CN117757931A - 选择新表位作为具有增强效力的用于治疗的疾病特异性靶标 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及选择新表位作为具有增强效力的用于治疗的疾病特异性靶标。具体的,本发明涉及用于确定仅在病变细胞中或在病变细胞上表达的新表位是否是合适的疾病特异性靶标以使得所述病变细胞能够逃脱免疫监视的可能性更低的方法,以及所述新表位在提供针对表达所述新表位的病变细胞的免疫应答中的用途。
Description
本申请是申请号为201780044824.0的发明名称为“选择新表位作为具有增强效力的用于治疗的疾病特异性靶标”的中国专利申请的分案申请,原申请是2017年07月19日提交的PCT国际申请PCT/EP2017/068226于2019年01月18日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉及用于确定疾病特异性新表位作为疾病特异性靶标的适合性(suitability)的方法,以及这些鉴定的合适的新表位在特异性靶向表达一种或更多种鉴定的合适新表位的患者病变组织(例如肿瘤组织)的免疫治疗中的用途。
背景技术
癌症是导致死亡的主要原因,占所有死亡的四分之一。传统上,癌症的治疗基于平均法则(the law of average)-即对最大数量的患者最有效。然而,由于癌症中的分子异质性,通常少于25%的被治疗个体从批准的治疗中获益。基于患者的定制治疗的个体化医疗被认为是药物开发中创新的效率低和成本高的潜在解决方案。
个体化癌症免疫治疗正在成为癌症治疗的潜在突破,有可能改变全球每年诊断的数百万癌症患者的护理标准。个体化癌症免疫治疗的联合方面使得免疫系统能够靶向患者癌症特有的遗传异常(突变)。这些疾病特异性突变可以编码新表位,所述新表位是疾病特异性靶标。可用作个体化免疫治疗的疾病特异性靶标的导致癌症基因组的最普遍遗传异常是非同义单核苷酸变异(nonsynonymous single nucleotide variation,SNV)。因此,精确和详尽地鉴定患者基因组编码区中的SNV是产生个体化癌症免疫治疗的方法中的关键步骤。
然而,如本文所述,了解疾病特异性突变的身份仅是蓝图的一部分。相反,突变的完整遗传分析需要知道病变细胞(例如肿瘤细胞)中含有突变的基因的确切拷贝数(包括野生型和突变等位基因两者),肿瘤细胞中突变等位基因的拷贝数(这里称为突变的接合性(zygosity)),以及病变细胞样品(例如肿瘤样品)中突变的亚克隆程度。实际上,在大多数疾病适应症中,在病变细胞中发生的拷贝数变异是病变细胞中遗传变异的重要组成部分。此外,拷贝数变异的程度,受拷贝数变异影响的基因的身份以及拷贝数变异的精确遗传组成对于每个个体是独特的,并且可以在个体之间广泛变化。通常参见Shlien和Malkin,2009,Genome Med.1:62;Yang等,2013,Cell 153:919-929。精确了解这些遗传特征对于选择当靶向时对肿瘤逃逸具有免疫并因此具有赋予总肿瘤控制的潜力的突变可能是重要的。
为了使个体化癌症免疫治疗的效力最大化并为大多数治疗的患者赋予持久的肿瘤控制,治疗需要以某种方式规避肿瘤逃避免疫监视的能力,例如通过使突变靶标的表达沉默,例如,通过使基因缺失。不解决这个问题,免疫治疗具有复发的风险,因为如果突变不表达,例如从基因组中缺失,免疫治疗就不能靶向突变。选择增强肿瘤控制的合适的新表位将有利于靶向新表位的所有个体化免疫治疗方法,无论它们如何实施。因此,本领域需要选择导致增强的肿瘤控制的由疾病特异性突变引起的新表位的方法。
发明内容
本发明提供了克服现有技术中的缺陷的方式,其通过提供用于确定由基因中的疾病特异性突变产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法来实现,通过所述方法,病变组织不容易逃脱免疫监视,在癌症的情况下将导致增强的肿瘤控制。一旦鉴定出合适的新表位,这些合适的表位可用作疾病特异性靶标,以在患有该疾病的患者中诱导特异性免疫应答。例如,疾病可以是癌症,并且潜在地可以靶向表达合适的新表位的原发性肿瘤以及肿瘤转移,以进行更有效的治疗。
本发明涉及用于确定由基因中等位基因的疾病特异性突变(突变等位基因)产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定编码新表位的突变等位基因的拷贝数。如本文所用,拷贝数也可称为接合性,例如,当突变等位基因的拷贝数为4时,突变等位基因的接合性为4。如本文所用,等位基因是基因组中具有特定核苷酸身份的位点,所述身份在基因组的母本和父本拷贝两者上可以是相同的(纯合基因型),或者所述身份在基因组的母本和父本拷贝上可以是不同的(杂合基因型)。突变等位基因是这样的等位基因,其由于疾病特异性突变而具有与相应正常基因组中的位点不同的身份,所述正常基因组为例如来自相同个体的非病变细胞的基因组(匹配的基因组),优选来自与病变细胞相同组织类型的非病变细胞的基因组。如本文所用,适合作为疾病特异性靶标的新表位(合适的新表位)是这样的新表位,当其被免疫系统靶向时,其表达被病变组织下调或沉默(例如,由于缺失)的可能性更低,以使得病变组织逃脱应答的可能性更低,优选通过例如针对新表位的疫苗接种或施用能够靶向(结合)新表位的免疫细胞而针对新表位产生的免疫应答。在一个实施方案中,突变等位基因的拷贝数可以与包含突变等位基因的基因的拷贝数相同,以使得本发明还涉及用于确定由基因中的疾病特异性突变产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定具有疾病特异性突变的基因的拷贝数。
在一个实施方案中,突变等位基因或具有疾病特异性突变的基因的高拷贝数表明新表位作为疾病特异性靶标的适合性,以使得突变等位基因或具有疾病特异性突变的基因的拷贝数越高,新表位作为疾病特异性靶标的适应性就越高。在一个实施方案中,其中突变等位基因或具有疾病特异性突变的基因的拷贝数大于2,这表明新表位作为疾病特异性靶标的适合性。在一个实施方案中,其中具有疾病特异性突变的基因的拷贝数大于3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大于100,这表明新表位作为疾病特异性靶标的适合性。
在其中至少一个拷贝具有突变等位基因之基因的并非所有拷贝都具有突变的情况下,优选的是所述基因的许多拷贝具有突变等位基因,即,优选的是所述基因的较高比例(fraction)而不是较低比例的拷贝具有突变等位基因(较高的接合性比例(fractionalzygosity),而不是较低的接合性比例)。因此,在某些实施方案中,在至少一个拷贝具有突变等位基因的基因中,所述突变等位基因以高比例的基因拷贝存在(接合性比例),其中接合性比例是突变等位基因的拷贝数(突变等位基因的接合性)相对于突变等位基因所映射的核苷酸位点的总拷贝数的比值,突变等位基因所映射的核苷酸位点特别是参照基因组或相应的野生型基因组或匹配的基因组,即来自相同个体的野生型基因组。突变等位基因的拷贝的接合性比例越高,新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。优选地,接合性比例可以大于0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95,并且最优选地,接合性比例为1,即病变细胞中所述基因的所有拷贝都具有突变等位基因。在接合性比例为1的情况下,没有基因的野生型拷贝,以使得病变细胞不能恢复到表达相应的野生型表位。如本文所用,1的比例是其中突变等位基因/基因的遗传构型(例如拷贝数、接合性)相同的假设不能被数据驳斥,即在统计学上是一致的。
已知诸如肿瘤的病变组织在其基因构成和基因表达方面可以是异质的,以使得可能不是病变组织中的所有病变细胞都具有相同的基因拷贝数和/或至少一个拷贝具有突变等位基因之基因的拷贝数(该基因的总拷贝数)和/或具有突变等位基因的基因的拷贝,更不用说疾病特异性突变本身。因此,优选的是,例如突变等位基因的拷贝数和/或接合性比例和/或突变等位基因所映射的核苷酸位点的总拷贝数在病变组织中的高比例的病变细胞而不是低比例的病变细胞中被发现相同或相似(高克隆比例而不是低克隆比例)。具有相同或相似的例如突变等位基因的拷贝数和/或接合性比例和/或突变等位基因所映射的核苷酸位点的总拷贝数的病变细胞的比例越高,新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。例如,克隆比例(clonal fraction)可以为至少0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或至少0.9。在一个优选的实施方案中,病变组织中的所有病变细胞具有相同或相似的拷贝数,即克隆比例为1,即在统计学上是一致的。如本文所用,相同或相似的拷贝数涵盖了相同的拷贝数或者所述拷贝数的30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或更少以内的拷贝数,例如具有或不具有误差校正(error correction)的拷贝数或绝对拷贝数。
优选地,突变的克隆比例可以由具有相同或相似突变遗传构型的病变细胞的比例给出,其中突变的遗传构型包括突变所映射的核苷酸位点的总拷贝数和突变等位基因的拷贝数。如果特征存在于所有病变细胞中至不能被可用数据统计学驳斥的程度,则称该特征在病变细胞群中是固定的(fixed)。优选地,克隆比例为1意味着突变的遗传构型在病变细胞群中是固定的。优选地,如果突变在病变细胞群中是固定的并且影响编码突变的位点的CNV在病变细胞群中是固定的,则突变的遗传构型在病变细胞群中是固定的。优选地,如果突变所映射的核苷酸位点的总拷贝数为2且位于病变(肿瘤)基因组的平衡区域中的突变被确定为在病变细胞群是固定的,则突变的遗传构型是固定的。
其中发现疾病特异性突变的基因可能潜在地位于基因组中的任何基因中。其中发现产生合适新表位的突变的优选基因类型是这样的基因,其表达导致细胞转化为癌表型或其表达的缺失导致癌细胞丧失其癌表型,即,其表达有助于肿瘤进展的基因。这样的基因被称为驱动基因(driver gene)。许多类型肿瘤的驱动基因的实例是众所周知的。例如,在Tamborero等,2013,Comprehensive identification of mutational cancer drivergenes across 12tumor types,Scientific Reports 3:2650中公开了作用于来自12种不同癌症类型的3,205种肿瘤的291种高置信度癌症驱动基因的列表。使用以下中公开的方法已经鉴定了另一些驱动基因:Youn等,2011,Identifying cancer driver genes in tumorgenome sequencing studies,Bioinformatics 27(2):175-181,Sakoparnig等,2015,Identification of constrained cancer driver genes based on mutation timing,PLoS Comput.Biol.11(1):e1004027,以及Forbes等,2008,Current protocols in humangenetics10-11。驱动基因中的疾病特异性突变可能会或不会导致癌表型。优选地,在病变细胞中发现的驱动基因的每个拷贝都具有疾病特异性突变。还优选地,病变组织中的所有细胞都是病变细胞,其中驱动基因的每个拷贝都具有疾病特异性突变。
另一种优选类型的基因是必需基因(essential gene)。在一个实施方案中,必需基因是这样的基因,当其沉默或其表达降低时(例如被缺失),至少导致细胞(优选病变细胞)的生长受损或适应性(fitness)降低。这样的基因在本文中称为必需基因。在一个实施方案中,必需基因是这样的基因,与其中基因未被沉默或表达降低的细胞相比,基因被沉默或表达降低的病变细胞具有至少10%的生长降低或适应性降低。在一个实施方案中,生长降低或适应性降低至少20%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或至少95%,最优选地必需基因的沉默或表达降低导致病变细胞的致死性。优选地,在病变细胞中存在的必需基因的每个拷贝都具有疾病特异性突变。
必需基因是本领域众所周知的,例如,在Liao等2008,Proc.Nat.Acad.Sci.USA105:6987-6992和Georgi等,2013,PLoS Genetics 9(5):e1003484中公开了人中(例如,在人细胞系中或从其他生物体中推断)必需基因的列表,以及公开了其他真核生物体中的相应直向同源物,例如小鼠(Liao等,2007,Trends Genet.23:378-381)、果蝇(Spradling等,1999,Genetics153:135-177)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)(Kamath等,2003,Nature421:231-237)、斑马鱼(Amsterdam等,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:12792-12797)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Tzafrir等,2004,Plant Physiol.135:1206-1220)、酵母(Kim等,2010,Nat.Biotechnol.28:617-623)等。Wang等,2015,Science 350:1096-1101中公开了来自人癌细胞系的必需基因的列表,并且必需基因列表可以在必需基因数据库DEG5.0(Zhang等,2009,Nucleic AcidsRes.37:D455-D458)中找到。
另外,其缺失/沉默显著降低细胞系群的适应性的必需基因的列表可以从多个健康组织和/或癌细胞系凭经验产生,所述细胞系可以来自供体或来自患者。基因的缺失/沉默可以使用多种分子生物学技术(例如CRISPR技术、RNA干扰等)通过实验进行,其中在推定的必需基因表达和不表达情况下确定细胞的存活或适应性。必需基因的列表也可以从细胞或细胞系通过实验确定,或者必需基因的列表可以通过生物信息学方法获得。细胞或细胞系可以是病变细胞或细胞系(肿瘤细胞或细胞系)或非病变(健康/正常)细胞或细胞系,并且可以从供体或患有该疾病的患者获得。优选地,非病变细胞或细胞系与病变细胞来自相同的组织类型,更优选来自同一患者。在其中疾病是癌症的实施方案中,细胞或细胞系可以从原发性肿瘤或任何转移瘤(如果存在的话)获得。此外,必需基因的列表可以与在体内多种组织中表达的最小基因的组基本相同。例如,必需基因是在多种不同组织中表达的基因,并且以RPKM(每千碱基转录物每百万映射读数的最小读数(minimum reads per kilobaseof transcript per million mapped reads))阈值大于0,优选大于0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、20、25表达。这样的必需基因的列表可以通过分析获自从至少5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多种不同的组织获得的一组细胞样品的RNA表达数据(例如,RNAseq)获得。此外,如果来自患者的肿瘤细胞系可用,则可以使其中所有拷贝都含有编码新表位的突变的基因一次一个地缺失,并测量每种经修饰细胞系的生长速率。这样的测量/分析可以通过本领域已知的高通量方法进行,其允许一次筛选至少一种基因,优选一次筛选多种基因,以评估其对病变细胞或非病变细胞的适应性的影响。这样的方法还允许检测如下所述基因的合成致病或致死组合。简而言之,可以使用每个细胞系缺少一个基因的细胞系文库来测试一个或更多个候选基因的缺失,从而可以确定基因缺失对细胞的影响。
本发明还涉及用于确定由基因中的疾病特异性突变产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定基因的拷贝数,即,确定其中基因的至少一个拷贝具有疾病特异性突变的基因的拷贝数。在病变细胞(例如肿瘤细胞)中基因具有高拷贝数的情况下(例如由于局灶扩增(focal amplification)),基因可能是驱动基因的可能性非常大。因此,基因的高拷贝数表明新表位作为疾病特异性靶标的适合性,并且基因的拷贝数越高,新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。例如,高拷贝数可以是大于2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大于100的拷贝数。高拷贝数也可以是比相应的非病变细胞中基因的拷贝数高至少50%的拷贝数。高拷贝数也可以是其中至少一个拷贝具有疾病特异性突变的基因的拷贝数为相应非病变细胞中所述基因的拷贝数的至少2×、3×、5×、10×、15×、20×、25×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×或至少100×。由于也可能存在于正常基因组中的拷贝数变异,因此正常基因组中基因的拷贝数不一定是2。此外,已知在某些疾病中比在其他地方更经常观察到局灶扩增,例如在胶质母细胞瘤中,表皮生长因子受体基因通常局灶扩增,因此该实施方案非常适合用于那些疾病。
此外,优选的是在高比例的病变细胞而不是低比例的病变细胞中发现基因的拷贝数相同或相似,以使得具有相同或相似拷贝数的病变细胞的比例越高,新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。在一个优选的实施方案中,病变组织中的所有病变细胞的其中至少一个拷贝具有疾病特异性突变的基因具有相同或相似的拷贝数,即克隆比例为1。如本文所用,相同或相似的拷贝数涵盖了相同的拷贝数或者所述拷贝数的30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或更少以内的拷贝数,例如具有或不具有误差校正的拷贝数或绝对拷贝数。
此外,具有高拷贝数的其中至少一个拷贝具有产生新表位的疾病特异性突变的基因优选地可以是其表达导致细胞转化为癌表型或其表达的缺失导致癌细胞丧失其癌表型的基因,即驱动基因,例如本领域已知的那些驱动基因,或者可以是必需基因,例如,当其沉默或其表达降低时,至少导致病变细胞的生长受损或适应性降低的基因。
本发明还涉及用于确定由基因中的疾病特异性突变产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定具有所述疾病特异性突变的基因是否是必需基因。在一个实施方案中,必需基因是当其沉默或其表达降低(例如通过基因缺失)时,至少导致病变细胞生长受损或适应性降低的基因。在该实施方案中,其中基因是必需基因并且必需基因的所有拷贝都具有疾病特异性突变(接合性比例为1)表明新表位作为优选的疾病特异性靶标的适合性。在一个实施方案中,必需基因是在多种不同组织中表达的基因,并且以RPKM(每千碱基转录物每百万映射读数的最小读数)阈值大于0,优选大于0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、20、25表达。优选地,必需基因的所有拷贝都含有突变。此外,优选高比例的病变细胞含有必需基因的拷贝,其中必需基因的所有拷贝都具有疾病特异性突变(高克隆比例而不是低克隆比例),以使得含有必须基因的拷贝的病变细胞比例越高,新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高,其中必需基因的所有拷贝都具有疾病特异性突变。在一个更优选的实施方案中,病变组织中的所有病变细胞都具有必需基因,其中必需基因的所有拷贝都具有疾病特异性突变,即克隆比例为1。
已知某些基因,当单独沉默或其表达单独降低时,对于病变细胞的适应性或生长能力可能仅具有小的影响(如果有的话)。然而,已经观察到,当两种这样的基因在其都沉默或者其每种表达都降低时,可以导致强得多的生长损伤,直至致死。这种遗传组合被称为合成致死或合成致病/损伤。参见Nijman,2011,Synthetic lethality:General principles,utility and detection using genetic screens in human cells,FEBS Lett.585:1-6对于合成致死和合成致病基因以及鉴定这些基因的方法的讨论。由于这两种基因都是细胞存活所必需的,因此细胞不可能使这两种基因沉默或表达降低。因此,作为疾病特异性靶标的新表位的合适组合可以由至少两种基因中的疾病特异性突变产生,这些基因一起是合成致死的或合成致病的。鉴于此,本发明还涉及用于确定由至少两种基因中的疾病特异性突变产生的至少两种新表位的组合作为疾病特异性靶标组合的适合性的方法,其包括确定各自具有疾病特异性突变的至少两种基因的组合是否是合成致死或合成致病基因。当至少两种基因的组合产生合成致死或合成致病表型时,这表明所得的新表位是疾病特异性靶标的合适组合。在一个优选的实施方案中,与从每种基因单独缺失或表达降低的累加效应所预期的相比,合成致病导致至少更高的对细胞生长/适应性的影响。在存在大量合适的新表位的情况下,这种方法是有利的,因为新表位的数量越多,可能是合成致病或致死的组合的数量就越多。例如,10种突变对应于45种可能的组合,100种突变对应于4950种组合,1000种突变对应于约500,000种组合。在某些实施方案中,在病变细胞和病变组织中的病变细胞两者中,所述至少两种基因各自具有较高而不是较低的接合性比例,优选接合性比例为1,和/或各自具有较高而不是较低的克隆比例,优选克隆比例为1。如本文所用,在合适的新表位的组合中发现的每种新表位各自被认为是用于本发明目的的合适的新表位。
如本文所述,无论是在病变细胞还是非病变细胞中,基因的拷贝数可以是相对拷贝数,但优选是绝对拷贝数,更优选是相对于倍性如病变细胞基因组的倍性(即基因组的拷贝数)归一化的绝对拷贝数。甚至更优选地,相对、绝对和归一化的拷贝数是经误差校正的。
当估计例如突变等位基因或基因的绝对拷贝数或其接合性时,估计可能是不准确的,并且需要校正绝对拷贝数以考虑误差来源。在使用下一代测序从基因组和外显子组获得序列信息的实施方案中,误差来源可包括:病变组织样品(例如肿瘤样品)的估计的纯度的偏差,导出纯度和/或绝对拷贝数所需的任何估计的参数的偏差,由于测序样品的有限覆盖率引起的随机误差,由于低纯度、低克隆比例等引起的有限的检测能力。
在使用含有杂合SNP的平衡杂合区段(balanced heterozygous segment)确定绝对拷贝数的实施方案中,例如与本申请同日提交的题为“Tumor Modeling Based onPrimary Balanced Heterozygous Segments”的国际PCT专利申请中公开的,其公开内容通过引用整体并入本文,区段的绝对拷贝数的误差可能传播到其他估计的参数,例如编码新表位的突变等位基因(例如SNV)的绝对拷贝数,突变等位基因的接合性,克隆比例等。由于这些下游估计参数对于如本文所述确定新表位作为患者的疾病特异性靶标的适合性具有临床意义,因此期望校正绝对拷贝数中的误差以获得绝对拷贝数的最准确值。此外,由于编码新表位的突变可以使用本文讨论的标准对于其待包含在给予患者的疫苗中的适合性进行优先化,并且因为1的接合性比例在质量上优于小于1的接合性比例,特别是当含有突变的基因是必需基因时,所以对绝对拷贝数和由其导出的任何参数进行最准确的估计是有益的。
在一个优选的实施方案中,可以对突变等位基因(例如SNV)的绝对拷贝数和/或SNV的接合性进行误差校正。在一个实施方案中,首先对SNV的绝对拷贝数进行误差校正,然后校正SNV的接合性以反映SNV的误差校正的绝对拷贝数。一旦对SNV的绝对拷贝数和/或SNV的接合性进行了误差校正,也可以校正克隆比例的估计以反映误差校正的绝对拷贝数,包括确定克隆比例是否在统计学上符合1的值。
SNV的绝对拷贝数优选由SNV所映射的区段的绝对拷贝数给出。可以对病变(例如肿瘤)基因组中的所有区段的绝对拷贝数进行误差校正,包括SNV的绝对拷贝数。一旦对基因组中所有区段的绝对拷贝数进行了误差校正,就可以基于病变(例如肿瘤)基因组中区段的误差校正的绝对拷贝数来计算误差校正的倍性。
在一个具体实施方案中,如果对SNV的绝对拷贝数进行了误差校正,以使得新的绝对拷贝数与原始绝对拷贝数不同,则这可以作为SNV的估计的绝对拷贝数不可靠的指示。
区段的绝对拷贝数的误差校正的一个实例是奇偶校验误差校正(parity errorcorrection),包括如果区段处于平衡区域则将区段的奇数绝对拷贝数校正为偶数绝对拷贝数。平衡区域是病变(例如肿瘤)基因组的区域,其中该区域内的母本和父本等位基因经历相等(平衡)扩增,或者母本和父本等位基因两者都没有经历任何扩增。
将区段的奇数绝对拷贝数进行误差校正为最接近的较高的偶数绝对拷贝数或最接近的较低的偶数绝对拷贝数的决定可取决于映射到区段的疾病读数和正常读数,以及与定义区段的绝对拷贝数的预测的边界进行比较。其中正常读数是与测序的正常样品有关的读数,而疾病读数是与测序的病变样品有关的读数。特别地,当疾病是癌症时,肿瘤读数是与测序的肿瘤样品有关的读数。
例如,在第一种奇偶校验误差校正中,如果CNmut是病变基因组中突变所映射的区段的绝对拷贝数,则预测具有CNmut值的区段的绝对拷贝数可以校正为CNmut+1(如果r>ρth)和CNmut-1(如果r<ρth),其中r是疾病读数相对于正常区段读数的比值(映射到区段的疾病(例如肿瘤)读数的数目相对于映射到区段的正常读数的数目的比值),其中ρth是预测的决策边界,其值也取决于疾病组织样品(例如肿瘤样品)的纯度。
区段的等位基因特异性拷贝数是病变基因组中区段的母本等位基因或父本等位基因的拷贝数。当区段含有杂合SNP(杂合区段)时,杂合SNP可用于确定区段的等位基因特异性拷贝数。可以将杂合区段分配给优选节点(node),其中节点可以定义为杂合区段的绝对拷贝数和杂合区段的等位基因特异性拷贝数的独特组合。偶数节点是节点的子集,其区段的绝对拷贝数为偶数。如果杂合区段含有多于一个杂合SNP,则两个或更多个杂合SNP的组可以由该组的单个成员表示,或者可以对组的所有成员的等位基因频率取平均,或者可以使用中值,只要对于在病变基因组中具有更高或更低拷贝数的等位基因,一致地计算每个杂合SNP的等位基因频率即可。
第一种杂合区段的奇偶校验误差校正可涉及找到最可能的偶数节点以对应于杂合区段,例如,基于给出映射到区段的测量的疾病(例如肿瘤)读数和正常读数的最大可能性框架。
在第二种奇偶校验误差校正中,鉴定不需要进行奇偶校验误差校正的最接近的上游和下游区段,优选在包含SNV的区段的10Mb、5Mb、1Mb内。如果最接近的上游和下游区段两者的绝对拷贝数相同,则将包含SNV的区段的绝对拷贝数改变为最接近区段的绝对拷贝数。通常,第二种奇偶校验误差校正优于第一种奇偶校验误差校正,除非其由于不能鉴定合适的相邻区段而不能实现,在这种情况下,可以应用第一种奇偶校验误差校正。
代替奇偶校验误差校正或者除了奇偶校验误差校正之外,还可以引入区段绝对拷贝数的其他形式的误差校正。例如,考虑病变基因组中包含突变的基因的紧邻区段的绝对拷贝数的方法,其中优选地如果绝对拷贝数的改变不大于3、2、优选1,并且优选地,如果大多数相邻区段(50%、60%、70%、80%、90%、100%)具有等于模式的绝对拷贝数,则将包含SNV的区段的绝对拷贝数改变为相邻区段的绝对拷贝数模式。
用于绝对拷贝数的不同误差校正方案可以组合。在一个优选实施方案中,应用第一奇偶校验误差校正作为第一层误差校正,在其上可以应用另外的误差校正方法。
如本文所用,区段可以是基因组的预定区域,例如,基于参照基因组预定。区段可以跨越基因,例如,如读数进行比对的参照基因组中所定义的。区段也可以是基因的片段、外显子、外显子的结合、或给定基因内相关外显子的结合。区段还可以是参照基因组中的另一组预定区域(具有或不具有内含子),或基于正常基因组的参照基因组中的另一组预定区域。在一些具体的实施方案中,区段可以是在病变(例如肿瘤)基因组中具有给定的恒定拷贝数和/或给定的等位基因特异性拷贝数的参照基因组的区域,或者替代地,是在病变(例如肿瘤)基因组中具有给定的恒定拷贝数和/或等位基因特异性拷贝数的基因的片段。可以定义区段以包含或排除内含子。
给定基因组(例如,在正常基因组中或在肿瘤基因组中)中区段的拷贝数可以定义为该区段的核苷酸序列出现在基因组中的总频率,而忽略由SNP和/或SNV和/或其他癌症相关变化引起的变异,例如但不限于突变、插入、缺失和/或其他癌症相关遗传变体。优选地,给定基因组中区段的不同拷贝具有相同的长度或几乎相同的长度。
基因组中区段的拷贝数可意指含有基因组的细胞中区段的物理拷贝数。正常基因组中区段的绝对拷贝数可以定义为健康细胞中给定区段的物理拷贝数。病变(例如肿瘤)基因组中区段的绝对拷贝数可以定义为病变(例如肿瘤)细胞中给定区段的物理拷贝数。基因组中区段的拷贝数可以称为所述基因组中区段的绝对拷贝数。拷贝数可意指绝对拷贝数。
在一个具体实施方案中,如果在基因组中区段的仅一部分扩增或缺失,则区段的该部分拷贝可以作为区段的拷贝计数或不作为区段的拷贝计数。在一个优选的实施方案中,可以忽略跨越区段长度的小于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%的区段的拷贝。
参照基因组用于映射读数并提供正常基因组和病变(例如肿瘤)基因组的坐标系,其中坐标系可包括提供染色体数目,染色体中的核苷酸位置以及读数的方向性,其中染色体中的位置由线表示。
参照基因组可以基于来自与提供病变组织样品的对象相同物种的一个或更多个成员的基因组,或者可以基于对象的正常基因组。
病变组织样品(例如肿瘤样品)也可能包含来自正常基因组,特别是取得样品的同一患者的正常基因组的污染物,和/或在肿瘤内异质性的情况下,也包含多于一种肿瘤基因组。纯度、肿瘤样品纯度、肿瘤纯度和样品纯度均视为等同术语,优选地意指肿瘤样品中存在的肿瘤细胞的比例。正常污染物优选地意指肿瘤样品中存在的正常细胞的比例,并且可以通过一减去纯度给出。
由于基因组复制事件,相对于细胞的倍性归一化用于基因拷贝的存在。在一个实施方案中,绝对拷贝数可以相对于基因组的倍性归一化,所述倍性是通过每个区段的长度加权的给定细胞中给定基因组中所有区段的绝对拷贝数的平均值。在一个实施方案中,绝对拷贝数可以相对于包含突变的目的基因(包含突变)的染色体的倍性归一化,所述倍性是通过染色体上的每个区段的长度加权的给定细胞中给定染色体上所有区段的绝对拷贝数的平均值。在一个实施方案中,绝对拷贝数可以相对于包含突变的目的基因的染色体邻近区域的倍性归一化,所述倍性是通过区域中每个区段的长度加权的给定细胞中给定区域中每个区段的平均值。邻近区域可以在具有疾病特异性突变的基因的预定距离内,例如,具有疾病特异性突变的基因的100兆碱基(Mb)、75Mb、50Mb、25Mb、10Mb、5Mb、4Mb、3Mb、2Mb或1Mb以内。区段的拷贝数可以通过本领域已知的方法常规地计算,包括实验或计算机两者。例如,EP专利No.2 198 292B1和EP 2 002 016B1分别公开了用于确定核酸序列的相对拷贝数和拷贝数频率的方法。此外,EP专利申请公开No.2 835 752A和国际专利申请公开No.WO2014/014497和WO 2014/138153也公开了用于确定拷贝数变异的方法。还参见Machado等2013,Copy Number Variation of Fc Gamma Receptor Genes in HIV-Infected andHIV-Tuberculosis Co-Infected Individuals in Sub-Saharan Africa,PLoS,8(11):e78165。其他方法包括使用FACS、FISH或其他基于荧光的方法、光谱核型分析(SKY)和数字PCR。区段也可以是基因。
疾病特异性突变可以是导致新表位表达的任何突变,优选在病变细胞的表面上。特别地,突变可以是插失(indel)或基因融合事件,或者可以是单核苷酸变异(点突变)。优选地,疾病特异性突变是非同义突变,优选在肿瘤或癌细胞中表达的蛋白质的非同义突变。可以使用本领域已知的用于确定疾病特异性突变的任何方法,并且特别地使用下一代测序数据来确定病变细胞的基因组/外显子组与相应的非病变野生型细胞的基因组/外显子组之间的任何变化的方法是优选的。例如,Carter等,2012,Absolute quantification ofsomatic DNAalterations in human cancer,Nature Biotechnology 30:413-421;Cibulskis等,2013,Sensitive detection of somatic point mutations in impure andheterogeneous cancer samples,Nature Biotechnology 31:213-219;以及Li和Li,2014,Ageneral framework for analyzing tumor subclonality using SNP array andDNAsequencing data,Genome Biology 15:473-495公开了不仅用于鉴定疾病特异性突变的方法,还公开了用于确定基因拷贝数、接合性比例以及接合性和接合性比例的亚克隆比例的方法。用于确定拷贝数(例如绝对拷贝数)的另一种方法涉及使用基因组的区段,每个区段含有至少一个杂合单核苷酸多态性(SNP),并且所述区段是平衡的(相等数目的每种形式的杂合SNP)并且具有共同拷贝数(初级拷贝数),其优选地是基因组的所有平衡区段中最常观察到的绝对拷贝数,如在与本申请同日提交的题为“Tumor Modeling Based onPrimary Balanced Heterozygous Segments”的国际PCT专利申请中所公开的,其公开内容通过引用整体并入本文。此外,除了确定绝对拷贝数之外,本申请还可以确定突变等位基因或至少一个拷贝包含突变等位基因之基因的接合性、接合性比例和亚克隆性(subclonality)。此外,其中的方法还对绝对拷贝数进行误差校正,这提高了绝对拷贝数和接合性以及由其导出的参数如亚克隆性、倍性等的准确性。
通常,突变等位基因所映射的核苷酸位点的总拷贝数可意指突变的绝对拷贝数,其可意指SNV的绝对拷贝数,特别是当突变是SNV时。通常,突变的绝对拷贝数可以优选地由突变所映射的区段的绝对拷贝数给出(其中绝对拷贝数在病变(例如肿瘤)基因组中)。
通常,编码新表位的突变等位基因的拷贝数可意指突变的突变等位基因的绝对拷贝数,其可意指SNV的替代等位基因的绝对拷贝数(SNV的接合性),其中SNV的替代等位基因是突变等位基因,特别是当突变是SNV时。
优选地,当突变不是SNV时,可以以与应用于SNV的方法类似的方式估计突变的突变等位基因的绝对拷贝数。
通常,基因的拷贝数可意指区段的绝对拷贝数,其中区段可以是基因,或可以涵盖基因。基因的拷贝数可意指基因的绝对拷贝数。
优选地,疾病可以是其中期望针对病变细胞/组织(例如病毒感染的细胞)的免疫应答的任何疾病。优选地,疾病是癌症。
本发明的方法可以包括确定通过本发明的方法鉴定的合适的新表位作为合适的疾病特异性靶标的可用性/适用性的进一步的步骤,其用于提供针对合适的新表位的免疫应答的方法,例如在癌症疫苗中包含合适的新表位。因此,进一步的步骤可涉及以下一种或更多种:确定合适的新表位的抗原性和/或免疫原性;评估合适的新表位是否在病变细胞表面上表达;包含合适的新表位的肽被作为MHC呈递表位呈递的能力;确定合适的新表位从编码核酸表达的效力;确定所设想的合适的新表位,特别是当存在于其天然序列环境中时,例如当侧翼氨基酸序列也是天然存在的蛋白质中所述新表位侧翼的氨基酸序列时,以及当在抗原呈递细胞中表达时,是否能够刺激T细胞,例如患者的具有期望的特异性的T细胞。
一旦根据其抗原性/免疫原性、表达能力、被作为MHC呈递表位呈递的能力等确定了新表位适合/适用于用作靶标,就可以根据其不从病变细胞中下调或缺失,即病变组织可以逃脱新表位靶向的可能性更低的潜力对鉴定的合适的新表位进行排序,即,优先化。例如,一种优先化从“最佳”新表位开始,其为由必需基因编码的新表位,其中必需基因的所有拷贝都具有编码新表位的突变,然后是一对合成致病或致死基因,其中每个基因的每个拷贝都具有编码新表位的突变,然后是由具有非常高的绝对拷贝数的已知驱动基因编码的新表位,其中该基因的所有拷贝都具有突变,然后是由具有非常高的绝对拷贝数和高接合性的不知道是驱动基因的基因编码的新表位,然后是由具有高拷贝数(接合性)的基因编码的新表位,等。
在一个实施方案中,由接合性比例为1的必需基因编码的新表位优于不由必需基因编码的其他新表位。在一个实施方案中,在接合性比例为1编码新表位的两个必需基因之间,由具有较高绝对拷贝数的基因编码的新表位是优选的。在一个实施方案中,在编码新表位的两个必需基因之间,由在缺失时导致较低适应性的基因编码的新表位是优选的。在一个实施方案中,在编码新表位的基因之间,其中所有基因的接合性比例为1,由具有较高绝对拷贝数的基因编码的新表位是优选的。在其中接合性比例小于1的实施方案中,由具有高接合性的基因编码的新表位优于具有高接合性比例的基因,并且如果接合性相同或相似,则具有高绝对拷贝数的基因优于具有高接合性比例的那些(突变等位基因的10个拷贝/核苷酸位点的20个总拷贝因为更高的接合性而比3/4更好;10/100优于10/20因为前者可能是驱动基因;9/100优于10/20,因为接合性相似,但前者可能是驱动基因)。在一个实施方案中,其中疾病特异性突变负责将细胞转化为癌表型的驱动基因编码的新表位优于其中突变在细胞转化为癌表型中不具有作用的那些。此外,优选的是新表位具有更高而不是更低的克隆比例。
本发明的另一些实施方案涉及确定新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法用于制备药物例如疫苗,例如个体化癌症疫苗的用途。疫苗可以来自通过本发明方法鉴定的一种或更多种合适的新表位或来自合适的新表位的组合。在一个优选的实施方案中,疫苗包含含有通过本发明方法鉴定的一种或更多种合适的新表位或合适的新表位的组合的肽或多肽,或者编码所述肽或多肽的核酸。
特别地,可以提供重组疫苗,其在施用于患者时优选提供MHC呈递表位的集合,其中至少一种是合适的新表位或其中至少两种是通过本发明方法鉴定的新表位的合适的组合,例如2种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、25种或更多种、30种或更多种,并且优选多至60种、多至55种、多至50种、多至45种、多至40种、多至35种或多至30种MHC呈递表位。由患者的细胞,特别是抗原呈递细胞呈递这些表位优选地导致T细胞在与结合时靶向表位,并且因此靶向表达MHC呈递表位衍生自的抗原并且在肿瘤细胞的表面上呈递相同表位的患者肿瘤,优选原发性肿瘤以及肿瘤转移。
本发明的方法还可用于制备重组免疫细胞,所述重组免疫细胞表达靶向合适的新表位或合适的新表位的组合中的一种新表位的抗原受体。优选地,免疫细胞是T细胞,并且抗原受体是T细胞受体。
本发明还涉及用于提供靶向合适的新表位或合适的新表位的组合中的一种表位的重组免疫细胞的方法,所述方法包括用重组抗原受体转染免疫细胞,所述重组抗原受体靶向通过本发明用于确定新表位作为基因特异性靶标的适合性的方法鉴定的合适的新表位或合适的新表位的组合中的一种表位,以及涉及通过这些方法产生的重组免疫细胞。
本发明还提供了用于靶向表达一种或更多种新表位的细胞群或组织的方法。例如,针对一种或更多种新表位的抗体可用于靶向表达通过本文所述方法鉴定的一种或更多种新表位的细胞或组织。在一个实施方案中,本发明提供了用于在哺乳动物中提供对于表达一种或更多种新表位的靶细胞群或靶组织的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用:(a)表达靶向一种或更多种新表位的一种或更多种抗原受体的一种或更多种免疫细胞;(b)施用编码一种或更多种新表位的核酸;或(c)施用包含一种或更多种新表位的肽或多肽,其中所述新表位根据本发明用于确定新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法鉴定。在一个实施方案中,用于在哺乳动物中提供对于表达一种或更多种新表位的靶细胞群或靶组织的免疫应答的方法包括以下步骤:(i)在病变细胞或病变细胞群中确定编码新表位的基因中突变等位基因(疾病特异性突变)的拷贝数;以及(ii)施用(a)表达靶向由疾病特异性突变产生的新表位之抗原受体的免疫细胞;(b)施用编码由疾病特异性突变产生的新表位的核酸;或(c)施用包含由疾病特异性突变产生的新表位的肽或多肽。
在一个实施方案中,用于在哺乳动物中提供对于表达一种或更多种新表位的靶细胞群或靶组织的免疫应答的方法包括以下步骤:(i)在病变细胞或病变细胞群中确定以下基因的拷贝数,其中所述基因的至少一个拷贝具有产生新表位的疾病特异性突变;以及(ii)施用(a)表达靶向由疾病特异性突变产生的新表位的抗原受体的免疫细胞;(b)施用编码由疾病特异性突变产生的新表位的核酸;或(c)施用包含由疾病特异性突变产生的新表位的肽或多肽。在一个实施方案中,用于在哺乳动物中提供对于表达一种或更多种新表位的靶细胞群或靶组织的免疫应答的方法包括以下步骤:(i)在病变细胞或病变细胞群中确定具有产生新表位的疾病特异性突变的基因是否是必需基因;以及(ii)施用(a)表达靶向由疾病特异性突变产生的新表位之抗原受体的免疫细胞;(b)施用编码由疾病特异性突变产生的新表位的核酸;或(c)施用包含由疾病特异性突变产生的新表位的肽或多肽。优选地,必需基因的所有拷贝都具有疾病特异性突变,即,接合性比例为1。
在一个实施方案中,用于在哺乳动物中提供对于表达一种或更多种新表位的靶细胞群或靶组织的免疫应答的方法包括以下步骤:(i)在病变细胞或病变细胞群中确定各自具有产生新表位的疾病特异性突变的至少两种基因的组合是否是合成致死或合成致病基因;以及(ii)施用(a)表达靶向由至少两种基因的疾病特异性突变产生的一种或更多种新表位之一种或更多种抗原受体的一种或更多种免疫细胞,(b)施用编码由至少两种基因的疾病特异性突变产生的一种或更多种新表位的核酸;或(c)施用包含由至少两种基因的疾病特异性突变产生的一种或更多种新表位的肽或多肽。优选地,由至少两种基因的疾病特异性突变产生的所有新表位由施用的免疫细胞靶向,由施用的核酸编码,或包含在施用的肽或多肽内。
此外,可以向具有与由疾病特异性突变产生的新表位表达相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物提供免疫应答,从而治疗或预防所述疾病、障碍或病症。优选地,所述疾病、障碍或病症是癌症。
优选地,免疫细胞是T细胞,并且抗原受体是T细胞受体,免疫应答是T细胞介导的免疫应答。更优选地,免疫应答是抗肿瘤免疫应答,并且表达一种或更多种合适的新表位的靶细胞群或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织。
根据以下详细描述和权利要求,本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图说明
图1a和1b具有表皮生长因子受体基因(EGFR)的高局灶扩增的胶质母细胞瘤样品。图1a:染色体7上EGFR周围局部基因的图示。图1b:具有最高绝对拷贝数的12种单核苷酸变异的列表。
图2通过接合性(Cx)分类的黑素瘤样品的具有疾病特异性突变的一些基因的列表。
图3黑素瘤样品的一些基因的列表,其中所有拷贝都具有疾病特异性突变(接合性比例等于1),其中三个基因是人中的必需基因或推断为人中的必需基因。
图中的缩写:chr_pos染色体位置;CN绝对拷贝数;Cx接合性;EC绝对拷贝数的误差校正;VAF变体等位基因频率;rho估计的含有突变等位基因(SNV)的肿瘤细胞的百分比;FLRT+u突变的置信度得分;位点分类(Site classification)是突变的置信度类别;必需基因,如果发现基因是必需的,则标记为Y。
具体实施方式
尽管下面详细描述了本发明,但是应当理解,本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂,因为这些可以变化。还应当理解,本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,并且不旨在限制本发明的范围,本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
下文中,将描述本发明的要素。这些要素随具体实施方案列出,然而,应当理解,其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。各个描述和优选的实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外,除非上下文另有指明,否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应当被认为通过本申请的说明书公开。例如,如果在一个优选的实施方案中,新表位具有高的接合性而不是高的接合性比例,并且在一个优选的实施方案中,新表位是由必需基因的突变产生的,则在一个优选的实施方案中,合适的新表位具有高的接合性比例并且是必需基因的突变产生的,而在一个更优选的实施方案中,接合性比例等于1。
优选地,本文使用的术语如以下所述定义:Amultilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,和H.编,(1995)Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland。
除非另外指出,否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法,其在本领域的文献中进行了说明(参见,例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,J.Sambrook等编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和所附权利要求书通篇,除非上下文另外要求,否则词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,但是不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,尽管在一些实施方案中可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾,否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应被解释为涵盖一个/种或更多个/种。本文中数值范围的记载仅意在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出,否则每个单独的值均被并入本说明书中,如同其在本文中被单独记载一样。
除非本文中另外指出或另外与上下文明显矛盾,否则本文中描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。例如,通过确定编码基因的拷贝数来确定新表位是否是合适的疾病特异性靶标可以在确定基因是驱动基因或必需基因之前、之后或同时确定,或者可以在确定新表位在细胞表面上表达或诱导令人满意的免疫应答以使其适合于疫苗之前、之后或同时确定。
本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如,“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明,而不对以其他方式要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的语言都不应被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求保护的要素。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中不管是在上文还是下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中没有内容应被解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这些公开内容。
本发明设想通过靶向新表位(“合适的新表位”)来治疗疾病,包括免疫治疗和放射治疗,特别是癌症,所述新表位仅在病变细胞中或在病变细胞上表达并具有由被病变细胞沉默的可能性更低的基因表达的特征,以使得病变细胞逃脱通过靶向新表位的免疫监视的可能性更低。免疫治疗可以通过主动和/或被动免疫治疗方法实现。例如,在一个实施方案中,可以根据本发明使用特异性靶向新表位并与能够杀伤表达新表位的细胞的毒剂偶联的抗体或其他分子来靶向并杀伤该细胞。
本发明特别涉及鉴定这些合适的新表位作为免疫治疗中的疾病特异性靶标。一旦鉴定出合适的新表位,它们可用于疫苗中以诱导针对新表位的免疫应答,特别是通过合适的抗原受体(例如T细胞受体或人工T细胞受体)来诱导和/或激活识别所鉴定的合适的新表位的适当的效应细胞(例如T细胞),特别是当在MHC的情况下呈递时,其导致表达合适的新表位的病变细胞死亡。或者/另外,可以施用通过合适的抗原受体来识别所鉴定的合适的新表位的免疫细胞,这也将导致表达合适的新表位的细胞死亡。
根据本发明的免疫治疗方法包括用以下进行免疫接种:含有合适的新表位的肽或多肽,ii)编码含有合适的新表位的肽或多肽的核酸,iii)编码含有合适的新表位的肽或多肽的重组细胞,iv)编码含有新表位的肽或多肽的重组病毒,和v)用含有新表位的肽或多肽脉冲或用编码所述肽或多肽的核酸转染的抗原呈递细胞。根据本发明的另一些免疫治疗方法包括转移vi)识别新表位的T细胞受体,和vii)编码识别新表位的受体的效应细胞(例如T细胞),特别是当在MHC的情况下呈递时。
在本发明的上下文中,术语“疾病特异性突变”涉及在病变细胞的核酸中存在但是在相应的正常非病变细胞的核酸中不存在的体细胞突变。该疾病可以是癌症,因此,术语“肿瘤特异性突变”或“癌症特异性突变”指存在于肿瘤细胞或癌细胞的核酸中但不存在于对应的正常细胞,即非肿瘤细胞或非癌细胞的核酸中的体细胞突变。术语“肿瘤特异性突变”和“肿瘤突变”与术语“癌症/癌特异性突变”和“癌症/癌突变”在本文中可互换使用。
如本文所用,单核苷酸多态性(SNP)是正常基因组中的位点,其中两个等位基因(母本或父本)中的至少一个具有与正常基因组或相对于例如参照基因组不同的身份。
如本文所用,杂合单核苷酸多态性(杂合SNP)定义为正常基因组中两个等位基因(母本和父本等位基因)具有不同身份的位点。
如本文所用,术语“接合性比例”是指具有疾病特异性突变的基因的拷贝数相对于基因(无论该基因是否具有突变)的总拷贝数的比例。例如,如果基因总共有20个拷贝,并且10个拷贝具有疾病特异性突变,则接合性比例为0.5。如果该基因的所有拷贝都具有疾病特异性突变,则接合性比例为1。接合性比例可以为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或至少0.95。在本发明的上下文中,优选较高的接合性比例而不是较低的接合性比例。在一个实施方案中,编码表位(优选新表位)的突变等位基因的接合性比例是突变等位基因的拷贝数相对于突变等位基因所映射的核苷酸位点(例如在参照基因组中)的总拷贝数的比值。
如本文所用,术语“克隆比例”是指在相同基因中包含相同疾病特异性突变及其遗传特征(如拷贝数和接合性比例)的病变细胞的数目相对于病变细胞(无论病变细胞是否在相同基因中包含相同突变)的总数目的比例。该术语也适用于肿瘤组织,其中克隆比例是肿瘤组织中在相同基因中包含相同疾病特异性突变及其遗传特征(如拷贝数)的病变细胞的数目相对于肿瘤组织中细胞的总数的比例。例如,在从肿瘤获得的样品中,其中只有一半的肿瘤细胞总数在相同基因中具有相同的突变,则克隆比例为0.5。克隆比例可以为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或至少0.95。在本发明的上下文中,优选较高的克隆比例而不是较低的克隆比例。最优选的克隆比例为1,其中所有病变细胞在相同基因中具有相同的疾病特异性突变。“克隆比例”、“克隆性比例”和“亚克隆性比例”在本文中可互换使用。
术语“局灶扩增”是指基因组的一部分的扩增或拷贝数的增加,例如,一起定位在同一染色体上的一个或更多个基因的扩增,其导致对于基因组的该部分,拷贝数大于2,优选大于5、10、15、20、25、50、75、100,条件是基因组的相同部分没有发生缺失事件。因此,出于本发明的目的,在病变细胞中局灶扩增的基因是与野生型拷贝数2或野生型拷贝数1(对于男性X和Y染色体上的那些基因)相比,具有增加的拷贝数的那些基因。局灶扩增不同于全基因组重复和/或扩增事件。
术语“免疫应答”是指对抗原的整体身体应答,并且优选地是指细胞免疫应答或细胞以及体液免疫应答。免疫应答可以是保护性/预防性/预先性和/或治疗性的。
“诱导免疫应答”可意指在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答,但其还可意指在诱导之前存在一定水平的针对特定抗原的免疫应答并且在诱导之后所述免疫应答被增强。因此,“诱导免疫应答”还包括“增强免疫应答”。优选地,在对象中诱导免疫应答之后,所述对象被保护免于发生疾病,例如癌症疾病,或者通过诱导免疫应答,疾病状况得以改善。例如,可在患有癌症疾病的患者中或在处于发生癌症疾病风险之中的对象中诱导针对肿瘤表达抗原的免疫应答。在这种情况下诱导免疫应答可意味着改善对象的疾病状况、对象不发生转移或者处于发生癌症疾病风险之中的对象不发生癌症疾病。
“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“针对抗原的细胞应答”或类似术语意在包括针对细胞的细胞应答,其特征在于用I类或II类MHC呈递抗原。细胞应答涉及被称为T细胞或T淋巴细胞的细胞,其充当“辅助者”或“杀手”。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用,而杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤诸如癌细胞的病变细胞,预防产生更多病变细胞。优选地,刺激针对肿瘤细胞的抗肿瘤CTL应答,所述肿瘤细胞表达一种或更多种肿瘤表达抗原并且优选地用I类MHC呈递这些肿瘤表达抗原。
根据本发明的“抗原”包括为免疫应答的靶标和/或诱导免疫应答,例如与抗体或T淋巴细胞(T细胞)的特异性反应的任何物质,优选肽或蛋白质。优选地,抗原包含至少一个表位,例如T细胞表位。优选地,本发明上下文中的抗原是任选地在加工后诱导免疫反应的分子,所述免疫反应优选是抗原(包括表达抗原的细胞)特异性的。抗原或其T细胞表位优选由细胞呈递,优选由抗原呈递细胞呈递,其包括病变细胞,特别是癌细胞,在MHC分子的情况下,其导致针对抗原(包括表达抗原的细胞)的免疫应答。
优选地,在本发明的上下文中的抗原是任选地在加工后诱导免疫反应的分子,所述免疫反应优选是抗原特异性的。根据本发明,可以使用作为免疫反应的候选者的任何合适的抗原,其中所述免疫反应可以是体液免疫反应以及细胞免疫反应两者。在本发明的上下文中,抗原优选地在MHC分子的情况下由细胞,优选由抗原呈递细胞呈递,这导致针对该抗原的免疫反应。抗原优选地是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可以包括或可以来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生物以及其他感染原和病原体,或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明,抗原可以对应于天然存在的产物,例如病毒蛋白或其部分。在一些优选的实施方案中,抗原是表面多肽,即天然展示在细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生物、变应原或肿瘤的表面上的多肽。抗原可以引发针对细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生物、变应原或肿瘤的免疫应答。
术语“疾病相关抗原”或“疾病特异性抗原”以其最广泛的含义使用,是指与疾病相关或是疾病特异性的任何抗原。这样的抗原是含有表位的分子,所述表位将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。因此,疾病相关抗原可用于治疗目的。疾病相关抗原优选与微生物(通常是微生物抗原)感染或与癌症(通常是肿瘤)相关。
术语“病原体”是指能够在生物体,优选脊椎动物生物体中引起疾病的致病性生物材料。病原体包括微生物,例如细菌、单细胞真核生物(原生动物)、真菌、以及病毒。
在本发明的上下文中,术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”指以下蛋白质,其在正常条件下在有限量的组织和/或器官中或在特定发育阶段特异性表达,例如肿瘤抗原可在正常条件下在胃组织中(优选地在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如在睾丸中)、在滋养层组织中(例如在胎盘中)、或在种系细胞中特异性表达;并且在一个或更多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在该情况下,“有限量”优选地意指不超过3,更优选不超过2。在本发明上下文中的肿瘤抗原包括例如分化抗原,优选细胞类型特异性分化抗原,即在正常条件下在特定分化阶段在特定细胞类型中特异性表达的蛋白质;癌症/睾丸抗原,即在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质;以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中,肿瘤抗原优选与癌细胞的细胞表面缔合,并且优选地在正常组织中不表达或仅很少表达。优选地,肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中,对象例如患有癌症疾病的患者中由癌细胞表达的肿瘤抗原优选地是所述对象中的自身蛋白。在一些优选实施方案中,在本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需组织或器官(即当被免疫系统损害时不导致对象死亡的组织或器官)中或者在免疫系统不可及或仅很难可及的身体器官或结构中特异性表达。优选地,肿瘤抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的肿瘤抗原和在癌组织中表达的肿瘤抗原之间是相同的。
根据本发明,术语“肿瘤抗原”、“肿瘤表达抗原”、“癌症抗原”和“癌症表达抗原”是等同的并且在本文中可互换使用。
术语“表位”、“抗原肽”、“抗原表位”、“免疫原性肽”和“MHC结合肽”在本文中可互换使用,并且指分子(例如抗原)中的抗原决定簇,即,被免疫系统识别,例如被T细胞识别(特别是当在MHC分子的情况下呈递时)的免疫活性化合物的一部分或片段。蛋白质的表位优选包含所述蛋白质的连续或不连续部分,并且优选地长度为5至100,优选5至50,更优选8至30,最优选10至25个氨基酸,例如,表位的长度可以优选地为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。根据本发明,表位可以结合MHC分子,例如细胞表面上的MHC分子,因此可以是“MHC结合肽”或“抗原肽”。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子,并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞和抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的,其中MHC蛋白质或分子与肽结合并呈递它们以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达,并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)两者展示给T细胞。优选的这样的免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。如本文所用,如果使用本领域已知的任何测定可检测这种结合,则称免疫原性部分与MHC I类或II类分子“结合”。术语“MHC结合肽”涉及与MHC I类和/或MHC II类分子结合的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下,结合肽通常长8-10个氨基酸,但是更长或更短的肽也可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下,结合肽通常长10-25个氨基酸,特别是13-18个氨基酸长,然而更长和更短的肽也可能是有效的。
如本文所用,术语“新表位”是指不存在于参照例如正常非癌细胞或种系细胞中但存在于病变细胞(例如癌细胞)中的表位。这尤其包括这样的情况:其中正常的非癌细胞或种系细胞中发现相应的表位,然而,由于癌细胞中的一个或更多个突变,表位的序列被改变以产生新表位。此外,新表位不仅可以是病变细胞特异性的,而且可以是患有疾病的患者特异性的。由于通过本发明的方法鉴定的新表位和合适的新表位是表位的亚组,因此本文中关于通常作为免疫靶标的表位的公开内容同样适用于新表位和合适的新表位。
在本发明的一个特别优选的实施方案中,表位或新表位是T细胞表位。如本文所用,术语“T细胞表位”是指以T细胞受体识别的构型与MHC分子结合的肽。通常,T细胞表位存在于抗原呈递细胞的表面上。
如本文所用,术语“预测免疫原性氨基酸修饰”是指预测包含这样的氨基酸修饰的肽是否将具有免疫原性并因此可用作疫苗接种中的表位,特别是T细胞表位。
根据本发明,T细胞表位可以作为较大实体(例如包含多于一个T细胞表位的疫苗序列和/或多肽)的一部分存在于疫苗中。所呈递的肽或T细胞表位在适当加工后产生。
T细胞表位可以在对于TCR识别或对于与MHC结合非必需的一个或更多个残基处进行修饰。这种经修饰的T细胞表位可以被认为是免疫学上等同的。
优选地,当被MHC呈递并被T细胞受体识别时,T细胞表位能够在适当的共刺激信号的存在下诱导携带特异性识别肽/MHC复合物的T细胞受体的T细胞的克隆扩增。
优选地,T细胞表位包含基本上对应于抗原片段的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地,所述抗原片段是MHC I类和/或II类呈递的肽。
根据本发明的T细胞表位优选涉及能够刺激针对抗原或细胞的免疫应答(优选细胞应答)的抗原的一部分或片段,所述细胞的特征在于表达抗原,并且优选地呈递抗原,例如病变细胞,特别是癌细胞。优选地,T细胞表位能够刺激针对以I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答,并且优选地能够刺激抗原反应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在一些实施方案中,抗原是自身抗原,特别是肿瘤抗原。肿瘤抗原及其测定是本领域技术人员已知的。
术语“免疫原性”指诱导优选地与治疗性治疗,例如针对癌症的治疗相关的免疫应答的相对功效。本文中使用的术语“免疫原性的”指具有免疫原性的特性。例如,当在肽、多肽或蛋白质的情况下使用时,术语“免疫原性修饰”指所述肽、多肽或蛋白质诱导由所述修饰引起和/或针对所述修饰的免疫应答的功效。优选地,未经修饰的肽、多肽或蛋白质不诱导免疫应答、诱导不同的免疫应答或诱导不同水平,优选较低水平的免疫应答。
根据本发明,术语“免疫原性”或“免疫原性的”优选地指诱导生物学相关免疫应答,特别是可用于疫苗接种的免疫应答的相对功效。因此,在一个优选实施方案中,如果氨基酸修饰或经修饰肽在对象中诱导针对靶修饰的免疫应答,则其是免疫原性的,所述免疫应答可对治疗或预防目的具有益处。
“抗原加工”或“加工”是指多肽或抗原降解为加工产物,所述加工产物为所述多肽或抗原的片段(例如,多肽降解为肽),以及将这些片段中的一个或更多个与MHC分子缔合(例如,通过结合)用于由细胞(优选抗原呈递细胞)呈递给特异性T细胞。
“抗原呈递细胞”(antigen presenting cell,APC)是呈递与其细胞表面上的MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可活化抗原特异性T细胞。
专职抗原呈递细胞在通过吞噬或通过受体介导的胞吞内化抗原并随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常有效。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与之相互作用。然后,抗原呈递细胞产生另外的共刺激信号,从而导致活化T细胞。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的限定特征。
专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞,其具有最宽范围的抗原呈递,并且可能是最重要的抗原呈递细胞;巨噬细胞;B细胞以及某些活化的上皮细胞。
树突细胞(DC)是通过MHC II类和I类两种抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递于T细胞的白细胞群体。众所周知的是,树突细胞是免疫应答的有效诱导剂,并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞常规被分类为“未成熟细胞”和“成熟细胞”,其可用作区分两种充分表征的表型的简单方式。然而,这种命名不应解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟树突细胞表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞,这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常以这些标志物的较低表达但是导致T细胞活化的细胞表面分子的高表达为特征,所述细胞表面分子例如I类和II类MHC、黏附分子(例如,CD54和CD11)和共刺激分子(例如,CD40、CD80、CD86和4-1BB)。
树突细胞成熟指这样的抗原呈递树突细胞导致T细胞致敏的树突细胞活化状态,而通过未成熟树突细胞的呈递导致耐受。树突细胞成熟主要由以下引起:具有被先天受体检测的微生物特征的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、树突细胞表面上的CD40被CD40L连接以及从正经受应激细胞死亡的细胞中释放的物质。树突细胞可以通过在体外用细胞因子培养骨髓细胞来获得,所述细胞因子例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α。
非专职抗原呈递细胞不组成型地表达与天然T细胞相互作用所需的MHC II类蛋白;这些仅在非专职抗原呈递细胞被某些细胞因子(例如IFNγ)刺激之后表达。
通过用编码包含待呈递肽的肽或多肽的核酸(优选RNA)(例如编码抗原的核酸)转导细胞,可以使“抗原呈递细胞”加载MHC I类呈递的肽。
在一些实施方案中,可以将包含靶向树突细胞或其他抗原呈递细胞的基因递送载体的本发明药物组合物施用于患者,从而导致体内发生的转染。例如,树突细胞的体内转染通常可以使用本领域已知的任何方法进行,例如WO 97/24447中描述的那些,或Mahvi等,Immunology and cell Biology 75:456-460,1997中描述的基因枪法。
术语“抗原呈递细胞”还包括靶细胞。
““靶细胞”应意指为免疫应答(例如细胞免疫应答)靶标的细胞。靶细胞包括呈递抗原或抗原表位(即来源于抗原的肽片段)的细胞,并且包括任何不期望的细胞,例如癌细胞。在一些优选的实施方案中,靶细胞是表达本文中所述的抗原并且优选地用I类MHC呈递所述抗原的细胞。
术语“段(portion)”指片段。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构,术语其“段”可指所述结构的连续或不连续片段。优选地,氨基酸序列的一段包含所述氨基酸序列的至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、优选至少40%、优选至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、甚至更优选至少80%并且最优选至少90%的氨基酸。优选地,如果该段是不连续片段,则所述不连续片段由结构的2、3、4、5、6、7、8个或更多个部分构成,每个部分为该结构的连续元件。例如,氨基酸序列的不连续片段可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8个或更多个,优选不超过4个部分构成,其中每个部分优选地包含该氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、优选至少20个连续氨基酸、优选至少30个连续氨基酸。
术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用,并且指连续元件。例如,例如氨基酸序列或蛋白质的结构的一部分指所述结构的连续元件。结构的段、部分或片段优选地包含所述结构的一种或更多种功能特性。例如,表位、肽或蛋白质的段、部分或片段优选地与其所来源于的表位、肽或蛋白质免疫学上等同。在本发明的上下文中,例如氨基酸序列的结构的“部分”优选地包含整体结构或氨基酸序列的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%,优选地由其组成。
在本发明的上下文中,术语“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应物功能的细胞。“免疫反应性细胞”优选能够结合抗原或以呈递抗原或衍生自抗原的抗原肽为特征的细胞,并且介导免疫应答。例如,这样的细胞分泌细胞因子和/或趋化因子,分泌抗体,识别癌细胞,并任选地消除这些细胞。例如,免疫反应性细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地,在本发明的上下文中,“免疫反应性细胞”是T细胞,优选CD4+和/或CD8+T细胞。
优选地,“免疫反应性细胞”以一定程度的特异性识别抗原或衍生自抗原的抗原肽,特别是如果在MHC分子的情况下呈递时,例如在抗原呈递细胞或病变细胞如癌细胞的表面上。优选地,所述识别使识别抗原或衍生自所述抗原的抗原肽的细胞响应或反应。如果细胞是具有在MHC II类分子的情况下识别抗原或衍生自抗原的抗原肽之受体的辅助T细胞(CD4+T细胞),则这种响应性或反应性可能涉及细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的活化。如果细胞是CTL,则这种响应或反应性可能涉及消除在MHC I类分子的情况下呈递的细胞,即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞,例如,通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解。CTL响应可包括持续的钙通量,细胞分裂,细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生,活化标志物如CD44和CD69的上调,以及表达抗原的靶细胞的特异性溶细胞性杀伤。还可以使用准确指示CTL响应性的人工报告物来确定CTL响应性。识别抗原或衍生自抗原的抗原肽并且具有响应或反应性的这种CTL在本文中也称为“抗原响应CTL”。如果细胞是B细胞,这种响应可能涉及免疫球蛋白的释放。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL,CD8+T细胞)。
T细胞属于已知为淋巴细胞的白细胞组,并且在细胞介导的免疫中起关键作用。其与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)的区别之处可在于在其细胞表面上存在称为T细胞受体(TCR)的特殊受体。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已发现T细胞的数个不同亚群,其各自均具有独特的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞,除其他功能之外还包括使B细胞成熟为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。这些细胞由于其在其表面上表达CD4蛋白而还被称为CD4+T细胞。辅助T细胞当抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子向其呈递肽抗原时变得活化。一旦活化,其迅速分裂并分泌在活性免疫应答中起调节或辅助作用的称为细胞因子的小蛋白。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞,并且还参与移植物排斥。这些细胞由于其在其表面上表达CD8糖蛋白而还被称为CD8+T细胞。这些细胞通过结合与MHC I类缔合的抗原来识别其靶标,MHC I类存在于身体的几乎每个细胞的表面上。
大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合体存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成,这些肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生,并且称为α-和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表在其表面上具有独特T细胞受体(TCR)的一小部分T细胞。然而,在γδT细胞中,TCR由一条γ链和一条δ链构成。与αβT细胞相比,该T细胞组群较不常见(总T细胞的2%)。
根据本发明,术语“抗原受体”包括天然存在的受体,例如T细胞受体以及经改造受体,其向免疫效应细胞例如T细胞赋予任意特异性例如单克隆抗体的特异性。以这种方式,可以产生大量抗原特异性T细胞以用于过继细胞转移。因此,根据本发明的抗原受体可以存在于T细胞上,例如,作为T细胞自身的T细胞受体的替代或补充。这样的T细胞不一定需要对抗原进行加工和呈递以识别靶细胞,而是可以优选地特异性地识别靶细胞上存在的任何抗原。优选地,所述抗原受体在细胞表面上表达。出于本发明的目的,包含抗原受体的T细胞包括在本文中使用的术语“T细胞”中。特别地,根据本发明,术语“抗原受体”包括包含以下单分子或分子复合物的人工受体,其识别(即结合)靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(例如,通过使抗原结合位点或抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合),并且可以向在细胞表面上表达所述抗原受体的免疫效应细胞例如T细胞赋予特异性。优选地,抗原受体对靶结构的识别导致表达所述抗原受体的免疫效应细胞的活化。抗原受体可包含一个或更多个蛋白质单元,所述蛋白质单元包含一个或更多个如本文所述的结构域。根据本发明,“抗原受体”也可以是“嵌合抗原受体(CAR)”、“嵌合T细胞受体”或“人工T细胞受体”。
抗原可以通过任何能够形成抗原结合位点的抗原识别结构域(本文中也简称为“结构域”)例如通过可以存在于同一或不同肽链上的抗体和T细胞受体的抗原结合部分被抗原受体识别。在一个实施方案中,形成抗原结合位点的两个结构域来源于免疫球蛋白。在一个实施方案中,形成抗原结合位点的两个结构域来源于T细胞受体。特别优选的是抗体可变结构域,例如来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv);和T细胞受体可变结构域,特别是TCRα和β单链。事实上,几乎任何以高亲和力结合给定靶标的物质都可以用作抗原识别结构域。
通过T细胞受体与由另一细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的短肽的结合来提供T细胞活化中的第一信号。这确保仅活化具有针对该肽的特异性的TCR的T细胞。伴侣细胞通常是专职抗原呈递细胞(APC),在稚应答(response)的情况下通常是树突细胞,但是B细胞和巨噬细胞可以是重要的APC。由MHC I类分子呈递给CD8+T细胞的肽通常长度为8-10个氨基酸;由MHC II类分子呈递给CD4+T细胞的肽通常更长,因为MHC II类分子的结合裂缝的末端是开放的。
根据本发明,如果分子对预定靶标具有显著亲和力并且在标准测定中与所述预定靶标结合,则其能够与所述靶标结合。通常通过平衡解离常数(KD)测量“亲和力”或“结合亲和力”。如果分子对靶标不具有显著亲和力并且在标准测定中不与所述靶标显著结合,则其(基本上)不能够与所述靶标结合。
细胞毒性T淋巴细胞可通过在体内向抗原呈递细胞中并入抗原或抗原肽来体内产生。抗原或抗原肽可作为蛋白质、作为DNA(例如在载体内)或作为RNA表示。抗原可被加工以产生MHC分子的肽配偶体,而其片段则无需进行进一步加工即可呈递。如果这些可以与MHC分子结合,则后者尤其如此。一般来说,可通过皮内注射来向患者施用。然而,注射也可以在节内进行进入淋巴结中(Maloy等,2001,Proc Natl Acad Sci USA98:3299-303)。产生的细胞呈递目的复合物并被自体细胞毒性T淋巴细胞识别,其随后增殖。
CD4+或CD8+T细胞的特异性活化可以以多种方式来检测。用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如,淋巴因子)的产生或细胞裂解活性的产生。对于CD4+T细胞,用于检测特异性T细胞活化的一种优选方法是检测T细胞增殖。对于CD8+T细胞,用于检测特异性T细胞活化的一种优选方法是检测细胞裂解活性的产生。
“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或类似表达意指这样的细胞,例如病变细胞如癌细胞,或抗原呈递细胞,其在MHC分子,特别是MHC I类分子的情况下呈递其表达的抗原或衍生自所述抗原的片段(例如通过处理抗原)。类似地,术语“以呈递抗原为特征的疾病”表示涉及以呈递抗原(特别是用I类MHC)为特征的细胞的疾病。细胞呈递抗原可以通过用核酸(例如编码抗原的RNA)转染细胞来实现。
“呈递的抗原片段”或类似表达意指该片段可以被MHC I类或II类,优选MHC I类呈递,例如当直接添加到抗原呈递细胞时。在一个实施方案中,片段是由表达抗原的细胞天然呈递的片段。
术语“免疫学上等同的”意指免疫学上等同分子(例如免疫学上等同氨基酸序列)表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用,例如对于免疫学作用的类型,例如诱导体液和/或细胞免疫应答、所诱导免疫反应的强度和/或持续时间、或者所诱导免疫反应的特异性。在本发明的上下文中,术语“免疫学上等同的”优选地针对用于免疫接种的肽的免疫学作用或特性使用。例如,如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参照氨基酸序列反应的特异性的免疫反应,则所述氨基酸序列与该参照氨基酸序列免疫学上等同。
在本发明的上下文中,术语“免疫效应物功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能,其导致例如杀伤肿瘤细胞,或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展,包括抑制肿瘤传播和转移。优选地,在本发明的上下文中的免疫效应物功能是T细胞介导的效应物功能。这样的功能包括:在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下,在MHC II类分子的情况下由T细胞受体识别抗原或者衍生自抗原的抗原肽,释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞,以及在CTL的情况下,在MHC I类分子情况下由T细胞受体识别抗原或衍生自抗原的抗原肽,消除在MHC I类分子的情况下呈递的细胞(即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞)(例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解),产生细胞因子如IFN-γ和TNF-α,和特异性溶细胞性杀伤表达靶细胞的抗原。
术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子,并且涉及在所有脊椎动物中出现的基因复合物。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的,其中MHC蛋白质或分子结合肽并呈递它们以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达,并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)呈现给T细胞。
MHC区域分为三个亚组,I类、II类和III类。MHC I类蛋白包含α链和β2-微球蛋白(不是15号染色体编码的MHC的一部分)。它们将抗原片段呈递给细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上,特别是在抗原呈递细胞上,MHC II类蛋白含有α-链和β-链,它们将抗原片段呈递给T辅助细胞。MHC III类区域编码其他免疫组分,例如补体成分和编码细胞因子的组分。
MHC是多基因的(有多个MHC I类和MHC II类基因)和多态性(每个基因有多个等位基因)。
如本文所用,术语“单倍型”是指在一条染色体上发现的HLA等位基因和由其编码的蛋白质。单倍型也可以指存在于MHC内任何一个基因座上的等位基因。每类MHC由多个基因座表示:例如,I类的HLA-A(人白细胞抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P和HLA-V,以及II类的HLA-DRA、HLA-DRB1-9、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB。术语“HLA等位基因”和“MHC等位基因”在本文中可互换使用。
MHC表现出极端的多态性。在人群中,在每个遗传基因座处,存在包含不同等位基因的大量单倍型。I类和II类两者的不同多态性MHC等位基因具有不同的肽特异性,其中每个等位基因编码结合呈现特定序列模式的肽的蛋白质。
在本发明的上下文中,MHC分子优选是HLA分子。
在本发明的上下文中,术语“MHC结合肽”包括MHC I类和/或II类结合肽,或者可以被加工以产生MHC I类和/或II类结合肽的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下,结合肽通常为8-12,优选8-10个氨基酸长,但是更长或更短的肽也可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下,结合肽通常为9-30,优选10-25个氨基酸长,特别是13-18个氨基酸长,但是更长和更短的肽也可能是有效的。
“抗原肽”优选涉及能够刺激针对抗原或细胞的免疫应答、优选细胞应答的抗原的部分或片段,所述细胞的特征在于表达抗原,并且优选地呈递抗原,例如病变细胞,特别是癌细胞。优选地,抗原肽能够刺激针对细胞的细胞应答,所述细胞的特征在于用I类MHC呈递抗原,并且优选能够刺激抗原反应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。优选地,抗原肽是MHC I类和/或II类呈递的肽,或者可以被加工以产生MHC I类和/或II类呈递的肽。优选地,抗原肽包含基本上对应于抗原片段的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地,所述抗原片段是MHC I类和/或II类呈递的肽。优选地,抗原肽包含基本上对应于这种片段的氨基酸序列的氨基酸序列,并且被加工以产生这样的片段,即MHC I类和/或II类呈递的衍生自抗原的肽。
如果要直接呈递肽,即不进行加工,特别地不进行切割,则其具有适合结合MHC分子,特别是I类MHC分子的长度,并且优选长度为7-20个氨基酸,更优选长度为7-12个氨基酸,更优选长度为8-11个氨基酸,特别是长度为9或10个氨基酸。
如果肽是包含另外序列的较大实体(例如疫苗序列或多肽)的一部分,并且要在加工之后,特别是切割之后呈递,则通过加工产生的肽具有适合与MHC分子,特别是I类MHC分子结合的长度,并且优选长度为7-20个氨基酸,更优选长度为7-12个氨基酸,更优选长度为8-11个氨基酸,特别是长度为9或10个氨基酸。优选地,在加工后呈递的肽序列衍生自抗原的氨基酸序列,即其序列与抗原片段基本上对应并且优选完全相同。因此,MHC结合肽包含与抗原片段基本上对应并且优选完全相同的序列。
具有基本上对应于由I类MHC呈递的肽序列的氨基酸序列的肽可以在对于I类MHC呈递的肽的TCR识别或者对于肽与MHC的结合不是必需的一个或更多个残基处不同。这种基本上对应的肽也能够刺激抗原响应性CTL,并且可以认为是免疫学上等同的。在不影响TCR识别但提高与MHC结合的稳定性的残基处具有与呈递的肽不同的氨基酸序列的肽可以改善抗原肽的免疫原性,并且在本文中可称为“优化肽”。使用关于这些残基中的哪些可更有可能影响与MHC或TCR的结合的现有知识,可以采用设计基本上对应的肽的合理方法。产生的功能性肽被认为是抗原肽。
当由MHC呈递时,抗原肽应该是T细胞受体可识别的。优选地,如果被T细胞受体识别,抗原肽能够在适当的共刺激信号存在下诱导携带特异性地识别抗原肽的T细胞受体的T细胞的克隆扩增。优选地,抗原肽(特别是如果在MHC分子的情况下呈递时)能够刺激针对它们衍生自的抗原或者以表达抗原为特征并且优选地以呈递抗原为特征的细胞的免疫应答,优选细胞应答。优选地,抗原肽能够刺激针对以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答,并且优选地能够刺激抗原应答性CTL。这种细胞优选是靶细胞。
术语“基因组”涉及生物体或细胞的染色体中的遗传信息的总量。
术语“外显子组”指生物体的基因组中由外显子形成的部分,其是所表达基因的编码部分。外显子组提供用于合成蛋白质及其他功能性基因产物的遗传蓝图。其是基因组中功能最相关的部分,因此,其最有可能促成生物体的表型。人基因组的外显子组估计占总基因组的1.5%(Ng等,2008,PLoS Gen.,4(8):1-15)。
术语“转录物组”指一个细胞或细胞群中产生的所有RNA分子,包括mRNA、rRNA、tRNA以及其他非编码RNA的集合。在本发明的上下文中,转录物组或RNAseq意指给定个体的一个细胞、细胞群(优选癌细胞群)或所有细胞在给定时间点产生的所有RNA分子的集合。
“核酸”优选地是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、更优选RNA、最优选体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA,IVT RNA)或合成的RNA。核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的分子和化学合成的分子。核酸可以作为单链或双链且线性或共价环状闭合的分子存在。核酸可以被分离。术语“分离的核酸”意指核酸(i)在体外扩增,例如通过聚合酶链式反应(PCR)体外扩增;(ii)通过克隆重组产生;(iii)是纯化的,例如通过切割并通过凝胶电泳分离而纯化的;或(iv)是合成的,例如通过化学合成而合成的。核酸可用于引入细胞中,即转染细胞,特别是以RNA的形式,其可通过体外转录由DNA模板制备。此外,可在应用之前通过稳定化序列、加帽和聚腺苷酸化对RNA进行修饰。
术语“遗传物质”指分离的核酸(DNA或RNA)、双螺旋的部分、染色体的部分、或者生物体或细胞的整个基因组,特别是其外显子组或转录物组。
术语“突变”是指与参照,并且优选与匹配的正常基因组相比,病变基因组中核酸序列的变化或差异(核苷酸替换、添加或缺失)。“体细胞突变”可以发生在生殖细胞(精子和卵子)以外的任何身体细胞中,因此不会传递给孩子。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病。优选地,突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物的氨基酸变化(例如氨基酸替换)的突变,优选核苷酸替换,其优选导致新表位的形成。
术语“单核苷酸变体/变异”(SNV)是指当将来自病变细胞(例如肿瘤细胞)的基因组与优选匹配的(相应)正常非病变细胞的基因组或参照基因组进行比较时,特定位点(等位基因)处的核酸序列的差异。如本文所用,术语突变优选涵盖SNV。
病变(肿瘤)基因组中的拷贝数变异(CNV)事件是仅在病变细胞中发生的体细胞拷贝数变异事件,并且定义为病变(肿瘤)基因组的区域的母本和/或父本等位基因的拷贝数相对于匹配的正常基因组的变化,其中替换优选地影响跨越约1kb或更长的基因组区域。
术语“突变”包括点突变、插失、融合、染色体碎裂(chromothripsis)和RNA编辑。
术语“插失”描述了一种特殊的突变类型,定义为导致共定位的插入和缺失以及核苷酸的净增加或损失的突变。在基因组的编码区中,除非插失的长度是3的倍数,否则其产生移码突变。插失可以与点突变形成对比;其中插失从序列中插入和缺失核苷酸,点突变是代替一个核苷酸的替换形式。
融合可产生由两个先前分离的基因形成的杂合基因。其可由于易位、中间缺失或染色体倒位而发生。通常,融合基因是癌基因。致癌性融合基因可导致具有新功能或不同于两个融合配偶体功能的基因产物。或者,原癌基因与强启动子融合,并且由此致癌功能被设定为通过由上游融合配偶体的强启动子引起的上调而起作用。致癌性融合转录物还可通过反式剪接或通读事件产生。
,术语“染色体碎裂”指通过单个灾难性事件(devastating event)基因组的特定区域被破碎并随后拼接在一起的遗传现象
根据本发明,术语“RNA编辑”指其中通过碱基组成的化学改变来改变RNA分子中的信息内容的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰,例如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基,以及非模板的核苷酸添加和插入。mRNA中的RNA编辑有效地改变所编码蛋白质的氨基酸序列,以使得其与由基因组DNA序列预测的不同。
术语“癌症突变标志”指与非癌性参照细胞相比时存在于癌细胞中的突变组。
在本发明的上下文中的“参照”可用于关联和比较从肿瘤试样获得的结果。通常来说,“参照”可基于从患者或者一个或更多个不同个体,优选健康个体,特别是同一物种的个体获得的一个或更多个正常试样,特别是未受癌症疾病影响的试样来获得。“参照”可凭经验通过测试足够大量的正常试样来确定。
术语“参照基因组”是指提供正常基因组和病变基因组的坐标系的基因组。参照基因组用于映射读数并提供正常基因组和肿瘤基因组的坐标系,其中该坐标系允许提供染色体数目,染色体中的核苷酸位置以及读数的方向性。参照基因组可以基于来自与提供病变样品的对象相同物种的一个或更多个成员的基因组,或者可以基于对象的正常基因组(匹配的基因组)。
可以在本发明的上下文中使用任何合适的测序方法来鉴定疾病特异性突变,优选下一代测序(NGS)技术,并且任选地与SNP阵列组合以获得绝对拷贝数信息。第三代测序方法在未来可能替代NGS技术以加速方法的测序步骤。为了说明目的,术语“下一代测序”或“NGS”在本发明的上下文中意指全部的新高通量测序技术,其与称为Sanger化学的“常规”测序方法形成对比,通过将整个基因组断裂成小碎片来沿着整个基因组平行地随机阅读核酸模板。这样的NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间段内,例如在1至2周内,优选地在1至7天内或者最优选地在不到24小时内递送整个基因组、外显子组、转录物组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息并且在原理上实现单细胞测序方法。在本发明的上下文中可使用可商购获得或文献中提及的多种NGS平台,例如Zhang等2011:The impact of next-generation sequencing ongenomics.J.Genet Genomics 38(3):95-109中;或者Voelkerding等2009:Nextgeneration sequencing:From basic research to diagnostics.Clinical chemistry55:641-658中详细描述的那些。这样的NGS技术/平台的非限制性实例为:
1)在例如Roche联合公司454Life Sciences(Branford,Connecticut)的GS-FLX454Genome SequencerTM中实施的称为焦磷酸测序的边合成边测序技术,其首先在Ronaghi等1998:A sequencing method based on real-time pyrophosphate".Science 281,363-365中进行了描述。这项技术使用乳剂PCR,其中通过剧烈涡旋将单链DNA结合珠包封在由油包围的包含PCR反应物的水性胶束中,以用于进行乳剂PCR扩增。在焦磷酸测序过程期间,随着聚合酶合成DNA链,记录在核苷酸并入期间从磷酸分子发射的光。
2)由Solexa(现在为Illumina Inc.,San Diego,California的一部分)开发的边合成边测序方法,其基于可逆染料-终止剂并且例如在Illumina/Solexa GenomeAnalyzerTM中和在Illumina HiSeq 2000Genome AnalyzerTM中实施。在这项技术中,将全部四种核苷酸与DNA聚合酶一起同时添加到流式细胞通道中的寡聚物引发的簇片段中。桥接扩增用所有四种荧光标记的核苷酸延伸簇链用于测序。
3)在例如Applied Biosystems(现在为Life Technologies Corporation,Carlsbad,California)的SOLidTM平台中实施的边连接边测序方法。在这项技术中,根据测序位置标记固定长度的所有可能寡核苷酸的库。使寡核苷酸退火并连接;DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生提供在该位置处核苷酸的信息的信号。在测序之前,通过乳剂PCR扩增DNA。将各自均仅包含相同DNA分子的拷贝的所得珠沉积在载玻片上。作为第二个实例,Dover Systems(Salem,New Hampshire)的PolonatorTM G.007平台还采用通过使用随机排列的基于珠的乳剂PCR来扩增DNA片段用于平行测序的边连接边测序方法。
4)例如如在Pacific Biosciences(Menlo Park,California)的PacBio RS系统或在Helicos Biosciences(Cambridge,Massachusetts)的HeliScopeTM平台中实施的单分子测序技术。这项技术的独特特征是其不经扩增对单DNA或RNA分子进行测序的能力,限定为单分子实时(Single-Molecule Real Time,SMRT)DNA测序。例如,HeliScope使用高灵敏荧光检测系统来直接随着每个核苷酸合成对其进行检测。Visigen Biotechnology(Houston,Texas)已经开发了基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的类似方法。其他基于荧光的单分子技术来自U.S.Genomics(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)。
5)用于单分子测序的纳米技术,其中使用例如布置在芯片上以监测在复制期间聚合酶分子在单链上的移动的多种纳米结构。基于纳米技术的方法的非限制性实例是OxfordNanopore Technologies(Oxford,UK)的GridONTM平台、由Nabsys(Providence,RhodeIsland)开发的杂交辅助纳米孔测序(HANSTM)平台、以及称为组合探针-锚连接(cPALTM)的具有DNA纳米球(DNAnanoball,DNB)技术的基于专有连接酶的DNA测序平台。
6)用于单分子测序的基于电子显微术的技术,例如由LightSpeed Genomics(Sunnyvale,California)和Halcyon Molecular(Redwood City,California)开发的那些。
7)基于检测在DNA聚合期间释放的氢离子的离子半导体测序。例如,离子激流系统(Ion Torrent System)(San Francisco,California)使用微加工孔的高密度阵列以大规模并行方式进行这一生物化学过程。每个孔容纳不同的DNA模板。在孔之下是离子灵敏层并且在其之下是专有离子传感器。
在一个实施方案中,是否发生疾病特异性突变可以通过涉及以下的方法来确定:确定正常基因组中的位点符合通过正常等位基因和三个噪音等位基因所反映的纯合基因型和理想的噪音分布,并且当肿瘤基因组中的相应位点不符合纯合基因型和理想的噪音分布时,宣称突变,其中如果读数以每个碱基三分之一的错误率的概率映射到每个噪音等位基因,则读数符合理想的噪音分布,如在与本申请同日提交的题为“Highly AccurateMutation Detection,In Particular for Personalized Therapeutics”的国际PCT专利申请中公开的,其公开内容通过引用整体并入本文。
优选地,DNA和RNA制备物充当NGS的起始物质。这样的核酸可容易地从例如生物材料的样品,例如从新鲜的、迅速冷冻的或福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织(FFPE)或者从新鲜分离的细胞或者从患者外周血中存在的CTC获得。可从正常的体细胞组织提取正常的未突变基因组DNA或RNA,然而在本发明的上下文中,种系细胞是优选的。种系DNA或RNA从患有非血液学恶性肿瘤的患者中的外周血单个核细胞(PBMC)提取。虽然从FFPE组织或新鲜分离的单细胞提取的核酸是高度片段化的,但是其适合NGS应用。
用于外显子组测序的数种靶向NGS方法在文献中进行了描述(有关综述,参见例如Teer和Mullikin 2010:Human Mol Genet 19(2),R145-51),其所有均可与本发明联合使用。这些方法(描述为例如基因组捕获、基因组分隔、基因组富集等)中有很多使用杂交技术并且包括基于阵列(例如,Hodges等2007:Nat.Genet.39,1522-1527)和基于液体(例如,Choi等2009:Proc.Natl.Acad.Sci USA 106,19096-19101)的杂交方法。用于DNA样品制备和后续外显子组捕获的市售试剂盒也是可以获得的:例如,Illumina Inc.(San Diego,California)提供TruSeqTMDNA样品制备试剂盒和外显子组富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
为了在将例如肿瘤样品的序列与参照样品的序列(例如种系样品的序列)进行比较时降低检测癌症特异性体细胞突变或序列差异中假阳性发现的数量,优选地重复测定这些样品类型中一种或两种的序列。因此,优选地将参照样品的序列(例如种系样品的序列)确定两次、三次或更多次。作为替代或补充,将肿瘤样品的序列确定两次、三次或更多次。还可如下多于一次地确定参照样品的序列(例如,种系样品的序列)和/或肿瘤样品的序列:将基因组DNA中的序列确定至少一次,并且将所述参照样品和/或所述肿瘤样品的RNA中的序列确定至少一次。例如,通过确定参照样品(例如种系样品)在重复之间的变化,可估计假阳性体细胞突变的预期比率(FDR)作为统计量。样品的技术重复应产生相同的结果,并且在该“相同间比较(same vs.same comparison)”中的任何检测到的突变均为假阳性。特别地,为了确定肿瘤样品相对于参照样品中体细胞突变检测的假发现率,可使用参照样品的技术重复作为参考来估计假阳性的数量。此外,可使用机器学习方法来将多个质量相关计量(例如,覆盖率或SNP质量)组合成单质量评分。任选地,对于给定的体细胞变异,可计数具有超标质量评分的所有其他变异,这使得能够对数据集中的所有变异进行排序。
在本发明的上下文中,术语“RNA”涉及包含至少一个核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA例如通过一个或更多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然存在的RNA的经修饰的RNA。这样的改变可包括非核苷酸物质的添加,例如添加到RNA的末端或内部添加,例如添加在RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸,例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在RNA的类似物。
术语“RNA”包括并且优选地涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”,并且涉及通过使用DNA模板产生且编码肽或多肽的“转录物”。通常来说,mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在本发明的上下文中,mRNA可由DNA模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如,多种体外转录试剂盒可商购获得。
可根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如,可通过具有稳定化效果和/或提高RNA翻译效率的一种或更多种修饰来稳定化RNA和提高其翻译。这样的修饰例如在PCT/EP2006/009448中进行了描述,其通过引用并入本文。为了提高在本发明实施方案中使用的RNA的表达,可在编码区(即编码所表达肽或蛋白质的序列)内,优选地在不改变所表达肽或蛋白质的序列的情况下对其进行修饰以提高GC含量从而提高mRNA稳定性和进行密码子优化,并且由此增强在细胞中的翻译。
在本发明中使用的RNA的上下文中,术语“修饰”包括对RNA的非天然存在于所述RNA中的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中,根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。去除这种未加帽的5'-三磷酸可以通过用磷酸酶处理RNA来实现。
根据本发明的RNA可以具有经修饰的核糖核苷酸,以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如,在一个实施方案中,在根据本发明使用的RNA中,5-甲基胞苷被部分或完全,优选完全替换为胞苷。作为替代或补充,在一个实施方案中,在根据本发明使用的RNA中,假尿苷被部分或完全,优选完全替换为尿苷。
在一个实施方案中,术语“修饰”涉及向RNA提供5'-帽或5'-帽类似物。术语“5'-帽”是指见于mRNA分子的5'-端上的帽结构,并且通常由通过不寻常的5'至5'三磷酸酯键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中,该鸟苷在7-位甲基化。术语“常规5'-帽”是指天然存在的RNA5'-帽,优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中,术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定化RNA和/或增强RNA翻译(如果连接于RNA的话,优选在体内和/或在细胞中)的能力的5’-帽类似物。
向RNA提供5'-帽或5'-帽类似物可以通过在所述5'-帽或5'-帽类似物存在下体外转录DNA模板来实现,其中所述5'-帽共转录并入产生的RNA链中,或者可以例如通过体外转录产生RNA并且可以在转录后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)使5'-帽与RNA连接。
RNA可包含另外的修饰。例如,本发明中使用的RNA的另外修饰可为延伸或截短天然存在的poly(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(UTR),例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR,例如用来源于珠蛋白基因的3’-UTR交换已有的3’-UTR或者插入来源于球蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个,优选两个拷贝,所述球蛋白基因例如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白,优选β-球蛋白,更优选人β-球蛋白。
与具有经掩盖poly-A序列的RNA相比,具有未掩盖poly-A序列的RNA更有效地翻译。术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”指通常位于RNA分子的3’端的腺嘌呤基(A)残基的序列,并且“未掩盖poly-A序列”意指在RNA分子3’端的poly-A序列以poly-A序列的A结束,并且除位于poly-A序列3’端(即下游)的A之外,在此之后没有核苷酸。此外,约120个碱基对的长poly-A序列产生最佳的转录物稳定性和RNA翻译效率。
因此,为了提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达,可对其进行修饰以使其与poly-A序列联合存在,所述poly-A序列的长度优选为10至500,更优选30至300,甚至更优选65至200,尤其是100至150个腺苷残基。在一个尤其优选的实施方案中,poly-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达,poly-A序列可以是未掩盖的。
此外,向RNA分子的3’-非翻译区中并入3’-非翻译区(UTR)可使得增强翻译效率。通过并入两个或更多个这样的3’-非翻译区可以实现协同效果。3’-非翻译区相对于并入其的RNA可以是自体或异源的。在一个具体实施方案中,3’-非翻译区来源于人-β球蛋白基因。
上述修饰的组合对RNA稳定性和翻译效率提高具有协同影响,所述修饰即并入poly-A序列、未掩盖poly-A序列以及并入一个或更多个3’-非翻译区。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间段。在本发明的上下文中,RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可能影响RNA的“表达持续时间”。可以预期具有长半衰期的RNA将在延长的时间段内表达。
当然,如果期望降低RNA的稳定性和/或翻译效率,则可以对RNA进行修饰以干扰如上所述提高RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。
术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽、或多肽,例如,通过转录和/或翻译。关于RNA,术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽或多肽。其还包括核酸的部分表达。此外,表达可以是瞬时的或稳定的。
术语表达还包括“异常表达“或“不正常表达”。“异常表达”或“不正常表达”意指与参照,例如未患有与某一蛋白质如肿瘤抗原的异常或不正常表达相关的疾病的对象的状态相比,表达改变,优选提高。表达提高是指提高至少10%,特别是至少20%、至少50%或至少100%或更多。在一个实施方案中,只在病变组织中发现表达,而在健康组织中的表达被抑制。
术语“特异性表达”意指蛋白质基本上仅在特定组织或器官中表达。例如,在胃黏膜中特异性表达的肿瘤抗原意指所述蛋白质主要在胃黏膜中表达,而不在其他组织中表达或者在其他组织或器官类型中不在显著程度上表达。因此,仅在胃黏膜细胞中表达和在任何其他组织如睾丸中在显著较小的程度上表达的蛋白质在胃黏膜细胞中特异性表达。在一些实施方案中,肿瘤抗原也可在正常条件下在多于一种组织类型或器官,例如2或3种组织类型或器官,但优选不超过3种不同的组织或器官类型中特异性表达。在这种情况下,肿瘤抗原然后在这些器官中特异性表达。例如,如果肿瘤抗原在正常条件下,优选在肺和胃中在大致相等的程度上表达,则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
在本发明的上下文中,术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后,可将RNA翻译成蛋白质。根据本发明,术语“转录”包括“体外转录”,其中术语“体外转录”涉及其中优选使用合适的细胞提取物在无细胞系统中体外合成RNA,特别是mRNA的过程。优选地,克隆载体被应用于产生转录物。这些克隆载体通常被指定为转录载体并且被术语“载体”所涵盖。本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地,体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸,特别是cDNA,并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的逆转录获得。
术语“翻译”涉及在细胞核糖体中的过程,通过该过程,信使RNA的链指导氨基酸序列的组装以产生肽或多肽。
表达控制序列或调节序列,其在本发明的上下文中可以与核酸功能性连接,相对于核酸可以是同源的或异源的。如果编码序列和调控序列共价结合在一起,以使得编码序列的转录或翻译在调节序列的控制或影响之下,则它们“功能性地”连接在一起。如果要将编码序列翻译成功能性蛋白质,通过调节序列与编码序列的功能性连接,调节序列的诱导导致编码序列的转录,而不会导致编码序列中的阅读框移位或编码序列不能翻译成期望的蛋白质或肽。
在本发明的上下文中,术语“表达控制序列”或“调节序列”包含控制核酸转录或所得RNA翻译的启动子、核糖体结合序列和其他控制元件。在某些实施方案中,可以控制调节序列。调节序列的精确结构可以根据物种或根据细胞类型而变化,但通常包括参与启动转录或翻译的5’-未转录序列以及5’和3’非翻译序列,例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。特别地,5’-未转录的调节序列包含启动子区,所述启动子区包含用于功能性结合基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可以包含增强子序列或上游活化子序列。
优选地,将待在细胞中表达的RNA引入到所述细胞中。在根据本发明方法的一个实施方案中,通过合适的DNA模板的体外转录获得待被引入到细胞中的RNA。
例如“能够表达…的RNA”和“编码…的RNA”的术语在本文中可互换使用,并且对于特定的肽或多肽意味着所述RNA如果存在于合适的环境中,优选在细胞中可以被表达以产生所述肽或多肽。优选地,RNA能够与细胞翻译机器相互作用以提供其能够表达的肽或多肽。
例如“转移”、“引入”或“转染”的术语在本文中可互换使用,并且涉及将核酸、特别是外源或异源核酸、特别是RNA引入到细胞中。根据本发明,细胞可以形成器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明,核酸的施用以裸核酸实现或与施用试剂组合来实现。优选地,核酸的施用以裸核酸的形式进行。优选地,RNA与稳定化物质如RNA酶抑制剂组合施用。本发明还设想将核酸重复引入到细胞中以允许持续表达的时间段延长。
可以用可与RNA缔合的任何载体来转染细胞,例如,通过与RNA形成复合物或形成其中封装或包封RNA的囊泡,从而导致与裸RNA相比RNA的稳定性提高。有用的载体包括例如含脂质载体如阳离子脂质、脂质体,特别是阳离子脂质体,以及胶束和纳米颗粒。阳离子脂质可与带负电荷的核酸形成复合物。可使用任何阳离子脂质。
优选地,将编码肽或多肽的RNA引入细胞,特别是在体内存在的细胞中,导致所述肽或多肽在细胞中表达。在一些具体实施方案中,优选将核酸靶向特定细胞。在这样的实施方案中,适用于将核酸施用于细胞的载体(例如,逆转录病毒或脂质体)展示靶向分子。例如,可以将分子例如对靶细胞上表面膜蛋白具有特异性的抗体或靶细胞上受体的配体并入到核酸载体中或可使其与核酸载体结合。在通过脂质体施用核酸的情况下,可将与和胞吞相关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入到脂质体制剂中,以能够靶向和/或摄取。这样的蛋白质包括对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内在化蛋白质的抗体、靶向细胞内位置的蛋白质等。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选是完整细胞,即未释放其正常细胞内组分如酶、细胞器或遗传物质的具有完整膜的细胞。完整细胞优选地是有生存力的细胞,即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地,所述术语涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。术语“细胞”包括原核细胞(例如,大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如,树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。外源核酸在细胞内可以如下存在:(i)本身自由分散、(ii)并入重组载体中或(iii)整合到宿主细胞基因组或线粒体DNA中。特别优选哺乳动物细胞,例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞。细胞可来源于大量组织类型并且包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。在另一些实施方案中,细胞是抗原呈递细胞,特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或多肽。
术语“克隆扩增”是指其中使特定实体倍增的过程。在本发明的上下文中,该术语优选在免疫应答的情况下使用,在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激,增殖,并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞扩增。优选地,克隆扩增导致淋巴细胞分化。
例如“降低”或“抑制”的术语涉及引起在水平上优选5%或更大、10%或更大、20%或更大,更优选50%或更大,并且最优选75%或更大的总体降低的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全的抑制,即降低到零或基本上降低到零。
例如“提高”、“增强”、“促进”或“延长”的术语优选地涉及提高、增强、促进或延长约至少10%,优选至少20%、优选至少30%、优选至少40%、优选至少50%、优选至少80%、优选至少100%、优选至少200%,并且特别是至少300%。这些术语还可涉及从零或者不可测量或不可检测的水平提高、增强、促进或延长至超过零的水平或者可测量或可检测的水平。
根据本发明,术语“肽”是指包含通过肽键共价连接的两个或更多个,优选3个或更多个,优选4个或更多个,优选6个或更多个,优选8个或更多个,优选10个或更多个,优选13个或更多个,优选16个或更多个,优选21个或更多个,并且多至优选8个、10个、20个、30个、40个或50个、特别是100个氨基酸的物质。术语“多肽”或“蛋白质”是指大肽,优选是指具有超过100个氨基酸残基的肽,但通常术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用。根据本发明,关于肽、多肽或蛋白质的术语“修饰”或“序列变化”涉及肽、多肽或蛋白质与亲本序列如野生型肽、多肽或蛋白质的序列相比的序列变化。该术语包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和氨基酸替换变体,优选氨基酸替换变体。根据本发明的所有这些序列变化可能潜在地产生新的表位。
氨基酸插入变体包含特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸,例如1、2、3、4或5个或更多个氨基酸的氨基末端和/或羧基末端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中移除一个或更多个氨基酸,例如通过移除1、2、3、4或5个或更多个氨基酸。
氨基酸替换变体的特征在于移除序列中的至少一个残基并在其位置插入另一个残基。
根据本发明,用于本发明方法中测试的修饰或经修饰肽可以衍生自包含修饰的蛋白质。
根据本发明,术语“衍生”是指特定的实体、特别是特定的肽序列存在于衍生其的物体中。在氨基酸序列,特别是特定序列区域的情况下,“衍生”特别意指相关的氨基酸序列衍生自其中其存在的氨基酸序列。
本文所述的药剂、组合物和方法可用于治疗患有疾病的对象,例如,特征在于存在表达抗原并呈递抗原肽的病变细胞的疾病。特别优选的疾病是癌症疾病。本文所述的药剂、组合物和方法还可用于免疫或疫苗接种以预防本文所述的疾病。
一种这样的药剂是疫苗,例如基于通过本发明方法鉴定的抵抗免疫逃逸的合适的新表位而设计的癌症疫苗。
根据本发明,术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答,特别是细胞免疫应答的药物制剂(药物组合物)或产品,所述免疫应答识别和攻击病原体或病变细胞如癌细胞。疫苗可用于预防或治疗疾病。术语“个性化癌症疫苗”或“个体化癌症疫苗”涉及特定癌症患者并且意味着癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
根据本发明提供的癌症疫苗在施用于患者时提供用于刺激、致敏和/或扩增对所述患者的肿瘤具有特异性的T细胞的一个或更多个T细胞表位。T细胞优选地针对表达T细胞表位所源自的抗原的细胞。因此,本文中描述的疫苗优选能够诱导或促进针对以用I类MHC呈递一种或更多种肿瘤相关新抗原为特征的癌症疾病的细胞应答,优选细胞毒性T细胞活性。因为本文提供的疫苗将靶向癌症特异性突变,所以其将对患者的肿瘤具有特异性。
在本发明的上下文中,疫苗涉及这样的疫苗,其在施用于患者时优选提供一种或更多种T细胞表位(本文鉴定的新表位、合适的新表位、合适的新表位的组合),例如2种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、25种或更多种、30种或更多种,并且优选多至60种、多至55种、多至50种、多至45种、多至40种、多至35种或多至30种引入氨基酸修饰的T细胞表位,或预测为合适表位的经修饰肽。由患者的细胞、特别是抗原呈递细胞呈递这些表位优选导致T细胞在与MHC结合时靶向表位,并且因此靶向表达T细胞表位衍生自的抗原并且在肿瘤细胞的表面上呈递相同表位的患者肿瘤,优选原发性肿瘤以及肿瘤转移。
本发明的方法可包括确定所鉴定的氨基酸修饰或包含本文所鉴定的合适新表位的经修饰肽用于癌症疫苗接种的可用性的进一步步骤。因此,进一步的步骤可以包括以下中的一个或更多个:(i)评估修饰是否位于已知或预测的MHC呈递表位中;(ii)在体外和/或通过计算机(in silico)测试修饰是否位于MHC呈递表位中,例如,测试修饰是否是被加工成MHC呈递表位和/或呈现为MHC呈递表位的肽序列的一部分;以及(iii)在体外测试所设想的经修饰表位是否能够刺激具有期望特异性的T细胞,例如患者的T细胞,特别是当存在于其天然序列环境中时,例如当侧翼为在天然存在蛋白质中也侧接所述表位的氨基酸序列时,并且当在抗原呈递细胞中表达时。这样的侧翼序列各自可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸,并且可在N端和/或C端侧接表位序列。
根据本发明确定的经修饰肽可以按其作为用于癌症疫苗接种的表位的可用性来排序。因此,在一个方面,本发明的方法包括人工或基于计算机的分析方法,在所述分析方法中对所鉴定的经修饰肽进行分析并针对其在待提供的各种疫苗中的可用性进行选择。在一个优选的实施方案中,所述分析方法是基于计算算法的方法。优选地,所述分析方法包括确定表位和/或根据其具有免疫原性的能力的预测来对其进行排序。
根据本发明鉴定并在疫苗中提供的表位优选以以下形式存在:包含所述表位(本文鉴定的新表位、合适的新表位、在合适的新表位的组合中存在的新表位)的多肽,例如多表位多肽,或编码所述多肽的核酸,特别是RNA。此外,表位可以存在于疫苗序列形式的多肽中,即存在于其天然序列环境中,例如侧翼为在天然存在的蛋白质中也在所述表位的侧翼的氨基酸序列。这样的侧翼序列各自可包含5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸并且可以在N末端和/或C末端表位序列的侧翼。因此,疫苗序列可包含20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸。在一个实施方案中,表位和/或疫苗序列在多肽中头对尾排列。
在一个实施方案中,本文鉴定的表位/合适的新表位和/或疫苗序列通过接头间隔,特别是中性接头。在本发明的上下文中使用的术语“接头”涉及在两个肽结构域(例如表位或疫苗序列)之间添加的肽,以连接所述肽结构域。关于接头序列没有特别限制。然而,优选的是,接头序列降低两个肽结构域之间的空间位阻,被很好地翻译,并且支持或允许表位的加工。此外,接头应该不具有或仅具有很少的免疫原性序列元件。接头优选不应产生非内源性表位,如由相邻表位之间的接合缝(junction suture)产生的表位,这可能产生不需要的免疫反应。因此,多表位疫苗应优选含有能够减少不需要的MHC结合连接表位数目的接头序列。Hoyt等(EMBO J.25(8),1720-9,2006)和Zhang等(J.Biol.Chem.,279(10),8635-41,2004)已经表明,富含甘氨酸的序列损害蛋白酶体加工,因此富含甘氨酸的接头序列的使用用于使可以被蛋白酶体加工的含接头的肽的数目最小化。此外,观察到甘氨酸抑制MHC结合沟位置中的强结合(Abastado等,1993,J.Immunol.151(7):3569-75)。Schlessinger等,2005,Proteins 61(1):115-26发现在氨基酸序列中包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸产生更柔性的蛋白质,其更有效地翻译和被蛋白酶体加工,能够更好地接近编码的表位。接头各自可包含3个或更多个、6个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、并且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸。优选地,接头富含甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。优选地,接头的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。在一个优选的实施方案中,接头基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成。在一个实施方案中,接头包含氨基酸序列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e,其中a、b、c、d和e独立地为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字,其中a+b+c+d+e不等于0,并且优选为2或更大,3或更大,4或更大,或者5或更大。在一个实施方案中,接头包含如本文所述的序列,包括实施例中描述的接头序列,例如序列GGSGGGGSG。
在一个特别优选的实施方案中,引入通过本文方法鉴定一种或更多种合适的新表位的多肽(例如多表位多肽)以核酸的形式施用于患者,所述核酸优选RNA,例如体外转录的或合成的RNA,其可以在患者的细胞中如抗原呈递细胞中表达以产生多肽。本发明还设想施用一种或更多种多表位多肽(其出于发明的目的包含在术语“多表位多肽”内),优选以核酸的形式,优选RNA,例如体外转录的或合成的RNA,其可以在患者的细胞中如抗原呈递细胞中表达以产生一种或更多种多肽。在施用多于一种多表位多肽的情况下,由不同多表位多肽提供的合适的新表位可以是不同的或部分重叠的。一旦存在于患者的细胞中,例如抗原呈递细胞中,根据本发明的多肽就被加工以产生根据本发明鉴定的合适的新表位。根据本发明提供的疫苗的施用可以提供MHC II类呈递的表位,其能够引发针对表达MHC呈递的表位衍生自的抗原之细胞的CD4+辅助T细胞应答。或者或另外,根据本发明提供的疫苗的施用可提供MHC I类呈递的新表位,其能够引发针对表达MHC呈递的新表位衍生自的抗原之细胞的CD8+T细胞应答。此外,根据本发明提供的疫苗的施用可以提供一种或更多种新表位(包括已知的新表位和根据本发明鉴定的合适的新表位)以及一种或更多种不含癌症特异性体细胞突变但由癌细胞表达并且优选诱导针对癌细胞的免疫应答,优选诱导癌症特异性免疫应答的表位。在一个实施方案中,根据本发明提供的疫苗的施用提供新表位,其为MHC II类呈递的表位和/或能够引发针对表达MHC呈递的表位衍生自的抗原之细胞的CD4+辅助T细胞应答,以及不含癌症特异性体细胞突变的表位,其为MHC I类呈递的表位和/或能够引发针对表达MHC呈递的表位衍生自的抗原之细胞的CD8+T细胞应答。在一个实施方案中,不含癌症特异性体细胞突变的表位衍生自肿瘤抗原。在一个实施方案中,新表位和不含癌症特异性体细胞突变的表位在癌症治疗中具有协同作用。优选地,根据本发明提供的疫苗可用于细胞毒性和/或辅助T细胞应答的多表位刺激。
根据本发明提供的疫苗可以是重组疫苗。
另一种类型的药剂是免疫细胞,例如表达T细胞受体的T细胞,或重组表达T细胞受体或表达人工或嵌合T细胞受体(CAR)的T细胞,所述受体靶向于抗原,例如,通过本发明的方法鉴定为合适的疾病特异性靶标的合适的新表位,优选地其中这样的表位在MHC分子复合物中的细胞表面上表达。优选地,一旦免疫细胞通过受体-抗原结合识别抗原,免疫细胞(免疫反应细胞)就被刺激、致敏和/或扩增或发挥如上所述的免疫反应细胞的效应物功能。
术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及这样的T细胞,其识别MHC I类分子内复合的抗原,例如新表位,并且在与所述抗原结合时优选发挥如上所述的T细胞的效应物功能。如果细胞杀伤表达抗原的靶细胞,则认为T细胞和其他淋巴细胞对抗原是特异性的。可以使用多种标准技术中的任何一种评估T细胞特异性,例如,在铬释放测定或增殖测定中。或者,可以测量淋巴因子(例如干扰素-γ)的合成。
T细胞受体和其他抗原受体在上文进行了描述。术语“CAR”(或“嵌合抗原受体”)涉及包含单个分子或分子复合物的人工受体,其识别(即结合)靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(例如,通过抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合)并且可以赋予在细胞表面上表达所述CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)以特异性。优选地,通过CAR识别靶结构导致表达所述CAR的免疫效应细胞的活化。CAR可包含一种或更多种蛋白质单元,所述蛋白质单元包含一种或更多种如本文所述的结构域。术语“CAR”不包括T细胞受体。
在一个实施方案中,衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜和胞内域(endodomain)融合。这样的分子导致响应于通过scFv识别靶细胞上的其抗原靶标的zeta信号的传递,并杀伤表达靶抗原的靶细胞。也可以使用的抗原识别结构域尤其包括T细胞受体(TCR)α和β单链。事实上,几乎任何以高亲和力结合给定靶标的物质都可以用作抗原识别结构域。
在抗原识别后,受体聚集并将信号传递给细胞。在这方面,“T细胞信号传导结构域”是在结合抗原后将活化信号传递给T细胞的结构域,优选是胞内域。最常用的胞内域组分是CD3-ζ。
使用表达嵌合抗原受体的CAR工程化T细胞的过继细胞转移疗法是一种有前景的治疗方式,因为CAR修饰的T细胞可以被工程化以靶向病变细胞上表达的几乎任何抗原,例如肿瘤抗原。优选地,肿瘤抗原是通过本发明的方法鉴定为合适的肿瘤特异性靶标的肿瘤特异性突变产生的新表位。例如,可以对患者的T细胞进行基因工程改造(遗传修饰)以表达特异性针对患者肿瘤细胞表面上的与MHC分子复合的肿瘤特异性新表位的CAR,然后输注回患者体内。
CAR可以代替T细胞受体的功能,特别是可以赋予细胞如T细胞以反应性,例如溶细胞活性。然而,与如上所述T细胞受体与抗原肽-MHC复合物的结合相反,CAR也可以与抗原结合,特别是当在细胞表面上表达时。
根据本发明,CAR通常可包含三个结构域。第一个结构域是结合结构域,其识别并结合抗原。第二个结构域是共刺激结构域。共刺激结构域用于在CAR与靶向部分结合后增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和存活。共刺激结构域的特性仅限于在CAR与靶向部分结合后增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)(肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员)、CD134(OX40)(TNFR受体超家族成员)和CD278(ICOS)(在活化的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子)。第三个结构域是激活信号传导结构域(或T细胞信号传导结构域)。激活信号传导结构域用于在CAR与抗原结合后激活细胞毒性淋巴细胞。激活信号传导结构域的特性仅限于在CAR与抗原结合后诱导所选细胞毒性淋巴细胞活化的能力。合适的激活信号传导结构域包括T细胞CD3[ζ]链和Fc受体[γ]。
CAR可以包含三个结构域,一起为融合蛋白的形式。这样的融合蛋白通常包含以N末端至C末端方向连接的结合结构域、一个或更多个共刺激结构域和激活信号传导结构域。然而,CAR不限于这种排列,并且其他排列是可接受的并且包括结合结构域、激活信号传导结构域和一个或更多个共刺激结构域。应当理解,因为结合结构域必须自由结合抗原,所以结合结构域在融合蛋白中的位置通常使得实现该区域在细胞外部展示。以相同的方式,因为共刺激结构域和激活信号传导结构域用于诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖,所以融合蛋白通常将这两个结构域展示在细胞内部。CAR可以包含另外的元件,例如信号肽以确保融合蛋白正确地输出到细胞表面,跨膜结构域以确保融合蛋白保持为完整膜蛋白,以及赋予结合结构域柔性并允许与抗原的强结合的铰链结构域(或间隔区)。
与CAR和其他人工抗原受体结合使用的细胞优选是T细胞,特别是细胞毒性淋巴细胞,优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。在活化后,这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种都会引起靶细胞的破坏。例如,细胞毒性T细胞通过以下一种或两种方式引起靶细胞的破坏。首先,在活化后,T细胞释放细胞毒素,例如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔,而颗粒酶进入细胞并在细胞质中引起胱天蛋白酶级联反应,其诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)。其次,可以通过T细胞与靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导凋亡。尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞,但细胞毒性淋巴细胞优选是自体细胞。
可能存在于CAR内的抗原结合结构域具有结合(靶向)抗原的能力,即结合(靶向)抗原中存在的表位的能力,优选结合(靶向)通过本发明的方法鉴定为合适的疾病特异性靶标的新表位的能力,其中新表位在MHC的情况下存在于细胞表面上。优选地,抗原的结合结构域对抗原是特异性的。
另一种类型的药剂是免疫细胞,例如淋巴样细胞,其载有含有通过本发明方法鉴定的合适的新表位的肽。在一个优选的实施方案中,淋巴样细胞是树突细胞。在本发明的上下文中,将优选从待治疗的患者分离的淋巴样细胞与待靶向的抗原一起孵育,然后将孵育的细胞施用于患者,其中诱导对表达该抗原的细胞的免疫应答。因此,可以将包含合适表位的肽与树突细胞一起孵育,并且可以施用孵育的细胞以诱导针对表达合适的新表位的细胞的免疫应答。
本发明上下文中的术语“重组的”意指“通过遗传工程制备的”。优选地,在本发明的上下文中的“重组实体”(例如重组多肽)不是天然存在的,并且优选是不天然组合的实体(例如氨基酸或核酸序列)组合的结果。例如,在本发明的上下文中的重组多肽可包含来源于不同蛋白质或者同一蛋白质的不同部分的数个氨基酸序列如新表位或疫苗序列,其例如通过肽键或合适接头融合在一起。
本文使用的术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中发现的事实。例如,存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。
根据本发明,术语“疾病”是指任何病理状态,包括癌症疾病,特别是本文所述的那些形式的癌症疾病。
术语“正常”是指健康状态,或者健康对象或组织中的状况,即非病理状况,其中“健康”优选意指非癌性的。
“涉及表达抗原的细胞的疾病”意指在病变组织或器官的细胞中检测到抗原的表达。与健康组织或器官中的状态相比,在病变组织或器官的细胞中的表达可提高。提高是指提高至少10%,特别是至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%、至少1000%、至少10000%或甚至更多。在一个实施方案中,只在病变组织中发现表达,而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明,涉及表达抗原的细胞或与之相关的疾病包括癌症疾病。
癌症(医学术语:恶性新生物(malignant neoplasm))是一类疾病,其中一组细胞显示出不受控制的生长(超出正常范围的分裂)、侵入(侵入和破坏邻近组织)、并且有时转移(通过淋巴或血液扩散到身体的其他位置)。癌症的这三种恶性特征将它们与良性肿瘤区分开来,后者是自限性的,并且不会侵入或转移。大多数癌症形成肿瘤,但有些癌症(如白血病)则不会。
恶性肿瘤与癌症基本上同义。恶性、恶瘤肿瘤和恶性新生物与癌症基本上同义。
根据本发明,术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长,优选形成肿胀或病灶。“肿瘤细胞”意指通过快速的不受控制的细胞增殖生长并在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失,并且通常形成独特的组织团块,其可能是良性的、恶化前的或恶性的。
良性肿瘤是缺少癌症的所有三种恶性特征的肿瘤。因此,根据定义,良性肿瘤不会以无限的、侵略性的方式生长,不侵入周围组织,并且不会扩散到非相邻组织(转移)。
新生物是瘤形成(neoplasia)引起的异常组织块。瘤形成(希腊语的新增长)是细胞的异常增殖。细胞的生长超过并且与其周围的正常组织的生长不协调。即使在刺激停止后,生长仍以同样过度的方式持续存在。其通常会导致肿块或肿瘤。新生物可能是良性的、恶变前的或恶性的。
在本发明的上下文中,“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”涉及肿瘤的尺寸增大的趋势和/或肿瘤细胞增殖的趋势。
出于本发明的目的,术语“癌症”和“癌症疾病”可与术语“肿瘤”和“肿瘤疾病”互换使用。
癌症根据类似于肿瘤的细胞类型进行分类,因此,组织被假定为肿瘤的起源。这些分别是组织学和位置。
根据本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其实例是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移和癌症复发。
“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是很复杂的过程,并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离,侵袭细胞外基质,渗透内皮基底膜以进入体腔和血管,以及然后在通过血液转运后浸润靶器官。最终,在靶位点的新肿瘤,即继发性肿瘤或转移性肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后,也经常发生肿瘤转移,这是因为肿瘤细胞或组分可能保留并发展转移潜力。在一个实施方案中,根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”,其涉及远离原发性肿瘤和区域性淋巴结系统的转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞与原始肿瘤中的细胞类似。这意味着,例如,如果卵巢癌转移至肝脏,则继发性肿瘤由异常卵巢细胞而不是异常肝细胞构成。肝中的肿瘤然后被称为转移性卵巢癌,而不是肝癌。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”涉及从原发性肿瘤或肿瘤转移瘤脱离并且在血流中循环的细胞。CTC可构成随后在不同组织中生长另外的肿瘤(转移)的种子。循环肿瘤细胞以约1至10个CTC/mL全血的频率存在于患有转移性疾病的患者中。已开发了研究方法来分离CTC。本领域中已描述了若干种研究方法来分离CTC,例如使用上皮细胞通常表达细胞黏附蛋白EpCAM(其在正常血细胞中不存在)的这一事实的技术。基于免疫磁珠的捕获涉及用已与磁性颗粒缀合的针对EpCAM的抗体处理血液试样,随后在磁场中分离标记的细胞。然后,将分离的细胞用针对另一上皮标志物细胞角蛋白和常见的白细胞标志物CD45的抗体染色,以使罕见的CTC与污染白细胞区分开来。这种稳健且半自动化的方法以平均产量为约1个CTC/mL且纯度为0.1%鉴定CTC(Allard等,2004:Clin Cancer Res 10,6897-6904)。用于分离CTC的第二种方法使用基于微流体的CTC捕获装置,其涉及使全血流过嵌入有80,000个微柱的室,所述微柱通过用针对EpCAM的抗体包被而变得具有功能性。CTC然后用针对细胞角蛋白或组织特异性标志物(例如前列腺癌中的PSA或乳腺癌中的HER2)的二抗进行染色,并且通过沿着三维坐标在多个平面中自动化扫描微柱来可视化。CTC芯片能够以50个细胞/ml的中值产量和1%至80%的纯度来鉴定患者中的细胞角蛋白化阳性循环肿瘤细胞(Nagrath等,2007:Nature 450,1235-1239)。用于分离CTC的另一种可能性是使用来自Veridex,LLC(Raritan,NJ)的CellSearchTM循环肿瘤细胞(CTC)测试,其对血管中的CTC进行捕获、鉴定和计数。CellSearchTM系统是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于全血中CTC计数的方法,其是基于免疫磁性标记和自动化数字显微术的组合。存在文献中描述的用于分离CTC的其他方法,所有这些方法均可以与本发明结合使用。
当个体再次受到过去影响其的病症影响时,出现复发或再现。例如,如果患者曾患有肿瘤疾病,已经接受所述疾病的成功治疗,并且再次发生所述疾病,则所述新发生的疾病可认为是复发或再现。然而,根据本发明,肿瘤疾病的复发或再现可以但不一定发生在原始肿瘤疾病的部位。因此,例如,如果患者曾患有卵巢肿瘤并且已接受了成功治疗,则复发或再现可为在与卵巢不同的部位处出现卵巢肿瘤或出现肿瘤。肿瘤的复发或再现还包括其中肿瘤出现在与原始肿瘤部位不同的部位和出现在原始肿瘤部位的情况。优选地,患者已经接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤,并且在与原始肿瘤部位不同的部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
术语“免疫应答”涉及免疫系统例如与免疫原性生物体如细菌或病毒、细胞或物质的反应。术语“免疫应答”包括先天免疫应答和适应性免疫应答。优选地,免疫应答与免疫细胞的活化、细胞因子生物合成的诱导和/或抗体产生有关。
优选地,由本发明的组合物诱导的免疫应答包括活化抗原呈递细胞(例如树突细胞和/或巨噬细胞),通过所述抗原呈递细胞呈递抗原或其片段以及由于这种呈递活化细胞毒性T细胞的步骤。
术语“免疫细胞”是指参与个体身体的防御的免疫系统的细胞。术语“免疫细胞”包括特定类型的免疫细胞及其前体,包括白细胞,包括巨噬细胞、单核细胞(巨噬细胞的前体)、粒细胞如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞,树突细胞、肥大细胞和淋巴细胞如B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞。巨噬细胞、单核细胞(巨噬细胞的前体)、嗜中性粒细胞、树突细胞和肥大细胞是吞噬细胞。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病或病症。设计用于引发或扩大免疫应答的免疫治疗被分类为活化免疫治疗,而降低或抑制免疫应答的免疫治疗被分类为抑制免疫治疗。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种,或者肿瘤免疫接种或肿瘤疫苗接种。术语“免疫治疗”还涉及免疫应答的操纵,以使得在自身免疫病如风湿性关节炎、变态反应、糖尿病或多发性硬化的情况下,将不合适的免疫应答调节成更合适的免疫应答。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了向个体施用抗原以诱导免疫应答的过程,例如,出于治疗或预防的原因。
“治疗”意指向对象施用本文所述的化合物或组合物以预防或消除疾病,包括降低肿瘤的大小或对象中的肿瘤数量;阻止或减缓对象中的疾病;抑制或减缓对象中新疾病的发展;降低目前患有或曾患有疾病的对象中症状和/或复发的频率或严重程度;和/或延长(即增加)对象的寿命。特别地,术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制进展或恶化,或预防或延迟疾病或其症状的发作。
“具有……的风险”是指对象(即患者)被认为与一般人群相比具有高于正常的发生疾病,特别是癌症的机会。另外,曾患有或目前患有疾病,特别是癌症的对象是具有提高的发展疾病的风险的对象,因为这样的对象可能继续发展疾病。目前患有或曾患有癌症的对象还具有提高的癌症转移的风险。
免疫治疗的预防性施用(例如本发明组合物的预防性施用)优选保护接受者免于疾病的发展。免疫治疗的治疗性施用(例如本发明组合物的治疗性施用)可以导致疾病进展/生长的抑制。这包括疾病进展/生长的减缓,特别是疾病进展的破坏,其优选地导致疾病的消除。
可以使用多种技术中的任何一种进行免疫治疗,其中本文提供的药剂用于从患者移除病变细胞。这种移除可以由于增强或诱导患者中对抗原或表达抗原的细胞特异性的免疫应答而引起。
在某些实施方案中,免疫治疗可以是主动免疫治疗,其中治疗依赖于利用免疫应答修饰剂(例如本文提供的多肽和核酸)的施用对内源宿主免疫系统进行体内刺激,以与病变细胞反应。
本文提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案例如手术、放射、化疗和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关)组合使用。
术语“体内”涉及对象中的情况。
术语“对象”、“个体”、“生物体”或“患者”涉及脊椎动物,特别是哺乳动物。例如,在本发明的上下文中的哺乳动物是人、非人灵长类动物、驯养的哺乳动物如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等,实验动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等,以及圈养的动物,如动物园的动物。这些术语还涉及非哺乳动物脊椎动物,如鸟类(特别是驯养鸟类,如鸡、鸭、鹅、火鸡)和鱼类(特别是养殖鱼类,如鲑鱼或鲶鱼)。如本文所用的术语“动物”还包括人。
术语“自体”用于描述来自同一对象的任何事物。例如,“自体移植”是指来自同一对象的组织或器官的移植。这些方法是有利的,因为它们克服了免疫屏障,否则会导致排斥。
术语“异源”用于描述由多种不同要素组成的事物。例如,将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成了异源移植。异源基因是来自对象以外的来源的基因。
作为用于免疫接种或疫苗接种的组合物的一部分,优选将一种或更多种如本文所述的药剂与一种或更多种佐剂一起施用,用于诱导免疫应答或用于增强免疫应答。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。本发明的组合物优选在不添加佐剂的情况下发挥其作用。此外,本申请的组合物可包含任何已知的佐剂。佐剂包括异质组的化合物,例如油乳剂(例如弗氏佐剂)、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素)、脂质体和免疫刺激复合物。佐剂的实例是单磷酰基-脂质-A(MPLSmithKline Beecham)、皂苷如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKlineBeecham;WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So等,1997,Mol.Cells 7:178-186)、不完全弗氏佐剂佐剂、完全弗氏佐剂、维生素E、montanid、明矾、CpG寡核苷酸(Krieg等,1995,Nature 374:546-549),以及由生物可降解油如角鲨烯和/或生育酚制备的各种油包水乳剂。
也可以施用刺激患者免疫应答的其他物质。例如,由于其对淋巴细胞的调节特性,可以在疫苗接种中使用细胞因子。这些细胞因子包括,例如,白细胞介素-12(IL-12)(其显示提高疫苗的保护作用(参见Hall,1995,IL-12at the crossroads,Science 268:1432-1434))、GM-CSF和IL-18。
有许多化合物可增强免疫应答,因此可用于疫苗接种。所述化合物包含以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子,例如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)。
根据本发明,“肿瘤试样”是含有肿瘤或癌细胞(如循环肿瘤细胞(CTC))的样品,例如身体样品,特别是组织样品(包括体液)和/或细胞样品。根据本发明,“非肿瘤试样”是不含肿瘤或癌细胞(如循环肿瘤细胞(CTC))的样品,例如身体样品,特别是组织样品(包括体液)和/或细胞样品。这样的身体样品可以以常规方式获得,例如通过组织活检,包括穿孔活组织检查,以及通过采集血液、支气管抽吸物、痰液、尿液、粪便或其他体液。根据本发明,术语“样品”还包括加工的样品,例如生物样品的级分或分离物,例如核酸或细胞分离物。
本文所述的治疗活性剂、疫苗和组合物可以通过任何常规途径施用,包括通过注射或输注。施用可以例如经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或透皮进行。在一个实施方案中,施用在结内进行,例如通过注射到淋巴结中。其他形式的施用设想了用本文所述的核酸体外转染抗原呈递细胞如树突细胞,然后施用该抗原呈递细胞。
本文所述的药剂以有效量给药。“有效量”是指单独地或与另外的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下,期望反应优选涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展,特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或病症中的期望反应也可以是所述疾病或所述病症的发作的延迟或者预防其发作。
本文所述药剂的有效量将取决于待治疗的病症,疾病的严重程度,患者的个体参数,包括年龄、生理状况、体型大小和体重,治疗持续时间,伴随治疗的类型(如果存在)、具体的施用途径和类似因素。因此,本文所述药剂的施用剂量可以取决于这些参数而变化。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下,可以使用更高剂量(或通过不同的更局部的施用途径实现的有效更高剂量)。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
本发明的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂、载体和任选地其他治疗剂。优选地,本发明的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
术语“赋形剂”旨在表示在药物组合物中但不是活性成分的所有物质,例如黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释试剂和/或稀化剂。此外,术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮和/或混合介质中的任意一种或更多种。
术语“载体”涉及适用于向人施用的一种或更多种相容性固体或液体填充剂或稀释剂。术语“载体”涉及天然或合成的有机或无机组分,其与活性组分组合以促进活性组分的应用。优选地,载体组分是无菌液体,例如水或油,包括来源于矿物油、动物或植物的那些,例如花生油、大豆油、芝麻油、向日葵油等。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作水性载体化合物。
用于治疗用途的可药用载体或稀释剂在制药领域中是公知的,并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro编辑,1985)中。合适的载体的实例包括,例如,碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
可以根据预期的施用途径和标准药学实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂。本发明的药物组合物可包含作为载体、赋形剂或稀释剂(除了其以外)的任何合适的黏合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或增溶剂。合适的黏合剂的实例包括淀粉,明胶,天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖,玉米甜味剂,天然和合成树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠,羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和助悬剂。
在一个实施方案中,组合物是含水组合物。含水组合物可任选包含溶质,例如盐。在一个实施方案中,组合物是冻干组合物的形式。通过冷冻干燥相应的含水组合物可获得冻干组合物。
本文提供的药剂和组合物可单独使用或与其他治疗方案如手术、放射、化疗和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关)组合使用。
通过附图和实施例详细描述和举例说明了本发明,这些附图和实施例仅用于说明目的而不是限制性的。由于描述和实施例,技术人员可以获得同样包括在本发明中的其他实施方案。
实施例1.靶向具有高拷贝数的基因中的疾病特异性突变
通过寻找具有高拷贝数并且其中基因的至少一个拷贝含有疾病特异性突变的基因来分析胶质母细胞瘤样品的基因组信息(Chin等,2008,Comprehensive genomiccharacterization defines human glioblastoma genes and core pathways,Nature455:1061-1068)。质量分析表明,对于分析的11,574个个体基因,存在高保真度的拷贝数分配,并且样品基因组的倍性确定为1.95。图1a显示了染色体7上表皮生长因子受体(EGFR)周围的局部基因的图示,其是已知的驱动基因并且已经成为治疗的靶标。其表明,该基因组中的EGFR具有误差校正的绝对拷贝数76,其中13个拷贝含有疾病特异性单核苷酸变异。图1b提供了该基因组样品中的具有最高绝对拷贝数的基因的列表。有四个另外的基因具有大于2的绝对拷贝数。实际上,EGFR扩增是原发性胶质母细胞瘤的已知遗传标志(Benito等,2009,Neuropathology 30(4):392-400),并且该基因已被考虑作为治疗的靶标(Taylor,2012,Curr Cancer Drug Targets.Mar;12(3):197–209)。
实施例2靶向具有高接合性的疾病特异性突变
通过寻找其中基因的至少一个拷贝具有疾病特异性突变的基因并且查看具有疾病特异性突变的基因的拷贝数以及基因的总拷贝数(无论基因是否具有突变)来分析从来自人肿瘤的黑素瘤细胞样品中获得的外显子组。图2提供了通过接合性分类的基因的列表,其中在基因的多个拷贝上发现疾病特异性突变。例如,OXGR1基因中的疾病特异性突变具有最高的接合性(4),并且特别地还具有最高接合性比例4/5或0.8,因为OXGR1基因存在总共5个拷贝,并且其中4个拷贝含有疾病特异性突变。该列表提供了10个另外的基因,其中基因的总共4个拷贝中的3个拷贝具有突变,表明这些基因中的疾病特异性突变的接合性比例为3/4或0.75。其余列出的基因具有接合性比例为2/3或0.66的突变,因为总共3个拷贝中的2个拷贝具有突变。
实施例3靶向存在于必需基因的所有拷贝中的疾病特异性突变
通过寻找其中基因的所有拷贝具有相同的疾病特异性突变的基因并且确定这些基因中的哪些是必需基因来分析从来自人肿瘤的黑素瘤细胞样品中获得的外显子组。通过从其在小鼠中必需的知识推断其在人中的必要性,来确定基因是必需的(Georgi等,2013,From mouse to human:evolutionary genomics analysis of human orthologs ofessential genes,PLoS Genetics 9(5):e1003484;Liao等,2007,Mouse duplicate genesare as essential as singletons,Trends Genet.23:378-381)。图3列出了一些基因,其中基因的所有拷贝都具有相同的疾病特异性突变。此外,通过从小鼠数据推断它们的必要性,确定了三个突出显示的基因是必需的。
Claims (59)
1.用于确定由基因中等位基因的疾病特异性突变(突变等位基因)产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定编码所述新表位的所述突变等位基因的拷贝数。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述突变等位基因的高拷贝数表明所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变等位基因的拷贝数越高,所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。
4.根据权利要求1所述的方法,其中当所述突变等位基因的拷贝数大于2时,表明所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性。
5.根据权利要求4所述的方法,其中当所述突变等位基因的拷贝数大于3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大于100时,表明所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中在至少一个拷贝具有所述突变等位基因的基因中,所述突变等位基因以高比例的基因拷贝存在(接合性比例),所述接合性比例是所述突变等位基因的拷贝数与所述突变所映射的核苷酸位点的总拷贝数的比值。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述接合性比例越高,所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其中所述接合性比例大于0.5,优选地所述接合性比例为1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述突变等位基因的拷贝数和/或所述接合性比例和/或所述突变等位基因所映射的核苷酸位点的总拷贝数存在于高比例的病变细胞中。
10.根据权利要求9所述的方法,其中具有所述突变等位基因的拷贝数和/或所述接合性比例和/或所述突变等位基因所映射的核苷酸位点的总拷贝数的病变细胞的比例越高,所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。
11.根据权利要求9或10所述的方法,其中病变细胞的比例为1。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述基因是驱动基因,其表达导致细胞转化为癌表型或其表达的缺失导致癌细胞丧失其癌表型。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述基因是必需基因。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述必需基因是这样的基因,当其沉默或其表达降低时,至少导致其中表达所述必需基因的细胞、优选所述病变细胞的生长受损或适应性降低。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述必需基因在多种不同组织中表达,并且以最小RPKM阈值大于0表达。
16.用于确定由基因中的疾病特异性突变产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定至少一个拷贝具有所述疾病特异性突变的基因的拷贝数。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述基因的高拷贝数表明所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性。
18.根据权利要求16或17所述的方法,其中所述基因的拷贝数越高,所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法,其中所述基因是驱动基因,其表达导致细胞转化为癌表型或其表达的缺失导致癌细胞丧失其癌表型。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法,其中所述基因的所述拷贝数存在于高比例的病变细胞中。
21.根据权利要求20所述的方法,其中具有所述拷贝数的病变细胞的比例越高,所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高。
22.根据权利要求20或21所述的方法,其中病变细胞的比例为1。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中所述拷贝数是绝对拷贝数。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述绝对拷贝数是误差校正的绝对拷贝数。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中所述绝对拷贝数或所述误差校正的绝对拷贝数相对于倍性、优选所述病变细胞的基因组的倍性、或所述病变细胞中所述突变或突变基因定位的染色体或染色体部分的倍性归一化。
26.用于确定由基因中的疾病特异性突变产生的新表位作为疾病特异性靶标的适合性的方法,其包括在病变细胞或病变细胞群中确定具有所述疾病特异性突变的基因是否是必需基因。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述必需基因是这样的基因,当其沉默或其表达降低时,至少导致其中表达所述必需基因的细胞、优选所述病变细胞的生长受损或适应性降低。
28.根据权利要求26所述的方法,其中所述必需基因在多种不同组织中表达,并且以最小RPKM阈值大于0表达。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法,其中当所述基因是必需基因并且所述必需基因的所有拷贝都具有所述疾病特异性突变时,表明所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性。
30.根据权利要求26或29中任一项所述的方法,其中高比例的病变细胞含有所述必需基因的拷贝,其中所述必需基因的所有拷贝都具有所述疾病特异性突变。
31.根据权利要求30所述的方法,其中含有所述必需基因的拷贝的病变细胞的比例越高,所述新表位作为疾病特异性靶标的适合性就越高,其中所述必需基因的所有拷贝都具有所述疾病特异性突变。
32.根据权利要求30或31所述的方法,其中病变细胞的比例为1。
33.用于确定由至少两种基因中的疾病特异性突变产生的至少两种新表位的组合作为疾病特异性靶标组合的适合性的方法,其包括确定各自具有疾病特异性突变的所述至少两种基因的组合是否是合成致死或合成致病基因。
34.根据权利要求33所述的方法,其中当所述至少两种基因的组合是合成致死或合成致病时,表明所述新表位组合作为疾病特异性靶标组合的适合性。
35.根据权利要求33或34所述的方法,其中所述至少两种基因的所有拷贝都具有所述疾病特异性突变。
36.根据权利要求35所述的方法,其中高比例的病变细胞含有具有所述疾病特异性突变的所述至少两种基因。
37.根据权利要求36所述的方法,其中病变细胞的比例为1。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法,其中所述疾病特异性突变是单核苷酸变异。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法,其中所述疾病是癌症。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法,其中通过包括对病变细胞的基因组或其部分进行测序的方法来鉴定所述新表位。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法,其用于制备药物。
42.根据权利要求1至40中任一项所述的方法,其用于制备疫苗。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述疫苗来自一种或更多种合适的新表位或来自合适的新表位的组合。
44.根据权利要求42或43所述的方法,其中所述疫苗包含含有一种或更多种合适的新表位或合适的新表位的组合的肽或多肽,或编码所述肽或多肽的核酸。
45.用于提供疫苗的方法,其包括根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定合适的新表位或合适的新表位的组合。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述疫苗包含含有一种或更多种合适的新表位或合适的新表位的组合的肽或多肽,或编码所述肽或多肽的核酸。
47.通过权利要求42至46中任一项所述的方法产生的疫苗。
48.根据权利要求1至40中任一项所述的方法,其用于制备重组免疫细胞,所述重组免疫细胞表达靶向合适的新表位或合适的新表位的组合中的一种新表位的抗原受体。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述免疫细胞是T细胞,并且所述抗原受体是T细胞受体。
50.用于提供靶向合适的新表位或合适的新表位的组合中的一种表位的重组免疫细胞的方法,所述方法包括用重组抗原受体转染免疫细胞,所述重组抗原受体靶向通过根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的合适的新表位或者合适的新表位的组合中的一种表位。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述免疫细胞是T细胞,并且所述抗原受体是T细胞受体。
52.通过权利要求48至51中任一项所述的方法产生的重组免疫细胞。
53.用于在哺乳动物中提供对于表达一种或更多种新表位的靶细胞群或靶组织的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用:
(a)一种或更多种免疫细胞,所述免疫细胞表达靶向根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的所述一种或更多种新表位的一种或更多种抗原受体;
(b)施用编码根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的一种或更多种新表位的核酸;或
(c)施用包含根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的一种或更多种新表位的肽或多肽。
54.根据权利要求53所述的方法,其中所述免疫细胞是T细胞,并且所述抗原受体是T细胞受体。
55.根据权利要求53或54所述的方法,其中所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法,其中所述免疫应答是抗肿瘤免疫应答,并且表达所述一种或更多种合适的新表位的靶细胞群或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织。
57.用于治疗患有与新表位的表达相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用:
(a)一种或更多种免疫细胞,所述免疫细胞表达靶向根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的一种或更多种新表位的一种或更多种抗原受体;
(b)施用编码根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的一种或更多种新表位的核酸;或
(c)施用包含根据权利要求1至40中任一项所述的方法鉴定的一种或更多种新表位的肽或多肽。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述免疫细胞是T细胞,并且所述抗原受体是T细胞受体。
59.根据权利要求57或58所述的方法,其中所述疾病、障碍或病症是癌症。
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