tipo, a menos que no se pueda implementar porque no se pueden identificar los segmentos vecinos adecuados, en cuyo caso se puede aplicar la corrección de errores de paridad del primer tipo.
También se pueden introducir otras formas de corrección de errores de un número absoluto de copias de un segmento en lugar de o además de la corrección de errores de paridad. Por ejemplo, métodos que consideran el número absoluto de copias de los segmentos en la vecindad inmediata del gen que contiene la mutación en el genoma enfermo, en los que el número absoluto de copias del segmento que contiene el SNV se cambia al modo de los números absolutos de copias de los segmentos vecinos, preferiblemente si el cambio en el número absoluto de copias no es más de 3, 2 y preferiblemente 1, y preferiblemente si la mayoría de los segmentos vecinos (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) tienen un valor absoluto número de copias igual al modo.
Se pueden combinar diferentes esquemas de corrección de errores para los números absolutos de copias. En una realización preferida, la primera corrección de errores de paridad se aplica como primera capa de corrección de errores, sobre la cual se pueden aplicar métodos de corrección de errores adicionales.
Como se usa en este documento, un segmento puede ser una región predeterminada del genoma, por ejemplo, predeterminada con base en un genoma de referencia. Un segmento puede abarcar un gen, por ejemplo, como se define en un genoma de referencia con el que se alinean las lecturas. Un segmento también puede ser un fragmento de un gen, un exón, una unión de exones o la unión de exones asociados dentro de un gen dado. Un segmento también puede ser otro conjunto de regiones predeterminadas en un genoma de referencia (con o sin intrones), u otro conjunto de regiones predeterminadas en un genoma de referencia con base en el genoma normal. En realizaciones específicas, un segmento puede ser una región del genoma de referencia con un número de copias constante dado y/o un número de copias específico de alelo dado en el enfermo, por ejemplo, tumor, genoma o alternativamente un fragmento de un gen con un número de copia constante dado y/o número de copias específico del alelo en el enfermo, por ejemplo, genoma del tumor. Se puede definir un segmento para incluir o excluir intrones.
Se puede definir un número de copias de un segmento en un genoma dado (por ejemplo, en el genoma normal o en el genoma tumoral) como la frecuencia con la que en total la secuencia de nucleótidos del segmento ocurre en el genoma, ignorando las variaciones causadas por SNP y/o SNV y/u otros cambios asociados al cáncer tales como, pero sin limitarse a, mutación, inserciones, eliminaciones y/u otras variantes genéticas relacionadas con el cáncer. Preferiblemente, las diferentes copias del segmento en el genoma dado tienen la misma longitud o casi la misma longitud.
El número de copias de un segmento en un genoma puede significar el número de copias físicas del segmento en una célula que contiene el genoma. Un número absoluto de copias de un segmento en el genoma normal se puede definir como el número de copias físicas del segmento dado en una célula sana. Un número absoluto de copias de un segmento en el enfermo, por ejemplo, tumor, genoma, puede definirse como el número de copias físicas del segmento dado en una célula enferma, por ejemplo, tumoral. El número de copias de un segmento en el genoma puede denominarse número absoluto de copias del segmento en dicho genoma. Un número de copias puede significar un número de copias absoluto.
En una realización específica, si solo una parte de un segmento se amplifica o elimina en un genoma, entonces dicha copia parcial del segmento puede contarse como una copia del segmento o no contarse como una copia del segmento. En una realización preferida, las copias del segmento que abarcan menos del 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% de la longitud del segmento pueden ignorarse.
Se usa un genoma de referencia para asignar lecturas y proporcionar un sistema de coordenadas para el genoma normal y el enfermo, por ejemplo, tumor, genoma, en el que un sistema de coordenadas puede comprender proporcionar un número de cromosoma, una posición de nucleótido en el cromosoma, así como como direccionalidad de la lectura, en la que la posición en el cromosoma indicada por la línea.
Un genoma de referencia puede basarse en el genoma de uno o más miembros de la misma especie que un sujeto que proporciona la muestra de tejido enfermo, o puede basarse en el genoma normal del sujeto.
Una muestra de tejido enfermo, tal como una muestra de tumor, también puede comprender contaminación del genoma normal, en particular del genoma normal del mismo paciente del que se tomó la muestra, y/o en caso de heterogeneidad intratumoral, también comprende más de un genoma tumoral. La pureza, la pureza de la muestra del tumor, la pureza del tumor y la pureza de la muestra se toman como términos equivalentes, preferiblemente significando la fracción de células tumorales presentes en una muestra de tumor. La contaminación normal significa preferiblemente la fracción de células normales presentes en la muestra de tumor, y se puede dar por uno menos la pureza.
La normalización contra la ploidía de las células controla la presencia de copias de un gen debido a eventos de duplicación del genoma. En una realización, el número absoluto de copias se puede normalizar frente a la ploidía del genoma, ploidía que es el promedio del número absoluto de copias de todos los segmentos en un genoma dado, es una célula determinada ponderada por la longitud de cada segmento. En una realización, el número absoluto de copias se puede normalizar frente a la ploidía del cromosoma que contiene el gen mutado de interés (que comprende la mutación), ploidía que es el promedio del número absoluto de copias de todos los segmentos en el cromosoma dado en una célula dada ponderada por la longitud de cada segmento del cromosoma. En una realización, el número absoluto de copias se puede normalizar frente a la ploidía de una región vecina del cromosoma que contiene el gen mutado de interés, cuya ploidía es el promedio de cada segmento en la región dada en una célula dada ponderado por la longitud de cada segmento de la región. La región vecina puede estar dentro de una distancia predeterminada del gen que tiene la mutación específica de la enfermedad, por ejemplo, dentro de 100 megabases (Mb), 75 Mb, 50 Mb, 25 Mb, 10 Mb, 5 Mb, 4 Mb, 3 Mb, 2 Mb, o 1 Mb del gen que tiene la mutación específica de la enfermedad. El número de copias de un segmento se puede calcular de forma rutinaria mediante métodos conocidos en la técnica, tanto de forma experimental como computacionalmente. Por ejemplo, las patentes EP Nos. 2198292 B1 y EP 2002 016 B1 describen métodos para determinar el número relativo de copias y la frecuencia del número de copias de secuencias de ácido nucleico, respectivamente. Además, la publicación de solicitud de patente EP No. 2835752 A y las publicaciones de solicitud internacional de patente Nos. WO 2014/014497 y WO 2014/138153 también describen métodos para determinar variaciones en el número de copias. Véase también, Machado et al., 2013, Copy Number Variation of Fc Gamma Receptor Genes in HIV-Infected and HIV-Tuberculosis Co-Infected Individuals in Sub-Saharan Africa, PLoS, 8 (11): e78165. Otros métodos incluyen el uso de FACS, FISH u otros métodos basados en fluorescencia, cariotipado espectral (SKY) y PCR digital. Un segmento también puede ser un gen.
La mutación específica de la enfermedad puede ser cualquier mutación que dé como resultado la expresión de un neoepítopo, preferiblemente en la superficie de la célula enferma. En particular, la mutación puede ser un evento de inserción/eliminación o de fusión génica o puede ser una variación de un solo nucleótido (mutación puntual). Preferiblemente, las mutaciones específicas de la enfermedad son mutaciones no sinónimas, preferiblemente mutaciones no sinónimas de proteínas expresadas en un tumor o célula cancerosa. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para determinar mutaciones específicas de enfermedad y, en particular, se prefieren métodos que usan datos de secuenciación de próxima generación para determinar cualquier cambio entre el genoma/exoma de las células enfermas en comparación con el genoma/exoma de las correspondientes células de tipo silvestre no enfermas. Por ejemplo, Carter et al., 2012, Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer, Nature Biotechnology 30: 413-421; Cibulskis et al., 2013, Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples, Nature Biotechnology 31: 213-219; y Li y Li, 2014, A general framework for analyzing tumor subclonality using SNP array and DNA sequencing data, Genome Biology 15: 473-495 divulgan métodos no solo para identificar mutaciones específicas de enfermedades, sino también divulgan métodos para determinar el número de copias de genes, cigosidad fraccional y subclonalidad fraccional de la cigosidad y cigosidad fraccional. Otro método para determinar el número de copias, como el número de copias absoluto, se refiere al uso de segmentos del genoma, conteniendo cada segmento al menos un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) heterocigoto, y qué segmentos están equilibrados (igual número de cada versión del SNP heterocigoto) y comparten un número común de copias (número de copias principal) que preferiblemente es el número de copias absoluto observado con más frecuencia de todos los segmentos equilibrados del genoma, como se describe en la solicitud internacional de patente PCT titulada "Tumor Modeling Based on Primary Balanced Heterozygous Segments" presentada en la misma fecha. Además, adicional a la determinación del número absoluto de copias, esta solicitud también puede determinar la cigosidad, la cigosidad fraccional y la subclonalidad del alelo mutado o del gen del cual al menos una copia comprende el alelo mutado. Además, la metodología en el mismo también realiza la corrección de errores para los números absolutos de copias, lo que mejora la precisión de los números absolutos de copias y las cigosidades y los parámetros derivados de los mismos, tales como subclonalidad, ploidía, etc.
Generalmente, un número total de copias del sitio de nucleótidos al que se asigna el alelo mutado puede significar el número absoluto de copias de la mutación, que puede significar el número absoluto de copias del SNV, en particular cuando la mutación es un SNV. Generalmente, el número absoluto de copias de la mutación puede estar dado preferiblemente por el número absoluto de copias de un segmento al que se asigna la mutación (en el que el número absoluto de copias está en el enfermo, por ejemplo, genoma del tumor).
Generalmente, un número de copias de un alelo mutado que codifica un neoepítopo puede significar un número absoluto de copias de un alelo mutado de una mutación, que puede significar un número absoluto de copias del alelo alternativo de un SNV (una cigosidad de un SNV), en el que el alelo alternativo del SNV es el alelo mutado, en particular cuando la mutación es un SNV.
Preferiblemente, cuando la mutación no es un SNV, el número absoluto de copias de un alelo mutado de una mutación puede estimarse de una manera similar al método aplicado para los SNV.
Generalmente, un número de copias de un gen puede significar el número absoluto de copias de un segmento, en el que el segmento puede ser el gen o puede abarcar el gen. Un número de copias de un gen puede significar un número absoluto de copias de un gen.
Preferiblemente, la enfermedad puede ser cualquier enfermedad en la que se desee una respuesta inmune contra la célula/tejido enfermo, tal como una célula infectada por virus. Preferiblemente, la enfermedad es cáncer.
Los métodos de la enseñanza pueden comprender la etapa adicional de determinar la usabilidad/idoneidad de los neoepítopos adecuados identificados por los métodos de la enseñanza como objetivos específicos de enfermedad adecuadas para su uso en un método para proporcionar una respuesta inmune contra el neoepítopo adecuado, como la inclusión del neoepítopo adecuado en una vacuna contra el cáncer. Por tanto, las etapas adicionales pueden implicar una o más de las siguientes: determinar la antigenicidad y/o inmunogenicidad del neoepítopo adecuado; evaluar si el neoepítopo adecuado se expresa en la superficie de la célula enferma; capacidad de un péptido que comprende el neoepítopo adecuado para presentarse como un epítopo presentado por el MHC; determinar la eficacia de la expresión del neoepítopo adecuado a partir de un ácido nucleico codificante; determinar si los neoepítopos adecuados previstos, en particular cuando están presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, cuando están flanqueadas por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos neoepítopos en la proteína de origen natural, y cuando se expresan en células presentadoras de antígenos son capaces de estimular las células T tales como las células T del paciente que tienen la especificidad deseada.
Una vez que se ha determinado que el neoepítopo es adecuado/apropiado para su uso como objetivo en vista de su antigenicidad/inmunogenicidad, capacidad para expresarse, capacidad para presentarse como un epítopo presentado por el MHC, etc., los neoepítopos adecuados identificados pueden clasificarse, es decir, priorizarse, en función de su potencial para no subregularse o eliminarse de la célula enferma, es decir, es menos probable que el tejido enfermo pueda escapar de la dirección del neoepítopo. Por ejemplo, una priorización comienza con el "mejor" neoepítopo, que es uno que está codificado por un gen esencial, en el que todas las copias del gen esencial tienen la mutación que codifica el neoepítopo, seguida de un par de genes sintéticos enfermos o letales en los que cada copia de cada gen tiene la mutación que codifica el neoepítopo, seguido de un neoepítopo codificado por un gen impulsor conocido con un número absoluto de copias muy alto en el que todas las copias del gen tienen la mutación, seguido de un neoepítopo codificado por un gen que no se sabe que sea un gen impulsor con un número de copias absoluto muy alto y una cigosidad alta, seguido de un neoepítopo codificado por un gen con un número de copias alto (cigosidad), y así sucesivamente.
En una realización, se prefiere un neoepítopo codificado por un gen esencial con una cigosidad fraccional de 1 a otros neoepítopos que no están codificados por un gen esencial. En una realización, entre dos genes esenciales que codifican neoepítopos con una cigosidad fraccional de 1, se prefiere el neoepítopo codificado por el gen que tiene un número absoluto de copias más alto. En una realización, entre dos genes esenciales que codifican neoepítopos, se prefiere el neoepítopo codificado por el gen que conduce a una menor aptitud cuando se elimina. En una realización, entre genes que codifican neoepítopos en los que todos los genes tienen una cigosidad fraccional de 1, se prefieren los neoepítopos codificados por los genes que tienen un número absoluto de copias más alto. En una realización donde la cigosidad fraccional es menor que 1, entonces se prefieren los neoepítopos codificados por genes que tienen una cigosidad alta a los genes que tienen una cigosidad fraccional alta, y si la cigosidad es la misma o similar, entonces los genes que tienen un número absoluto de copias alto son preferido a aquellos con una alta cigosidad fraccional (10 copias del alelo mutado/20 copias totales del sitio del nucleótido es mejor que 3/4 debido a una mayor cigosidad; 10/100 es mejor que 10/20 porque el primero puede ser un gen impulsor; 9/100 es mejor que 10/20 porque la cigosidad es similar, pero el primero puede ser un gen impulsor). En una realización, se prefiere un neoepítopo codificado por un gen impulsor, en el que la mutación específica de la enfermedad es responsable de transformar la célula en un fenotipo canceroso, a aquellos en los que la mutación no tiene un papel en la transformación de la célula en el fenotipo canceroso. Además, se prefiere que los neoepítopos tengan una fracción clonal mayor en lugar de menor.
Otras realizaciones de la presente enseñanza se refieren al uso de los métodos para determinar la idoneidad de un neoepítopo como objetivo específico de enfermedad para la fabricación de un medicamento, tal como una vacuna, por ejemplo, una vacuna personalizada contra el cáncer. La vacuna puede derivarse de uno o más neoepítopos adecuados o de una combinación de neoepítopos adecuados identificados por los métodos de la enseñanza. En una realización preferida, la vacuna comprende un péptido o polipéptido que comprende uno o más neoepítopos adecuados o una combinación de neoepítopos adecuados identificados por los métodos de la enseñanza, o un ácido nucleico que codifica dicho péptido o polipéptido.
En particular, se puede proporcionar una vacuna recombinante que cuando se administra a un paciente proporciona preferiblemente una colección de epítopos presentados por el MHC, al menos uno de los cuales es un neoepítopo adecuado o al menos dos de los cuales son una combinación adecuada de neoepítopos identificados por el métodos de la presente enseñanza, tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más y preferiblemente hasta 60, hasta 55, hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 del MHC presentaron epítopos. La presentación de estos epítopos por las células de un paciente, en particular las células presentadoras de antígenos, preferiblemente da como resultado que las células T se dirijan a los epítopos cuando se unen al MHC y, por lo tanto, al tumor del paciente, preferiblemente al tumor primario, así como a las metástasis tumorales, que expresan antígenos a partir de los cuales los epítopos presentados por el MHC se derivan y presentan los mismos epítopos en la superficie de las células tumorales.
Los métodos de la presente enseñanza también son útiles en la fabricación de células inmunes recombinantes que expresan un receptor de antígeno dirigido a un neoepítopo adecuado o a un neoepítopo en una combinación de neoepítopos adecuados. Preferiblemente, las células inmunes son células T y el receptor de antígeno es un receptor de células T.
La presente enseñanza también se refiere a un método para proporcionar una célula inmunitaria recombinante dirigida a un neoepítopo adecuado o un epítopo en una combinación de neoepítopos adecuados, comprendiendo dicho método transfectar una célula inmunitaria con un receptor de antígeno recombinante dirigido al neoepítopo adecuado o al único epítopo en una combinación de epítopos adecuados identificados por los métodos de la presente enseñanza para determinar la idoneidad de un neoepítopo como objetivo específico de enfermedad, así como a células inmunes recombinantes producidas por tales métodos.
La presente enseñanza también proporciona métodos para dirigirse a una población celular o tejido que expresa uno o más neoepítopos. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo dirigido contra uno o más de los neoepítopos para dirigirse a las células o tejido que expresan el uno o más neoepítopos identificados por los métodos descritos en este documento. En una realización, la presente enseñanza proporciona métodos para proporcionar una respuesta inmune a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa uno o más neoepítopos en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar al mamífero (a) una o más células inmunes que expresan uno o más receptores de antígenos dirigidos a uno o más neoepítopos; (b) administrar un ácido nucleico que codifica uno o más de los neoepítopos; o (c) administrar un péptido o polipéptido que comprende uno o más de los neoepítopos, en el que los neoepítopos se identifican de acuerdo con los métodos de la enseñanza para determinar la idoneidad de un neoepítopo como objetivo específico de enfermedad. En una realización, el método para proporcionar una respuesta inmune a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa uno o más neoepítopos en un mamífero comprende las etapas de (i) determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias de un alelo mutado en un gen que codifica un neoepítopo (una mutación específica de la enfermedad); y (ii) administrar (a) una célula inmunitaria que expresa un receptor de antígeno dirigido al neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad; (b) administrar un ácido nucleico que codifica el neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad; o (c) administrar un péptido o polipéptido que comprende el neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad.
En una realización, el método para proporcionar una respuesta inmune a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa uno o más neoepítopos en un mamífero comprende las etapas de (i) determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias de un gen en el que al menos una copia del gen tiene una mutación específica de la enfermedad que da como resultado un neoepítopo; y (ii) administrar (a) una célula inmunitaria que expresa un receptor de antígeno dirigido al neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad; (b) administrar un ácido nucleico que codifica el neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad; o (c) administrar un péptido o polipéptido que comprende el neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad. En una realización, el método para proporcionar una respuesta inmune a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa uno o más neoepítopos en un mamífero comprende las etapas de (i) determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, si un gen tiene una mutación específica de la enfermedad que da como resultado un neoepítopo es un gen esencial; y (ii) administrar (a) una célula inmunitaria que expresa un receptor de antígeno dirigido al neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad; (b) administrar un ácido nucleico que codifica el neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad; o (c) administrar un péptido o polipéptido que comprende el neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad. Preferiblemente, todas las copias del gen esencial tienen la mutación específica de la enfermedad, es decir, la cigosidad fraccional es 1.
En una realización, el método para proporcionar una respuesta inmune a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa uno o más neoepítopos en un mamífero comprende las etapas de (i) determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, si una combinación de al menos dos genes, cada uno con una mutación específica de la enfermedad que da como resultado un neoepítopo, son genes sintéticamente letales o sintéticamente enfermos; y (ii) administrar (a) una o más células inmunes que expresan uno o más receptores de antígenos dirigidos a uno o más neoepítopos resultantes de las mutaciones específicas de enfermedad de al menos dos genes; (b) administrar un ácido nucleico que codifica uno o más neoepítopos resultantes de las mutaciones específicas de enfermedad de al menos dos genes; o (c) administrar un péptido o polipéptido que comprende uno o más neoepítopos resultantes de las mutaciones específicas de enfermedad de al menos dos genes. Preferiblemente, todos los neoepítopos resultantes de las mutaciones específicas de la enfermedad de al menos dos genes son el objetivo de las células inmunitarias administradas, codificadas por el ácido nucleico administrado o comprendidas dentro del péptido o polipéptido administrado.
Además, la respuesta inmune se puede proporcionar a un mamífero que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión del neoepítopo resultante de la mutación específica de la enfermedad, de manera que la enfermedad, trastorno o afección se trate o prevenga. Preferiblemente, la enfermedad, trastorno o afección es cáncer.
Preferiblemente, las células inmunes son células T y los receptores de antígenos son receptores de células T, y la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria mediada por células T. Más preferiblemente, la respuesta inmune es una respuesta inmune antitumoral y la población de células objetivo o tejido objetivo que expresa uno o más neoepítopos adecuados son células tumorales o tejido tumoral.
Otras características y ventajas de la presente enseñanza serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
Descripción detallada de la invención
Aunque la presente enseñanza se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.
A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Las realizaciones preferidas descritas de diversas formas no deben interpretarse como que limitan la presente enseñanza solo a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción apoya y engloba realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse reveladas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, si en una realización preferida el neoepítopo tiene una cigosidad alta en lugar de una cigosidad fraccional alta, y en una realización preferida el neoepítopo resulta de una mutación en un gen esencial, entonces en una realización preferida, el neoepítopo adecuado tiene una cigosidad fraccional alta y resulta de una mutación en un gen esencial, y en una realización más preferida, la cigosidad fraccional es igual a 1.
Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.
La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía en este campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende" implican la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas aunque en algunas realizaciones dicho otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas puede ser excluido, es decir, el tema en cuestión consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas indicadas. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento. o claramente contradicho por el contexto. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento.
Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente de otro modo. Por ejemplo, la determinación de si el neoepítopo es un objetivo específico de enfermedad adecuado mediante la determinación del número de copias del gen codificante puede determinarse antes, después o al mismo tiempo que la determinación de que el gen es un gen impulsor o un gen esencial, o puede ser determinado antes, después o al mismo tiempo que la determinación de que el neoepítopo se expresa en la superficie de la célula o induce una respuesta inmune satisfactoria de modo que sería adecuado en una vacuna.
El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplo de expresión (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en el presente documento está destinado simplemente a ilustrar mejor la enseñanza y no supone una limitación en el alcance de la enseñanza reivindicada de otro modo. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.
La presente enseñanza prevé la terapia de enfermedades, incluida la inmunoterapia y la radioterapia, en particular el cáncer, por direccionamiento a neoepítopos ("neoepítopos adecuados") que solo se expresan en o sobre las células enfermas y que tienen la característica de expresarse a partir de genes que tienen menos probabilidades de ser silenciados por la célula enferma, de modo que es menos probable que la célula enferma pueda escapar de la vigilancia inmunológica a través del neoepítopo objetivo. La inmunoterapia puede realizarse mediante métodos inmunoterapéuticos activos y/o pasivos. Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo u otra molécula que se dirija específicamente a un neoepítopo y conjugado con un agente tóxico capaz de matar la célula que expresa el neoepítopo se puede usar de acuerdo con la presente enseñanza para atacar y matar esa célula.
La enseñanza se dirige específicamente a la identificación de tales neoepítopos adecuados como objetivos específicos de la enfermedad en inmunoterapia. Una vez que se han identificado los neoepítopos adecuados, se pueden usar en vacunas para inducir una respuesta inmune contra el neoepítopo, en particular, induciendo y/o activando células efectoras apropiadas tales como células T que reconocen el neoepítopo adecuado identificado, en particular cuando se presenta en el contexto del MHC, a través de un receptor de antígeno apropiado, tal como un receptor de células T o un receptor de células T artificial, que da como resultado la muerte de la célula enferma que expresa el neoepítopo adecuado. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden administrar células inmunes que reconocen el neoepítopo adecuado identificado a través de un receptor de antígeno apropiado, lo que también dará como resultado la muerte de las células que expresan el neoepítopo adecuado.
Los enfoques inmunoterapéuticos de acuerdo con la enseñanza incluyen inmunización con un péptido o polipéptido que contiene el neoepítopo adecuado, ii) ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido que contiene el neoepítopo adecuado, iii) células recombinantes que codifican el péptido o polipéptido que contiene el neoepítopo adecuado, iv) virus recombinantes que codifican el péptido o polipéptido que contiene el neoepítopo y v) células presentadoras de antígeno pulsadas con el péptido o polipéptido que contiene el neoepítopo o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican el péptido o polipéptido. Otros enfoques inmunoterapéuticos de acuerdo con la enseñanza incluyen la transferencia de vi) receptores de células T que reconocen el neoepítopo, y vii) células efectoras que codifican receptores (tales como células T) que reconocen el neoepítopo, en particular cuando se presentan en el contexto del MHC.
El término "mutación específica de enfermedad" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de una célula enferma pero ausente en el ácido nucleico de una correspondiente célula normal, no enferma. La enfermedad puede ser cáncer, por lo tanto, el término "mutación específica de tumor" o "mutación específica de cáncer" se refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de un tumor o célula cancerosa pero ausente en el ácido nucleico de una célula correspondiente normal, es decir, no tumoral o no cancerosa. Los términos "mutación específica de tumor" y "mutación de tumor" y los términos "mutación específica de cáncer" y "mutación de cáncer" se usan indistintamente en el presente documento.
Como se usa en este documento, un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) es un sitio en el genoma normal en el que al menos uno de los dos alelos (materno o paterno) tiene una identidad diferente a la del genoma normal, o con respecto a, por ejemplo, un genoma de referencia.
Como se usa en el presente documento, un polimorfismo de un solo nucleótido heterocigoto (SNP heterocigoto) se define como un sitio en el genoma normal en el que los dos alelos (los alelos materno y paterno) tienen una identidad diferente.
Como se usa en este documento, el término "cigosidad fraccional" se refiere a la fracción del número de copias de un gen que tiene una mutación específica de la enfermedad en vista del número total de copias del gen, ya sea que el gen tenga la mutación o no. Por ejemplo, si hay un total de 20 copias del gen y 10 de las copias tienen la mutación específica de la enfermedad, entonces la cigosidad fraccional es 0,5. Si todas las copias del gen tienen la mutación específica de la enfermedad, entonces la cigosidad fraccional es 1. La cigosidad fraccional puede ser al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o al menos 0,95. En el contexto de la presente enseñanza, se prefiere una cigosidad fraccional más alta en lugar de una cigosidad fraccional más baja. En una realización, la cigosidad fraccional de un alelo mutado que codifica un epítopo, preferiblemente un neoepítopo, es la proporción del número de copias del alelo mutado sobre el número total de copias del sitio del nucleótido al que se asigna el alelo mutado, por ejemplo, en un genoma de referencia.
Como se usa en este documento, el término "fracción clonal" se refiere a la fracción del número de células enfermas que contienen la misma mutación específica de la enfermedad en el mismo gen y sus características genéticas tales como el número de copias y la cigosidad fraccional en vista del total número de células enfermas, tanto si las células enfermas tienen la misma mutación en el mismo gen como si no. Este término también se puede aplicar al tejido tumoral en el sentido de que la fracción clonal es la fracción de células enfermas en el tejido tumoral que contienen la misma mutación específica de la enfermedad en el mismo gen y sus características genéticas, como el número de copias en vista del número total de células en el tejido tumoral. Por ejemplo, en una muestra obtenida de un tumor, en la que solo la mitad del número total de células tumorales tiene la misma mutación en el mismo gen, entonces la fracción clonal es 0,5. La fracción clonal puede ser al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o al menos 0,95. En el contexto de la presente enseñanza, se prefiere una fracción clonal más alta en lugar de una fracción clonal más baja. La más preferida es una fracción clonal de 1, en la que todas las células enfermas tienen la misma mutación específica de la enfermedad en el mismo gen. "Fracción clonal", "clonalidad fraccional" y "subclonalidad fraccional" se usan indistintamente en el presente documento.
El término "amplificación focal" se refiere a una amplificación, o aumento en el número de copias, de una parte de un genoma, por ejemplo, la amplificación de uno o más genes ubicados juntos en el mismo cromosoma, que da como resultado un número de copias mayor de 2, preferiblemente mayor de 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 para esta parte del genoma, siempre que no haya ocurrido ningún evento de eliminación para la misma parte del genoma. Por lo tanto, para los propósitos de la presente enseñanza, los genes que se amplifican focalmente en las células enfermas son aquellos genes que pueden tener un número de copias aumentado en comparación con el número de copias de tipo silvestre de 2 o el número de copias de tipo silvestre de 1 para esos gene en los cromosomas X y Y en los hombres. La amplificación focal es distinta de los eventos de duplicación y/o amplificación del genoma completo.
El término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno y preferiblemente se refiere a una respuesta inmune celular o una respuesta inmune celular así como humoral. La respuesta inmune puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica.
"Inducir una respuesta inmune" puede significar que no hubo una respuesta inmune contra un antígeno particular antes de la inducción, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmune contra un antígeno particular antes de la inducción y después de la inducción dicha respuesta inmune está mejorada. Por tanto, "inducir una respuesta inmunitaria" también incluye "potenciar una respuesta inmunitaria". Preferiblemente, después de inducir una respuesta inmune en un sujeto, dicho sujeto está protegido de desarrollar una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o la condición de la enfermedad mejora induciendo una respuesta inmune. Por ejemplo, se puede inducir una respuesta inmune contra un antígeno expresado por un tumor en un paciente que padece una enfermedad cancerosa o en un sujeto que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Inducir una respuesta inmune en este caso puede significar que el estado de enfermedad del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.
Una "respuesta inmune celular", una "respuesta celular", una "respuesta celular contra un antígeno" o un término similar incluye una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC clase I o clase II. La respuesta celular se relaciona con células llamadas células T o linfocitos T que actúan como "colaboradores" o "asesinos". Las células T colaboradoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central al regular la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan las células enfermas como las células cancerosas, evitando la producción de más células enfermas. Preferiblemente, se estimula una respuesta de CTL antitumoral contra células tumorales que expresan uno o más antígenos expresados en tumores y que presentan preferiblemente tales antígenos expresados en tumores con MHC de clase I.
Un "antígeno" de acuerdo con las enseñanzas cubre cualquier sustancia, preferiblemente un péptido o proteína, que es un objetivo de y/o induce una respuesta inmune tal como una reacción específica con anticuerpos o linfocitos T (células T). Preferiblemente, un antígeno comprende al menos un epítopo tal como un epítopo de células T. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que preferiblemente es específica para el antígeno (incluidas las células que expresan el antígeno). El antígeno o un epítopo de células T del mismo se presenta preferiblemente por una célula, preferiblemente por una célula presentadora de antígeno que incluye una célula enferma, en particular una célula cancerosa, en el contexto de moléculas del MHC, lo que da como resultado una respuesta inmune contra el antígeno (incluidas las células que expresan el antígeno).
Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que es preferiblemente específica para el antígeno. De acuerdo con la presente enseñanza, se puede usar cualquier antígeno adecuado, que sea candidato para una reacción inmune, en la que la reacción inmune puede ser tanto una reacción inmune humoral como celular. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno lo presenta preferiblemente una célula, preferiblemente una célula presentadora de antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, lo que da como resultado una reacción inmune contra el antígeno. Un antígeno es preferiblemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Dichos antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivarse de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral. De acuerdo con la presente enseñanza, un antígeno puede corresponder a un producto de origen natural, por ejemplo, una proteína viral, o una parte de la misma. En realizaciones preferidas, el antígeno es un polipéptido de superficie, es decir, un polipéptido que se presenta de forma natural en la superficie de una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor.
El término "antígeno asociado a la enfermedad" o "antígeno específico de la enfermedad" se usa en su sentido más amplio para referirse a cualquier antígeno asociado o específico a una enfermedad. Dicho antígeno es una molécula que contiene epítopos que estimularán el sistema inmunológico de un huésped para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno celular y/o una respuesta de anticuerpo humoral contra la enfermedad. Por tanto, el antígeno asociado a la enfermedad se puede utilizar con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades se asocian preferiblemente con infección por microbios, típicamente antígenos microbianos, o asociados con cáncer, típicamente tumores.
El término "patógeno" se refiere a material biológico patógeno capaz de causar enfermedad en un organismo, preferiblemente un organismo vertebrado. Los patógenos incluyen microorganismos como bacterias, organismos eucariotas unicelulares (protozoos), hongos y virus.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a tumor" se refiere a proteínas que se encuentran en condiciones normales expresadas específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas específicas de desarrollo, por ejemplo, el antígeno tumoral puede expresarse en condiciones normales específicamente en el tejido del estómago, preferiblemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y se expresan o expresan de forma aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa preferiblemente no más de 3, más preferiblemente no más de 2. Los antígenos tumorales en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos del tipo celular, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en un cierto tipo de células en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en testículos y, a veces, en placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno tumoral se asocia preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o solo rara vez se expresa en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno tumoral o la expresión aberrante del antígeno tumoral identifica células cancerosas. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno tumoral que expresa una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa es preferiblemente una autoproteína en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno tumoral en el contexto de la presente enseñanza se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunológico no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o sólo difícilmente accesibles por el sistema inmunológico. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral es idéntica entre el antígeno tumoral que se expresa en tejidos normales y el antígeno tumoral que se expresa en tejidos cancerosos.
De acuerdo con las enseñanzas, los términos "antígeno tumoral", "antígeno expresado por tumor", "antígeno canceroso" y "antígeno expresado por cáncer" son equivalentes y se usan indistintamente en el presente documento.
Los términos "epítopo", "péptido antigénico", "epítopo antigénico", "péptido inmunogénico" y "péptido de unión al MHC" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o un fragmento de un compuesto inmunológicamente activo que es reconocido por el sistema inmunológico, por ejemplo, que es reconocido por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC. Un epítopo de una proteína comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. De acuerdo con la enseñanza, un epítopo puede unirse a moléculas del MHC tales como moléculas del MHC en la superficie de una célula y, por tanto, puede ser un "péptido de unión a MHC" o "péptido antigénico". El término "complejo principal de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas del MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que está presente en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto autoantígenos (fragmentos de péptidos de la propia célula) como no autoantígenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T. Las porciones inmunogénicas preferidas se unen a una molécula del MHC de clase I o clase II. Como se usa en el presente documento, se dice que una porción inmunogénica se "une a" una molécula del MHC de clase I o clase II si dicha unión es detectable usando cualquier ensayo conocido en la técnica. El término "péptido de unión al MHC" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC de clase I y/o del MHC de clase II. En el caso de complejos del MHC de clase I/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente de 8 a 10 aminoácidos de longitud, aunque los péptidos más largos o más cortos pueden ser eficaces. En el caso de complejos del MHC de clase II/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente una longitud de 10-25 aminoácidos y, en particular, una longitud de 13-18 aminoácidos, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces.
Como se usa en este documento, el término "neoepítopo" se refiere a un epítopo que no está presente en una referencia tal como una célula normal no cancerosa o de línea germinal pero que se encuentra en células enfermas, tales como células cancerosas. Esto incluye, en particular, situaciones en las que en una célula normal no cancerosa o de línea germinal se encuentra un epítopo correspondiente, sin embargo, debido a una o más mutaciones en una célula cancerosa, la secuencia del epítopo se cambia para dar como resultado el neoepítopo. Además, un neoepítopo no solo puede ser específico de las células enfermas, sino que también puede ser específico del paciente que padece la enfermedad. Dado que los neoepítopos y los neoepítopos adecuados que se identifican mediante los métodos de la enseñanza son subconjuntos de epítopos, la descripción en el presente documento relacionada con los epítopos en general como objetivos inmunológicas se aplica igualmente a los neoepítopos y a los neoepítopos adecuados. En una realización particularmente preferida de la enseñanza, un epítopo o neoepítopo es un epítopo de células T. Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de células T" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC en una configuración reconocida por un receptor de células T. Normalmente, los epítopos de células T se presentan en la superficie de una célula presentadora de antígeno.
Como se usa en el presente documento, el término "predecir modificaciones de aminoácidos inmunogénicos" se refiere a una predicción de si un péptido que comprende tal modificación de aminoácidos será inmunogénico y, por tanto, útil como epítopo, en particular epítopo de células T, en la vacunación.
De acuerdo con las enseñanzas, un epítopo de células T puede estar presente en una vacuna como parte de una entidad mayor, tal como una secuencia de vacuna y/o un polipéptido que comprende más de un epítopo de células T. El péptido o epítopo de células T presentado se produce siguiendo un procesamiento adecuado.
Los epítopos de células T pueden modificarse en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de TCR o para la unión al MHC. Dichos epítopos de células T modificados pueden considerarse inmunológicamente equivalentes.
Preferiblemente, un epítopo de célula T cuando se presenta por el MHC y es reconocido por un receptor de células T es capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, expansión clonal de la célula T que porta el receptor de células T que reconoce específicamente el complejo péptido/MHC.
Preferiblemente, un epítopo de células T comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde sustancialmente con la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por el MHC de clase I y/o clase II.
El epítopo de células AT de acuerdo con la enseñanza se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno 0 células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente por la presentación del antígeno. antígeno tal como células enfermas, en particular células cancerosas. Preferiblemente, un epítopo de células T es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase 1 y preferiblemente es capaz de estimular un linfocito T citotóxico sensible al antígeno (CTL).
En algunas realizaciones, el antígeno es un autoantígeno, particularmente un antígeno tumoral. Los expertos en la materia conocen los antígenos tumorales y su determinación.
El término "inmunogenicidad" se refiere a la efectividad relativa para inducir una respuesta inmune que se asocia preferiblemente con tratamientos terapéuticos, tales como tratamientos contra cánceres. Como se usa en este documento, el término "inmunogénico" se refiere a la propiedad de tener inmunogenicidad. Por ejemplo, el término "modificación inmunogénica" cuando se usa en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína se refiere a la efectividad de dicho péptido, polipéptido o proteína para inducir una respuesta inmune causada por y/o dirigida contra dicha modificación. Preferiblemente, el péptido, polipéptido o proteína no modificados no induce una respuesta inmune, induce una respuesta inmune diferente o induce un nivel diferente, preferiblemente un nivel más bajo, de respuesta inmune.
De acuerdo con la enseñanza, el término "inmunogenicidad" o "inmunogénico" se refiere preferiblemente a la efectividad relativa para inducir una respuesta inmune biológicamente relevante, en particular una respuesta inmune que es útil para la vacunación. Por tanto, en una realización preferida, una modificación de aminoácidos o un péptido modificado es inmunogénico si induce una respuesta inmunitaria contra la modificación objetivo en un sujeto, respuesta inmunitaria que puede ser beneficiosa para fines terapéuticos o profilácticos.
"Procesamiento de antígenos" o "procesamiento" se refiere a la degradación de un polipéptido o antígeno en productos de procesión, que son fragmentos de dicho polipéptido o antígeno (por ejemplo, la degradación de un polipéptido en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas del MHC para su presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígenos, a células T específicas. Las "células presentadoras de antígeno" (APC) son células que presentan fragmentos peptídicos de antígenos proteicos en asociación con moléculas del MHC en su superficie celular. Algunas APC pueden activar células T específicas de antígeno.
Las células presentadoras de antígeno profesionales son muy eficaces para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula del MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas del MHC de clase II-antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, que conduce a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales.
Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen el intervalo más amplio de presentación de antígenos, y son probablemente las células presentadoras de antígenos, macrófagos, células B y ciertas células epiteliales activadas más importantes.
Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de las vías de presentación de antígenos del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral. Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que pueden usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor de Fey y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de las moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T, como el MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo,CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).
La maduración de las células dendríticas se denomina estado de activación de las células dendríticas en el que dichas células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por las células dendríticas inmaduras da como resultado tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligación de CD40 en la superficie de las células dendríticas por CD40L, y sustancias liberadas por las células que sufren una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden obtener cultivando células de médula ósea in vitro con citocinas, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.
Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II necesarias para la interacción con células T no alteradas; estas se expresan solo tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citocinas tales como IFNy.
Las "células presentadoras de antígeno" se pueden cargar con péptidos presentados por el MHC de clase I transduciendo las células con ácido nucleico, preferiblemente ARN, que codifica un péptido o polipéptido que comprende el péptido que se va a presentar, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el antígeno.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de la enseñanza que comprende un vehículo de administración de genes que se dirige a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno puede administrarse a un paciente, dando como resultado una transfección que se produce in vivo. La transfección in vivo de células dendríticas, por ejemplo, se puede realizar generalmente usando cualquier método conocido en la técnica, como los descritos en el documento WO 97/24447, o el enfoque de pistola de genes descrito por Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997.
El término "célula presentadora de antígeno" también incluye células objetivo.
"Célula objetivo" significará una célula que es un objetivo para una respuesta inmune tal como una respuesta inmune celular. Las células objetivo incluyen células que presentan un antígeno o un epítopo de antígeno, es decir, un fragmento de péptido derivado de un antígeno, e incluyen cualquier célula indeseable, tal como una célula cancerosa. En realizaciones preferidas, la célula objetivo es una célula que expresa un antígeno como se describe en el presente documento y que presenta preferiblemente dicho antígeno con MHC de clase I.
El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o proteína, el término "porción" de la misma puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferiblemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70%, incluso más preferiblemente al menos el 80% y lo más preferiblemente al menos el 90% de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, si la porción es una fracción discontinua, dicha fracción discontinua está compuesta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más partes de una estructura, siendo cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede estar compuesta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, preferiblemente no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en donde cada parte preferiblemente comprende al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.
Los términos "parte" y "fragmento" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura como una secuencia de aminoácidos o una proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura preferiblemente comprende una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo, péptido o proteína es preferiblemente inmunológicamente equivalente al epítopo, péptido o proteína del que deriva. En el contexto de la presente enseñanza, una "parte" de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos preferiblemente comprende, preferiblemente consta de al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50 %, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 94%, al menos 96%, al menos 98%, al menos 99 % de la estructura completa o secuencia de aminoácidos.
El término "célula inmunorreactiva" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una "célula inmunorreactiva" preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o un péptido de antígeno derivado de un antígeno y mediar una respuesta inmune. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, secretan anticuerpos, reconocen células cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T colaboradoras, células T que infiltran tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferiblemente, en el contexto de la presente enseñanza, "células inmunorreactivas" son células T, preferiblemente células T CD4+ y/o CD8+.
Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un péptido de antígeno derivado de un antígeno con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas del MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como como células cancerosas. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un péptido de antígeno derivado de dicho antígeno sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (célula T CD4+) que porta receptores que reconocen un antígeno o un péptido de antígeno derivado de un antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase II, tal capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina. La capacidad de respuesta de CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, sobrerregulación de marcadores de activación como CD44 y CD69, y destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar usando un informador artificial que indique con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Dichos CTL que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan aquí "CTL sensibles al antígeno". Si la célula es una célula B, dicha capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.
Los términos "célula T" y "linfocito T" se utilizan indistintamente en el presente documento e incluyen células T colaboradoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.
Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, como las células B y las células asesinas naturales por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.
Las células T colaboradoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T colaboradoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas del MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmune activa.
Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+, ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.
La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas de péptidos separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a-TCR y p-TCR. Las células T y8 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T y§, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2% del total de células T) que las células T ap.
De acuerdo con las enseñanzas, el término "receptor de antígeno" incluye receptores de origen natural, tal como el receptor de células T, así como receptores modificados genéticamente, que confieren una especificidad arbitraria, tal como la especificidad de un anticuerpo monoclonal, a una célula efectora inmunitaria como un célula T. De esta manera, se puede generar un gran número de células T específicas de antígeno para la transferencia de células adoptivas. Por tanto, un receptor de antígeno de acuerdo con las enseñanzas puede estar presente en las células T, por ejemplo en lugar de o además del propio receptor de células T de la célula T. Tales células T no requieren necesariamente el procesamiento y la presentación de un antígeno para el reconocimiento de la célula objetivo, sino que pueden reconocer preferiblemente con especificidad cualquier antígeno presente en una célula objetivo. Preferiblemente, dicho receptor de antígeno se expresa en la superficie de las células. Para el propósito de la presente enseñanza, las células T que comprenden un receptor de antígeno están comprendidas por el término "célula T" como se usa en este documento. Específicamente, de acuerdo con la enseñanza, el término "receptor de antígeno" incluye receptores artificiales que comprenden una sola molécula o un complejo de moléculas que reconocen, es decir, se unen a una estructura objetivo (por ejemplo, un antígeno) en una célula objetivo tal como una célula cancerosa (por ejemplo, mediante la unión de un sitio de unión a antígeno o dominio de unión a antígeno a un antígeno expresado en la superficie de la célula objetivo) y puede conferir especificidad a una célula efectora inmunitaria tal como una célula T que expresa dicho receptor de antígeno en la superficie celular. Preferiblemente, el reconocimiento de la estructura objetivo por un receptor de antígeno da como resultado la activación de una célula efectora inmunitaria que expresa dicho receptor de antígeno. Un receptor de antígeno puede comprender una o más unidades de proteína, comprendiendo dichas unidades de proteína uno o más dominios como se describe en el presente documento. De acuerdo con la enseñanza, un "receptor de antígeno" también puede ser un "receptor de antígeno quimérico (CAR)", "receptor de células T quimérico" o "receptor de células T artificial".
Un antígeno puede ser reconocido por un receptor de antígeno a través de cualquier dominio de reconocimiento de antígeno (en el presente documento también denominado simplemente "dominios") capaz de formar un sitio de unión a antígeno tal como a través de porciones de anticuerpos y receptores de células T de unión a antígeno que pueden residir en la misma o en diferentes cadenas de péptidos. En una realización, los dos dominios que forman un sitio de unión al antígeno se derivan de una inmunoglobulina. En una realización, los dos dominios que forman un sitio de unión al antígeno se derivan de un receptor de células T. Particularmente preferidos son los dominios variables de anticuerpos, tales como fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales y dominios variables de receptores de células T, en particular cadenas simples alfa y beta de TCR. De hecho, casi cualquier cosa que se una a un objetivo determinado con alta afinidad se puede utilizar como dominio de reconocimiento de antígenos.
La primera señal en la activación de las células T se proporciona mediante la unión del receptor de las células T a un péptido corto presentado por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en otra célula. Esto asegura que solo se active una célula T con un TCR específico para ese péptido. La célula asociada suele ser una célula presentadora de antígeno (APC) profesional, generalmente una célula dendrítica en el caso de respuestas no alteradas, aunque las células B y los macrófagos pueden ser APC importantes. Los péptidos presentados a las células T CD8+ por las moléculas del MHC de clase I son típicamente de 8 a 10 aminoácidos de longitud; los péptidos presentados a las células T CD4+ por las moléculas del MHC de clase II son típicamente más largos, ya que los extremos de la hendidura de unión de la molécula del MHC de clase II están abiertos.
De acuerdo con la presente enseñanza, una molécula es capaz de unirse a un objetivo si tiene una afinidad significativa por dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" se mide a menudo mediante la constante de disociación de equilibrio (Kd). Una molécula no es (sustancialmente) capaz de unirse a un objetivo si no tiene una afinidad significativa por dicho objetivo y no se une significativamente a dicho objetivo en ensayos estándar.
Los linfocitos T citotóxicos se pueden generar in vivo mediante la incorporación de un antígeno o un péptido de antígeno en células presentadoras de antígeno in vivo. El antígeno o péptido de antígeno se puede representar como proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno puede procesarse para producir un péptido asociado para la molécula del MHC, mientras que puede presentarse un fragmento del mismo sin necesidad de procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si estos pueden unirse a moléculas del MHC. En general, es posible la administración a un paciente mediante inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también puede llevarse a cabo intranodalmente en un ganglio linfático (Maloy et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299­ 303). Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por linfocitos T citotóxicos autólogos que luego se propagan.
La activación específica de células T CD4+ o CD8+ puede detectarse de diversas formas. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas) o la generación de actividad citolítica. Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación específica de las células T es la detección de la generación de actividad citolítica.
Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula que presenta un antígeno" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula enferma, por ejemplo una célula cancerosa, o una célula presentadora de antígeno que presenta el antígeno que expresa o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo por procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, en particular moléculas del MHC de clase I. De manera similar, los términos "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" denotan una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I. La presentación de un antígeno por una célula puede efectuarse transfectando la célula con un ácido nucleico como el ARN que codifica el antígeno.
Por "fragmento de un antígeno que se presenta" o expresiones similares se entiende que el fragmento puede ser presentado por el MHC de clase I o clase II, preferiblemente el MHC de clase I, por ejemplo cuando se agrega directamente a las células presentadoras de antígeno. En una realización, el fragmento es un fragmento que es presentado naturalmente por células que expresan un antígeno.
El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico, tal como la inducción de una respuesta inmune humoral y/o celular, la fuerza y/o duración de la reacción inmune inducida, o la especificidad de la reacción inmune inducida. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferiblemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicas de un péptido usado para inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos cuando se expone al sistema inmunológico de un sujeto induce una reacción inmunitaria que tiene la especificidad de reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia.
El término "funciones efectoras inmunes" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunológico que dan como resultado, por ejemplo, la destrucción de células tumorales 0 la inhibición del crecimiento tumoral y/o inhibición del desarrollo de tumores, incluida la inhibición de la diseminación y metástasis tumorales. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes en el contexto de la presente enseñanza son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T colaboradora (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un péptido antígeno derivado de un antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase II por los receptores de células T, la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL, el reconocimiento de un antígeno o un péptido de antígeno derivado de un antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase I por receptores de células T, la eliminación de células presentada en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas como IFN-y y TNF-a, y destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígenos.
Los términos "complejo principal de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas del MHC de clase 1 y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que se encuentra en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto antígenos propios (fragmentos de péptidos de la propia célula) como antígenos no propios (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.
La región del MHC se divide en tres subgrupos, clase I, clase II y clase III. Las proteínas del MHC de clase I contienen una cadena a y una microglobulina p2 (que no forma parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmentos de antígeno a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmunológico, específicamente en las células presentadoras de antígenos, las proteínas del MHC de clase II contienen cadenas a y p y presentan fragmentos de antígeno a las células T colaboradoras. La región del MHC de clase III codifica otros componentes inmunitarios, como los componentes del complemento y algunos que codifican citoquinas.
El MHC es poligénico (hay varios genes del MHC de clase I y MHC de clase II) y polimórfico (hay múltiples alelos de cada gen).
Como se usa en este documento, el término "haplotipo" se refiere a los alelos de HLA que se encuentran en un cromosoma y las proteínas codificadas por el mismo. El haplotipo también puede referirse al alelo presente en cualquier locus dentro del MHC. Cada clase del MHC está representada por varios loci: por ejemplo, HLA-A (antígeno leucocitario humano A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J,HLA-K, HLA-L, HLA-P y HLA-V para clase I y HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA y HLA-DOB para la clase II. Los términos "alelo de HLA" y "alelo de MHC" se usan indistintamente en el presente documento.
Los MHC exhiben un polimorfismo extremo. Dentro de la población humana hay, en cada locus genético, un gran número de haplotipos que comprenden distintos alelos. Diferentes alelos polimórficos del MHC, tanto de clase I como de clase II, tienen diferentes especificidades de péptido en el sentido de que cada alelo codifica proteínas que se unen a péptidos que exhiben patrones de secuencia particulares.
En el contexto de la presente enseñanza, una molécula del MHC es preferiblemente una molécula de HLA.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "péptido de unión al MHC" incluye péptidos de unión a MHC de clase I y/o clase II o péptidos que pueden procesarse para producir péptidos de unión a MHC de clase I y/o clase II. En el caso de complejos del m Hc de clase I/péptido, los péptidos de unión son típicamente de 8 a 12, preferiblemente de 8 a 10 aminoácidos de longitud, aunque los péptidos más largos o más cortos pueden ser eficaces. En el caso de complejos del MHC de clase II/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente de 9 a 30, preferiblemente de 10 a 25 aminoácidos de longitud y, en particular, de 13 a 18 aminoácidos de longitud, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces.
Un "péptido antigénico" se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente por la presentación del antígeno tal como células enfermas, en particular células cancerosas. Preferiblemente, un péptido antigénico es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I y preferiblemente es capaz de estimular un linfocito T citotóxico (CTL) sensible al antígeno. Preferiblemente, los péptidos antigénicos son péptidos presentados por el MHC de clase I y/o clase II o pueden procesarse para producir péptidos presentados por el MHC de clase I y/o clase II. Preferiblemente, los péptidos antigénicos comprenden una secuencia de aminoácidos que se corresponde sustancialmente con la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por el MHC de clase I y/o clase II. Preferiblemente, un péptido antigénico comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de tal fragmento y se procesa para producir tal fragmento, es decir, un péptido presentado por el MHC de clase I y/o clase II derivado de un antígeno.
Si un péptido se va a presentar directamente, es decir, sin procesamiento, en particular sin escisión, tiene una longitud adecuada para unirse a una molécula del MHC, en particular a una molécula del MHC de clase I, y preferiblemente es de 7-20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 7-12 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud.
Si un péptido es parte de una entidad más grande que comprende secuencias adicionales, por ejemplo de una secuencia de vacuna o polipéptido, y debe presentarse después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido producido por procesamiento tiene una longitud que es adecuada para unirse a una molécula del MHC, en particular una molécula del MHC de clase I, y preferiblemente es de 7-20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de 7-12 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de 8-11 aminoácidos de longitud, en particular de 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia del péptido que se presentará después del procesamiento se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno, es decir, su secuencia corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a un fragmento de un antígeno. Por tanto, un péptido de unión al MHC comprende una secuencia que corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a un fragmento de un antígeno.
Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden sustancialmente a una secuencia de un péptido que es presentado por el MHC de clase I pueden diferir en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de t Cr del péptido tal como lo presenta el MHC de clase I, o para la unión de péptidos al MHC. Dichos péptidos sustancialmente correspondientes también son capaces de estimular un CTL sensible al antígeno y pueden considerarse inmunológicamente equivalentes. Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de un péptido presentado en residuos que no afectan el reconocimiento de TCR pero mejoran la estabilidad de unión al MHC pueden mejorar la inmunogenicidad del péptido antigénico y pueden denominarse en el presente documento "péptido optimizado". Utilizando el conocimiento existente sobre cuál de estos residuos puede tener más probabilidades de afectar la unión al MHC o al TCR, puede emplearse un enfoque racional para el diseño de péptidos sustancialmente correspondientes. Los péptidos resultantes que son funcionales se contemplan como péptidos antigénicos.
Un péptido antigénico cuando se presenta por el MHC debería ser reconocible por un receptor de células T. Preferiblemente, el péptido antigénico, si es reconocido por un receptor de células T, puede inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, la expansión clonal de la célula T que porta el receptor de células T reconociendo específicamente el péptido antigénico. Preferiblemente, los péptidos antigénicos, en particular si se presentan en el contexto de moléculas del MHC, son capaces de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno del que derivan o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente caracterizadas por la presentación del antígeno. Preferiblemente, un péptido antigénico es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación del antígeno con MHC de clase I y preferiblemente es capaz de estimular un CTL sensible al antígeno. Preferiblemente, dicha célula es una célula objetivo.
El término "genoma" se refiere a la cantidad total de información genética en los cromosomas de un organismo o una célula.
El término "exorna" se refiere a parte del genoma de un organismo formado por exones, que codifican porciones de genes expresados. El exorna proporciona el modelo genético utilizado en la síntesis de proteínas y otros productos génicos funcionales. Es la parte más funcionalmente relevante del genoma y, por lo tanto, es más probable que contribuya al fenotipo de un organismo. Se estima que el exorna del genoma humano comprende el 1,5% del genoma total (Ng et al., 2008, PLoS Gen., 4 (8): 1-15).
El término "transcriptoma" se refiere al conjunto de todas las moléculas de ARN, incluyendo ARNm, ARNr, ARNt y otro ARN no codificante producido en una célula o una población de células. En el contexto de la presente enseñanza, el transcriptoma o ARN secuenciado significa el conjunto de todas las moléculas de ARN producidas en una célula, una población de células, preferiblemente una población de células cancerosas, o todas las células de un individuo dado en un momento determinado.
Un "ácido nucleico" es preferiblemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), más preferiblemente ARN, lo más preferiblemente ARN transcrito in vitro (ARN TIV) o ARN sintético. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas de manera recombinante y sintetizadas químicamente. Un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria y lineal o covalentemente cerrada circularmente. Puede aislarse un ácido nucleico. El término "ácido nucleico aislado" significa que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y la separación mediante electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Puede emplearse un ácido nucleico para la introducción en, es decir, la transfección de, células, en particular, en forma de a Rn que puede prepararse mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN se puede modificar antes de la aplicación mediante la estabilización de las secuencias, la protección y la poliadenilación.
El término "material genético" se refiere a un ácido nucleico aislado, ya sea ADN o ARN, una sección de una doble hélice, una sección de un cromosoma o el genoma completo de un organismo o célula, en particular su exoma o transcriptoma.
El término "mutación" se refiere a un cambio o diferencia en la secuencia de ácido nucleico (sustitución, adición o eliminación de nucleótidos) en el genoma enfermo en comparación con una referencia, y preferiblemente un genoma normal emparejado. Una "mutación somática" puede ocurrir en cualquiera de las células del cuerpo, excepto en las células germinales (espermatozoides y óvulos) y, por lo tanto, no se transmiten a los niños. Estas alteraciones pueden (pero no siempre) causar cáncer u otras enfermedades. Preferiblemente, una mutación es una mutación no sinónima. El término "mutación no sinónima" se refiere a una mutación, preferiblemente una sustitución de nucleótidos, que da como resultado un cambio de aminoácido tal como una sustitución de aminoácido en el producto de traducción, que preferiblemente da como resultado la formación de un neoepítopo.
El término "variante/variación de un solo nucleótido" (SNV) se refiere a una diferencia en la secuencia de ácido nucleico en un sitio particular (alelo) cuando se compara un genoma de una célula enferma, tal como una célula tumoral, y un genoma de una célula normal, no enferma, preferiblemente emparejada (correspondiente) o un genoma de referencia. Como se usa en este documento, el término mutación preferiblemente abarca un SNV.
Un evento de variación del número de copias (CNV) en el genoma enfermo (tumor) es un evento de variación del número de copias somáticas que ocurre solo en células enfermas, y definido como un cambio en el número de copias de los alelos maternos y/o paternos de una región del genoma enfermo (tumor) con respecto a un genoma normal emparejado, en el que la alternancia afecta preferiblemente a una región del genoma que abarca aproximadamente 1 kb o más.
El término "mutación" incluye mutaciones puntuales, inserciones/eliminaciones, fusiones, cromotripsis y ediciones de ARN.
El término "inserción/eliminación" describe una clase de mutación especial, definida como una mutación que da como resultado una inserción y eliminación colocalizada y una ganancia o pérdida neta de nucleótidos. En las regiones codificantes del genoma, a menos que la longitud de un inserción/eliminación sea un múltiplo de 3, producen una mutación por desplazamiento del marco de lectura. Las inserciones/eliminaciones se pueden contrastar con una mutación puntual; en la que una inserción/eliminación inserta y elimina nucleótidos de una secuencia, una mutación puntual es una forma de sustitución que reemplaza uno de los nucleótidos.
Las fusiones pueden generar genes híbridos formados a partir de dos genes previamente separados. Puede ocurrir como resultado de una translocación, eliminación intersticial o inversión cromosómica. A menudo, los genes de fusión son oncogenes. Los genes de fusión oncogénicos pueden conducir a un producto génico con una función nueva o diferente a la de los dos socios de fusión. Alternativamente, un protooncogén se fusiona con un promotor fuerte y, por lo tanto, la función oncogénica se establece para que funcione mediante una sobrerregulación causada por el promotor fuerte del compañero de fusión secuencia arriba. Las transcripciones de fusión oncogénicas también pueden ser causadas por eventos empalme trans o de lectura completa.
El término "cromotripsis" se refiere a un fenómeno genético por el cual regiones específicas del genoma se rompen y luego se unen mediante un solo evento devastador.
El término "editar ARN" o "edición de ARN" se refiere a procesos moleculares en los que el contenido de información en una molécula de ARN se altera mediante un cambio químico en la composición de la base. La edición de ARN incluye modificaciones de nucleósidos como desaminaciones de citidina (C) por uridina (U) y adenosina (A) por inosina (I), así como adiciones e inserciones de nucleótidos sin plantilla. La edición de ARN en ARNm altera eficazmente la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada para que difiera de la predicha por la secuencia de ADN genómico.
El término "firma de mutación del cáncer" se refiere a un conjunto de mutaciones que están presentes en las células cancerosas en comparación con las células de referencia no cancerosas.
Puede usarse una "referencia" en el contexto de la presente enseñanza para correlacionar y comparar los resultados obtenidos a partir de una muestra de tumor. Normalmente, la "referencia" puede obtenerse sobre la base de una o más muestras normales, en particular muestras que no se ven afectadas por una enfermedad cancerosa, obtenidas de un paciente o de uno o más individuos diferentes, preferiblemente individuos sanos, en particular individuos de la misma especie. Una "referencia" puede determinarse empíricamente analizando un número suficientemente grande de muestras normales.
El término "genoma de referencia" se refiere a un genoma que proporciona un sistema de coordenadas para el genoma normal y el genoma enfermo. Se usa un genoma de referencia para asignar lecturas y proporcionar un sistema de coordenadas para el genoma normal y el genoma tumoral, en el que el sistema de coordenadas permite la provisión del número de cromosoma, una posición de nucleótido en el cromosoma, así como la direccionalidad de la lectura. Un genoma de referencia puede basarse en el genoma de uno o más miembros de la misma especie que el sujeto que proporciona la muestra enferma, o puede basarse en el genoma normal del sujeto (un genoma emparejado).
Se puede usar cualquier método de secuenciación adecuado en el contexto de la presente enseñanza para identificar mutaciones específicas de enfermedad, prefiriéndose las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) y, opcionalmente, en combinación con matrices de SNP para obtener información del número de copias absoluto. Los métodos de secuenciación de tercera generación podrían sustituir a la tecnología NGS en el futuro para acelerar la etapa de secuenciación del método. Para fines de aclaración: los términos "secuenciación de próxima generación" o "NGS" en el contexto de la presente enseñanza se refieren a todas las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que, en contraste con la metodología de secuenciación "convencional" conocida como química de Sanger, leen plantillas de ácido nucleico al azar en paralelo a lo largo de todo el genoma rompiendo todo el genoma en pequeños trozos. Dichas tecnologías NGS (también conocidas como tecnologías de secuenciación masivamente paralela) son capaces de entregar información de secuencia de ácido nucleico de un genoma completo, exoma, transcriptoma (todas las secuencias transcritas de un genoma) o metiloma (todas las secuencias metiladas de un genoma) en períodos de tiempo muy cortos, por ejemplo dentro de 1-2 semanas, preferiblemente dentro de 1-7 días o más preferiblemente dentro de menos de 24 horas y permitir, en principio, enfoques de secuenciación de células individuales. Se pueden usar múltiples plataformas de NGS que están disponibles comercialmente o que se mencionan en la bibliografía en el contexto de la presente enseñanza, por ejemplo los descritos en detalle en Zhang et al., 2011, The impact of next-generation sequencing on genomics, J. Genet Genomics 38(3): 95-109; o en Voelkerding et al., 2009, Next generation sequencing: From basic research to diagnostics, Clinical chemistry 55: 641-658. Ejemplos no limitativos de tales tecnologías/plataformas de NGS son
1) La tecnología de secuenciación por síntesis conocida como pirosecuenciación implementada, por ejemplo en el secuenciador de genoma GS-FLX 454MR de la compañía 454 Life Sciences (Branford, Connecticut) asociada a Roche, descrito por primera vez en Ronaghi et al., 1998, A sequencing method based on real-time pyrophosphate, Science 281: 363-365. Esta tecnología utiliza una PCR en emulsión en la que las perlas de unión a a Dn de una sola cadena se encapsulan mediante una agitación tipo vórtice vigorosa en micelas acuosas que contienen reactivos de PCR rodeados de aceite para la amplificación por PCR en emulsión. Durante el proceso de pirosecuenciación, la luz emitida por las moléculas de fosfato durante la incorporación de nucleótidos se registra cuando la polimerasa sintetiza la cadena de ADN.
2) Los enfoques de secuenciación por síntesis desarrollados por Solexa (ahora parte de Illumina Inc., San Diego, California) que se basan en terminadores de colorantes reversibles e implementados por ejemplo en Illumina/Solexa Genome AnalyzerMR y en Illumina HiSeq 2000 Genome AnalyzerMR. En esta tecnología, los cuatro nucleótidos se agregan simultáneamente en fragmentos de racimo cebados con oligo en canales de células de flujo junto con la ADN polimerasa. La amplificación de puente extiende las cadenas de grupos con los cuatro nucleótidos marcados con fluorescencia para la secuenciación.
3) Enfoques de secuenciación por ligación, por ejemplo implementado en la plataforma SOLidMR de Applied Biosystems (ahora Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). En esta tecnología, se marca un conjunto de todos los posibles oligonucleótidos de una longitud fija de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se hibridan y se ligan; la ligación preferencial por ADN ligasa para emparejar secuencias da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica mediante PCR en emulsión. Las perlas resultantes, cada una de las cuales contiene solo copias de la misma molécula de ADN, se deposita en un portaobjetos de vidrio. Como segundo ejemplo, la plataforma PolonatorMR G.007 de Dover Systems (Salem, New Hampshire) también emplea un enfoque de secuenciación por ligación mediante el uso de una PCR de emulsión basada en perlas y ordenada al azar para amplificar fragmentos de ADN para la secuenciación paralela.
4) Tecnologías de secuenciación de una sola molécula, como por ejemplo la implementada en el sistema PacBio RS de Pacific Biosciences (Menlo Park, California) o en la plataforma HeliScopeMR de Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). La característica distintiva de esta tecnología es su capacidad para secuenciar moléculas simples de ADN o ARN sin amplificación, definida como secuenciación de ADN de una sola molécula en tiempo real (SMRT). Por ejemplo, HeliScope utiliza un sistema de detección de fluorescencia de alta sensibilidad para detectar directamente cada nucleótido a medida que se sintetiza. Un enfoque similar basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se ha desarrollado en Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Otras técnicas de molécula única basadas en fluorescencia son de U.S. Genomics (GeneEngineMR) y Genovoxx (AnyGeneMR).
5) Nanotecnologías para la secuenciación de una sola molécula en las que se utilizan varias nanoestructuras que son por ejemplo dispuestas en un chip para monitorizar el movimiento de una molécula de polimerasa en una sola cadena durante la replicación. Ejemplos no limitativos de enfoques basados en nanotecnologías son la plataforma GridONMR de Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido), las plataformas de secuenciación de nanoporos asistida por hibridación (HANSMR) desarrolladas por Nabsys (Providence, Rhode Island), y la plataforma patentada de secuenciación de ADN basada en ligasa con tecnología de nanoesferas de a Dn (DNB) denominada ligación combinatoria de anclaje de sonda (cPALMR).
6) Tecnologías basadas en microscopía electrónica para secuenciación de una sola molécula, por ejemplo los desarrollados por LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) y Halcyon Molecular (Redwood City, California). 7) Secuenciación de semiconductores de iones que se basa en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN. Por ejemplo, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) utiliza una matriz de pozos micromecanizados de alta densidad para realizar este proceso bioquímico de forma masivamente paralela. Cada pocillo contiene una plantilla de ADN diferente. Debajo de los pocillos hay una capa sensible a los iones y debajo de ella un sensor de iones patentado.
En una realización, en la que se puede determinar si se produjo una mutación específica de la enfermedad mediante un método relacionado con la determinación de que un sitio en el genoma normal es consistente con un genotipo homocigoto reflejado por un alelo normal y tres alelos de ruido, y un distribución ideal de ruido y declarar una mutación cuando el sitio correspondiente en el genoma del tumor es inconsistente con el genotipo homocigoto y una distribución de ruido ideal, en la que las lecturas son consistentes con una distribución de ruido ideal si las lecturas se asignan a cada uno de los alelos de ruido con una probabilidad de uno un tercio de una tasa de error por base, como se describe en la solicitud internacional de patente PCT titulada "Highly Accurate Mutation Detection, In Particular for Personalized Therapeutics" presentada en la misma fecha, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
Preferiblemente, las preparaciones de ADN y ARN sirven como material de partida para NGS. Dichos ácidos nucleicos se pueden obtener fácilmente a partir de muestras tales como material biológico, por ejemplo de tejidos tumorales incrustados en parafina (FFPE) recién congelados o fijados en formalina o de células recién aisladas o de CTC que están presentes en la sangre periférica de los pacientes. El ADN o ARN genómico normal no mutado se puede extraer de tejido somático normal, sin embargo, se prefieren las células de la línea germinal en el contexto de la presente enseñanza. El ADN o ARN de la línea germinal se extrae de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en pacientes con neoplasias malignas no hematológicas. Aunque los ácidos nucleicos extraídos de tejidos FFPE o células individuales recién aisladas están muy fragmentados, son adecuados para aplicaciones de NGS.
En la bibliografía se describen varios métodos de NGS dirigidos para la secuenciación del exoma (para una revisión, véase, por ejemplo, Teer y Mullikin, 2010, Human Mol Genet 19 (2): R145-51), todos los cuales pueden usarse junto con la presente enseñanza. Muchos de estos métodos (descritos, por ejemplo, como captura del genoma, partición del genoma, enriquecimiento del genoma, etc.) utilizan técnicas de hibridación e incluyen matrices (por ejemplo, Hodges et al., 2007, Nat. Genet. 39: 1522-1527) y enfoques de hibridación basados en líquidos (por ejemplo, Choi et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci USA 106: 19096-19101). También se encuentran disponibles kits comerciales para la preparación de muestras de ADN y la posterior captura del exoma: por ejemplo, Illumina Inc. (San Diego, California) ofrece el kit de preparación de muestras de ADN TruSeqMR y el kit de enriquecimiento del exoma TruSeqMR.
Con el fin de reducir el número de hallazgos falsos positivos en la detección de mutaciones somáticas específicas de cáncer o diferencias de secuencia cuando se comparan, por ejemplo la secuencia de una muestra de tumor con la secuencia de una muestra de referencia, tal como la secuencia de una muestra de línea germinal, se prefiere determinar la secuencia en réplicas de uno o ambos tipos de muestras. Por tanto, se prefiere que la secuencia de una muestra de referencia, como la secuencia de una muestra de la línea germinal, se determine dos veces, tres veces o más. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de una muestra de tumor se determina dos veces, tres veces o más. También puede ser posible determinar la secuencia de una muestra de referencia, como la secuencia de una muestra de línea germinal y/o la secuencia de una muestra de tumor más de una vez, determinando al menos una vez la secuencia en el ADN genómico y determinando al menos una vez la secuencia en ARN de dicha muestra de referencia y/o de dicha muestra tumoral. Por ejemplo, al determinar las variaciones entre réplicas de una muestra de referencia, tal como una muestra de línea germinal, se puede estimar la tasa esperada de mutaciones somáticas de falso positivo (FDR) como una cantidad estadística. Las repeticiones técnicas de una muestra deben generar resultados idénticos y cualquier mutación detectada en esta "comparación de la misma frente a la misma" es un falso positivo. En particular, para determinar la tasa de descubrimiento falso para la detección de mutaciones somáticas en una muestra de tumor en relación con una muestra de referencia, se puede usar una repetición técnica de la muestra de referencia como referencia para estimar el número de falsos positivos. Además, varias métricas relacionadas con la calidad (por ejemplo, cobertura o calidad de SNP) se pueden combinar en una sola puntuación de calidad utilizando un enfoque de aprendizaje automático. Opcionalmente, para una variación somática dada, se pueden contar todas las demás variaciones con un puntaje de calidad superior, lo que permite una clasificación de todas las variaciones en un conjunto de datos.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótido. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ARN" comprende ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado, como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado de forma recombinante, tal como ARN modificado que se diferencia del ARN natural por adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos de ARN de origen natural.
El término "ARN" incluye y preferiblemente se refiere a "ARNm". El término "ARNm" significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcripto" que se genera usando una plantilla de ADN y codifica un péptido o polipéptido. Normalmente, un ARNm comprende una 5'-UTR, una región codificante de proteína y una 3'-UTR. El ARNm solo posee una vida media limitada en las células e in vitro. En el contexto de la presente enseñanza, el ARNm puede generarse mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. El experto en la materia conoce la metodología de transcripción in vitro. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.
La estabilidad y la eficacia de traducción del ARN se pueden modificar según se requiera. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse y su traducción aumentada mediante una o más modificaciones que tienen efectos estabilizadores y/o un aumento de la eficiencia de traducción del ARN. Tales modificaciones se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP2006/009448. Para aumentar la expresión del ARN utilizado en las realizaciones de la presente enseñanza, se puede modificar dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresados, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresados, de modo que aumente el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, por lo tanto, mejorar la traducción en las células.
El término "modificación" en el contexto del ARN usado en la presente enseñanza incluye cualquier modificación de un ARN que no está presente de forma natural en dicho ARN.
En una realización de la enseñanza, el ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza no tiene 5'-trifosfatos sin protección. La eliminación de dichos 5'-trifosfatos sin protección se puede lograr tratando el ARN con una fosfatasa.
El ARN de acuerdo con las enseñanzas puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con las enseñanzas, la 5-metilcitidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con las enseñanzas, la pseudouridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina.
En una realización, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una protección de 5' o análogo de protección de 5'. El término "protección de 5'" se refiere a una estructura de protección que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARNm a través de un enlace trifosfato de 5' con 5' inusual. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término "protección de 5' convencional" se refiere a una protección de 5' de ARN de origen natural, preferiblemente a la protección de 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente enseñanza, el término "protección de 5'" incluye un análogo de protección de 5' que se asemeja a la estructura de la protección del ARN y se modifica para poseer la capacidad de estabilizar el ARN y/o mejorar la traducción del ARN si está unido al mismo, preferiblemente in vivo y/o en una célula.
Proporcionar un ARN con una protección de 5' o un análogo de protección de 5' se puede lograr mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN en presencia de dicho análogo de protección de 5' o protección de 5', en el que dicha protección de 5' se incorpora cotranscripcionalmente en la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante transcripción in vitro, y la protección de 5' puede unirse al ARN posttranscripcionalmente usando enzimas de protección, por ejemplo, enzimas de protección del virus vaccinia.
El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN usado en la presente enseñanza puede ser una extensión o truncamiento de la cola poli(A) de origen natural o una alteración de las regiones 5' o 3' no traducidas (UTR) tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente con o la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tal como alfa2-globina, alfa1-globina, betaglobina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.
El ARN que tiene una secuencia de poli-A no enmascarada se traduce de manera más eficaz que el ARN que tiene una secuencia de poli-A enmascarada. El término "cola de poli(A)" o "secuencia de poli-A" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que normalmente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia de poli-A desenmascarada" significa que la secuencia de poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia de poli-A y no es seguida por nucleótidos distintos de A ubicados en el extremo 3', es decir, secuencia abajo, de la secuencia de poli-A. Además, una secuencia de poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficiencia de traducción óptimas del ARN.
Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con la presente enseñanza, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia de poli-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia de poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con las enseñanzas, se puede desenmascarar la secuencia de poli-A.
Además, la incorporación de una región no traducida (UTR) 3' en la región no traducida 3' de una molécula de ARN puede dar como resultado una mejora en la eficacia de la traducción. Puede conseguirse un efecto sinérgico incorporando dos o más de dichas regiones 3' no traducidas. Las regiones 3' no traducidas pueden ser autólogas o heterólogas al ARN en el que se introducen. En una realización particular, la región 3' no traducida se deriva del gen de la p-globina humana.
Una combinación de las modificaciones descritas anteriormente, es decir, la incorporación de una secuencia de poli-A, el desenmascaramiento de una secuencia de poli-A y la incorporación de una o más regiones 3' no traducidas, tiene una influencia sinérgica sobre la estabilidad del ARN y aumento de la eficiencia de la traducción.
El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tenga una vida media larga se exprese durante un período de tiempo prolongado.
Por supuesto, si se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos descritos anteriormente aumentando la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN.
El término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o polipéptidos, por ejemplo por transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o polipéptidos. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.
El término expresión también incluye una "expresión aberrante" o "expresión anormal". "Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa que la expresión se altera, preferiblemente aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una determinada proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de expresión se refiere a un aumento de al menos un 10%, en particular al menos un 20%, al menos un 50% o al menos un 100% o más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano está reprimida.
El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa principalmente en la mucosa gástrica y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en un grado significativo en otros tipos de tejidos u órganos. Así, una proteína que se expresa exclusivamente en células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, como los testículos, se expresa específicamente en células de la mucosa gástrica. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente en condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejido u órganos, pero preferiblemente en no más de 3 tipos de tejido u órgano diferentes. En este caso, el antígeno tumoral se expresa específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa en condiciones normales preferiblemente en una extensión aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en el que el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcripciones. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y están englobados por el término "vector". El ARN usado en la presente enseñanza es preferiblemente ARN transcrito in vitro (ARN TIV) y puede obtenerse mediante transcripción in vitro de un molde de ADN apropiado. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las a Rn polimerasas T7, T3 y SP6. Preferiblemente, la transcripción in vitro está controlada por un promotor T7 o SP6. Puede obtenerse una plantilla de ADN para la transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.
El término "traducción" se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o polipéptido.
Las secuencias de control de la expresión o secuencias reguladoras, que en el contexto de la presente enseñanza pueden estar unidas funcionalmente con un ácido nucleico, pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas "funcionalmente" si están unidas covalentemente, de modo que la transcripción o traducción de la secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia codificante se va a traducir en una proteína funcional, con un enlace funcional de una secuencia reguladora con la secuencia codificante, la inducción de la secuencia reguladora conduce a una transcripción de la secuencia codificante, sin provocar un cambio del marco de lectura en la secuencia codificante o incapacidad de la secuencia codificante para traducirse en la proteína o péptido deseado.
El término "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora" comprende, en el contexto de la enseñanza, promotores, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control, que controlan la transcripción de un ácido nucleico o la traducción del ARN derivado. En determinadas formas de realización, se pueden controlar las secuencias reguladoras. La estructura precisa de las secuencias reguladoras puede variar dependiendo de la especie o dependiendo del tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas, que están involucradas en el inicio de la transcripción o traducción, tales como la caja TATA, secuencia de protección, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras secuencia arriba.
Preferiblemente, el ARN a expresar en una célula se introduce en dicha célula. En una realización de los métodos de acuerdo con la enseñanza, el ARN que se va a introducir en una célula se obtiene mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada.
Los términos como "ARN capaz de expresarse" y "ARN que codifica" se usan indistintamente en este documento y con respecto a un péptido o polipéptido particular significan que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido. Preferiblemente, el ARN puede interactuar con la maquinaria de traducción celular para proporcionar el péptido o polipéptido que es capaz de expresar.
Los términos como "transferir", "introducir" o "transfectar" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, en particular ARN en una célula. De acuerdo con la presente enseñanza, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo. De acuerdo con la presente enseñanza, la administración de un ácido nucleico se logra como ácido nucleico desnudo o en combinación con un reactivo de administración. Preferiblemente, la administración de ácidos nucleicos se realiza en forma de ácidos nucleicos desnudos. Preferiblemente, el ARN se administra en combinación con sustancias estabilizantes tales como inhibidores de ARNasa. La presente enseñanza también prevé la introducción repetida de ácidos nucleicos en las células para permitir una expresión sostenida durante períodos de tiempo prolongados.
Las células se pueden transfectar con cualquier portador con el que se pueda asociar ARN, por ejemplo formando complejos con el ARN o formando vesículas en las que el ARN está encerrado o encapsulado, lo que da como resultado una mayor estabilidad del ARN en comparación con el ARN desnudo. Los vehículos útiles incluyen, por ejemplo, vehículos que contienen lípidos tales como lípidos catiónicos, liposomas, en particular liposomas catiónicos y micelas y nanopartículas. Los lípidos catiónicos pueden formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente. Puede usarse cualquier lípido catiónico.
Preferiblemente, la introducción de ARN que codifica un péptido o polipéptido en una célula, en particular en una célula presente in vivo, da como resultado la expresión de dicho péptido o polipéptido en la célula. En realizaciones particulares, se prefiere el direccionamiento de los ácidos nucleicos a células particulares. En tales realizaciones, un portador que se aplica para la administración del ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) exhibe una molécula de direccionamiento. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo que es específico para una proteína de membrana de superficie en la célula objetivo o un ligando para un receptor en la célula objetivo puede incorporarse al portador de ácido nucleico o puede unirse al mismo. En caso de que el ácido nucleico se administre mediante liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie que está asociada con la endocitosis pueden incorporarse en la formulación de liposomas para permitir el direccionamiento y/o la captación. Dichas proteínas abarcan proteínas de la cápside de fragmentos de las mismas que son específicas para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteínas que están internalizadas, proteínas que se dirigen a una ubicación intracelular, etc.
El término "célula" o "célula huésped" es preferiblemente una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, orgánulos o material genético. Una célula intacta es preferiblemente una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente, dicho término se refiere a cualquier célula que pueda transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insectos). El ácido nucleico exógeno se puede encontrar dentro de la célula (i) libremente disperso como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o ADN mitocondrial. Se prefieren particularmente las células de mamíferos, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En realizaciones adicionales, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o macrófago.
Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico preferiblemente expresa el péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico.
El término "expansión clonal" se refiere a un proceso en el que se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente enseñanza, el término se usa preferiblemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.
Los términos como "reducir" o "inhibir" se refieren a la capacidad de provocar una disminución general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y más preferiblemente del 75% o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.
Los términos como "aumentar", "mejorar", "promover" o "prolongar" se refieren preferiblemente a un aumento, mejora, promoción o prolongación en aproximadamente al menos un 10%, preferiblemente al menos un 20%, preferiblemente al menos un 30%, preferiblemente al menos un 40%, preferiblemente al menos un 50%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 100%, preferiblemente al menos un 200% y en particular al menos 300%. Estos términos también pueden referirse a un aumento, mejora, promoción o prolongación desde cero o un nivel no medible o no detectable hasta un nivel de más de cero o un nivel que es medible o detectable.
De acuerdo con la presente enseñanza, el término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "polipéptido" o "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en este documento. De acuerdo con la enseñanza, el término "modificación" o "cambio de secuencia" con respecto a péptidos, polipéptidos o proteínas se refiere a un cambio de secuencia en un péptido, polipéptido o proteína en comparación con una secuencia parental tal como la secuencia de un péptido, polipéptido o proteína de tipo silvestre. El término incluye variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y variantes de sustitución de aminoácidos, preferiblemente variantes de sustitución de aminoácidos. Todos estos cambios de secuencia de acuerdo con las enseñanzas pueden potencialmente crear nuevos epítopos.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular.
Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones a terminales amino carboxilo de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.
Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.
Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan porque se elimina al menos un residuo en la secuencia y se inserta otro residuo en su lugar.
De acuerdo con la enseñanza, una modificación o un péptido modificado usado para ensayar en los métodos de la enseñanza puede derivarse de una proteína que comprende una modificación.
El término "derivado" significa de acuerdo con la enseñanza que una entidad particular, en particular una secuencia peptídica particular, está presente en el objeto del que se deriva. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.
Los agentes, composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno y presentan un péptido antigénico. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas. Los agentes, composiciones y métodos descritos en este documento también pueden usarse para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en este documento.
Uno de tales agentes es una vacuna tal como una vacuna contra el cáncer diseñada sobre la base de neoepítopos adecuados que resisten el escape inmune identificado por los métodos de la presente enseñanza.
De acuerdo con las enseñanzas, el término "vacuna" se refiere a una preparación farmacéutica (composición farmacéutica) o producto que tras la administración induce una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune celular, que reconoce y ataca a un patógeno o una célula enferma tal como una célula cancerosa. Se puede usar una vacuna para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. El término "vacuna contra el cáncer personalizada" o "vacuna contra el cáncer individualizada" se refiere a un paciente de cáncer en particular y significa que una vacuna contra el cáncer se adapta a las necesidades o circunstancias especiales de un paciente de cáncer individual.
Las vacunas contra el cáncer proporcionadas de acuerdo con las enseñanzas cuando se administran a un paciente proporcionan uno o más epítopos de células T para estimular, cebar y/o expandir células T específicas para el tumor del paciente. Las células T se dirigen preferiblemente contra las células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos de las células T. Por tanto, las vacunas descritas en el presente documento son preferiblemente capaces de inducir o promover una respuesta celular, preferiblemente actividad de células T citotóxicas, contra una enfermedad cancerosa caracterizada por la presentación de uno o más neoantígenos asociados a tumores con el MHC de clase I. Dado que una vacuna proporcionada en este documento se dirigirá a mutaciones específicas del cáncer, será específica para el tumor del paciente.
En el contexto de la presente enseñanza, una vacuna se refiere a una vacuna que cuando se administra a un paciente proporciona preferiblemente uno o más epítopos de células T (neoepítopos, neoepítopos adecuados, combinación de neoepítopos adecuados identificados en este documento), tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más y preferiblemente hasta 60, hasta 55, hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 epítopos de células T, que incorporan modificaciones de aminoácidos o péptidos modificados que se predice que son epítopos adecuados. La presentación de estos epítopos por las células de un paciente, en particular las células presentadoras de antígenos, preferiblemente da como resultado que las células T se dirijan a los epítopos cuando se unen al MHC y, por lo tanto, al tumor del paciente, preferiblemente al tumor primario, así como a las metástasis tumorales, que expresan antígenos a partir de los cuales los epítopos de células T se derivan y presentan los mismos epítopos en la superficie de las células tumorales.
Los métodos de la enseñanza pueden comprender la etapa adicional de determinar la usabilidad de las modificaciones de aminoácidos identificadas o péptidos modificados que contienen un neoepítopo adecuado identificado en este documento para la vacunación contra el cáncer. Por lo tanto, los pasos adicionales pueden involucrar uno o más de los siguientes: (i) evaluar si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por el MHC conocidos o predichos, (ii) pruebas in vitro y/o in silico si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por el MHC, por ejemplo probar si las modificaciones son parte de secuencias de péptidos que se procesan y/o presentan como epítopos presentados por el MHC, y (iii) probar in vitro si los epítopos modificados previstos, en particular cuando están presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo cuando están flanqueadas por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en la proteína de origen natural, y cuando se expresan en células presentadoras de antígenos son capaces de estimular las células T tales como las células T del paciente que tienen la especificidad deseada. Cada una de estas secuencias flanqueantes puede comprender 3 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo en el terminal N y/o en el terminal C.
Los péptidos modificados determinados de acuerdo con las enseñanzas pueden clasificarse por su usabilidad como epítopos para la vacunación contra el cáncer. Por tanto, en un aspecto, el método de la enseñanza comprende un proceso analítico manual o por ordenador en el que los péptidos modificados identificados se analizan y seleccionan por su utilidad en la vacuna respectiva que se va a proporcionar. En una realización preferida, dicho proceso analítico es un proceso basado en algoritmos computacionales. Preferiblemente, dicho proceso analítico comprende determinar y/o clasificar epítopos de acuerdo con una predicción de su capacidad de ser inmunogénicos.
Los epítopos identificados de acuerdo con la enseñanza y proporcionados en una vacuna están preferiblemente presentes en forma de un polipéptido que comprende dichos epítopos (neoepítopos, neoepítopos adecuados, neoepítopos encontrados en una combinación de neoepítopos adecuados identificados en este documento) tal como un polipéptido poliepitópico o un ácido nucleico, en particular ARN, que codifica dicho polipéptido. Además, los epítopos pueden estar presentes en el polipéptido en forma de una secuencia de vacuna, es decir, presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo flanqueado por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en la proteína de origen natural. Cada una de estas secuencias flanqueantes puede comprender 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo en el terminal N y/o el terminal C. Por tanto, una secuencia de vacuna puede comprender 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos. En una realización, los epítopos y/o las secuencias de la vacuna se alinean en el polipéptido de un extremo al otro.
En una realización, los epítopos/neoepítopos adecuados identificados en el presente documento y/o las secuencias de vacuna están espaciados por enlazadores, en particular enlazadores neutros. El término "enlazador" utilizado en el contexto de la presente enseñanza se refiere a un péptido añadido entre dos dominios peptídicos, tales como epítopos o secuencias de vacuna, para conectar dichos dominios peptídicos. No existe ninguna limitación particular con respecto a la secuencia del enlazador. Sin embargo, se prefiere que la secuencia enlazadora reduzca el impedimento estérico entre los dos dominios peptídicos, esté bien traducida y soporte o permita el procesamiento de los epítopos. Además, el enlazador debe tener pocos elementos de secuencia inmunogénica o ninguno. Los enlazadores preferiblemente no deberían crear epítopos no endógenos como los generados a partir de la sutura de unión entre epítopos adyacentes, que podrían generar reacciones inmunes no deseadas. Por lo tanto, la vacuna poliepitópica debería contener preferiblemente secuencias enlazadoras que sean capaces de reducir el número de epítopos de unión de unión del MHC no deseados. Hoyt et al. (EMBO J. 25 (8), 1720-9, 2006) y Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279 (10), 8635-41, 2004) han demostrado que las secuencias ricas en glicina perjudican el procesamiento proteasómico y, por tanto, el uso de secuencias enlazadoras ricas en glicina actúa para minimizar el número de péptidos que contienen enlazador que pueden ser procesado por el proteasoma. Además, se observó que la glicina inhibía una fuerte unión en las posiciones de los surcos de unión del MHC (Abastado et al., 1993, J. Immunol. 151 (7): 3569-75). Schlessinger et al., 2005, Proteins 61 (1): 115-26 encontraron que los aminoácidos glicina y serina incluidos en una secuencia de aminoácidos dan como resultado una proteína más flexible que el proteasoma traduce y procesa de manera más eficiente, lo que permite un mejor acceso a los epítopos codificados. Cada enlazador puede comprender 3 o más, 6 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos. Preferiblemente, el enlazador está enriquecido en aminoácidos glicina y/o serina. Preferiblemente, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de los aminoácidos del enlazador son glicina y/o serina. En una realización preferida, un enlazador está compuesto sustancialmente por los aminoácidos glicina y serina. En una realización, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e en la que a, b, c, d y e es independientemente un número seleccionado entre 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 y en la que a b c d e son diferentes de 0 y preferiblemente son 2 o más, 3 o más, 4 o más o 5 o más. En una realización, el enlazador comprende una secuencia como se describe en el presente documento que incluye las secuencias del enlazador descritas en los ejemplos tales como la secuencia GGSGGGGSG.
En una realización particularmente preferida, un polipéptido que incorpora uno o más neoepítopos adecuados identificados por los métodos de la presente invención, tal como un polipéptido poliepitópico, se administra a un paciente en forma de ácido nucleico, preferiblemente ARN tal como ARN transcrito o sintético in vitro, que puede expresarse en células de un paciente, como células presentadoras de antígenos, para producir el polipéptido. La presente enseñanza también prevé la administración de uno o más polipéptidos multiepitópicos que para el propósito de la presente enseñanza están comprendidos por el término "polipéptido poliepitópico", preferiblemente en forma de un ácido nucleico, preferiblemente a Rn tal como ARN sintético o transcrito in vitro, que puede expresarse en células de un paciente, tales como células presentadoras de antígenos, para producir uno o más polipéptidos. En el caso de una administración de más de un polipéptido multiepitópico, los neoepítopos adecuados proporcionados por los diferentes polipéptidos multiepitópicos pueden ser diferentes o superponerse parcialmente. Una vez presente en las células de un paciente, como las células presentadoras de antígenos, el polipéptido de acuerdo con las enseñanzas se procesa para producir los neoepítopos adecuados identificados de acuerdo con las enseñanzas. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con las enseñanzas puede proporcionar epítopos presentados por el MHC de clase II que son capaces de provocar una respuesta de células T colaboradoras CD4+ contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por el MHC. Alternativa o adicionalmente, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con las enseñanzas puede proporcionar neoepítopos presentados por el MHC de clase I que son capaces de provocar una respuesta de células T c D8+ contra células que expresan antígenos de los que se derivan los neoepítopos presentados por el MHC. Además, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con las enseñanzas puede proporcionar uno o más neoepítopos (incluidos neoepítopos conocidos y neoepítopos adecuados identificados de acuerdo con las enseñanzas) así como uno o más epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas del cáncer pero que son expresados por células cancerosas y preferiblemente induciendo una respuesta inmune contra las células cancerosas, preferiblemente una respuesta inmune específica del cáncer. En una realización, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con las enseñanzas proporciona neoepítopos que son epítopos presentados por el MHC de clase II y/o son capaces de provocar una respuesta de células T colaboradoras CD4+ contra células que expresan antígenos de los que también se derivan los epítopos presentados por el MHC así como epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas de cáncer que son epítopos presentados por el MHC de clase I y/o son capaces de provocar una respuesta de células T CD8+ contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por el MHC. En una realización, los epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas de cáncer se derivan de un antígeno tumoral. En una realización, los neoepítopos y epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas del cáncer tienen un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer. Preferiblemente, una vacuna proporcionada de acuerdo con las enseñanzas es útil para la estimulación poliepitópica de respuestas de células T citotóxicas y/o colaboradoras.
La vacuna proporcionada de acuerdo con las enseñanzas puede ser una vacuna recombinante.
Otro tipo de agente es una célula inmunitaria, tal como una célula T que expresa un receptor de célula T, o una célula T que expresa de forma recombinante un receptor de célula T, o que expresa un receptor de célula T artificial o quimérico (CAR), cuyo receptor es dirigido a un antígeno, por ejemplo, un neoepítopo adecuado identificado por los métodos de la presente enseñanza como un objetivo específico de enfermedad adecuado, preferiblemente cuando dicho neoepítopo se expresa en la superficie de una célula en un complejo con moléculas del MHC. Preferiblemente, una vez que la célula inmunitaria reconoce el antígeno mediante la unión receptor-antígeno, la célula inmunitaria (célula inmunorreactiva) se estimula, ceba y/o expande o ejerce funciones efectoras de las células inmunorreactivas como se describió anteriormente.
El término "célula T específica de antígeno" o términos similares se refiere a una célula T que reconoce un antígeno, por ejemplo, un neoepítopo adecuado complejado dentro de moléculas del MHC de clase I, y al unirse a dicho antígeno ejerce preferiblemente funciones efectoras de las células T como se describió anteriormente. Se considera que las células T y otras células linfoides son específicas del antígeno si las células matan a las células objetivo que expresan el antígeno. La especificidad de las células T puede evaluarse usando cualquiera de una variedad de técnicas estándar, por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación. Alternativamente, se puede medir la síntesis de linfocinas (tal como interferón y).
Los receptores de células T y otros receptores de antígenos se describen más arriba. El término "CAR" (o "receptor de antígeno quimérico") se refiere a un receptor artificial que comprende una sola molécula o un complejo de moléculas que reconoce, es decir, se une a, una estructura objetivo (por ejemplo, un antígeno) en una célula objetivo tal como una célula cancerosa (por ejemplo, mediante la unión de un dominio de unión a antígeno a un antígeno expresado en la superficie de la célula objetivo) y puede conferir especificidad a una célula efectora inmunitaria tal como una célula T que expresa dicho CAR en la superficie celular. Preferiblemente, el reconocimiento de la estructura objetivo por un CAR da como resultado la activación de una célula efectora inmunitaria que expresa dicho CAR. Un CAR puede comprender una o más unidades de proteína, comprendiendo dichas unidades de proteína uno o más dominios como se describe en el presente documento. El término "CAR" no incluye los receptores de células T.
En una realización, un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal se fusiona con la CD3-zeta transmembrana y el endodominio. Tales moléculas dan como resultado la transmisión de una señal zeta en respuesta al reconocimiento por el scFv de su antígeno objetivo en una célula objetivo y la muerte de la célula objetivo que expresa el antígeno objetivo. Los dominios de reconocimiento de antígenos que también pueden usarse incluyen, entre otras, cadenas simples alfa y beta del receptor de células T (TCR). De hecho, casi cualquier cosa que se una a un objetivo determinada con alta afinidad se puede utilizar como dominio de reconocimiento de antígenos.
Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. A este respecto, un "dominio de señalización de células T" es un dominio, preferiblemente un endodominio, que transmite una señal de activación a la célula T después de que se une el antígeno. El componente de endodominio más utilizado es CD3-zeta.
La terapia de transferencia celular adoptiva con células T modificadas con CAR que expresan receptores de antígenos quiméricos es un modo prometedor de terapia, ya que las células T modificadas con CAR pueden modificarse para direccionarse a prácticamente cualquier antígeno expresado en células enfermas, por ejemplo, antígenos tumorales. Preferiblemente, el antígeno tumoral es un neoepítopo resultante de una mutación específica de tumor identificada por los métodos de la presente enseñanza como un objetivo adecuado específico de tumor. Por ejemplo, las células T del paciente pueden modificarse por ingeniería genética (modificadas genéticamente) para expresar un CAR dirigido específicamente hacia un neoepítopo específico de tumor complejado con moléculas del MHC en la superficie de las células tumorales del paciente, y luego infundirse nuevamente en el paciente.
Un CAR puede reemplazar la función de un receptor de células T y, en particular, puede conferir reactividad tal como actividad citolítica a una célula tal como una célula T. Sin embargo, en contraste con la unión del receptor de células T a un complejo antígeno peptídico-MHC como se describió anteriormente, un CAR también puede unirse a un antígeno, en particular cuando se expresa en la superficie celular.
De acuerdo con la enseñanza, los CAR generalmente pueden comprender tres dominios. El primer dominio es el dominio de unión que reconoce y se une al antígeno. El segundo dominio es el dominio de coestimulación. El dominio de coestimulación sirve para mejorar la proliferación y supervivencia de los linfocitos citotóxicos tras la unión del CAR a la fracción objetivo. La identidad del dominio de coestimulación está limitada únicamente porque tiene la capacidad de potenciar la proliferación celular y la supervivencia tras la unión de la fracción objetivo por el CAR. Los dominios de coestimulación adecuados incluyen CD28, CD137 (4-1BB), un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), CD134 (OX40), un miembro de la superfamilia de receptores TNFR, y CD278 (ICOS), una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 expresada en células T activadas. El tercer dominio es el dominio de señalización de activación (o dominio de señalización de células T). El dominio de señalización de activación sirve para activar linfocitos citotóxicos tras la unión del CAR al antígeno. La identidad del dominio de señalización de activación está limitada solo porque tiene la capacidad de inducir la activación del linfocito citotóxico seleccionado tras la unión del antígeno por el CAR. Los dominios de señalización de activación adecuados incluyen la cadena CD3 [zeta] de células T y el receptor [gamma] de Fc.
Los CAR pueden comprender los tres dominios, juntos en forma de una proteína de fusión. Dichas proteínas de fusión comprenderán generalmente un dominio de unión, uno o más dominios de coestimulación y un dominio de señalización de activación, unidos en dirección terminal N al terminal C. Sin embargo, las CAR no se limitan a esta disposición y otras disposiciones son aceptables e incluyen un dominio de unión, un dominio de señalización de activación y uno o más dominios de coestimulación. Se entenderá que debido a que el dominio de unión debe estar libre para unirse al antígeno, la ubicación del dominio de unión en la proteína de fusión será generalmente tal que se logre la visualización de la región en el exterior de la célula. De la misma manera, debido a que los dominios de señalización de coestimulación y activación sirven para inducir la actividad y la proliferación de los linfocitos citotóxicos, la proteína de fusión generalmente mostrará estos dos dominios en el interior de la célula. Los CAR pueden incluir elementos adicionales, tales como un péptido señal para garantizar la exportación adecuada de la proteína de fusión a la superficie de las células, un dominio transmembrana para garantizar que la proteína de fusión se mantenga como una proteína de membrana integral y un dominio bisagra (o región espaciadora) que imparte flexibilidad al dominio de unión y permite una unión fuerte al antígeno.
Las células usadas en relación con los CAR y otros receptores de antígenos artificiales son preferiblemente células T, en particular linfocitos citotóxicos, preferiblemente seleccionados entre células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). Tras la activación, cada uno de estos linfocitos citotóxicos desencadena la destrucción de las células objetivo. Por ejemplo, las células T citotóxicas desencadenan la destrucción de las células objetivo por uno o ambos de los siguientes medios. Primero, tras la activación, las células T liberan citotoxinas tales como perforina, granzimas y granulisina. La perforina y la granulisina crean poros en la célula objetivo y las granzimas entran en la célula y desencadenan una cascada de caspasas en el citoplasma que induce la apoptosis (muerte celular programada) de la célula. En segundo lugar, la apoptosis se puede inducir mediante la interacción del ligando Fas-Fas entre las células T y las células objetivo. Los linfocitos citotóxicos serán preferiblemente células autólogas, aunque se pueden usar células heterólogas o células alogénicas.
Un dominio de unión para un antígeno que puede estar presente dentro de un CAR tiene la capacidad de unirse a (objetivo) un antígeno, es decir, la capacidad de unirse a (objetivo) un epítopo presente en un antígeno, preferiblemente la capacidad de unirse a (objetivo) un neoepítopo identificado por los métodos de la presente enseñanza como un objetivo adecuado específico de la enfermedad en el que el neoepítopo se presenta en el contexto del MHC en la superficie de la célula. Preferiblemente, un dominio de unión para un antígeno es específico para el antígeno.
Otro tipo de agente es una célula inmunitaria, tal como una célula linfoide, cargada con un péptido que contiene un neoepítopo adecuado identificado por los métodos de la presente enseñanza. En una realización preferida, la célula linfoide es una célula dendrítica. En el contexto de la presente enseñanza, las células linfoides preferiblemente aisladas del paciente que se va a tratar se incuban con un antígeno que se va a tratar y las células incubadas se administran luego al paciente en el que se induce una respuesta inmune a las células que expresan el antígeno. Por tanto, un péptido que comprende un epítopo adecuado puede incubarse con células dendríticas y las células incubadas pueden administrarse para inducir una respuesta inmune contra las células que expresan el neoepítopo adecuado.
El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "elaborado mediante ingeniería genética". Preferiblemente, una "entidad recombinante" tal como un polipéptido recombinante en el contexto de la presente enseñanza no se produce de forma natural, y preferiblemente es el resultado de una combinación de entidades tales como secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que no se combinan en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido recombinante en el contexto de la presente enseñanza puede contener varias secuencias de aminoácidos tales como neoepítopos o secuencias de vacuna derivadas de diferentes proteínas o diferentes porciones de la misma proteína fusionadas juntas, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos o enlazadores apropiados.
El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.
De acuerdo con las enseñanzas, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, incluidas las enfermedades cancerosas, en particular las formas de enfermedades cancerosas descritas en el presente documento.
El término "normal" se refiere al estado sano o las condiciones en un sujeto o tejido sano, es decir, condiciones no patológicas, en las que "saludable" significa preferiblemente no canceroso.
"Enfermedad que implica células que expresan un antígeno" significa que se detecta la expresión del antígeno en células de un tejido u órgano enfermo. La expresión en las células de un tejido u órgano enfermo puede aumentar en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos un 10%, en particular al menos un 20%, al menos un 50%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 500%, al menos un 1000%, al menos un 10000% o incluso más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano está reprimida. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que involucran o están asociadas con células que expresan un antígeno incluyen enfermedades cancerosas.
El cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento descontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras ubicaciones del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados y no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no lo hacen.
El tumor maligno es esencialmente sinónimo de cáncer. Malignidad, neoplasia maligna y tumor maligno son esencialmente sinónimos de cáncer.
De acuerdo con las enseñanzas, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, células tumorales o células tumorales) que preferiblemente forman una hinchazón o una lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y, por lo general, forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigno, premaligno o maligno.
Un tumor benigno es un tumor que carece de las tres propiedades malignas de un cáncer. Así, por definición, un tumor benigno no crece de forma ilimitada y agresiva, no invade los tejidos circundantes y no se disemina a tejidos no adyacentes (no hace metástasis).
La neoplasia es una masa anormal de tejido como resultado de una neoplasia. La neoplasia (nuevo crecimiento en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células excede y no está coordinado con el de los tejidos normales que lo rodean. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después de la cesación de los estímulos. Por lo general, causa una masa o un tumor. Las neoplasias pueden ser benignas, premalignas o malignas.
El "crecimiento de un tumor" o "crecimiento tumoral" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a la tendencia de un tumor a aumentar su tamaño y/o a la tendencia de las células tumorales a proliferar.
Para los propósitos de la presente enseñanza, los términos "cáncer" y "enfermedad cancerosa" se usan de manera intercambiable con los términos "tumor" y "enfermedad tumoral".
Los cánceres se clasifican por el tipo de célula que se asemeja al tumor y, por lo tanto, el tejido que se presume es el origen del tumor. Estos son la histología y la ubicación, respectivamente.
El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer de recto, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer de sangre, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de cuello uterino, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, cáncer nariz y garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y sus metástasis. Ejemplos de los mismos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas de cuello uterino o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la enseñanza también comprende metástasis de cáncer y recidiva de cáncer.
Por "metástasis" se entiende la propagación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportadas por la sangre, infiltración de órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o un tumor metastásico, en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a "metástasis distante" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.
Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario está formado por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.
El término "células tumorales circulantes" o "CTC" se refiere a células que se han desprendido de un tumor primario o metástasis tumorales y circulan en el torrente sanguíneo. Las CTC pueden constituir semillas para el crecimiento posterior de tumores adicionales (metástasis) en diferentes tejidos. Las células tumorales circulantes se encuentran en frecuencias del orden de 1-10 CTC por mL de sangre completa en pacientes con enfermedad metastásica. Se han desarrollado métodos de investigación para aislar CTC. Se han descrito varios métodos de investigación en la técnica para aislar CTC, por ejemplo técnicas que utilizan el hecho de que las células epiteliales expresan comúnmente la proteína de adhesión celular EpCAM, que está ausente en las células sanguíneas normales. La captura basada en perlas inmunomagnéticas implica el tratamiento de muestras de sangre con anticuerpos contra EpCAM que se han conjugado con partículas magnéticas, seguido de la separación de las células marcadas en un campo magnético. A continuación, las células aisladas se tiñen con anticuerpo contra otro marcador epitelial, citoqueratina, así como un marcador de leucocitos común CD45, para distinguir las CTC raras de los glóbulos blancos contaminantes. Este enfoque robusto y semiautomático identifica CTC con un rendimiento promedio de aproximadamente 1 CTC/mL y una pureza del 0,1% (Allard et al., 2004, Clin Cancer Res 10: 6897-6904). Un segundo método para aislar CTC utiliza un dispositivo de captura de CTC basado en microfluidos que implica hacer fluir sangre completa a través de una cámara incrustada con 80.000 micropostes que se han vuelto funcionales al recubrir con anticuerpos contra EpCAM. Luego, las CTC se tiñen con anticuerpos secundarios contra citoqueratina o marcadores específicos de tejido, como PSA en el cáncer de próstata o HER2 en el cáncer de mama, y se visualizan mediante escaneo automático de micropostes en múltiples planos a lo largo de coordenadas tridimensionales. Los chips de CTC son capaces de identificar células tumorales circulantes positivas para citoqueración en pacientes con un rendimiento medio de 50 células/mL y una pureza que oscila entre el 1 y el 80% (Nagrath et al., 2007, Nature 450: 1235-1239). Otra posibilidad para aislar las CTC es utilizar la prueba de células tumorales circulantes (CTC) CellSearchMR de Veridex, LLC (Raritan, NJ) que captura, identifica y cuenta las CTC en un tubo de sangre. El sistema CellSearchMR es una metodología aprobada por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) para el recuento de CTC en sangre completa que se basa en una combinación de etiquetado inmunomagnético y microscopía digital automatizada. Hay otros métodos para aislar CTC descritos en la bibliografía, todos los cuales pueden usarse junto con la presente enseñanza.
Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona se ve afectada nuevamente por una condición que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento satisfactorio de dicha enfermedad y vuelve a desarrollar dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con las enseñanzas, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor ocurre en un sitio diferente al sitio del tumor original así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.
El término "respuesta inmune" se refiere a una reacción del sistema inmune tal como a organismos inmunogénicos, tales como bacterias o virus, células o sustancias. El término "respuesta inmune" incluye la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. Preferiblemente, la respuesta inmune está relacionada con una activación de células inmunes, una inducción de la biosíntesis de citocinas y/o la producción de anticuerpos.
Se prefiere que la respuesta inmune inducida por las composiciones de la presente enseñanza comprenda las etapas de activación de células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y/o macrófagos, presentación de un antígeno o fragmento del mismo por dichas células presentadoras de antígeno y activación de células T citotóxicas debido a esta presentación.
El término "células inmunes" se refiere a las células del sistema inmunológico implicadas en la defensa del cuerpo de un individuo. El término "células inmunes" abarca tipos específicos de células inmunes y sus precursores, incluidos leucocitos que comprenden macrófagos, monocitos (precursores de macrófagos), granulocitos tales como neutrófilos, eosinófilos y basófilos, células dendríticas, mastocitos y linfocitos tales como células B, células T y células asesinas naturales (NK). Los macrófagos, monocitos (precursores de macrófagos), neutrófilos, células dendríticas y mastocitos son células fagocíticas.
El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de una enfermedad o afección induciendo, mejorando o suprimiendo una respuesta inmune. Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmune se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen una respuesta inmune se clasifican como inmunoterapias de supresión. El término "inmunoterapia" incluye inmunización con antígenos o vacunación con antígenos, o inmunización con tumores o vacunación con tumores. El término "inmunoterapia" también se refiere a la manipulación de respuestas inmunes de manera que las respuestas inmunes inapropiadas se modulan en otras más apropiadas en el contexto de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumática, alergias, diabetes o esclerosis múltiple.
Los términos "inmunización" o "vacunación" describen el proceso de administrar un antígeno a un individuo con el propósito de inducir una respuesta inmune, por ejemplo, por razones terapéuticas o profilácticas.
Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición como se describe en el presente documento a un sujeto para prevenir o eliminar una enfermedad, incluida la reducción del tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retrasar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retrasar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas y/o las recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que ha tenido una enfermedad anteriormente; y/o prolongar, es decir, aumentar la vida útil del sujeto. En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, ralentizar o inhibir la progresión o empeorar, o prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o los síntomas de la misma.
Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica con una probabilidad mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que tiene actualmente, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que dicho sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen, o que han tenido, un cáncer también tiene un mayor riesgo de metástasis del cáncer.
Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de la composición de la enseñanza protege preferiblemente al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de la composición de la enseñanza puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción del progreso de la enfermedad, que preferiblemente conduce a la eliminación de la enfermedad.
La inmunoterapia se puede realizar usando cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes proporcionados en el presente documento funcionan para eliminar las células enfermas de un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado de potenciar o inducir una respuesta inmune en un paciente específico para un antígeno o una célula que expresa un antígeno.
En determinadas realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario endógeno del huésped para reaccionar contra las células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (tales como polipéptidos y ácidos nucleicos como se proporciona en este documento).
Los agentes y composiciones proporcionados en este documento pueden usarse solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).
El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.
Los términos "sujeto", "individuo", "organismo" o "paciente" se refieren a vertebrados, particularmente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente enseñanza son seres humanos, primates no humanos, mamíferos domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como animales en cautiverio tales como animales de zoológicos. Los términos también se refieren a vertebrados no mamíferos como aves (en particular aves domesticadas como pollos, patos, gansos, pavos) y a peces (en particular peces de piscifactoría, por ejemplo, salmón o bagre). El término "animal" como se usa en este documento también incluye seres humanos.
El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "autotrasplante" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de otro modo da como resultado el rechazo.
El término "heterólogo" se usa para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Por ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a otro individuo constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta al sujeto.
Como parte de la composición para una inmunización o vacunación, preferiblemente uno o más agentes como se describen en el presente documento se administran junto con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmune o para aumentar una respuesta inmune. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que prolongan, potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. La composición de la presente enseñanza ejerce preferiblemente su efecto sin adición de adyuvantes. Aún así, la composición de la presente solicitud puede contener cualquier adyuvante conocido. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones oleosas (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (como alumbre), productos bacterianos (como la toxina de Bordetella pertussis), liposomas y complejos inmunoestimulantes. Ejemplos de adyuvantes son lípido A monofosforilado (MPL SmithKline Beecham). Saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; documento WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adyuvantes incompletos de Freund, adyuvantes completos de Freund, vitamina E, montánido, alumbre, oligonucleótidos CpG (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), y diversas emulsiones de agua en aceite que se preparan a partir de aceites biológicamente degradables tales como escualeno y/o tocoferol.
También se pueden administrar otras sustancias que estimulan una respuesta inmune del paciente. Es posible, por ejemplo, usar citocinas en una vacuna, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Dichas citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina 12 (IL-12) que se demostró que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (véase, Hall, 1995, IL-12 at the crossroads, Science 268: 1432-1434), GM-CSF e IL-18.
Hay una serie de compuestos que potencian una respuesta inmunitaria y que, por tanto, pueden usarse en una vacuna. Dichos compuestos comprenden moléculas coestimulantes proporcionadas en forma de proteínas o ácidos nucleicos tales como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente).
De acuerdo con la enseñanza, una "muestra de tumor" es una muestra tal como una muestra corporal que contiene células tumorales o cancerosas tal como células tumorales circulantes (CTC), en particular una muestra de tejido, que incluye fluidos corporales, y/o una muestra celular. De acuerdo con la enseñanza, una "muestra no tumoral" es una muestra tal como una muestra corporal que no contiene células tumorales o cancerosas tal como las células tumorales circulantes (CTC), en particular una muestra de tejido, incluidos los fluidos corporales, y/o una muestra celular. Tales muestras corporales pueden obtenerse de manera convencional, tal como por biopsia de tejido, incluida la biopsia por punción, y extrayendo sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. De acuerdo con la enseñanza, el término "muestra" también incluye muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo ácidos nucleicos o aislados de células.
Los agentes terapéuticamente activos, las vacunas y las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar mediante cualquier ruta convencional, incluso mediante inyección o infusión. La administración puede realizarse, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o transdérmica. En una realización, la administración se lleva a cabo por vía intranodal, por ejemplo mediante inyección en un ganglio linfático. Otras formas de administración prevén la transfección in vitro de células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas con los ácidos nucleicos descritos en el presente documento seguido de la administración de las células presentadoras de antígenos.
Los agentes descritos en el presente documento se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser un retraso del inicio o una prevención del inicio de dicha enfermedad o dicho estado.
Una cantidad eficaz de un agente descrito en el presente documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la afección fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía de administración específica y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de los agentes descritos en el presente documento pueden depender de dichos parámetros de diversas formas. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas por una vía de administración diferente, más localizada).
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, vehículos y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
El término "excipiente" pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.
El término "diluyente" se refiere a un agente diluyente y/o dispersante. Además, el término "diluyente" incluye uno cualquiera o más de medios de suspensión y/o mezcla fluidos, líquidos o sólidos.
El término "vehículo" se refiere a uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para administración a un ser humano. El término "vehículo" se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación del componente activo. Preferiblemente, los componentes del vehículo son líquidos estériles tales como agua o aceites, incluidos los que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. Soluciones salinas y dextrosa acuosa y también se pueden usar soluciones de glicerina como compuestos portadores acuosos.
Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.
Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticos se pueden seleccionar con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender como, o además de, el portador(es), excipiente(s) o diluyente(s) cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento y/o agente(s) solubilizantes adecuados. Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.
En una realización, la composición es una composición acuosa. La composición acuosa puede comprender opcionalmente solutos, por ejemplo sales. En una realización, la composición está en forma de composición liofilizada. Una composición liofilizada se puede obtener liofilizando una composición acuosa respectiva.
Los agentes y composiciones proporcionados en este documento pueden usarse solos o en combinación con otros regímenes terapéuticos tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).
La presente enseñanza se describe en detalle y se ilustra mediante las figuras y ejemplos, que se utilizan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, el experto en la materia puede acceder a otras formas de realización que también se incluyen en la enseñanza.
Figuras
Figuras 1a y 1b. Muestra de glioblastoma con alta amplificación focal del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Fig. 1a: Una representación gráfica de genes locales que rodean la EGFR en el cromosoma 7. Fig. 1b: Listado de las 12 variaciones de un solo nucleótido con los números absolutos de copia más altos.
Figura 2. Un listado de varios genes que tienen una mutación específica de la enfermedad de una muestra de melanoma ordenados por cigosidad (Cx).
Figura 3. Un listado de varios genes de una muestra de melanoma en la que todas las copias tienen la mutación específica de la enfermedad (la fracción de cigosidad es igual a 1), de los cuales tres de los genes son genes esenciales en humanos o se infiere que son genes esenciales en humanos.
Abreviaturas de las figuras: posición cromosómica chr_pos, posición cromosómica; CN, número absoluto de copias; Cx, cigosidad; EC, corrección de error del número absoluto de copias; VAF, frecuencia alélica variante; rho, porcentaje estimado de células tumorales que contienen el alelo mutado (SNV); FLRT+u, puntuación de confianza en la mutación; la clasificación del sitio es la clase de confianza de la mutación; gen esencial, Y si se determina que el gen es esencial.
Ejemplo 1. Direccionamiento de mutaciones específicas de la enfermedad en genes con alto número de copias
La información genómica para la muestra de glioblastoma (Chin et al., 2008, Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways, Nature 455: 1061-1068) se analizó buscando genes que tuvieran un alto número de copias y en los que al menos una copia del gen contuviera una mutación específica de la enfermedad. El análisis de calidad indicó que hubo una alta fidelidad en la asignación del número de copias para los 11.574 genes individuales analizados, y se determinó que la ploidía del genoma de la muestra era 1,95. La Figura 1a muestra una representación gráfica de los genes locales que rodean al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en el cromosoma 7, que es un gen impulsor conocido y ha sido un objetivo para el tratamiento. Se demostró que el EGFR en este genoma tenía un número de copias absoluto con corrección de errores de 76, de las cuales 13 copias contenían la variación de un solo nucleótido específico de la enfermedad. La Figura 1b proporciona una lista de los genes de esta muestra genómica con el mayor número absoluto de copias. Hay cuatro genes adicionales que tienen un número absoluto de copias superior a 2. De hecho, la amplificación de EGFR es un sello genético conocido de los glioblastomas primarios (Benito et al., 2009, Neuropathology 30 (4): 392-400) y este gen se ha considerado como objetivo de tratamiento (Taylor, 2012, Curr Cancer Drug Targets. Mar; 12 (3): 197-209).
Ejemplo 2. Direccionamiento de mutaciones específicas de la enfermedad con alta cigosidad
Se analizó un exoma obtenido de una muestra de células de melanoma de un tumor en un ser humano buscando genes en los que al menos una copia del gen tuviera una mutación específica de la enfermedad y observando el número de copias del gen que tiene la mutación específica de la enfermedad, así como el número total de copias del gen, tanto si el gen tiene la mutación como si no. La Figura 2 proporciona una lista de genes ordenados por cigosidad en los que la mutación específica de la enfermedad se encuentra en múltiples copias del gen. Por ejemplo, la mutación específica de la enfermedad en el gen OXGR1 tiene la cigosidad más alta (4) y, en particular, también tiene la cigosidad fraccional más alta de 4/5 o 0,8, ya que hay un total de 5 copias del gen OXGR1 y 4 de cuyas copias contienen la mutación específica de la enfermedad. La lista proporciona 10 genes adicionales en los que 3 copias del gen de un total de 4 copias tienen la mutación, lo que indica que la mutación específica de la enfermedad en estos genes tiene una cigosidad fraccional de 3/4 o 0,75. Los genes restantes de la lista tienen mutaciones que tienen una cigosidad fraccional de 2/3 o 0,66 ya que 2 copias de un total de 3 copias tienen la mutación.
Ejemplo 3. Direccionamiento de mutaciones específicas de la enfermedad presentes en todas las copias de un gen esencial
Se analizó un exoma obtenido de una muestra de células de melanoma de un tumor en un ser humano buscando genes en los que todas las copias del gen tuvieran la misma mutación específica de la enfermedad y se determinó cuál de estos genes es un gen esencial. Se determinó que los genes eran esenciales al inferir su esencialidad en humanos a partir del conocimiento de que son esenciales en ratones (Georgi et al., 2013, From mouse to human: evolutionary genomics analysis of human orthologs of essential genes, PLoS Genetics 9 (5 ): e1003484; Liao et al., 2007, Mouse duplicate genes are as essential as singletons, Trends Genet. 23: 378-381). La Figura 3 enumera varios genes en los que todas las copias del gen tienen la misma mutación específica de la enfermedad. Además, se determinó que los tres genes resaltados eran esenciales al inferir su esencialidad a partir de datos de ratones.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la idoneidad de un neoepítopo resultante de una mutación específica de la enfermedad en un alelo en un gen (alelo mutado) como objetivo específico de la enfermedad que comprende determinar, en una célula enferma o población de células enfermas, el número de copias del alelo mutado que codifica el neoepítopo, en el que un número de copias del alelo mutado que es mayor que 2 indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad, en el que la enfermedad es cáncer y en el que cuanto mayor es el número de copias del alelo mutado, mayor es la idoneidad del neoepítopo como un objetivo específico de la enfermedad.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un número de copias del alelo mutado que es mayor que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o es mayor que 100 indica la idoneidad del neoepítopo como objetivo específico de la enfermedad.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la relación entre el número de copias del alelo mutado sobre el número total de copias del sitio del nucleótido al que se asigna la mutación es mayor que 0,5, en el que, preferiblemente, la relación es 1.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que cuanto mayor sea la proporción del número de copias del alelo mutado sobre el número total de copias del sitio del nucleótido al que se asigna la mutación, mayor será la idoneidad del neoepítopo como un objetivo específico de la enfermedad.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el gen es un gen impulsor cuya expresión da como resultado la transformación de la célula en un fenotipo canceroso o cuya falta de expresión da como resultado que una célula cancerosa pierda su fenotipo canceroso.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el gen es un gen esencial, en el que, preferiblemente,
el gen esencial es un gen, que cuando se silencia o se reduce su expresión, al menos da como resultado un crecimiento deficiente o una aptitud reducida de una célula en la que se expresa el gen esencial, preferiblemente la célula enferma; o
el gen esencial se expresa en una amplia variedad de tejidos diferentes y se expresa con un umbral mínimo de RPKM superior a 0.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la mutación específica de la enfermedad es una variación de un solo nucleótido.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el neoepítopo se identifica mediante un método que comprende secuenciar el genoma o una porción del mismo de una célula enferma.
9. Un método para proporcionar una vacuna que comprende identificar un neoepítopo adecuado o una combinación de neoepítopos adecuados de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la vacuna comprende un péptido o polipéptido que comprende uno o más neoepítopos adecuados o una combinación de neoepítopos adecuados, o un ácido nucleico que codifica dicho péptido o polipéptido.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico es ARN.
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