KR20190027832A - 향상된 효능을 갖는 치료를 위한 질병-특이적 표적으로서 네오에피토프의 선택 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질병에 걸린 세포가 면역 감시(immune surveillance)를 벗어날 가능성이 적게 하기 위하여, 질병에 걸린 세포 내에서 또는 상에서만 발현되는 네오에피토프(neoepitopes)가 질병-특이적 표적으로 적합한지 여부를 결정하기 위한 방법 및 네오에피토프를 발현하는 질병에 걸린 세포에 대한 면역 반응을 제공하는데 있어서 네오에피토프의 용도를 제공한다.

Description

향상된 효능을 갖는 치료를 위한 질병-특이적 표적으로서 네오에피토프의 선택
본 발명은 질병-특이적 표적으로서 질병-특이적 네오에피토프(neoepitope)의 적합성을 결정하기 위한 방법 및 하나 이상의 동정된 적합한 네오에피토프를 발현하는 환자의 질병에 걸린 조직, 예를 들어 종양 조직에 특이적으로 표적화된 면역요법에서의 이러한 동정된 적합한 네오에피토프의 용도에 관한 것이다.
암은 모든 사망의 1/4을 차지하는, 주된 사망 원인이다. 암의 치료는 전통적으로 평균의 법칙 - 가장 많은 환자에 대하여 최상의 효과를 나타내는 것에 기반하였다. 그러나, 암의 분자 이질성으로 인하여, 종종 치료받는 개인의 25% 미만이 승인된 치료로 이익을 얻는다. 환자 맞춤형 치료를 기반으로 한 개별화된 의약품은 약물 개발의 혁신을 위한 낮은 효능과 높은 비용에 대한 잠재적인 해결책으로 간주됩니다.
개인 맞춤화된 암 면역요법은 암 치료에 있어 전-세계적으로 매년 수 백만명의 진단받은 암 환자에 대한 치료의 기준을 변형시킬수 있는 잠재성이 있는 잠재적인 돌파구로 부각되고 있다. 개인 맞춤화된 암 면역요법의 통합 측면은 면역계가 환자 암 특유의 유전적인 비정상 (돌연변이)을 표적으로 할 수 있는 것이다. 이러한 질병-특이적 돌연변이는 네오에피토프를 인코딩할 수 있으며, 네오에피토프는 질병-특이적 표적이다. 개인 맞춤화된 면역요법의 질병-특이적 표적으로서 사용될 수 있는 암 게놈을 괴롭히는 가장 흔한 유전적 비정상은 비동의적인(nonsynonymous) 단일 뉴클레오타이드 변이 (SNV)이다. 그러므로, 게놈의 코딩 영역 내 환자의 SNV를 정확하고 철저하게 동정하는 것은 개인 맞춤화된 암 면역 요법을 제조하는 과정에서 중요한 단계이다.
그러나, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 질병-특이적 돌연변이의 정체성을 아는 것은 그림의 일부일 뿐이다. 오히려, 돌연변이의 완전한 유전적 프로파일링은 질병에 걸린 세포, 예를 들어, 종양 세포 (야생형 및 돌연변이 대립유전자 모두 포함)에서 돌연변이를 함유하는 유전자의 정확한 카피 수에 대한 지식, 종양 세포에서의 돌연변이 대립유전자 (본 명세서에서 돌연변이의 접합성으로 언급됨), 및 종양 샘플과 같은 질병에 걸린 세포의 샘플에서의 돌연변이의 서브클론성(subclonality)의 정도를 포함한다. 실제로, 질병에 걸린 세포에서 발생하는 카피 수 변화는 대부분의 질병 징후에서 질병에 걸린 세포의 유전적 변이의 중요한 요소이다. 게다가, 카피 수 변이의 범위, 카피 수 변이에 영향을 받는 유전자의 상동성 및 카피 수 변이의 정확한 유전적 구성은 각 개인마다 매우 다양할 수 있다. 일반적으로, [Shlien and Malkin, 2009, Genome Med. 1:62; Yang et al., 2013, Cell 153:919-929]를 참조한다. 이러한 유전적 특징에 대한 정확한 지식은 표적화된 경우에 종양이 회피하는 면역적인 돌연변이를 선택하는데 결정적일 수 있으며, 따라서 전체적인 종양 조절 잠재성을 부여한다.
개인 맞춤화된 암 면역요법의 효능을 최대화하고 대다수의 치료받는 환자에게 지속적인 종양 조절을 제공하기 위해, 치료요법은 예를 들어 돌연변이 표적의 발현을 침묵화, 예를 들어 유전자의 결실에 의하여 종양이 면역 감시를 피할 수 있는 능력을 방해할 필요가 있다. 이 문제를 해결하지 않으면, 면역요법은 돌연변이가 발현되지 않는 경우, 예를 들어 게놈으로부터 결실된 경우에 면역요법이 돌연변이를 표적으로 할 수 없기 때문에 재발의 위험을 갖는다. 종양 조절을 향상시키는 적합한 네오에피토프(neoepitope)를 선택하는 것은 네오에피포트가 어떻게 수행되는지에 관계없이, 네오에피토프를 표적으로 하는 모든 개인 맞춤화된 면역요법 접근에 이익이 될 것이다. 따라서, 본 기술 분야에서 향상된 종양 억제를 유발하는, 질병-특이적 돌연변이로부터 생성된 네오에피토프를 선택하는 방법에 대한 요구가 있다.
본 발명은 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성된 네오에피토프(neoepitope)의 질병에 걸린 조직이 면역 감시(immune surveillance)를 쉽게 벗어날 수 없는 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법을 제공함으로써 최신 기술의 결함을 극복하는 방법을 제공하고, 이는 암의 경우에 향상된 종양 통제를 유발한다. 적절한 네오에피토프가 동정되면, 이러한 적합한 에피토프는 질병을 갖는 환자에서 특이적 면역 반응을 유도하기 위하여 질병-특이적 표적으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 질병은 암일 수 있으며, 잠재적인 원발성 종양 뿐만 아니라 적합한 네오에피토프를 발현하는 종양 전이가 보다 효과적인 치료를 위해 표적화될 수 있다.
본 발명은 유전자의 대립유전자에서 질병-특이적 돌연변이 (돌연변이 대립유전자)로부터 생성되는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 네오에피토프를 인코딩(encoding)하는 돌연변이 대립유전자의 카피 수를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 카피 수는 예를 들어, 돌연변이 대립유전자의 카피 수가 4이고, 돌연변이 대립유전자가 4의 접합성(zygosity)을 갖는 접합성을 의미할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 대립유전자는 특이적 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 게놈 내의 부위이며, 상동성(identity)은 게놈의 모계와 부계 카피 상에서 둘 다 동일 (동형접합성 유전자형)할 수 있거나 상동성은 게놈의 모계와 부계 카피 상에서 상이 (이형접합성 유전자형)할 수 있다. 돌연변이 대립유전자는 질병-특이적 돌연변이로 인하여, 상응하는 정상적인 게놈, 예를 들어, 동일한 개체의 질병에 걸리지 않은 세포로부터, 바람직하게는 질병에 걸린 세포와 동일한 조직 유형의 질병에 걸리지 않은 세포로부터 유래한 게놈 (매치된(matched) 게놈) 내의 부위와 상이한 상동성을 갖는 대립유전자이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 질병-특이적 표적으로서 적합한 네오에피토프 (적합한 네오에피토프)는 면역계에 의해 표적화된 경우에, 질병에 걸린 조직에 의하여 발현이 하향 조절되거나 침묵될 (예를 들어, 결실에 의해) 가능성이 적으므로, 질병에 걸린 조직은 반응, 바람직하게는 예를 들어, 네오에피토프에 대한 백신접종 또는 네오에피토프를 표적화 (결합)할 수 있는 면역 세포를 투여함으로써 네오에피토프에 대하여 생성된 면역 반응을 벗어날 수 있는 가능성이 적다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 돌연변이 대립유전자의 카피 수는 돌연변이 대립유전자를 포함하는 유전자의 카피 수와 동일할 수 있으므로, 본 발명은 또한 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하기 위한 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 돌연변이 대립유전자 또는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 높은 카피 수는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타내므로, 돌연변이 대립유전자 또는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수가 높을수록, 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성이 높다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 질병에 걸린 세포에서 돌연변이 대립유전자 또는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수가 2보다 크다는 것은, 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타낸다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 보다 크다는 것은, 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타낸다.
하나 이상의 카피가 돌연변이 대립유전자를 갖는 유전자의 모든 카피에 돌연변이가 있는 경우가 아니라면, 유전자의 많은 카피는 돌연변이 대립유전자를 갖는 것이 바람직하며, 즉, 유전자의 카피의 보다 낮은 분율(fraction) 보다는 보다 높은 분율이 돌연변이 대립유전자를 갖는 것 (보다 낮은 분획 접합성(fractional zygosity) 보다는 높은)이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 구현예에 있어서, 돌연변이 대립유전자는 적어도 하나의 카피가 돌연변이 대립유전자를 갖는 유전자의 카피의 높은 분율로 발견되고 (분획 접합성), 분획 접합성은 돌연변이 대립유전자가 매핑되는(map), 특히 기준 게놈 또는 상응하는 야생형 게놈 또는 매치된 게놈, 즉, 동일한 개체로부터 야생형 게놈의 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수에 대한 돌연변이 대립유전자의 카피 수 (돌연변이 대립유전자의 접합성)의 비율이다. 돌연변이 대립유전자 카피의 분획 접합성이 높을수록, 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성이 높다. 바람직하게는, 분획 접합성은 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95 보다 클 수 있고, 가장 바람직하게는 분획 접합성은 1이며, 즉, 질병에 걸린 세포 내의 유전자의 모든 카피가 돌연변이 대립유전자를 갖는다. 분획 접합성이 1인 것은, 질병에 걸린 세포가 상응하는 야생형 에피토프를 발현하기 위해 되돌아갈 수 없도록 하기 위하여 유전자의 야생형 카피는 없다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 1의 분율은 돌연변이 대립유전자/유전자의 유전적인 배열, 예를 들어, 카피 수, 접합성은 동일하다는 가설이 데이터에 의해 부인될 수 없다는 것, 즉, 통계적으로 일치한다는 것이다.
종양과 같은 질병에 걸린 조직은 그들의 유전적인 구성 및 유전자 발현이 불균일하여 질병에 걸린 조직의 질병에 걸린 모든 세포가 유전자 및/또는 적어도 하나의 카피가 돌연변이 대립유전자를 갖는 유전자의 카피 수 (유전자의 전체적인 카피 수) 및/또는 질병-특이적 돌연변이 자체가 훨씬 적은, 돌연변이 대립유전자를 갖는 유전자의 카피를 갖지 않을 가능성이 있다고 알려져 있다. 그러므로, 예를 들어, 돌연변이 대립유전자의 카피 수 및/또는 분획 접합성 및/또는 돌연변이 대립유전자가 매핑되는 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수는 질병에 걸린 조직 내에 질병에 걸린 세포의 낮은 분율 보다는 질병에 걸린 세포의 높은 분율 (낮은 클론(clonal) 분율 보다는 높은)로 동일하거나 유사한 것으로 발견되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 돌연변이 대립유전자의 카피 수 및/또는 분획 접합성 및/또는 돌연변이 대립유전자가 매핑되는 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수와 동일한 또는 유사한 카피 수를 갖는 질병에 걸린 세포의 분율이 높을수록, 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성이 높다. 예를 들어, 클론 분율은 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 적어도 0.9일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에 있어서, 질병에 걸린 조직 내의 모든 질병에 걸린 세포는 동일하거나 유사한 카피 수를 가지며, 즉, 클론 분율은 1이고, 즉, 통계적으로 일치한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 동일하거나 유사한 카피 수는 동일한 카피 수 또는 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4% 이내의 카피 수; 카피 수, 예를 들어 카피 수 또는 오차 수정되거나 되지 않은 절대 카피 수의 3%, 2% 이하의 카피 수를 포함한다.
바람직하게는, 돌연변이의 클론 분율은 돌연변이와 동일하거나 유사한 유전 적인 배열을 갖는 질병에 걸린 세포의 분율에 의해 주어질 수 있고, 돌연변이의 유전적인 배열은 돌연변이가 매핑된 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수와 돌연변이 대립유전자의 카피 수를 포함한다. 특징이 모든 질병에 걸린 세포 내에 사용가능한 데이터에 의해 통계적으로 반박될 수 없는 정도까지 존재한다면 특징은 질병에 걸린 세포군에 고정되어 있다고 한다. 바람직하게는, 1의 클론 분율은 돌연변이의 유전적인 배열이 질병에 걸린 세포군 내에 고정되어 있음을 의미한다. 바람직하게는, 돌연변이가 질병에 걸린 세포군 내에 고정되고 돌연변이를 인코딩하는 부위에 영향을 미치는 CNV가 질병에 걸린 세포군 내에 고정되는 경우 돌연변이의 유전적인 배열은 질병에 걸린 세포군 내에 고정된다. 바람직하게는, 돌연변이가 매핑된 뉴클레오타이드 부위의 총 카피 수가 2이고 질병에 걸린 (종양) 게놈의 균형 잡힌 영역 내에 있는 돌연변이가 질병에 걸린 세포군 내에 고정된 것으로 결정되고 나서, 돌연변이의 유전적인 배열이 고정된다.
질병-특이적 돌연변이가 발견된 유전자는 게놈 내의 모든 유전자에 잠재적으로 존재할 수 있다. 적합한 네오에피토프를 유발하는 돌연변이가 발견되는 바람직한 유형의 유전자는 발현이 세포를 암 표현형으로 형질전환하도록 유발하거나 유전자 발현의 부족은 암 세포가 암 표현형을 상실하도록 유발하는 유전자, 즉 발현이 종양 진행의 원인이 되는 유전자이다. 이러한 유전자는 원인 유전자(driver gene)로 알려져 있다. 많은 종류의 종양에 대한 운전자 유전자의 예는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 12 가지 암 유형의 3,205 종양에 작용하는 291개의 높은 확실함 암 원인 유전자 목록이 [Tamborero et al., 2013, Comprehensive identification of mutational cancer driver genes across 12 tumor types, Scientific Reports 3:2650]에 개시되었다. 추가적인 원인 유전자는 [Youn et al., 2011, Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies, Bioinformatics 27(2):175-181], [Sakoparnig et al., 2015, Identification of constrained cancer driver genes based on mutation timing, PLoS Comput. Biol. 11(1):e1004027], 및 [Forbes et al., 2008, Current protocols in human genetics 10-11] 내에 개시되어 있는 방법을 사용하여 동정되었다. 원인 유전자의 질병-특이 적 돌연변이는 암 표현형의 원인이 될 수도 있고 아닐 수도 있다. 바람직하게는, 질병에 걸린 세포 내에서 발견되는 모든 원인 유전자의 카피는 질병-특이적 돌연변이를 갖는다. 또한, 바람직하게는, 질병에 걸린 조직 내의 모든 세포는 원인 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 질병에 걸린 세포이다.
다른 바람직한 유형의 유전자는 필수 유전자이다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 필수 유전자는 침묵되거나 발현이 감소된 (예를 들어, 결실됨으로써) 경우에, 적어도 세포의, 바람직하게는 질병에 걸린 세포의 성장 장애 또는 감소된 적합성을 유발하는 유전자이다. 이러한 유전자는 본 명세서에서 필수 유전자라고 한다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 필수 유전자는 유전자가 침묵되지 않거나 발현이 감소되지 않은 세포와 비교하여 유전자가 침묵되거나 발현이 감소된 질병에 걸린 세포의 성장 또는 감소된 적합성에서 적어도 10%의 감소가 있는 유전자이다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 성장 또는 감소된 적합성의 감소는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 필수 유전자의 침묵 또는 감소된 발현이 질병에 걸린 세포의 치사를 유발한다. 바람직하게는, 질병에 걸린 세포 내에서 발견되는 필수 유전자의 모든 카피는 질병-특이적 돌연변이를 갖는다.
필수 유전자는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 마우스 (Liao et al., 2007, Trends Genet. 23:378-381), 과실 파리 (Spradling et al., 1999, Genetics 153:135-177), 예쁜꼬마선충(C. elegans) (Kamath et al., 2003, Nature 421:231-237), 제브라피쉬 (Amsterdam et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:12792-12797), 애기장대 (Tzafrir et al., 2004, Plant Physiol. 135:1206-1220), 효모 (Kim et al., 2010, Nat. Biotechnol. 28:617-623)등과 같은 다른 진핵 유기체 내에 상응하는 오르소로그(ortholog) 뿐만 아니라, 예를 들어, 인간 내에서의 (예를 들어, 인간 세포주 또는 다른 유기체로부터 유래된) 필수 유전자 리스트는 [Liao et al., 2008, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 105: 6987-6992] 및 [Georgi et al., 2013, PLoS Genetics 9 (5):e1003484]에 개시되어 있다. 인간 암 세포주로부터 유래된 필수 유전자 리스트는 [Wang et al., 2015, Science 350:1096-1101]에 개시되어 있고, 필수 유전자 리스트는 필수 유전자의 데이터베이스, DEG5.0 (Zhang et al., 2009, Nucleic Acids Res. 37:D455-D458)에서 찾을 수 있다.
추가적으로, 결실/침묵이 세포주 코호트(cohort)의 적합성을 현저하게 감소시키는 필수 유전자의 리스트는 다수의 건강한 조직 및/또는 암 세포주로부터 경험적으로 생성될 수 있으며, 세포주는 기증자 또는 환자로부터 유래 될 수 있다. 유전자의 결실/침묵은 CRISPR 기술, RNA 간섭 등과 같은 다양한 분자 생물학 기술을 사용하여 실험적으로 수행될 수 있으며, 세포의 생존 또는 적합성은 추정되는 필수 유전자의 발현 여부로 결정된다. 필수 유전자의 리스트는 또한 세포 또는 세포주로부터 실험적으로 결정될 수 있거나 필수 유전자의 리스트는 바이오인포매틱(bioinformatic) 접근법에 의해 수득될 수 있다. 세포 또는 세포주는 질병에 걸린 세포 또는 세포주 (종양 세포 또는 세포주) 또는 질병에 걸리지 않은 (건강한/정상적인) 세포 또는 세포주일 수 있으며, 기증자 또는 질병을 가진 환자로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 질병에 걸리지 않은 세포 또는 세포주는 질병에 걸린 세포와 같은 동일한 조직 유형, 보다 바람직하게는 동일한 환자로부터이다. 본 발명에 따른 구현예에 있어서, 질병이 암인 경우, 세포 또는 세포주는 원발성 종양 또는 존재하는 경우 임의의 전이로부터 수득될 수 있다. 추가로, 필수 유전자의 리스트는 신체의 다양한 조직에서 발현되는 최소한의 유전자 세트와 본질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 필수 유전자는 다양한 상이한 조직에서 발현되는 유전자이며, 0보다 큰, 바람직하게는 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25 보다 큰 RPKM (백만 매핑된 리드(reads) 당 전사의 킬로베이스 당 최소한의 리드) 임계값으로 발현된다. 이러한 필수 유전자의 리스트는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 보다 상이한 조직으로부터 수득한 세포 샘플 패널로부터 얻은 RNA 발현 데이터 (예를 들어, RNAseq)를 분석함으로써 수득될 수 있다. 게다가, 환자의 종양 세포주가 이용 가능하다면, 모든 카피가 네오에피토프를 인코딩하는 돌연변이를 함유하는 유전자를 한 번에 하나씩 삭제할 수 있으며 각각 변형된 세포주의 성장 비율이 측정된다. 이러한 측정/분석은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 고-처리량 방법에 의해 수행될 수 있으며, 질병에 걸린 또는 걸리지 않은 세포의 적합성에 대한 그 효과를 평가하기 위하여, 한 번에 적어도 하나의 유전자, 바람직하게는 한 번에 많은 유전자를 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법은 또한 아래에 논의된 합성 병(synthetic sick) 또는 치사의 유전자 조합을 검출할 수 있다. 간략하게, 하나의 유전자가 결핍된(missing) 각 세포주의, 세포주 라이브러리는 하나 이상의 후보 유전자의 결실을 시험하여 결실 유전자의 세포에 대한 영향이 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서 유전자의 카피 수를 결정하는 단계, 즉, 적어도 하나의 유전자 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 종양 세포와 같은 질병에 걸린 세포 내에, 예를 들어, 초점성 증폭(focal amplification)에 의해 유전자가 높은 카피 수를 갖는 경우, 유전자가 원인 유전자일 수 있는 가능성이 매우 크다. 따라서, 유전자의 높은 카피 수는 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성을 나타내고, 유전자의 카피 수가 높을수록 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성이 높다. 예를 들어, 높은 카피 수는 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 보다 큰 카피 수일 수 있다. 높은 카피 수는 또한 상응하는 질병에 걸리지 않은 세포 내의 유전자의 카피 수 보다 적어도 50% 더 큰 카피 수일 수 있다. 높은 카피 수는 적어도 하나의 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수가 상응하는 질병에 걸리지 않은 세포 내의 유전자의 카피 수 보다 적어도 2x, 3x, 5x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x 또는 적어도 100x 큰 것일 수 있다. 정상적인 게놈 내에 존재할 수 있는 카피 수의 변이 때문에, 정상적인 게놈 내의 유전자의 카피 수는 반드시 2는 아니다. 게다가, 초점성 증폭은 다른 질병 보다는 상피 성장 인자 수용체 유전자가 종종 초점성으로 증폭되는 교모세포종(glioblastoma)과 같은 특정 질병에서 종종 관찰되는 것으로 알려져 있어서, 이 구현예는 이들 질병에 사용하기에 매우 적합하다.
추가로, 유전자의 카피 수는 질병에 걸린 세포의 낮은 분율 보다 질병에 걸린 세포의 높은 분율로 동일하거나 유사하게 발견되면, 동일하거나 유사한 카피 수를 가진 질병에 걸린 세포의 분율이 높을수록, 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성이 높은 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 바람직한 일 구현예에 있어서, 질병에 걸린 조직 내의 모든 질병에 걸린 세포는 적어도 하나의 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 동일하거나 유사한 카피 수를 가지며, 즉 클론 분율은 1이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 동일하거나 유사한 카피 수는 동일한 카피 수 또는 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4% 이내의 카피 수; 카피 수, 예를 들어 카피 수 또는 오차 수정되거나 되지 않은 절대 카피 수의 3%, 2% 이하의 카피 수를 포함한다.
게다가, 높은 카피 수를 가지며, 적어도 하나의 카피가 네오에피토프를 유발하는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자는 바람직하게는 발현이 세포를 암 표현형으로 형질전환하도록 유발하거나 발현의 부족은 암 세포가 암 표현형을 상실하도록 유발하는 유전자, 즉, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 원인 유전자와 같은 원인 유전자일 수 있거나, 필수 유전자, 예를 들어, 침묵되거나 발현이 감소된 경우에, 적어도 질병에 걸린 세포의 성장 장애 또는 적합성의 감소를 유발하는 유전자일 수 있다.
본 발명은 또한 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자가 필수 유전자인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 필수 유전자는 침묵되거나 발현이 감소된 경우에 (예를 들어, 유전자의 결실에 의해), 적어도 질병에 걸린 세포의 성장 장애 또는 감소된 적합성을 유발하는 유전자이다. 본 구현예에 있어서, 유전자가 필수 유전자이고 필수 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이 (1의 분획 접합성)를 갖는 것이 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성을 나타낸다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 필수 유전자는 다양한 상이한 조직에서 발현되는 유전자이며, 0보다 큰, 바람직하게는 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25 보다 큰 RPKM (백만 매핑된 리드 당 전사의 킬로베이스 당 최소한의 리드) 임계값으로 발현된다. 바람직하게는, 필수 유전자의 모든 카피는 돌연변이를 포함한다. 추가로, 질병에 걸린 세포의 높은 분율은 필수 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 필수 유자의 카피를 함유하는 것 (낮은 클론 분율 보다는 높은)이 바람직하며, 필수 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 필수 유전자의 카피를 함유하는 질병에 걸린 세포의 분율이 높을수록, 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성이 높다. 본 발명에 따른 보다 바람직한 구현예에 있어서, 질병에 걸린 조직 내의 질병에 걸린 모든 세포는 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는, 즉 클론 분율이 1인 필수 유전자를 갖는다.
개별적으로 침묵되거나 그들의 발현이 개별적으로 감소되는 경우에, 만약에 있다면, 특정 유전자는 질병에 걸린 세포의 적합성 또는 성장 능력에 미치는 영향은 작은 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 유전자 중 두 유전자가 모두 침묵되거나 각각의 발현이 감소된 경우 치사에 이르는 보다 강한 성장 장애를 유발할 수 있다는 것이 관찰되었다. 이러한 유전적인 조합을 합성 치사(synthetic lethal) 또는 합성 병/장애라고 한다. 합성 치사 및 합성 병 유전자와 이러한 유전자를 동정하기 위한 방법에 관하여 논의하기 위해서는 [Nijman, 2011, Synthetic lethality: General principles, utility and detection using genetic screens in human cells, FEBS Lett. 585:1-6]를 참고한다. 세포가 생존하기 위해서는 두 유전자가 요구되기 때문에, 세포는 두 유전자를 침묵시키거나 발현을 감소시키지 않을 것이다. 따라서, 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합한 조합은 적어도 두 개의 유전자에서 질병-특이적 돌연변이로부터 생성될 수 있으며, 유전자들은 함께 합성 치명적이거나 합성 질병이다. 이러한 관점에서, 추가로 본 발명은 적어도 두 개의 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 적어도 두 개의 네오에피토프의 조합의 질병-특이적 표적 조합으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 각각 질병-특이적 돌연변이를 갖는 적어도 두 개의 유전자의 조합이 합성 치사 또는 합성 병 유전자인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 적어도 두 개의 유전자의 조합이 합성 치사 또는 합성 병의 표현형을 유발하는 경우에, 이는 생성된 네오에피토프가 질병-특이적 표적의 적절한 조합이라는 것을 나타낸다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에 있어서, 합성 병은 적어도 개별적으로 각각의 유전자의 결실/감소된 발현의 부가적인 효과로부터 예상되는 것 보다 세포 성장/적합성에 더 큰 효과를 초래한다. 이러한 접근은 네오에피토프의 수가 높을수록, 합성 병 또는 치사일 수 있는 조합의 수가 많기 때문에 높은 수의 적절한 네오에피토프가 있는 것이 선호된다. 예를 들어, 10개의 돌연변이는 45개의 가능한 조합에 상응하며, 100개의 돌연변이는 4950개의 조합에 상응하며, 1000개의 돌연변이는 약 500,000개의 조합에 상응한다. 본 발명에 따른 특정 구현예에 있어서, 적어도 두 개의 유전자는 각각 낮은 분획 접합성 보다 높은, 바람직하게는 1의 분획 접합성을 가지며, 및/또는 각각은 질병에 걸린 세포 및 질병에 걸린 조직 내의 질병에 걸린 세포 둘 다에서 낮은 클론 분율 보다는 높은, 바람직하게는 1의 클론 분율을 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 적합한 네오에피토프의 조합에서 발견되는 각각의 네오에피토프는 각각 본 발명의 목적에 적합한 네오에피토프인 것으로 간주된다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 질병에 걸리거나 걸리지 않은 세포에서의 유전자의 카피 수는 상대적인 카피 수일 수 있지만, 바람직하게는 절대 카피 수이며, 보다 바람직하게는 배수성(ploidy)에 대하여 표준화된 절대 카피 수, 예를 들어, 질병이 걸린 세포의 게놈의 배수성, 즉, 게놈의 카피 수이다. 보다 더 바람직하게는, 상대, 절대 및 표준화된 카피 수는 오차 수정된다.
예를 들어 돌연변이 대립유전자 또는 유전자 또는 접합성의 절대 카피 수를 추정하는(estimating) 경우에, 추정치가 정확하지 않을 수 있으며 오차의 원인을 고려하여 절대 카피 수를 수정하는 것이 바람직하다. 차세대 시퀀싱(next generation sequencing)이 게놈 및 엑솜으로부터 서열 정보를 얻기 위하여 사용되는 본 발명에 따른 구현예에 있어서, 오차의 원인은 다음을 포함할 수 있다: 종양 샘플과 같은 질병에 걸린 조직 샘플의 추정된 순도에서의 바이어스(bias), 순도 및/또는 절대 카피 수를 얻기 위하여 요구되는 어떠한 추정된 파라미터에서의 바이어스, 시퀀싱되는 샘플의 한정된 커버리지(coverage)로 인한 확률적 오차, 낮은 순도로 인한 한정된 검출 능력, 낮은 클론 분율 등.
본 발명과 동일한 날에 "주된 균형잡힌 이형접합성 세그먼트에 기초한 종양 모델링"이라는 명칭으로 출원되고, 본 명세서에서 전체 내용이 참조로서 인용된, 국제 PCT 특허 출원에 개시된 바와 같이, 세그먼트(segment)의 절대 카피 수에서 오차는 돌연변이 대립유전자의 절대 카피 수와 같은, 다른 추정된 파라미터, 예를 들어 SNV, 네오에피토프를 인코딩하는 것, 돌연변이 대립유전자의 접합성, 클론 분율 등에 전파될 수 있다. 이러한 후속 추정된 파라미터가 본 명세서에 기재된 바와 같이 환자에 대한 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 적합성을 결정하기 위한 임상 적인 영향을 가지므로, 절대 카피 수의 가장 정확한 값을 얻기 위해 절대 카피 수의 오차를 수정하는 것이 바람직하다. 게다가, 네오에피토프를 인코딩하는 돌연변이는 본 명세서에서 논의된 기준을 사용하여 환자에게 투여될 백신에 적합성을 부여하기 위해 우선 순위를 매길 수 있기 때문에, 1의 분획 접합성이 1 보다 작은 분획 접합성 보다 질적으로 우수하기 때문에, 특히 돌연변이를 함유하는 유전자가 필수 유전자인 경우, 절대 카피 수 및 이로부터 유도된 임의의 파라미터의 가장 정확한 추정치를 갖는 것이 유익하다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에 있어서, 돌연변이 대립유전자의 절대 카피 수, 예를 들어 SNV 및/또는 SNV의 접합성은 오차 수정될 수 있다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, SNV의 절대 카피 수를 먼저 오차 수정한 다음, SNV의 오차 수정된 절대 카피 수를 반영하기 위하여 SNV의 접합성이 수정된다. 일단 SNV의 절대 카피 수 및/또는 SNV의 접합성이 오차 수정되면, 클론 분율의 추정치는 클론 분율이 통계적으로 1의 값과 일치하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 오차 수정된 카피 수를 반영하도록 수정될 수 있다.
SNV의 절대 카피 수는 바람직하게는 SNV가 매핑하는 세그먼트의 절대 카피 수에 의해 주어지는 것이 바람직하다. 질병에 걸린, 예를 들어, 종양 게놈의 모든 세그먼트의 절대 카피 수는 SNV의 절대 카피 수를 포함하도록 오차 수정될 수 있다. 일단 게놈 내의 모든 세크먼트의 절대 카피 수를 오차 수정하면, 오차 수정된 배수성은 질병에 걸린, 예를 들어, 종양 게놈 내 세그먼트의 오차 수정된 절대 카피 수에 기초하여 계산될 수 있다.
본 발명에 따른 특정 구현예에 있어서, SNV의 절대 카피 수가 오차 수정되어 새로운 카피 수가 원래 카피 수와 상이하다면, 이는 SNV의 추정된 절대 카피 수가 신뢰할 수 없다는 의미로서 간주될 수 있다.
세그먼트의 절대 카피 수의 오차 수정의 하나의 예는, 세그먼트가 균형잡힌 영역에 있는 경우, 홀수의 절대 카피 수를 짝수 절대 카피 수로 수정하는 단계를 포함하는, 패리티(parity) 오차 수정이다. 균형잡힌 영역은 질병에 걸린, 예를 들어 종양 게놈의 영역이며, 이 영역 내의 모계 및 부계 대립유전자가 균등한 (균형 잡힌) 증폭을 겪거나 또는 모체 및 부형 대립유전자 둘 다 전혀 증폭을 하지 않는다.
세그먼트의 홀수 절대 카피 수를 가장 가까운 보다 높은 짝수 절대 카피 수 또는 가장 가까운 보다 낮은 짝수 절대 카피 수로 오차를 수정하는 결정은 질병 리드 및 정상 리드를 세그먼트에 매핑하고, 세그먼트의 절대 카피 수를 한정하는 예측된 경계값과 비교하는 것에 의존한다. 정상 리드는 시퀀스된 정상 샘플에 적용되는 리드이고, 질병 리드는 시퀀스된 질병에 걸린 샘플에 적용되는 리드인 것을 특징으로 한다. 특히, 질병이 암인 경우에, 종양 리드는 시퀀스된 종양 샘플에 적용되는 리드이다.
예를 들어, 첫 번째 유형의 패리티 오차 수정에서,
Figure pct00001
가 돌연변이가 매핑된 세그먼트의 질병에 걸린 게놈의 절대 카피 수이면,
Figure pct00002
값을 가질 것으로 예상되는 세그먼트의 절대 카피 수는
Figure pct00003
이면
Figure pct00004
로,
Figure pct00005
이면
Figure pct00006
로 수정될 수 있고, 여기서 r은 정상 세그먼트 리드 카운트 비율에 대한 질병 (질병 수, 예를 들어 세그먼트에 매핑되는 정상 리드의 수에 대한 세그먼트에 매핑되는 종양 리드의 비율)이고,
Figure pct00007
는 예측되는 결정 경계, 질병에 걸린 조직 샘플, 예를 들어, 종양 샘플의 순도에 의해 결정되는 값이다.
세그먼트의 대립유전자 특이적 카피 수는 모체 대립유전자 또는 부계 대립유전자의 질병에 걸린 게놈에서의 카피 수이다. 세그먼트가 이형접합성 SNP (이형접합성 세그먼트)를 포함하는 경우, 이형접합성 SNP는 세그먼트의 대립유전자 특이적 카피 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이형접합성 세그먼트는 바람직한 노드에 지정될 수 있으며, 노드는 이형접합성 세그먼트의 절대 카피 수와 이형접합성 세그먼트의 대립유전자 특이적 카피 수의 고유한 조합으로 정의될 수 있다. 노드가 세그먼트의 절대 카피 수가 짝수인 노드의 서브세트이다. 이형접합성 세그먼트가 하나 이상의 이형접합성 SNP를 함유한다면, 두 개 이상의 이형접합성 SNPs의 그룹은 그룹의 단일 구성으로 표현될 수 있거나, 각각의 이형접합성 SNP의 대립유전자 빈도가 질병에 걸린 게놈에서 더 높거나 낮은 수의 카피를 갖는 대립유전자에 대하여 일관적으로 계산된다면, 그룹의 모든 구성의 대립유전자 빈도는 평균화될 수 있거나, 중간값을 얻을 수 있다.
첫 번째 유형의 이형접합성 세그먼트의 패리티 오차 수정은, 예를 들어, 세그먼트에 매핑하는 측정된 질병 (예를 들어, 종양) 리드 및 정상 리드가 주어진 최대 가능성 프레임워크(framework)에 기초하여, 이형접합성 세그먼트에 상응할 가능성이 가장 높은 노드를 찾는 것을 포함할 수 있다.
두 번째 유형의 패리티 오차 수정에서, 패리티 오차 수정을 필요로 하지 않는 가장 가까운 업스트림 및 다운스트림(upstream and downstream) 세그먼트가 SNV를 함유하는 세그먼트의 10Mb, 5Mb, 1Mb 내에서 동정되는 것이 바람직하다. 업스트림 및 다운스트림 세그먼트 모두에 가장 가까운 절대 카피 수가 동일한 경우, SNV를 함유하는 세그먼트의 절대 카피 수는 가장 가까운 세그먼트의 절대 카피 수로 변경된다. 일반적으로, 두 번째 유형의 패리티 오차 수정은 적절한 이웃 세그먼트가 동정될 수 없기 때문에 수행될 수 없는 것이 아니라면, 첫 번째 유형의 패리티 오차 수정이 적용될 수 있는 경우에, 첫 번째 유형의 패리티 오차 수정 보다 선호될 수 있다.
세그먼트의 절대 카피 수의 다른 형태의 오차 수정이 또한 패리티 오차 수정 대신에 또는 추가로 도입될 수 있다. 예를 들어, 질병에 걸린 게놈에서 돌연변이를 함유하는 유전자의 바로 근처에 있는 세그먼트의 절대 카피 수를 고려하는 방법으로, SNV를 함유하는 세그먼트의 절대 카피 수가 이웃하는 세그먼트의 절대 카피 수의 모드로 변경되고, 바람직하게는 절대 카피 수의 변화가 3, 2 및 바람직하게는 1 이하이고, 바람직하게는 이웃하는 세그먼트의 대부분 (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%)이 모드와 동일한 절대 카피 수를 갖는다.
절대 복사 수에 대한 다른 오류 수정 체계가 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에 있어서, 첫 번째 패리티 오차 수정은 오차 수정의 첫 번째 계층으로서 적용되며, 그 위에는 추가적인 오차 수정 방법이 적용될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 세그먼트는 게놈의 미리결정된 영역, 예를 들어, 기준 게놈에 기초하여 미리 결정된 영역일 수 있다. 세그먼트는 리드가 정렬되는 기준 게놈 내에 정의된 바와 같이, 유전자에 확장(span) 할 수있다. 세그먼트는 또한 유전자의 단편, 엑손, 엑손의 유니온, 또는 주어진 유전자 내에서 연관된 엑손의 유니온일 수 있다. 세그먼트는 기준 게놈 내에서 미리결정된 영역의 또 다른 세트 (인트론을 갖거나 갖지 않는), 또는 정상 게놈에 기초한 기준 게놈 내에서미리결정된 영역의 또 다른 소정의 세트일 수 있다. 본 발명에 따른 특정 구현예에 있어서, 세그먼트는 주어진 일정한 카피 수 및/또는 질병에 걸린, 예를 들어 종양, 게놈 또는 대체적으로 주어진 일정한 카피 수 및/또는 질병에 걸린, 예를 들어 종양 게놈 내에 대립유전자 특이적 카피 수를 갖는 유전자의 단편 내에 주어진 일정한 카피 수 및/또는 주어진 대립유전자 특이적 카피 수를 갖는 기준 게놈의 영역 일 수 있다. 세그먼트는 인트론을 포함하거나 제외하는 것으로 정의될 수 있다.
주어진 게놈 (예를 들어, 정상 게놈 또는 종양 게놈) 내 세그먼트 카피 수는 SNPs 및/또는 SNVs 및/또는 예를 들어 돌연변이, 삽입, 결실 및/또는 다른 암 관련 유전적인 변이체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 다른 암 관련 변화에 의해 발생된 변이를 무시하면서, 얼마나 자주 세그먼트의 전체적인 뉴클레오타이드 서열이 게놈에서 발생하는지로 정의될 수 있다. 바람직하게는 주어진 게놈 내의 세그먼트의 상이한 카피는 동일한 길이 또는 거의 동일한 길이를 갖는다.
게놈 내의 세그먼트의 카피 수는 게놈을 함유하는 세포에서 세그먼트의 물리적인 카피 수를 의미할 수 있다. 정상적인 게놈 내 세그먼트의 절대 카피 수는 건강한 세포에서 주어진 세그먼트의 물리적인 카피 수로서 정의될 수 있다. 질병에 걸린, 예를 들어, 종양, 게놈 내의 세그먼트의 절대 카피 수는 질병에 걸린, 예를 들어, 종양 세포 내에 주어진 세그먼트의 물리적인 카피 수로서 정의될 수 있다. 게놈 내의 세그먼트의 카피 수는 상기 게놈 내의 세그먼트의 절대 카피 수로 언급될 수 있다. 카피 수는 절대 카피 수를 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 특정 구현예에 있어서, 세그먼트의 일부만이 게놈 내에서 증폭되거나 결실된다면, 이러한 세그먼트의 부분적인 카피는 세그먼트의 카피로 카운트되거나 세그먼트의 카피로 카운트되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에 있어서, 세그먼트 길이의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5 % 이하로 확장된(spanning) 세그먼트의 카피는 무시될 수 있다.
기준 게놈은 질병에 걸린 조직의 샘플을 제공하는 개체와 동일한 종으로부터 하나 이상의 구성원의 게놈에 기초할 수 있거나, 개체의 정상적인 게놈에 기초할 수 있다.
종양 샘플과 같은, 질병에 걸린 조직의 샘플은 또한 정상적인 게놈, 특히 샘플을 채취한 동일한 환자의 정상 게놈으로부터의 오염을 포함 및/또는 종양 내 이질성의 경우에, 또한 하나 이상의 종양 게놈을 포함할 수 있다. 순도, 종양 샘플 순도, 종양 순도 및 샘플 순도는 모두 동일한 의미로 취급되며, 바람직하게는 종양 샘플에 존재하는 종양 세포의 분율을 의미한다. 정상적인 오염은 바람직하게는 종양 샘플에 존재하는 정상 세포의 분율을 의미하며, 1에서 순도를 제외한 것으로 주어질 수 있다.
게놈 카피 결과로 인한 유전자 카피의 존재에 대한 세포 대조군의 배수성에 대하여 표준화하는 단계. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 절대 카피 수는 게놈의 배수성에 대하여 표준화될 수 있으며, 배수성은 각각의 세그먼트의 길이에 의해 가중된 주어진 세포인 주어진 게놈 내의 모든 세그먼트의 절대 카피 수의 평균이다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 절대 카피 수는 관심있는 돌연변이 유전자를 함유하는 (돌연변이를 포함하는) 염색체의 배수성에 대하여 표준화될 수 있으며, 배수성은 염색체 상의 각각의 세그먼트의 길이에 의해 가중된 주어진 세포 내에 주어진 염색체 상의 모든 세그먼트의 절대 카피 수의 평균이다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 절대 카피 수는 관심있는 돌연변이 유전자를 함유하는 염색체의 이웃하는 영역의 배수성에 대하여 표준화될 수 있으며, 배수성은 영역 내의 각각의 세그먼트의 길이에 의해 가중된 주어진 세포 내에 주어진 영역 내의 각각의 세그먼트의 평균이다. 이웃하는 영역은 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 미리결정된 거리 이내, 예를 들어 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 100 메가베이스 (Mb), 75 Mb, 50 Mb, 25 Mb, 10 Mb, 5 Mb, 4 Mb, 3 Mb, 2 Mb, 또는 1 Mb 이내 일 수 있다. 세그먼트의 카피 수는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 실험적으로 및 컴퓨터상으로, 공지된 방법에 의해 일상적으로 계산될 수 있다. 예를 들어, 유럽 등록특허 제 2198292 B1호 및 유럽 등록특허 제 2002016 B1호는 각각 핵산 서열의 상대적인 카피 수 및 카피 수 빈도를 결정하기 위한 방법을 개시한다. 또한, 유럽 특허 출원 공개공보 제 2835752 A호 및 국제 특허 출원 공개공보 WO 2014/014497호 및 WO 2014/138153호는 또한 카피 수 차이를 결정하기 위한 방법을 개시한다. 또한 [Machado et al., 2013, Copy Number Variation of Fc Gamma Receptor Genes in HIV-Infected and HIV-Tuberculosis Co-Infected Individuals in Sub-Saharan Africa, PLoS, 8(11):e78165]를 참조한다. 다른 방법은 FACS, FISH 또는 다른 형광 기반 방법, 스펙트럼 핵형분석 (SKY) 및 디지털 PCR의 사용을 포함한다. 세그먼트는 또한 유전자일 수 있다.
질병-특이적 돌연변이는 바람직하게는 질병에 걸린 세포 표면 상에서 네오에피토프의 발현을 유발하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 특히, 돌연변이는 인델(indel) 또는 유전자-융합 결과이거나 단일 뉴클레오타이드 변이 (점 돌연변이)일 수 있다. 바람직하게는, 질병-특이적 돌연변이는 비-동의 돌연변이, 바람직하게는 종양 또는 암 세포 내에서 발현되는 단백질의 비-동의 돌연변이이다. 질병-특이 적 돌연변이를 결정하기 위하여 본 발명에 속하는 기술 분야에서 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 특히 상응하는 질병에 걸리지 않은 게놈/엑솜과 비교하여 질병에 걸린 세포의 게놈/엑솜 사이의 임의의 변화를 결정하기 위하여 차세대 시퀀싱 데이터를 사용하는 방법이 선호된다. 예를 들어, [Carter et al., 2012, Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer, Nature Biotechnology 30:413-421]; [Cibulskis et al., 2013, Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples, Nature Biotechnology 31:213-219]; 및 [Li and Li, 2014, A general framework for analyzing tumor subclonality using SNP array and DNA sequencing data, Genome Biology 15:473-495]는 질병-특이적 돌연변이를 동정하기 위한 방법 뿐만 아니라 유전자 카피 수, 분획 접합성 및 접합성과 분획 접합성의 분획 서브클론성(subclonality)을 결정하기 위한 방법을 개시한다. 절대 카피 수와 같은, 카피 수를 결정하기 위한 또 다른 방법은 적어도 하나의 이형접합성 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)을 함유하는 각각의 세그멘트와 세그먼트는 균형잡힌 (이형접합성 SNP의 각각의 버전의 동일한 수) 게놈의 세그먼트의 사용에 관한 것이고, 바람직하게는 게놈의 모든 균형잡힌 세그먼트의 가장 빈번하게 관찰된 절대 카피 수인 공통적인 카피 수 (주된 카피 수)를 본 발명과 동일한 날에 "주된 균형잡힌 이형접합성 세그먼트에 기초한 종양 모델링"이라는 명칭으로 출원되고, 본 명세서에서 전체 내용이 참조로서 인용된, 국제 PCT 특허 출원에 개시된 바와 같이, 공유한다. 게다가, 절대 카피 수를 결정하는 것 이외에, 본 발명은 접합성, 분획 접합성 및 돌연변이 대립유전자 또는 적어도 하나의 카피가 돌연변이 대립유전자를 포함하는 유전자의 서브클론성을 결정한다. 추가로, 그런 점에서 방법론은 절대 카피 수에 대한 오차 수정을 수행하고, 절대 카피 수 및 접합성 및 그로부터 유도된 서브클론성, 배수성 등과 같은 파라미터의 정확성을 향상시킨다.
일반적으로, 돌연변이 대립유전자가 매핑되는 뉴클레오타이드 부위의 전체적인 카피 수는 특히 돌연변이가 SNV인 경우에, SNV의 절대 카피 수를 의미할 수 있는 돌연변이의 절대 카피 수를 의미할 수 있다. 일반적으로, 돌연변이의 절대 카피 수는 바람직하게는 돌연변이가 매핑되는 세그먼트의 절대 카피 수 (절대 카피 수가 질병에 걸린 조직, 예를 들어 종양 게놈인 것인)로 주어질 수 있다.
일반적으로, 네오에피토프를 인코딩하는 돌연변이 대립유전자의 카피 수는 SNV의 교대 대립유전자의 절대 카피 수 (SNV의 접합성)를 의미할 수 있는, 돌연변이의 돌연변이 대립유전자의 절대 카피 수를 의미할 수 있으며, SNV의 교대 대립유전자는 특히 돌연변이가 SNV인 경우에 돌연변이 대립유전자인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 돌연변이가 SNV가 아닌 경우에, 돌연변이의 돌연변이 대립유전자의 절대 카피 수는 SNVs에 적용된 방법과 유사한 방식으로 추정될 수 있다.
일반적으로, 유전자의 카피 수는 세그먼트의 절대 카피 수를 의미할 수 있으며, 세그먼트는 유전자일 수 있고, 유전자를 포함할 수 있는 것을 특징으로 한다. 유전자의 카피 수는 유전자의 절대 카피 수를 의미한다.
바람직하게는, 질병은 바이러스 감염된 세포와 같은, 질병에 걸린 세포/조직에 대한 면역 반응이 바람직한 임의의 질병일 수 있다. 바람직하게는, 질병은 암이다.
본 발명의 방법은 암 백신 내에 적합한 네오에피토프를 포함하는 것과 같은, 적합한 네오에피토프에 대한 면역 반응을 제공하기 위하여 본 발명의 방법에 의해방법에 사용하기 위한 적합한 질병-특이적 표적으로서 동정된 적합한 네오에피토프의 유용성/적합성을 결정하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 추가적인 단계는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 적합한 네오에피토프의 항원성 및/또는 면역원성을 결정하는 단계; 적합한 네오에피토프가 질병에 걸린 세포의 표면 상에 발현되는지 여부를 평가하는 단계; 에피토프가 제시된 MHC로서 제시되는 적합한 네오에피토프를 포함하는 펩타이드의 능력; 인코딩 핵산으로부터 적합한 네오에피토프의 발현 효능을 결정하는 단계; 예상된 적합한 네오에피토프가 특히 그들의 자연적인 서열 콘텍스트(context)에 존재하는 경우, 예를 들어, 자연적으로 발생한 단백질에서 인접한 아미노산 서열이 상기 네오에피토프 측면에 위치하는 경우, 및 항원 제시 세포에서 발현되는 경우에, 원하는 특이성을 갖는 환자의 T 세포와 같은 T 세포를 자극할 수 있는지 여부를 결정하는 단계.
네오에피토프가 항원성/면역원성, 발현되는 능력, 에피토프를 제시하는 MHC로서 제시되는 능력 등의 관점에서 표적으로 사용하기에 적합/적절하다고 결정되면, 동정된 적합한 네오에피토프는 질병에 걸린 세포로부터 하향-조절되거나 삭제되지 않을 가능성에 대하여 순위가 매겨 질 수, 즉, 우선 순위화될 수 있으므로, 질병에 걸린 조직이 네오에피토프의 표적을 벗어날 수 있는 가능성이 적다. 예를 들어, 하나의 우선 순위 결정은 필수 유전자의 모든 카피가 네오에피토프를 인코딩하는 돌연변이를 가지고 있는, 필수 유전자에 의해 인코딩된 하나의 "최상의" 네오에피토프부터 시작하여, 다음에는 합성 병 또는 치사 유전자의 쌍, 그 다음에는 네오에피토프를 인코딩하는 돌연변이를 갖는 각각의 유전자의 각각의 카피, 그 다음에는 유전자의 모든 유전자의 카피가 돌연변이를 가지는 매우 높은 절대 카피 수를 갖는 알려진 원인 유전자에 의해 인코딩된 네오에피토프, 그 다음에는 매우 높은 절대 카피 수와 높은 접합성을 갖는 원인 유전자로 알려지지 않은 유전자에 의해 인코딩된 네오에피토프, 그 다음에는 높은 카피 수 (접합성)을 갖는 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프 등이다.
본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 1의 분획 접합성을 갖는 필수 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프는 필수 유전자에 의해 인코딩되지 않는 다른 네오에피토프보다 선호된다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 1의 분획 접합성을 갖는 네오에피토프를 인코딩하는 두 개의 필수 유전자 사이에서, 더 높은 절대 카피 수를 갖는 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프가 선호된다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 네오에피토프를 인코딩하는 두 개의 필수 유전자 사이에서, 결실되는 경우에, 더 낮은 적합성을 유도하는 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프가 선호된다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 모든 유전자가 1의 분획 접합성을 갖는 네오에피토프를 인코딩하는 유전자 사이에서, 더 높은 절대 카피 수를 갖는 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프가 선호된다. 분획 접합성이 1보다 작은 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 높은 접합성을 갖는 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프가 높은 분획 접합성을 갖는 유전자 보다 선호하고, 접합성이 동일하거나 유사한 경우, 높은 절대 카피 수를 갖는 유전자는 높은 분획 접합성을 갖는 유전자 보다 선호된다 (돌연변이 대립유전자의 10 카피/뉴클레오타이드의 20 전체적인 카피가 높은 접합성으로 인한 3/4 보다 우수하며; 10/100은 원인 유전자일 수 있으므로 10/20 보다 우수하고; 9/100은 접합성이 유사하지만 원인 유전자일 수 있으므로 10/20보다 우수하다). 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 질병-특이적 돌연변이가 세포를 암 표현형으로 형질전환시키는 원인이 되는 원인 유전자에 의해 인코딩되는 네오에피토프는 돌연변이가 세포를 암 표현형으로 형질전환시키는 역할을 하지 않는 원인 유전자에 인코딩되는 네오에피토프 보다 선호된다. 게다가, 낮은 클론 분율 보다는 높은 클론 분율을 갖는 네오에피토프는가 선호된다.
본 발명에 따른 추가적인 구현예는 의약, 백신과 같은, 예를 들어, 개인 맞춤화된(personalized) 암 백신의 제조에 있어서, 질병-특이적 표적으로서의 네오에피토프의 용도를 결정하는 방법에 관한 것이다. 백신은 하나 이상의 적합한 네오에피토프 또는 본 발명의 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프의 조합으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에 있어서, 백신은 하나 이상의 적합한 네오에피토프 또는 본 발명의 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프의 조합을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
특히, 환자에게 투여되는 경우에, 바람직하게는 적합한 네오에피토프 중 적어도 하나 또는 본 발명의 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프의 조합 중 적어도 2개인, 예를 들어 2 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상 및 바람직하게는 60 이하, 55 이하, 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 이하 또는 30 이하인 에피토프를 제시하는 MHC와 같은, 에피토프를 제시하는 MHC의 조합을 제공하는 재조합 백신이 제공될 수 있다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의한 이들 에피토프의 제시는 바람직하게는 MHC에 결합되는 경우에 T 세포를 표적화하는 에피토프를 유발하고, 따라서 에피토프를 제시하는 MHC로부터 항원을 발현하는, 환자의 종양, 바람직하게는 종양 전이 뿐만 아니라 주된 종양은 유도되고 종양 세포의 표면 상에 동일한 에피토프를 제시한다.
본 발명의 방법은 또한 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프의 조합 내에서 하나의 네오에피토프를 표적으로 하는 항원 수용체를 발현하는 재조합 면역 세포의 제조에서 유용하다. 바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이고 항원 수용체는 T 세포 수용체이다.
본 발명은 또한 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프의 조합 내에서 하나의 네오에피토프를 표적으로 하는 재조합 면역 세포를 제공하는 방법, 및 이러한 방법에 의해 제조된 재조합 면역 세포에 관한 것으로, 상기 방법은 면역 세포를 적합한 네오에피토프 또는 질병-특이적 표적으로서 네오에피토프의 적합성을 결정하기 위한 본 발명의 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프의 조합 내에서 하나의 네오에피토프를 표적으로 하는 재조합 항원 수용체로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 세포군 또는 조직을 표적화하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 네오에피토프에 대항하는 항체는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 본 발명은 포유동물에서 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 표적 세포 군 또는 표적 조직에 면역 반응을 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 포유동물에게 하기와 같이 투여하는 단계를 포함한다: (a) 하나 이상의 네오에피토프를 표적하는 하나 이상의 항원 수용체를 발현하는 하나 이상의 면역 세포; (b) 하나 이상의 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계; 또는 (c) 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하기 위한 본 발명의 방법에 따라 네오 에피토프가 동정된, 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 투여하는 단계. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 포유동물에서 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직에 면역 반응을 제공하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: (i) 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 네오에피토프를 인코딩하는 유전자의 돌연변이 대립유전자 (질병-특이적 돌연변이)의 카피 수를 결정하는 단계; 및 (ii) (a) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 표적으로 하는 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 투여하는 단계; (b) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계; 또는 (c) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 투여하는 단계.
본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 포유동물에서 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직에 면역 반응을 제공하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: (i) 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 유전자의 적어도 하나의 카피가 네오에피토프를 유발하는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수를 결정하는 단계; 및 (ii) (a) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 표적으로 하는 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 투여하는 단계; (b) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계; 또는 (c) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 투여하는 단계. 본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 포유동물에서 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직에 면역 반응을 제공하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: (i) 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자가 필수 유전자인지 여부를 결정하는 단계; 및 (ii) (a) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 표적으로 하는 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 투여하는 단계; (b) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계; 또는 (c) 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 투여하는 단계. 바람직하게는, 필수 유전자의 모든 카피는 질병-특이적 돌연변이를 가지며, 즉 분획 접합성은 1이다.
본 발명에 따른 일 구현예에 있어서, 포유동물에서 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직에 면역 반응을 제공하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: (i) 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 각각 네오에피토프를 유발하는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 적어도 두 개의 유전자의 조합이 합성 치사 또는 합성 병 유전자인지 여부를 결정하는 단계; 및 (ii) (a) 적어도 두 개 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 하나 이상의 네오에피토프를 표적으로 하는 하나 이상의 항원 수용체를 발현하는 하나 이상의 면역 세포를 투여하는 단계; (b) 적어도 두 개 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 하나 이상의 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계; 또는 (c) 적어도 두 개 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 투여하는 단계. 바람직하게는, 적어도 두 개의 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 모든 네오에피토프는 투여된 면역 세포에 의해 표적화되거나, 투여된 핵산에 의해 인코딩되거나 또는 투여된 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내에 포함된다.
게다가, 질병, 장애 또는 증상는 치료 또는 예방되도록, 면역 반응은 질병 특이적-돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프의 발현과 관련된 질병, 장애 또는 증상를 갖는 포유동물에 제공될 수 있다. 바람직하게는 질병, 장애 또는 증상는 암이다.
바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이고 항원 수용체는 T 세포 수용체이고, 면역 반응은 T 세포 매개 면역 반응이다. 보다 바람직하게는, 면역 반응은 항-종양 면역 반응이고, 하나 이상의 적합한 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a 및 1b는 표피 성장 인자 수용체 유전자 (EGFR)의 높은 초점성(focal) 증폭을 갖는 교모세포종(Glioblastoma) 샘플이다. 도 1a: 염색체 7 상에서 EGFR을 둘러싼 국소적인 유전자의 그래프적 표현. 도 1b: 가장 높은 절대 카피 수를 갖는 12 개의 단일 뉴클레오티드 변이의 목록.
도 2는 접합성에 의해 분류된 흑색종 샘플의 질병-특이적 돌연변이를 갖는 많은 유전자의 목록이다.
도 3은 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 (분획 접합성이 1과 동일하다) 흑색종 샘플의 유전자 목록으로, 이 유전자들 중 세 개는 인간의 필수 유전자이거나 인간의 필수 유전자로 추정된다.
도면에 대한 약어: chr_pos는 염색체 위치; CN은 절대 카피 수; Cx는 접합성; EC는 절대 카피 수의 오차 수정; VAF는 변이형 대립유전자 빈도; rho는 돌연변이 대립유전자를 함유하는 종양 세포의 추정된 퍼센트; FLRT+u는 돌연변이에서 스코어의 신뢰도; Site classification는 돌연변이의 신뢰 등급이다; essential gene, Y는 유전자가 필수적인 것으로 밝혀진 경우이다.
이하에 본 발명을 상세히 설명하고 있지만, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것이 아니고 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구현예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 구성요소를 설명할 것이다. 이들 구성요소는 특정 구현예와 함께 열거되지만, 이들은 임의의 방식 및 임의의 수로 조합되어 추가적인 구현예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 바람직한 구현예들은 본 발명을 단지 명시적으로 기재된 구현예들만으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 기재는 명시적으로 기재된 구현예들과 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성요소들을 조합하는 구현예들를 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 본 출원에서 기재된 모든 구성요소들의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본 출원의 기재에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서 네오에피토프는 높은 분획 접합성 보다는 높은 접합성을 가지며, 하나의 바람직한 구현예에서 네오에피토프는 필수 유전자의 돌연변이로부터 생성되고, 바람직한 구현예에서는, 적합한 네오에피토프는 높은 분획 접합성을 가지고 필수 유전자의 돌연변이로부터 생성되고, 보다 바람직한 구현예에서는 분획 접합성이 1과 동일하다.
바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 용어들은 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. K
Figure pct00008
lbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 발명을 실시는 달리 지시되지 않는 한, 기술 분야의 문헌 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참조)에서 설명되는 생화학, 세포생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이다.
이하의 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 구성, 정수 또는 단계 또는 구성, 정수 또는 단계의 그룹을 포괄하는 것을 암시하며, 비록 일부 구현예에서는 다른 구성, 정수 또는 단계 또는 구성, 정수 또는 단계의 그룹을 제외할 수도 있지만, 그러한 다른 구성, 정수 또는 단계 또는 구성, 정수 또는 단계의 그룹이 제외되는 것을 암시하는 것은 아니며, 즉 본 발명의 주제는 명시된 구성, 정수 또는 단계 또는 구성, 정수 또는 단계의 그룹을 포괄하는 것으로 구성된다. 본 발명을 기재하는 문맥상 (특히 청구범위의 문맥상) 사용된 단어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 참조 용어들은 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 아우르는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위 내에 속하는 각각의 분리된 값들을 개별적으로 간편하게 지칭하기 위한 것이다. 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한, 각각의 분리된 값들은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 통합된다.
본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어, 인코딩 유전자의 카피 수를 결정함으로써 네오에피토프가 적합한 질병-특이적 표적인지 여부를 결정하는 것은 유전자가 원인 유전자 또는 필수 유전자임을 결정하기 전, 후 또는 동시에 결정될 수 있거나, 네오에피토프가 세포 표면 상에 발현되거나 백신 내에서 적합할 정도로 만족스러운 면역 반응을 유도하는지를 결정하기 전, 후 또는 동시에 결정될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 임의의 그리고 모든 예시 또는 예시적 언어 (예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서의 전반에 걸쳐서 여러 문헌들이 인용되었다. 본 명세서에 인용된 각각의 문헌들 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 설명서, 지침서 등)은, 앞 또는 뒤 여부에 관계없이, 모두 그 전체 내용이 참조로서 인용된다. 본 명세서에 기재된 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시에 선행할 자격이 없는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 질병에 걸린 세포 내에서 또는 상에서만 발현되는 특징을 가지고, 질병에 걸린 세포에 의해 침묵화될 가능성이 적은 네오에피토프 ("적합한 네오에피토프")를 표적화하여, 질병에 걸린 세포가 표적화된 네오에피토프를 통하여 면역 감시를 벗어날 가능성이 적은, 면역요법 및 방사선요법, 특히 암을 포함하는 질병의 치료를 계획한다. 면역요법은 능동 및/또는 수동 면역요법의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 네오에피토프를 특이적으로 표적으로 하고 네오에피토프를 발현하는 세포를 사멸할 수 있는 독성 제제에 접합된 항체 또는 다른 물질은 본 발명에 따라서 그 세포를 표적화 및 사멸하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 구체적으로 면역요법에서 질병-특이적 표적으로서 적합한 네오에피토프의 동정에 관한 것이다. 적합한 네오에피토프가 동정되면, 그들은 특히, MHC와 관련하여, 적합한 네오에피토프를 발현하는 질병에 걸린 세포의 사멸을 유도하는, T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체와 같은, 적절한 항원 수용체를 통하여, 제시되는 경우에, 특히, 동정된 적합한 네오에피토프를 인식하는 T 세포와 같은 적절한 효과기 세포(effector cells)를 유도 및/또는 활성화함으로써 네오에피토프에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 백신으로 사용될 수 있다. 대체적으로, 또는 부가적으로, 적절한 항원 수용체를 통해 동정된 적합한 네오에피토프를 인식하는 면역 세포는 투여될 수 있으며, 이는 또한 적합한 네오에피토프를 발현하는 세포의 사멸을 초래할 것이다.
본 발명에 따른 면역요법 접근법은 적합한 네오에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, ii) 적합한 네오에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리 펩타이드를 인코딩하는 핵산, iii) 적합한 네오에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 세포, iv) 네오에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 바이러스 및 v) 네오에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 펄스된(pulsed) 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산으로 형질감염된 항원 제시 세포를 갖는 면역법을 포함한다. 본 발명에 따른 다른 면역요법 접근법은 vi) 네오에피토프를 인식하는 T 세포 수용체, 및 vii) 특히 MHC와 관련하여 제시되는 경우에, 네오에피토프를 인식하는 수용체 (T 세포와 같은)를 인코딩하는 효과기 세포의 전달을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "질병-특이적 돌연변이"는 질병에 걸린 세포의 핵산에는 존재하지만 질병에 걸린 세포가 아닌, 상응하는 정상 세포의 핵산에는 존재하지 않는 체세포 돌연변이에 관한 것이다. 질병은 암일 수 있으므로, "종양-특이적 돌연변이" 또는 "암-특이적 돌연변이"는 종양 또는 암 세포의 핵산에는 존재하지만 상응하는 정상, 즉 종양이 아닌 또는 암이 아닌 세포의 핵산에는 존재하지 않는 체세포 돌연변이에 관한 것이다. 용어 "종양-특이적 돌연변이"와 "종양 돌연변이" 및 용어 "암-특이적 돌연변이" 및 "암 돌연변이""는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)은 두 개의 대립유전자 중 적어도 하나 (모계 또는 부계)가 정상 게놈 내에서, 또는 예를 들어, 기준 게놈에 대하여 다른 상동성을 갖는 정상 게놈 내의 부위이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 이형접합성 단일 뉴클레오타이드 다형성 (이종접합성 SNP)은 정상적인 게놈에서 두 개의 대립유전자 (모계 및 부계 대립유전자)가 다른 상동성을 갖는 부위로 정의된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "분획 접합성(fractional zygosity)"은 유전자가 돌연변이를 가지는지 여부와 상관없이, 유전자의 전체적인 카피 수의 관점에서 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수의 분율을 의미한다. 예를 들어, 전체적인 20개의 유전자 카피가 있고 10개의 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는다면, 분획 접합성은 0.5이다. 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는다면, 분획 접합성은 1이다. 분획 접합성은 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 적어도 0.95일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 낮은 분획 접합성 보다는 높은 분획 접합성이 선호된다. 본 발명의 일 구현예에서, 에피토프, 바람직하게는 네오에피토프를 인코딩하는 돌연변이 대립유전자의 분획 접합성은 예를 들어, 기준 게놈 내에서 돌연변이 대립유전자가 매핑되는(map) 뉴클레오타이드 부위의 전체적인 카피 수에 대한 돌연변이 대립유전자의 카피 수의 비율이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "클론 분율(clonal fraction)"은 질병에 걸린 세포가 동일한 유전자 내에 동일한 돌연변이를 가지는지 여부와 상관없이, 동일한 유전자 내에 동일한 질병-특이적 돌연변이 및 질병에 걸린 세포의 전체적인 수와 관련하여 카피 수 및 분획 접합성과 같은 유전적인 특성을 함유하는 질병에 걸린 세포의 수의 분율을 의미한다. 이 용어는 클론 분율이 동일한 유전자 내에 동일한 질병-특이적 돌연변이 및 종양 조직 내 세포의 전체적인 수와 관련하여 카피 수와 같은 유전적인 특성을 함유하는 종양 조직 내 질병에 걸린 세포의 분율이므로 종양 조직에 적용될 수도 있다. 클론 분율은 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 적어도 0.95일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 낮은 클론 분율 보다는 높은 클론 분율이 선호된다. 가장 바람직한 클론 분율은 1이고, 질병에 걸린 세포 모두가 동일한 유전자의 동일한 질병-특이적 돌연변이를 갖는다. "클론 분율", "분획 클론성"및 "분획 서브클론성(subclonality)"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "초점성 증폭(focal amplification)"은 동일한 염색체 상에 함께 위치하는 하나 이상의 유전자의 증폭과 같은, 게놈의 일부의 증폭 또는 카피 수의 증가를 의미하며, 이는 게놈의 동일한 부분에서 결실 사건이 발생하지 않는 조건에서, 게놈의 이 부분에 대하여 2 이상의 카피 수를 유발하고, 바람직하게는 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100보다 크다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 질병에 걸린 세포에서 국소적으로 증폭되는 유전자는 남성의 X와 Y염색체 상의 유전자에 대하여 야생형 카피 수가 2 또는 야생형 카피 수가 1인 유전자와 비교하여 증가된 카피 수를 가질 수 있는 유전자이다. 초점성 증폭은 전체 게놈 카피 및/또는 증폭 사건과 구별된다.
용어 "면역 반응"은 항원에 대한 통합된 신체 반응을 의미하고 바람직하게는 세포성 면역 반응 또는 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포성을 의미한다. 면역 반응은 보호적인/예방적인/예방을 위한 및/또는 치료적일 수 있다.
"면역 반응의 유도(inducing an immune response)"는 유도 전에 특정 항원에 대한 면역 반응이 없었다는 것을 의미할 수 있지만, 유도 전에 특정 항원에 대한 일정 수준의 면역 반응이 있었고 유도 후 상기 면역 반응이 향상되었다는 것을 의미할 수도 있다. 따라서, "면역 반응의 유도"는 또한 "면역 반응의 향상"도 포함한다. 바람직하게는, 개체에서 면역 반응이 유도된 후, 상기 개체는 암 질병과 같은 질병의 발병으로부터 보호되거나 또는 면역 반응의 유도에 의해 질병 증상이 완화된다. 예를 들어, 종양 발현 항원에 대한 면역 반응은 암 질병을 갖는 환자 또는 암 질병에 걸릴 위험이 있는 개체에서 유도될 수 있다. 이 경우에 면역 반응의 유도는 개체의 질병 증상이 완화되는 것, 개체에서 전이가 발생하지 않는 것, 또는 암 질병에 걸릴 위험이 있는 개체가 암 질병에 걸리지 않는 것을 의미할 수 있다.
"세포성 면역 반응" 및 "세포성 반응", "항원에 대한 세포성 반응" 또는 이와 유사한 용어들은 클래스 I 또는 클래스 II MHC로 항원의 제시에 의하여 특징화되는 세포에 대한 세포성 반응을 포함하는 것을 의미한다. 세포성 반응은 "헬퍼(helpers)" 또는 "킬러(killers)" 역할을 하는 T 세포 또는 T 림프구로 불리는 세포에 관한 것이다. 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절함으로써 중심적인 역할을 하고 킬러 세포 (세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTLs라고도 함)는 암 세포와 같은 질병에 걸린 세포를 사멸하고, 보다 많은 질병에 걸린 세포의 생산을 예방한다. 바람직하게는, 항-종양 CTL 반응은 항원을 발현하는 하나 이상의 종양을 발현하고 바람직하게는 클래스 I MHC로 항원을 발현하는 종양을 제시하는 종양 세포에 대하여 자극되고 한다.
본 발명에 따르면 "항원"은 항체 또는 T 림프구 (T 세포)를 갖는 특정 반응과 같은 면역 반응의 표적 및/또는 유도하는 임의의 물질, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질을 포괄한다. 바람직하게는, 항원은 T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 항원은 선택적으로 처리(processing) 후에, 바람직하게는 항원 (항원을 발현하는 세포 포함)에 대하여 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 항원 또는 그의 T 세포 에피토프는 바람직하게는 세포에 의해, 바람직하게는 항원 (항원을 발현하는 세포 포함)에 대하여 면역 반응을 유발하는, MHC 분자와 관련하여, 질병에 걸린 세포, 특히 암 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 제시된다.
바람직하게는, 본 발명의 문맥상 항원은 선택적으로 처리 후에, 바람직하게는 항원 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응에 대한 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 면역 반응은 세포성 면역 반응 뿐만 아니라 체액성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 항원은 바람직하게는 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의하여, MHC 분자와 관련하여, 제시되어, 항원에 대한 면역 반응을 유발한다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 해당하거나 또는 이로부터 유래된 생성물이다. 이러한 자연 발생 항원은 알레르겐(allergens), 바이러스, 박테리아, 균류(fungi), 기생충 및 기타 감염원을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있고, 병원체 또는 항원은 또한 종양 항원일 수도 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생 생성물, 예를 들어, 바이러스 단백질, 또는 그의 일부에 해당할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원은 표면 폴리펩타이드, 즉 세포, 병원체, 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르겐 또는 종양의 표면 상에 자연적으로 디스플레이된(displayed) 폴리펩타이드이다. 항원은 세포, 병원체, 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르겐 또는 종양에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수도 있다.
용어 "질병-관련 항원" 또는 "질병-특이적 항원"은 질병과 관련되거나 질병에 특이적인 임의의 항원을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 이러한 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 질병에 대한 세포성 항원-특이적 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서, 질병-관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질병-관련 항원은 바람직하게는 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나, 암, 전형적으로 종양과 관련된다.
용어 "병원체(pathogen)"는 생물, 바람직하게는 척추동물에서 질병을 일으킬 수 있는 병원성 생물학적 물질을 의미한다. 병원체에는 박테리아, 단세포 진핵 생물 (원생동물), 곰팡이 및 바이러스와 같은 미생물이 포함된다.
본 발명의 문맥상, 용어 "종양 항원" 또는 "종양-관련 항원"은 정상적인 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 단백질에 관한 것이며, 예를 들어, 종양 항원은 정상적인 조건 하에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막(gastric mucosa), 생식 기관, 예를 들어, 고환, 영양막(trophoblastic) 조직, 예를 들어, 태반, 또는 생식선(germ line) 세포에서 특이적으로 발현될 수도 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 이러한 맥락에서, "제한된 수"는 바람직하게는 3 이하, 보다 바람직하게는 2 이하를 의미한다. 본 발명의 문맥상 종양 항원은 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉 정상적인 조건 하에서 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형으로 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉 정상적인 조건 하에서 고환 및 때로는 태반에서 특이적으로 발현되는 단백질, 및 생식선 특이적 항원을 포함한다. 본 발명의 문맥상, 종양 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면과 결합되고, 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 거의 발현되지 않는다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적인 발현은 암 세포를 동정한다. 본 발명의 문맥상, 개체, 예를 들어, 암 질병을 앓고 있는 환자 내에서 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은 바람직하게는 상기 개체 내의 자가 단백질(self-protein)이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 문맥상 종양 항원은 필수적이지 않은 조직 또는 기관, 즉 면역계에 의해 손상된 경우 개체의 죽음을 초래하지 않는 조직 또는 기관 내에서, 또는 면역계에 의해 접근할 수 없거나 거의 접근할 수 없는 신체의 기관 또는 구조물에서 정상적인 조건 하에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 사이에서 동일하다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양 항원", "종양-발현 항원", "암 항원" 및 "암-발현 항원"은 동의어이고 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "에피토프", "항원 펩타이드", "항원 에피토프", "면역원성 펩타이드" 및 "MHC 결합 펩타이드"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기(antigenic determinant)를 의미하며, 즉, 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우에 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어 T 세포에 의해 인식되는 면역학적으로 활성인 화합물의 일부 또는 단편을 의미한다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속적인 부분을 포함하고, 바람직하게는 5 내지 100, 바람직하게는 5 내지 50, 보다 바람직하게는 8 내지 30, 가장 바람직하게는 10 내지 25개 길이의 아미노산이며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 길이의 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따르면, 에피토프는 MHC 분자, 예를 들어 세포 표면의 MHC 분자에 결합할 수도 있으며, 이에 따라 "MHC 결합 펩타이드" 또는 "항원 펩타이드"일 수도 있다. 용어 "주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 모든 척추동물 내 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병에 걸린 세포 사이의 신호 전달에서 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드와 결합하여 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시한다. MHC에 의해 인코딩된 단백질은 세포의 표면 상에서 발현되고, 자가 항원(self-antigens) (세포 자체로부터의 펩타이드 단편) 및 비-자가 항원(non-self-antigens) (예를 들어, 침입 미생물의 단편) 모두를 T 세포에 디스플레이한다. 이러한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 면역원성 부분은 이러한 결합이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 임의의 분석을 사용하여 검출 가능한 경우, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합한다"고 한다. 용어 "MHC 결합 펩타이드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩타이드에 관한 것이다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 보다 길거나 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있음에도 일반적으로 8-10개의 아미노산 길이이다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 일반적으로 10-25개의 아미노산 길이이고, 특히 13-18개의 아미노산 길이이며, 보다 길고 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "네오에피토프(neoepitopes)"는 정상 비-암성 또는 생식선 세포와 같은 기준에는 존재하지 않지만 암 세포와 같은, 질병에 걸린 세포에서는 발견되는 에피토프를 의미한다. 이는 특히, 정상 비-암성 또는 생식선 세포에서는 상응하는 에피토프가 발견되지만, 암 세포에서의 하나 이상의 돌연변이로 인하여 에피토프의 서열이 변화되어 네오에피토프가 초래되는 상황을 포함한다. 게다가, 네오에피토프는 질병에 거린 세포에 특이적일 뿐만 아니라 또한 질병을 가지는 환자에 특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 네오에피토프 및 적합한 네오에피토프는 에피토프의 서브세트(subsets)이므로, 일반적으로 면역학적 표적으로서의 에피토프에 관한 본 명세서의 개시는 네오에피토프와 적합한 네오에피토프에 동일하게 적용된다.
본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에서, 에피토프 또는 네오에피토프는 T 세포 에피토프이다. 본 명세서에서, 용어 "T 세포 에피토프"는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 형태로 MHC 분자에 결합하는 펩타이드를 의미한다. 전형적으로, T 세포 에피토프는 항원-제시 세포의 표면 상에서 제시된다.
본 명세서에서, 용어 "면역원성 아미노산 변형 예측"은 이러한 아미노산 변형을 포함하는 펩타이드가 면역원성일지 및 따라서 백신접종에서, 에피토프, 특히 T 세포 에피토프로서 유용할 것인지 여부에 대한 예측을 의미한다.
본 발명에 따르면, T 세포 에피토프는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 백신 서열과 같은 보다 큰 대상체(entity)의 일부로서 백신 내에 존재할 수도 있다. 제시된 펩타이드 또는 T 세포 에피토프는 적합한 프로세싱 후에 생성된다.
T 세포 에피토프는 TCR 인식 또는 MHC에 대한 결합에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 변형될 수도 있다. 이러한 변형된 T 세포 에피토프는 면역학적으로 동등한 것으로 간주될 수도 있다.
바람직하게는, T 세포 에피토프는 MHC에 의해 제시되고 T 세포 수용체에 의해 인식되는 경우에 적절한 공자극 신호(co-stimulatory signals)의 존재하에서, 펩타이드/MHC-복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 지니는 T 세포의 클론 확장(clonal expansion)을 유도할 수 있다.
바람직하게는, T 세포 에피토프는 항원 단편의 아미노산 서열과 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항원 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩타이드이다.
본 발명에 따른 T 세포 에피토프는 바람직하게는 항원, 또는 항원의 발현 및 바람직하게는 질병에 걸린 세포, 특히 암 세포와 같은 항원의 제시를 특징으로 하는 세포 또는 에 대한 면역 반응, 바람직하게는 세포성 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, T 세포 에피토프는 클래스 I MHC로 항원을 제시하는 것인 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원-반응성 세포독성 T 림프구 (CTL)를 자극할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서 항원은 자가 항원, 특히 종양 항원이다. 종양 항원 및 그들의 결정은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
용어 "면역원성(immunogenicity)"은 바람직하게는 암에 대한 치료와 같은, 치료요법의 치료와 관련된 면역 반응을 유도하는 상대적인 효과에 관한 것이다. 본 명세서에서, 용어 "면역원성의(immlunogenic)"은 면역원성을 갖는 특성에 관한 것이다. 예를 들어, 용어 "면역원성 변형(immunogenic modification)"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련하여 사용되는 경우에, 상기 변형에 의하여 야기된 및/또는 상기 변형에 대하여 면역 반응을 유도하는 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 효과에 관한 것이다. 바람직하게는, 변형되지 않은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 면역 반응을 유도하지 않거나, 상이한 면역 반응을 유도하거나, 상이한 수준, 바람직하게는 보다 낮은 수준의 면역 반응을 유도한다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역원성" 또는 "면역원성의"는 바람직하게는 생물학적으로 연관된 면역 반응, 특히 백신 접종에 유용한 면역 반응을 유도하는 상대적 효과에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드는 그것이 개체에서 표적 변형에 대하여 면역 반응을 유도한다면, 면역원성이며, 면역 반응은 치료 또는 예방을 위한 목적에 유익할 수도 있다.
"항원 처리(Antigen processing)" 또는 "처리(processing)"는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 단편인 처리 산물로 분해되는 것 (예를 들어, 폴리펩타이드의 펩타이드로의 분해), 및 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 특이적 T 세포에 제시되기 위하여 이들 단편 중 하나 이상이 MHC 분자와 결합 (예를 들어, 결합을 통해) 하는 것을 의미한다.
"항원 제시 세포(antigen presenting cells)" (APC)는 이들의 세포 표면 상에서 MHC 분자와 관련된 단백질 항원의 펩타이드 단편을 제시하는 세포이다. 일부 APCs는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수도 있다.
전문적인(Professional) 항원 제시 세포는 식세포작용(phagocytosis) 또는 수용체-매개 엔도시토시스(endocytosis)에 의하여 항원을 내재화한 후, 이들의 막 상에 클래스 II MHC 분자에 결합된, 항원 단편을 디스플레이하는 데 매우 효과적이다. T 세포는 항원-제시 세포의 막 상에서 항원-클래스 II MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용한다. 항원-제시 세포에 의해 추가적인 공자극 신호가 생성되고 나서, T 세포의 활성화를 유도한다. 공자극 분자의 발현은 전문적인 항원-제시 세포의 특징을 규정한다.
전문적인 항원-제시 세포의 주요 유형은 가장 넓은 항원 제시의 범위를 가지고, 아마도 가장 중요한 항원-제시 세포인 수지상 세포, 대식세포, B 세포 및 임의의 활성화된 상피 세포이다.
수지상 세포 (DCs)는 말초 조직 내에 포획된 항원을 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로 모두를 통하여 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도자이고 이들 세포의 활성화가 항-종양 면역의 유도에 주요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포는 편의상 "미성숙한" 및 "성숙한" 세포로 분류되며, 이는 두 가지 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 이 명칭(nomenclature)은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 제외하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 미성숙한 수지상 세포는 항원 흡수(uptake) 및 처리 능력이 높은 항원 제시 세포로서 특징화되며, 이는 Fcγ수용체 및 만노스(mannose) 수용체의 높은 발현과 연관되어 있다. 성숙한 표현형은 일반적으로 이들 마커는 보다 낮은 발현이지만, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(adhesion molecules) (예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자 (예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자는 높은 발현에 의해 특징화된다.
수지상 세포 성숙은 이러한 항원-제시 수지상 세포가 T 세포 프라이밍(priming)을 유도하는 수지상 세포 활성화의 상태를 의미하는 반면, 미성숙한 수지상 세포에 의한 제시는 내성(tolerance)을 유발한다. 수지상 세포 성숙은 선천적인 수용체 (박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소(endotoxin) 등), 전-염증성 사이토카인 (TNF, IL-1, IFNs), CD40L에 의한 수지상 세포 표면 상에서 CD40 라이게이션(ligation), 및 스트레스성 세포사를 겪는 세포로부터 방출된 물질에 의해 검출되는 미생물 특징을 갖는 생체분자에 의해 주로 야기된다. 수지상 세포는 골수 세포를 사이토카인, 예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파와 함께 시험관 내(in vitro) 배양함으로써 유래될 수 있다.
비-전문적인 항원-제시 세포는 나이브(naive) T 세포와의 상호 작용에 요구되는 MHC 클래스 II 단백질을 구조적으로 발현하지 않으며; 이들은 오직 IFNγ와 같은 특정 사이토카인에 의한 비-전문적인 항원-제시 세포의 자극시에만 발현된다.
"항원 제시 세포"는 제시될 펩타이드를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 항원을 인코딩하는 핵산, 바람직하게는 RNA로 세포를 형질도입함으로써 펩타이드가 제시된 MHC 클래스 I로 로딩될(loaded) 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 수지상 또는 다른 항원 제시 세포를 표적화하는 유전자 전달 운반체(vehicle)를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 환자에게 투여되어, 생체 내(in vivo ) 형질감염을 유발할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포의 생체 내 형질감염은 일반적으로 국제 공개 특허 WO 97/24447에 개시된 방법과 같은,본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 임의의 방법, 또는 [Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기재되어 있는 유전자 총 접근법을 사용하여 수행될 수도 있다.
용어 "항원 제시 세포"는 또한 표적 세포를 포함한다.
"표적 세포(target cell)"는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응의 표적인 세포를 의미한다. 표적 세포는 항원 또는 항원 에피토프, 즉 항원으로부터 유래된 펩타이드 단편을 제시하는 세포를 포함하고, 암 세포와 같은 바람직하지 못한 임의의 세포를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 표적 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 항원을 발현하고, 바람직하게는 클래스 I MHC로 상기 항원을 제시하는 세포이다.
용어 "일부(portion)"는 부분(fraction)을 의미한다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조와 관련하여, 용어 그의 "일부"는 상기 구조의 연속 또는 불연속적인 부분을 가리킬 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 일부는 상기 아미노산 서열의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%의 아미노산를 포함한다. 바람직하게는, 상기 일부가 불연속적인 부분인 경우, 상기 불연속적인 부분은 구조의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 부분으로 구성되며, 각 부분은 상기 구조의 연속적인 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속적인 부분은 상기 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상, 바람직하게는 4 이하의 부분으로 구성될 수 있으며, 각 부분은 아미노산 서열 중 바람직하게는 5 이상의 연속적인 아미노산, 10 이상의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 20 이상의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 30 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
용어 "부분(part)" 및 "단편(fragment)"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며 연속적인 요소를 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조의 부분은 상기 구조의 연속적인 요소를 의미한다. 구조물의 일부, 부분 또는 단편은 바람직하게는 상기 구조의 하나 이상의 기능적인 특성을 포함한다. 예를 들어, 에피토프, 펩타이드 또는 단백질의 일부, 부분 또는 단편은 바람직하게는 그것이 유래된 에피토프, 펩타이드 또는 단백질과 면역학적으로 동등하다. 본 발명의 문맥상, 아미노산 서열과 같은 구조의 "부분"은 바람직하게는 전체 구조 또는 아미노산 서열의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성된다.
본 발명의 문맥상, 용어 "면역 반응성 세포(immunoreactive cell)"는 면역 반응 동안에 효과기 기능을 발휘하는 세포에 관한 것이다. "면역 반응성 세포"는 바람직하게는 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드 제시에 의해 특징화되는 세포 또는 항원에 결합 및 면역 반응을 매개할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 항체를 분비하고, 암 세포를 인식하고, 선택적으로 이러한 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역 반응성 세포는 T 세포 (세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포(natural killer cells), 호중구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, "면역 반응성 세포"는 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다.
바람직하게는, "면역 반응성 세포"는 특히 MHC 분자와 관련하여, 예를 들어 항원 제시 세포 또는 암 세포와 같은 질병에 걸린 세포의 표면 상에서 제시되는 경우에, 어느 정도의 특이성으로 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식한다. 바람직하게는, 상기 인식은 항원 또는 상기 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식하는 세포가 민감한(responsive) 또는 반응적(reactive)일 수 있게한다. 세포가 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식하는 수용체를 갖는 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)인 경우, 이러한 민감성(responsiveness) 또는 반응성(reactivity)은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTLs) 및/또는 B 세포의 활성화를 수반할 수도 있다. 세포가 CTL인 경우, 이러한 민감성 또는 반응성은 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시되는 세포, 즉 클래스 I MHC로 항원을 제시하는 것인 세포를, 예를 들어, 세포 사멸(apoptosis) 또는 퍼포린(perforin)-매개 세포 용해를 통해 제거하는 것을 수반할 수도 있다. CTL 반응성은 지속적인 칼슘 플럭스(flux), 세포 분열, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향 조절, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적인 세포 용해성 사멸을 수반할 수도 있다. CTL 반응성은 또한 CTL 반응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 결정될 수도 있다. 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식하고 민감한 또는 반응적인 이러한 CTL은 또한 본 명세서에서 "항원-반응성 CTL"로 언급된다. 세포가 B 세포인 경우, 이러한 반응성은 면역 글로불린(immunoglobulins)의 방출을 수반할 수도 있다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포 (CTLs, CD8+ T 세포)를 포함한다.
T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 그룹에 속하며, 세포-매개 면역에서 중심적인 역할을 한다. 이들은 T 세포 수용체 (TCR)로 불리는 이들 세포 표면 상에서 특별한 수용체의 존재에 의해 다른 림프구 유형들, 예를 들어 B 세포 및 자연 살해 세포와 구분될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 주요 기관이다. T 세포의 몇몇 상이한 서브세트가 발견된 바 있으며, 각각은 별개의 기능을 갖는다.
T 헬퍼 세포는 다른 기능들 중에서도, B 세포의 혈장 세포로의 성숙 및 세포 독성 T 세포와 대식세포의 활성화를 수반하는, 면역학적 과정에서 다른 백혈구들을 돕는다. 이들 세포는 또한 이들의 표면 상에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APCs)의 표면 상에 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원으로 제시되는 경우에 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들은 신속하게 분열하여 활성 면역 반응을 조절하거나 돕는, 사이토카인이라고 불리는 작은 단백질을 분비한다.
세포독성 T 세포는 바이러스 감염 세포와 종양 세포를 파괴하며, 또한 이식 거부의 원인이 된다. 또한, 이들 세포는 이들의 표면에 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포 표면 상에 존재하는, MHC 클래스 I과 연관된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식한다.
대다수의 T 세포는 여러 단백질의 복합체로 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생성되고, α- 및 β-TCR 사슬이라고 불리는 두 개의 별개의 펩타이드 사슬로 구성된다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 이들의 표면 상에 뚜렷한 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있는 T 세포의 작은 서브세트를 나타낸다. 그러나, γδ T 세포에서, TCR은 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다. 이 T 세포 그룹은 αβ T 세포보다 훨씬 드물다 (전체적인 T 세포의 2%).
본 발명에 따르면, 용어 "항원 수용체"는 임의의 특이성, 예를 들어 T 세포와 같은 효과기 세포에 대한 단일클론(monoclonal) 항체의 특이성을 부여한 조작된(engineered) 수용체 뿐만 아니라 T 세포 수용체와 같은 자연 발생 수용체를 포함한다. 이러한 방식으로, 많은 양의 항원-특이적 T 세포가 입양 세포(adoptive cell) 전달을 위해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 수용체는 T 세포 상에, 예를 들어 T 세포 자신의 T 세포 수용체 대신 또는 이에 더하여 존재할 수도 있다. 이러한 T 세포는 표적 세포의 인식을 위한 항원의 처리 및 제시를 필수적으로 요구하지 않지만, 바람직하게는 표적 세포 상에 존재하는 임의의 항원을 특이적으로 인식할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 항원 수용체는 세포의 표면 상에 발현된다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 명세서에서 사용된 용어 "T 세포"는 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, 용어 "항원 수용체"는 암 세포와 같은 표적 세포 상에 표적 구조 (예를 들어, 항체)를 인식하는, 즉, 결합하는 (예를 들어, 항원 결합 부위 또는 표적 세포 표면 상에서 발현되는 항원에 대한 항원 결합 도메인에 결합함으로써) 단일 분자 또는 분자 복합체를 포함하는 인공적인 수용체를 포함하고 세포 표면 상에 상기 항원을 발현하는 T 세포와 같은 면역 효과기 세포에 특이성을 부여할 수도 있다. 바람직하게는, 항원 수용체에 의한 표적 구조의 인식은 상기 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포의 활성화를 유발한다. 항원 수용체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 도메인을 포함하는 상기 단백질 유닛 하나 이상의 단백질 유닛을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따르면, "항원 수용체"는 "키메라 항원 수용체 (CAR)", "키메라(chimeric) T 세포 수용체" 또는 "인공 T 세포 수용체"일 수도 있다.
항원은 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 임의의 항원 인식 도메인 (본 명세서에서 간단히 "도메인"으로도 언급됨)을 통해, 예를 들어 항체의 항원-결합 부분 및동일하거나 상이한 펩타이드 사슬 상에 존재할 수 있는 T 세포 수용체를 통해 항원 수용체에 의해 인식될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 두 개의 도메인은 면역 글로불린으로부터 유래된다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 두 개의 도메인은 T 세포 수용체로부터 유래된다. 항체 가변 도메인, 예를 들어 단일클론 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및 T 세포 수용체 가변 도메인, 특히 TCR 알파 및 베타 단일 사슬이 특히 바람직하다. 실제로, 주어진 표적에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 도메인으로 사용될 수 있다.
T 세포의 활성화에서 첫 번째 신호는 T 세포 수용체가 다른 세포 상의 MHC에 의해 제시되는 짧은 펩타이드에 결합함으로써 제공된다. 이는 그 펩타이드에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포만이 활성화되도록 한다. 파트너 세포는 대체로 전문적인 항원 제시 세포 (APC)이며, 나이브 반응의 경우 대체로 수지상 세포지만, B 세포 및 대식세포도 중요한 APCs일 수 있다. MHC 클래스 I 분자에 의하여 CD8+에 제시되는 펩타이드는 전형적으로 8-10 아미노산 길이이며; MHC 클래스 II 분자에 의하여 CD4+에 제시되는 펩타이드는 MHC 클래스 II 분자의 결합 균열(cleft)의 말단이 열려 있기 때문에, 보다 길다.
본 발명에 따르면, 분자는 미리결정된 표적에 대하여 현저한 친화도를 갖는 경우 표적에 결합할 수 있으며 표준 분석에서 상기 미리결정된 표적에 결합한다. "친화도(affinity)" 또는 "결합 친화도(binding affinity)"는 종종 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant; KD)로 측정된다. 분자는 상기 표적에 대하여 현저한 친화도가 없는 경우 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없으며 표준 분석에서 상기 표적에 결합하지 않는다.
세포독성 T 림프구는 생체 내에서 항원-제시 세포 내에 항원 또는 항원 펩타이드를 혼입함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 항원 또는 항원 펩타이드는 단백질, DNA (예를 들어, 벡터 내에서) 또는 RNA로 나타낼 수도 있다. 항원은 MHC 분자에 대한 펩타이드 파트너를 생산하도록 처리될 수 있는 반면, 그의 단편은 추가적인 처리를 필요로 하지 않고 제시될 수도 있다. 특히 후자는, 이들이 MHC 분자에 결합할 수 있는 경우이다. 일반적으로, 환자에게 피부 내(intradermal) 주사에 의한 투여가 가능하다. 그러나, 주사는 림프절 내로 결절 내로(intranodally) 수행될 수도 있다 (Maloy et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). 생성되는 세포는 관심 대상 복합체를 나타내며 자가세포 독성 T 림프구에 의해 인식된 후 증식한다.
CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 다양한 방법으로 검출될 수도 있다. 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 방법은 T 세포의 증식, 사이토카인 (예를 들어, 림포카인)의 생성, 또는 세포용해 활성의 발생을 검출하는 것을 수반한다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 T 세포의 증식의 검출이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 세포용해 활성의 발생의 검출이다.
"항원의 제시를 특징으로 하는 세포" 또는 "항원을 제시하는 세포" 또는 이와 유사한 표현들은 질병에 걸린 세포, 예를 들어 암 세포, 또는 그것이 발현하는 항원을 나타내는 항원 제시 세포와 같은 세포 또는 예를 들어 MHC 분자, 특히 MHC 클래스 I 분자와 관련하여, 항원의 처리에 의하여 상기 항원에 의해 유래된 단편을 의미한다. 유사하게, 용어 "항원의 제시를 특징으로 하는 질병"은 항원, 특히 클래스 I MHC로 제시하는 것인 세포를 포함하는 질병을 의미한다. 세포에 의한 항원의 제시는 항원을 인코딩하는 RNA와 같은 핵산으로 세포를 형질감염시킴으로써 효과적일 수도 있다.
"제시된 항원의 단편" 또는 이와 유사한 표현들은 예를 들어 항원 제시 세포에 직접 첨가될 때, 단편이 MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 바람직하게는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있음을 의미한다. 일 구현예에서, 단편은 항원을 발현하는 세포에 의해 자연적으로 제시되는 단편이다.
용어 "면역학적으로 동등한(immunologically equivalent)"은 면역학적으로 동등한 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 동등한 분자가 예를 들어, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 유도, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 지속 기간, 또는 유도된 면역 반응의 특이성과 같은 면역학적 효과의 유형에 대하여, 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내는 것 및/또는 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 용어 "면역학적으로 동등한"은 바람직하게는 면역학적 효과 또는 면역화에 사용되는 펩타이드의 특성에 대하여 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열이 개체의 면역계에 노출되는 경우에 기준 아미노산 서열과 반응하는 특이성을 갖는 면역 반응을 유도한다면, 상기 아미노산 서열은 기준 아미노산 서열과 면역학적으로 동등하다.
본 발명의 문맥상, 용어 "면역 효과기 기능(immune effector functions)"은 예를 들어, 종양 세포의 살해 또는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 포함하는, 종양 발달의 억제를 유발하는, 면역계의 성분에 의해 매개된 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, 면역 효과기 기능은 T 세포 매개 효과기 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)의 경우에 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 T 세포 수용체에 의한 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드의 인식, 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTLs) 및/또는 B 세포의 활성화, 및 CTL의 경우에 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 T 세포 수용체에 의한 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드의 인식, MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시된 세포, 즉 클래스 I MHC로 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 예를 들어, 세포 사멸 또는 퍼포린-매개 세포 용해를 통한 제거, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포용해성 살해를 포함한다.
용어 "주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 모든 척추동물 내 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병에 걸린 세포 사이의 신호 전달에서 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드와 결합하여 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시한다. MHC에 의해 인코딩된 단백질은 세포의 표면 상에서 발현되고, 자가 항원 (세포 자체로부터의 펩타이드 단편) 및 비-자가 항원 (예를 들어, 침입 미생물의 단편) 모두를 T 세포에 디스플레이한다.
MHC 영역은 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III인 세 개의 하위 그룹으로 구분된다. MHC 클래스 I 단백질에는 α-사슬과 β2-마이크로글로불린(microglobulin) (15번 염색체에 의해 인코딩된 MHC의 일부는 아닌)을 함유한다. 그들은 세포독성 T 세포에 항원 단편을 제시한다. 대부분의 면역계 세포, 구체적으로 항원-제시 세포 상에서 MHC 클래스 II 단백질은 α- 및 β-사슬을 함유하고 그들은 T-헬퍼 세포에 항원 단편을 제시한다. MHC 클래스 III 영역은 보체 성분(complement components) 및 사이토카인을 인코딩하는 일부와 같은, 다른 면역 성분을 인코딩한다.
MHC는 다유전자성 (MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 유전자가 여러 개 있음)및 다형성 (각 유전자의 다중 대립 유전자가 있음) 모두이다.
본 명세서에서, 용어 "일배체형(haplotype)"은 하나의 염색체에서 발견되는 HLA 대립유전자 및 이에 의해 인코딩된 단백질을 의미한다. 일배체형은 또한 MHC 이내의 임의의 하나의 유전자좌(locus)에 존재하는 대립유전자를 의미할 수도 있다. MHC의 각 클래스는 클래스 I에 대한 HLA-A (Human Leukocyte Antigen-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P 및 HLA-V 및 클래스 II에 대한 HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB와 같은, 여러 유전자좌에 의하여 표시된다. 용어 "HLA 대립유전자" 및 "MHC 대립유전자"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
MHCs는 극단적인 다형성을 나타낸다. 인간 개체군 내에는 각각의 유전자좌에, 구분되는 대립유전자를 포함하는 다수의 일배체형이 존재한다. 클래스 I 및 클래스 II 모두의, 상이한 다형성 MHC 대립유전자는 각각의 대립유전자가 특정 서열 패턴을 나타내는 펩타이드에 결합하는 단백질을 인코딩한다는 점에서 상이한 펩타이드 특이성을 갖는다.
본 발명과 관련하여, MHC 분자는 바람직하게는 HLA 분자이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "MHC 결합 펩타이드"는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 결합 펩타이드 또는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 결합 펩타이드를 생산하도록 처리될 수 있는 펩타이드를 포함한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우에, 결합 펩타이드는 전형적으로 8-12, 바람직하게는 8-10개의 아미노산 길이지만, 보다 길거나 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우에, 결합 펩타이드는 전형적으로 9-30, 바람직하게는 10-25개의 아미노산 길이이고, 특히 13-18개의 아미노산 길이이며, 보다 길고 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있는 것을 특징으로 한다.
"항원 펩타이드"는 바람직하게는 면역 반응, 바람직하게는 항원 또는 항원의 발현 및 바람직하게는 항원의 제시를 특징으로 하는 질병에 걸린 세포, 특히 암 세포와 같은 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있는 항원의 부분 또는 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 클래스 I MHC로 항원을 제시하는 것인 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원-반응성 세포독성 T-림프구 (CTL)를 자극할 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드이거나 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드를 생산하도록 처리될 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 항원 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항원 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드이다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 이러한 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 단편, 즉 항원으로부터 유래된 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드를 생산하도록 처리된다.
펩타이드가 직접적으로, 즉 처리 없이, 특히 절단 없이 제시된다면, MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자와의 결합에 적합한 길이를 가지며, 바람직하게는 7-20개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 7-12개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 8-11개 아미노산 길이, 특히 9 또는 10개 아미노산 길이이다.
펩타이드가 예를 들어, 백신 서열 또는 폴리펩타이드의 추가적인 서열을 포함하는 보다 큰 대상체의 일부이고, 후속 처리, 특히 후속 절단에 제시된다면, 처리에 의해 생성된 펩타이드는 MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자에 결합하기에 적합한 길이를 가지며, 바람직하게는 7-20개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 7-12개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 8-11 개의 아미노산, 특히 9 또는 10개 아미노산 길이이다. 바람직하게는, 처리 후 제시되는 펩타이드의 서열은 항원의 아미노산 서열로부터 유래되며, 즉, 그 서열은 실질적으로 상응하고 바람직하게는 항원의 단편과 완전하게 동일하다. 따라서, MHC 결합 펩타이드는 실질적으로 상응하는 서열을 포함하고 바람직하게는 항원의 단편과 완전하게 동일하다.
클래스 I MHC에 의해 제시되는 펩타이드의 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 펩타이드의 TCR 인식, 또는 MHC에 결합하는 펩타이드에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 상이할 수도 있다. 이러한 실질적으로 상응하는 펩타이드는 또한 항원-반응성 CTL을 자극할 수 있고 면역학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다. TCR 인식에 영향을 미치지 않지만 MHC에 대한 결합의 안정성을 개선시키는 잔기에서 제시된 펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 항원 펩타이드의 면역원성을 향상시킬 수도 있으며, 본 명세서에서는 "최적화된 펩타이드"로 언급될 수도 있다. 이들 잔기들 중 어느 것이 MHC 또는 TCR에 대한 결합에 보다 영향을 미칠 수 있는지에 대한 기존의 지식을 사용하여, 실질적으로 상응하는 펩타이드의 설계에 대한 합리적인 접근법이 사용될 수 있다. 기능적인 생성된 펩타이드는 항원 펩타이드로 고려된다.
MHC에 의해 제시되는 경우에 항원 펩타이드는 T 세포 수용체에 의해 인식될 수 있어야 한다. 바람직하게는, T 세포 수용체에 의해 인식되는 경우 항원 펩타이드는 적절한 공-자극 신호의 존재 하에서 항원 펩타이드를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 클론성 팽창을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우에, 면역 반응, 바람직하게는 이들이 유래된 항원 또는 항원의 발현을 특징으로 하고 바람직하게는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 클래스 I MHC로 항원을 제시하는 것인 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원- 반응성 CTL을 자극할 수 있다. 이러한 세포는 바람직하게는 표적 세포이다.
용어 "게놈(genome)"은 생물체 또는 세포의 염색체 내 유전적인 정보의 전체적인 양에 관한 것이다.
용어 "엑솜(exome)"은 발현된 유전자의 코딩 부분인 엑손에 의해 형성된 생물체의 게놈의 일부를 의미한다. 엑솜은 단백질 및 다른 기능적 유전자 산물의 합성에 사용되는 유전적인 청사진을 제공한다. 이는 게놈의 가장 기능적으로 연관된 부분이므로, 생물체의 표현형에 기여할 가능성이 가장 크다. 인간 게놈의 엑솜은 전체 게놈의 1.5%를 차지하는 것으로 평가된다 (Ng et al., 2008, PLoS Gen., 4(8): 1-15).
용어 "전사체(transcriptome)"는 하나의 세포 또는 세포군에서 생산되는 mRNA, rRNA, tRNA 및 다른 비-코딩 RNA를 포함하는, 모든 RNA 분자의 세트에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, 전사체 또는 RNAseq는 하나의 세포, 세포군, 바람직하게는 암 세포군, 또는 특정 시점에서 주어진 개인의 모든 세포에서 생성되는 모든 RNA 분자의 세트를 의미한다.
"핵산"은 바람직하게는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 보다 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게는 시험관 내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 본 발명에 따르면, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유결합적으로 순환 폐쇄된(circularly closed) 분자로서 존재할 수 있다. 핵산은 단리될 수 있다. 용어 "단리된 핵산(isolated nucleic acid)"은 핵산이 (i) 시험관 내, 예를 들어, 중합효소(polymerase) 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭되었거나, (ii) 클로닝(cloning)에 의해 재조합적으로 생산되었거나, (iii) 예를 들어, 겔 전기 영동에 의한 절단 및 분리에 의해 정제되었거나, 또는 (iv) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 핵산은 특히 DNA 주형(template)으로부터 시험관 내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA의 형태로, 세포 내로의 도입, 즉, 형질감염을 위해 사용될 수 있다. RNA는 또한 안정화 서열, 캡핑(capping) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.
용어 "유전 물질(genetic material)"은 단리된 핵산, DNA 또는 RNA, 이중 나선의 한 섹션(Section), 염색체의 한 섹션, 또는 생물체 또는 세포의 전체 게놈, 특히 그의 엑솜 또는 전사체를 의미한다.
용어 "돌연변이(mutation)"는 기준, 및 바람직하게는 매치된 정상 게놈과 비교하여 질병에 걸린 게놈에서 핵산 서열의 변화 또는 차이 (뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실)를 의미한다. "체세포 돌연변이(somatic mutation)"는 생식 세포 (정자 및 난자)를 제외한 신체의 임의의 세포에서 발생할 수 있으므로, 자손에게 전달되지 않는다. 이들 변화는 (항상 그런 것은 아니지만) 암 또는 기타 질병을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 비-동의적 돌연변이이다. 용어 "비-동의적 돌연변이(non-synonymous mutation)"는 바람직하게는 네오에피토프의 형성을 유발하는, 돌연변이, 바람직하게는 번역 산물에서 아미노산 서열 치환과 같은 아미노산 변화를 유발하는, 뉴클레오타이드 치환에 관한 것이다.
용어 "단일 뉴클레오타이드 변이체/변이"(SNV)는 종양 세포와 같은, 질병에 걸린 세포의 게놈을 바람직하게는 매치된 (상응하는) 정상적인, 질병에 걸리지 않은 세포 또는 기준 게놈과 비교하는 경우에 특정 부위 (대립유전자)의 핵산 서열 내 차이에 관한 것이다.
질병에 걸린 (종양) 게놈에서의 카피 수 변이 (copy number variation; CNV) 사건은 질병에 걸린 세포에서만 발생하는 체세포 카피 수 변화의 사건이며, 매치된 정상적인 게놈에 대하여 질병에 걸린 (종양) 게놈 영역의 모계 및/또는 부계 대립유전자의 카피의 수 변화로 정의되고, 변화는 바람직하게는 약 1 kb 이상에 걸쳐있는 게놈 영역에 영향을 미친다.
용어 "돌연변이"는 점 돌연변이, 인델(Indels), 융합(fusions), 염색체파열(chromothripsis) 및 RNA 편집(edits)을 포함한다.
용어 "인델(Indel)"은 공동화된(colocalized) 삽입 및 결실과 뉴클레오타이드에서의 순증가 또는 순감소를 유발하는 돌연변이로서 정의되는 특수한 돌연변이 클래스를 설명한다. 게놈의 코딩 영역에서, 인델의 길이가 3의 배수가 아닌 경우, 이들은 프레임시프트(frameshift) 돌연변이를 일으킨다. 인델은 점 돌연변이와 대조될 수 있는데; 인델은 서열의 뉴클레오타이드를 삽입 또는 결실하고, 점 돌연변이는 뉴클레오타이드 중 하나를 대체하는 치환의 형태이다.
융합(fusions)은 이전에 분리된 두 개의 유전자로부터 형성된 하이브리드(hybrid) 유전자를 생성할 수 있다. 이는 전좌(translocation), 사이 결실(interstitial deletion), 또는 염색체 역위(chromosomal inversion)의 결과로서 발생할 수 있다. 종종, 융합 유전자는 온코진(oncogenes)이다. 온코진 융합 유전자는 새롭거나 두 개의 융합 파트너와는 상이한 기능을 갖는 유전자 산물을 유도할 수도 있다. 대안적으로, 프로토-온코진(proto-oncogene)은 강력한 프로모터에 융합됨으로써, 온코진 기능이 상류 융합 파트너의 강력한 프로모터에 의해 야기되는 상향조절에 의해 기능하도록 설정된다. 온코진 융합 전사체는 또한 트랜스-스플라이싱(trans-splicing) 또는 리드-스로우(read-through) 이벤트에 의해서 유발될 수도 있다.
용어 "염색체파열(chromothripsis)"은 단일의 파괴적인 이벤트를 통해 게놈의 특정 영역이 산산조각난 후 함께 봉합되는 유전 현상을 의미한다.
용어 "RNA 편집(RNA edit)" 또는 "RNA 편집(RNA editing)"은 RNA 분자의 정보 내용이 기본 구성의 화학적 변화를 통해 변경되는 분자적인 과정을 의미한다. RNA 편집은 시티딘 (C)에서 우리딘 (U) 및 아데노신 (A)에서 이노신 (I) 탈아민화와 같은 뉴클레오타이드 변형 뿐만 아니라, 주형이 아닌(non-templated) 뉴클레오타이드 첨가 및 삽입도 포함한다. mRNA에서의 RNA 편집은 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 효과적으로 변화시키므로, 이는 게놈 DNA 서열에 의해 예측된 것과 상이하다.
용어 "암 돌연변이 시그니처(cancer mutation signature)"는 비-암성 기준 세포와 비교할 때 암 세포에 존재하는 돌연변이의 세트를 의미한다.
본 발명의 문맥상 "기준(reference)"은 종양 검체로부터 수득된 결과를 연관 및 비교하는 데 사용될 수도 있다. 일반적으로 "기준"은 환자 또는 하나 이상의 상이한 개인, 바람직하게는 건강한 개인, 특히 동일한 종의 개인로부터 수득된, 하나 이상의 정상 검체, 특히 암 질병에 영향을 받지 않은 검체에 기초하여 수득될 수도 있다. "기준"은 충분히 많은 수의 정상 검체를 검사함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
용어 "기준 게놈(reference genome)"은 정상적인 게놈과 질병에 걸린 게놈에 대하여 좌표계(coordinate system)를 제공하는 게놈을 의미한다. 기준 게놈은 리드를 매핑하고 정상 게놈 및 종양 게놈에 대한 좌표계를 제공하기 위해 사용되고, 좌표계는 염색체 번호, 염색체 내의 뉴클레오타이드 위치 뿐만 아니라 판독의 방향성의 제공을 가능하게 한다. 기준 게놈은 질병에 걸린 샘플을 제공하는 개체와 동일한 종의 한 명 이상의 구성원의 게놈에 기초하거나 개체의 정상 게놈 (매치된 게놈)을 기초로 할 수 있다.
본 발명의 문맥상 임의의 적합한 시퀀싱 방법이 질병-특이적 돌연변이를 동정하기 위하여 사용될 수 있으며, 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing; NGS) 기술이 바람직하고 선택적으로 절대 카피 수 정보를 수득하기 위하여 SNP 분석과 조합한다. 3 세대 시퀀싱 방법은 향후 상기 방법의 시퀀싱 단계를 가속화하기 위하여 NGS 기술을 대체할 수 있다. 명확한 설명을 위하여: 본 발명의 문맥상, 용어 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"는 Sanger 화학으로 알려진 "종래의" 시퀀싱 방법과는 달리, 전체 게놈을 작은 조각으로 분해하여 전체 게놈을 따라 핵산 템플릿을 무작위로 리딩하는 모든 새로운 고효율(high throughput) 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술 (대규모 병렬 시퀀싱 기술(massively parallel sequencing technologies)이라고도 함)은 전체 게놈, 엑솜, 전사체 (게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(methylome) (게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 짧은 시간 내, 예를 들어 1-2 주 내, 바람직하게는 1-7 일 내 또는 가장 바람직하게는 24 시간 이내에 전달할 수 있고, 이론상으로는, 단일 세포 시퀀싱 접근법을 가능하게 한다. 상업적으로 입수 가능하거나 문헌에 언급된 여러 NGS 플랫폼이 본 발명의 문맥상 사용될 수 있으며, 예를 들어 [Zhang et al., 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics, J. Genet Genomics 38(3):95-109]; 또는 [Voelkerding et al., 2009, Next generation sequencing: From basic research to diagnostics, Clinical chemistry 55:641-658]에 상세히 설명되어 있다. 이러한 NGS 기술/플랫폼의 비-제한적인 예시들은 다음과 같다:
1) 예를 들어, Roche-관련 회사 454 Life Sciences (Branford, Connecticut)의 GS-FLX 454 Genome SequencerTM에서 실시되고, [Ronaghi et al., 1998, A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281:363-365]에 처음으로 설명된 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)으로 알려진, 시퀀싱-바이-합성(sequencing-by-synthesis) 기술. 이 기술은 단일 가닥 DNA 결합 비드를 에멀젼 PCR 증폭을 위해 오일로 둘러싸인 PCR 반응물을 함유하는 수성 미셀(micelles)로 격렬한 볼텍싱(vortexing)에 의해 캡슐화하는 에멀젼(emulsion) PCR을 사용한다. 파이로시퀀싱 과정 중, 뉴클레오타이드 혼입 동안 포스페이트(phosphate) 분자로부터 방출된 빛은 중합효소가 DNA 가닥을 합성함에 따라 기록된다.
2) 가역성 염료-터미네이터(dye-terminators)를 기반으로 하는 Solexa (현재 Illumina Inc., San Diego, California의 일부)에 의해 개발되고, 예를 들어 Illumina/Solexa Genome AnalyzerTM 및 Illumina HiSeq 2000 Genome AnalyzerTM에서 실시된 시퀀싱-바이-합성(sequencing-by-synthesis) 접근법. 이 기술에서, 네 개의 뉴클레오타이드 모두가 DNA 중합효소와 함께 유동-세포 채널 내 올리고-프라이밍된 클러스터(oligo-primed cluster) 단편에 동시에 첨가된다. 브릿지(Bridge) 증폭은 시퀀싱을 위해 형광 표지된 네 개의 뉴클레오타이드 모두와 함께 클러스터 가닥을 연장시킨다.
3) 예를 들어, Applied Biosystems (현재 Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)의 SOLidTM 플랫폼에서 실시된 시퀀싱-바이-라이게이션(sequencing-by-ligation) 접근법. 이 기술에서, 고정된 길이의 모든 가능한 올리고 뉴클레오타이드의 풀은 시퀀싱된 위치에 따라 표지된다. 올리고 뉴클레오타이드는 어닐링(anneal) 및 라이게이션되고; 일치하는 서열에 대한 DNA 리가아제(ligase)에 의한 우선적인 라이게이션은 그 위치에서 뉴클레오타이드의 신호 정보를 제공한다. 시퀀싱 전, DNA는 에멀젼 PCR에 의해 증폭된다. 각각 동일한 DNA 분자의 카피만을 함유하는 생성된 비드는, 유리 슬라이드 상에 부착된다. 두 번째 예시로서, Dover Systems (Salem, New Hampshire)의 PolonatorTM G.007 플랫폼 또한 무작위로 배열된, 비드 기반의, 에멀젼 PCR을 사용함으로써 시퀀싱-바이-라이게이션 접근법을 사용하여 병렬 시퀀싱을 위한 DNA 단편을 증폭한다.
4) 예를 들어, Pacific Biosciences (Menlo Park, California)의 PacBio RS 시스템 또는 Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts)의 HeliScopeTM 플랫폼에서 실시된 것과 같은 단일 분자 시퀀싱(single-molecule sequencing) 기술. 이 기술의 눈에 띄는 특징은 증폭 없이 단일 DNA 또는 RNA 분자를 시퀀싱하는 능력으로, Single-Molecule Real Time (SMRT) DNA 시퀀싱으로 정의된다. 예를 들어, HeliScope는 높은 민감성의 형광 검출 시스템을 사용하여, 각 뉴클레오타이드가 합성됨에 따라, 각 뉴클레오타이드를 직접 검출한다. 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer; FRET)에 기반한 유사한 접근법이 Visigen Biotechnology (Houston, Texas)에서 개발된 바 있다. 기타 형광-기반 단일 분자 기술들은 미국 Genomics (GeneEngineTM) 및 Genovoxx (AnyGeneTM)에서 개발되었다.
5) 복제 중 단일 가닥 상의 중합효소 분자의 움직임을 모니터링하기 위해 예를 들어 칩 상에 배열된 다양한 나노구조물이 사용되는, 단일 분자 시퀀싱을 위한 나노 기술. 나노 기술에 기반한 접근법의 비-제한적 예시로는 Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK)의 GridONTM 플랫폼, Nabsys (Providence, Rhode Island)에서 개발된 하이브리드화-보조 나노-포어(hybridization-assisted nano-pore) 시퀀싱 (HANSTM) 플랫폼, 및 조합적인 프로브-앵커 라이게이션(combinatorial probe-anchor ligation) (cPALTM)이라고 불리는 DNA 나노볼 (DNB) 기술을 이용한 전매 리가아제-기반 DNA 시퀀싱 플랫폼이 있다.
6) 예를 들어, LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) 및 Halcyon Molecular (Redwood City, California)에서 개발된, 단일 분자 시퀀싱을 위한 전자 현미경 기반 기술.
7) DNA의 중합 과정에서 방출된 수소 이온의 검출에 기반한 이온 반도체 시퀀싱. 예를 들어, Ion Torrent Systems (San Francisco, California)은 미세-가공된(micro-machined) 웰(well)의 고-밀도 분석을 사용하여 대규모 병렬식으로 이 생화학적 과정을 수행한다. 각 웰은 상이한 DNA 템플릿을 가지고 있다. 웰 밑에는 이온-민감성 층이 있고 그 밑에는 전매 이온 센서가 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 질병-특이적 돌연변이가 발생했는지 여부는 본 발명과 동일한 날에 "고도로 정확한 돌연변이 검출, 특히 개인 맞춤화된 치료법에 있어서"이라는 명칭으로 출원되고, 본 명세서에서 전체 내용이 참조로서 인용된, 국제 PCT 특허 출원에 개시된 바와 같이, 정상적인 게놈의 부위가 정상적인 대립유전자 및 세 개의 노이즈(noise) 대립유전자에 의해 반영된 동형접합성 유전자형, 및 이상적인 노이즈 분포와 일치하는지를 결정하는 것과 종양 게놈 내에서 상응하는 부위는 동형접합성 유전자형과 이상적인 노이즈 분포와 일치하지 않는 돌연변이를 명확하게 하는 것에 관련된 방법에 의해 결정될 수 있으며, 리드(reads)가 베이스 당 1/3인 오차 비율의 확률로 노이즈 대립유전자의 각각에 매핑되는 경우에 리드는 이상적인 노이즈 분포와 일치하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, DNA 및 RNA 제제는 NGS의 출발 물질로서 작용한다. 이러한 핵산은 생물학적 물질과 같은 샘플로부터, 예를 들어 신선한, 급속-냉동된(flash-frozen) 또는 포르말린-고정 파라핀 포매된(formalin-fixed paraffin embedded; FFPE) 종양 조직으로부터, 또는 막 단리된 세포로부터, 또는 환자의 말초 혈액에 존재하는 CTCs로부터 쉽게 수득될 수 있다. 정상 비-돌연변이 게놈 DNA 또는 RNA는 정상 체세포 조직으로부터 추출될 수 있지만, 본 발명의 문맥상, 생식 세포가 바람직하다. 생식 계열 DNA 또는 RNA는 비-혈액학적 악성 종양 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 추출될 수 있다. FFPE 조직 또는 막 단리된 단일 세포로부터 추출된 핵산은 매우 단편화되었지만, 이들은 NGS 적용에 적합하다.
엑솜 시퀀싱을 위한 몇몇 표적화된 NGS 방법은 문헌에 기재되어 있으며 (예를 들어, [Teer and Mullikin, 2010, Human Mol Genet 19(2):R145-51]를 검토를 위해 참조한다), 이들 모두는 본 발명의 문맥상 사용될 수 있다. 이들 방법 중 다수는 (예를 들어, 게놈 포획(capture), 게놈 파티셔닝(partitioning), 게놈 풍부화(enrichment) 등으로 기재됨) 하이브리드화 기술을 사용하고, 어레이-기반 (예를 들어, Hodges et al., 2007, Nat. Genet. 39:1522-1527) 및 액체-기반 (예를 들어, Choi et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci USA 106:19096-19101) 하이브리드화 접근법을 포함한다. DNA 샘플 제조 및 후속적인 엑솜 포획을 위한 시판 중인 키트 또한 입수 가능하다: 예를 들어, Illumina Inc. (San Diego, California)은 TruSeqTM DNA Sample Preparation Kit 및 Exome Enrichment Kit TruSeqTM Exome Enrichment Kit를 제공한다.
예를 들어, 종양 샘플의 서열을 생식 계열 샘플의 서열과 같은 기준 샘플의 서열과 비교할 때, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 검출함에 있어서 위양성(false positive) 결과의 수를 줄이기 위하여, 이들 샘플 유형 중 하나 또는 둘 모두를 반복하여 서열을 결정하는 것이 바람직하다. 따라서, 생식 계열 샘플의 서열과 같은 기준 샘플의 서열은 2회, 3회 또는 그 이상으로 결정되는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 부가적으로, 종양 샘플의 서열은 2회, 3회 또는 그 이상으로 결정된다. 또한, 생식 계열 샘플과 같은 기준 샘플 및/또는 종양 샘플의 RNA의 서열을 적어도 1회 결정하고 게놈 DNA의 서열을 적어도 1회 결정함으로써, 상기 생식 계열 샘플의 서열과 같은 기준 샘플의 서열 및/또는 상기 종양 샘플의 서열을 2 회 이상 결정할 수 있다. 예를 들어, 생식 계열 샘플과 같은 기준 샘플의 복제물들 간의 변이를 결정함으로써, 위양성 체세포 돌연변이의 예상 비율 (FDR)을 통계학적 정량법으로 평가할 수 있다. 샘플의 기술적 반복은 동일한 결과를 생성하여야 하며 이 "동일 vs. 동일 비교"에서 검출되는 모든 돌연변이는 위양성이다. 특히, 기준 샘플에 대한 종양 샘플에서 체세포 돌연변이 검출에 대한 오발견율(false discovery rate)을 결정하기 위하여, 기준 샘플의 기술적 반복을 기준으로서 사용하여 위양성의 수를 평가할 수 있다. 또한, 다양한 품질 관련 메트릭스(metrics) (예를 들어, 커버리지(coverage) 또는 SNP 품질)를 기계 학습 접근법을 사용하여 단일 품질 스코어로 통합할 수도 있다. 주어진 체세포 변이에 대하여, 초과 품질 스코어를 갖는 다른 모든 변이를 계수하여, 데이터세트의 모든 변이를 순위화할 수 있다.
본 발명의 문맥상, 용어 "RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 잔기로 완전히 구성되거나 실질적으로 구성된 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기(β-D-ribofuranosyl group)의 2'-위치에 하이드록시기(hydroxyl group)를 갖는 뉴클레오타이드에 관한 것이다. 용어 "RNA"는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA (예를 들어, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA), 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA (예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변형 RNA)를 포함한다. 이러한 변경은 RNA의 말단(들) 또는 내부에, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에 비-뉴클레오타이드 물질를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자 내 뉴클레오타이드는 비-표준 뉴클레오타이드, 예를 들어 비-자연 발생 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 언급될 수 있다.
용어 "RNA"는 "mRNA"를 포함하며 바람직하게는 "mRNA"에 관한 것이다. 용어 "mRNA"는 "메신저-RNA(messenger-RNA)"를 의미하며, DNA 템플릿을 사용하여 생성되고 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 "전사체(transcript)"에 관한 것이다. 일반적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포와 시험관 내에서 오직 제한된 반감기만을 갖는다. 본 발명의 문맥상, mRNA는 DNA 템플릿으로부터 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관 내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 다양한 시험관 내 전사 키트가 존재한다.
RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 RNA의 안정화 효과를 갖는 및/또는 번역 효율를 증가시키는 하나 이상의 변형에 의하여, 안정화될 수 있고 그의 번역이 증가할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 본 명세서에서 참조 문헌으로 인용된 PCT/EP2006/009448에 기재되어 있다. 본 발명의 일 구현예에서 사용된 RNA의 발현을 증가시키기 위하여, 코딩 영역 내에서, 즉 발현된 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 서열 내에서, 바람직하게는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 서열 변경 없이 이를 변형시켜, mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하기 위하여 GC-함량을 증가시키고, 이로써 세포 내 번역을 향상시킨다.
본 발명에서 사용된 RNA와 관련하여, 용어 "변형(modification)"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트(5'-triphosphates)를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제(phosphatase)로 처리함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따르면, RNA는 그의 안정성을 증가시키고 및/또는 세포독성을 감소시키기 위하여 변형된 리보뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘(5-methylcytidine)은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 슈도우리딘(pseudouridine)은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된다.
본 발명의 일 구현예에서, 용어 "변형(modification)"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조물을 지칭하며 일반적으로 흔치 않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 구성된다. 본 발명의 일 구현예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 자연 발생적인 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡 (m7G)을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조물을 닮은 5'-캡 유사체를 포함하며, 바람직하게는 생체 내 및/또는 세포 내에서 부착된 경우 RNA를 안정화시키고 및/또는 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된다.
RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재하에서 DNA 템플릿의 시험관 내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥에 공동전사로(co-transcriptionally) 혼입되거나, RNA는 예를 들어 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡은 캡핑 효소들, 예를 들어 백시니아(vaccinia) 바이러스의 캡핑 효소들을 사용하여 전사 후(post-transcriptionally) RNA에 부착될 수 있다.
RNA는 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가적인 변형은 자연 발생 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절단(truncation), 또는 5'- 또는 3'- 번역되지 않은 영역 (UTR)의 변경, 예를 들어 상기 RNA의 코딩 영역과 관련이 없는 UTR의 도입일 수 있으며, 예를 들어, 글로빈 유전자 (예를 들어, 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 보다 바람직하게는 인간 베타-글로빈)로부터 유래된 3'-UTR의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 두 개의 카피의 삽입 또는 기존의 3'-UTR과의 교환일 수 있다.
언마스킹된(unmasked) 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스킹된(masked) 폴리-A 서열을 갖는 RNA에 비해 더 효과적으로 번역된다. 용어 "폴리(A) 꼬리(tail)" 또는 "폴리-A 서열"은 일반적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐 (A) 잔기의 서열에 관한 것이며, "언마스킹된 폴리-A 서열"은 RNA 분자의 3' 말단에서의 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 끝나고, 폴리-A 서열의 3' 말단, 즉 다운스트림(downstream)에 위치한 A 이외의 뉴클레오타이드가 뒤따르지 않는다는 것을 의미한다. 또한, 약 120 염기쌍의 긴 폴리-A 서열은 RNA의 최적의 전사 안정성 및 번역 효율을 초래한다.
그러므로, 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위하여, 바람직하게는 길이가 10 내지 500개, 보다 바람직하게는 30 내지 300개, 보다 더 바람직하게는 65 내지 200 및 특히 100 내지 150개의 아데노신 잔기인 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 폴리-A 서열은 길이가 약 120개의 아데노신 잔기이다. 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 더 증가시키기 위하여, 폴리-A 서열은 언마스킹될 수 있다.
추가로, RNA 분자의 3'-번역되지 않은 영역에 3'-번역되지 않은 영역 (UTR)을 혼입시키면 번역 효율이 향상될 수 있다. 시너지 효과는 이러한 3'-번역되지 않은 영역을 두 개 이상 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 3'-번역되지 않은 영역은 이들이 도입되는 RNA와 동종 또는 이종일 수 있다. 본 발명의 특정한 일 구현예에서, 3'-번역되지 않은 영역은 인간 β글로빈 유전자로부터 유래된다.
전술한 변형의 조합, 즉 폴리-A 서열의 혼입, 폴리-A 서열의 언마스킹 및 하나 이상의 3'-번역되지 않은 영역의 혼입은 RNA의 안정성 및 번역 효율의 증가에 시너지(synergistic) 영향을 미친다.
용어 RNA의 "안정성"은 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표이다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속 시간"에 영향을 미칠 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장시간 동안 발현될 것으로 예상할 수 있다.
물론, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 감소시키는 것을 목적하는 경우, 전술한 바와 같이 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는 요소들의 기능을 방해하도록 RNA를 변형시키는 것이 가능하다.
용어 "발현(expression)"은 가장 일반적인 의미로 본 발명에서 사용되었으며, RNA 및/또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 예를 들어, 전사 및/또는 번역에 의해 생산하는 것을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 생산에 관한 것이다. 이는 또한 핵산의 부분적인 발현도 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다.
용어 발현은 또한 "비정상적인 발현(aberrant expression)" 또는 "이상 발현(abnormal expression)"도 포함한다. "비정상적인 발현" 또는 "이상 발현"은 발현이 기준, 예를 들어 개체 내에 특정 단백질 (예를 들어, 종양 항원)의 비정상적 또는 이상 발현과 관련된 질병이 없는 증상인 기준과 비교하여 변경된, 바람직하게는 증가된 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 발현은 질병에 걸린 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
용어 "특이적으로 발현된(specifically expressed)"은 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현되는 것을 의미한다. 예를 들어, 위 점막에서 특이적으로 발현된 종양 항원은, 상기 단백질이 위 점막에서 일차적으로 발현되고 다른 조직에서 발현되지 않거나 또는 다른 조직 또는 기관 유형에서는 유의한 정도로 발현되지 않은 것을 의미한다. 따라서, 위 점막의 세포에서 독점적으로 발현되고 임의의 다른 조직, 예를 들어 고환에서는 훨씬 낮은 정도로 발현된 단백질은 위 점막의 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 종양 항원은 또한 정상 조건 하에서 하나 이상의 조직 유형 또는 기관에서, 예를 들어 두 개 또는 세 개의 조직 유형 또는 기관에서, 그러나 바람직하게는 세 개 이하의 상이한 조직 또는 기관 유형에서 특이적으로 발현될 수 있다. 이 경우, 종양 항원은 이들 기관에서 특이적으로 발현되는 것이다. 예를 들어, 종양 항원이 정상적인 조건 하에서 바람직하게는 폐 및 위에서 거의 같은 정도로 발현되는 경우, 상기 종양 항원은 폐 및 위에서 특이적으로 발현되는 것이다.
본 발명의 문맥상, 용어 "전사(transcription)"는 DNA 서열 내의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정에 관한 것이다. 이어서, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관 내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관 내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무-세포계(cell-free system)에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관 내 합성되는 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체를 생성하는 데 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 지정되고, 용어 "벡터"에 포괄된다. 본 발명에서 사용된 RNA는 바람직하게는 시험관 내 전사된 RNA (IVT-RNA)이고, 적절한 DNA 템플릿의 시험관 내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 조절하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 중합효소의 특정 예시로는 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소가 있다. 바람직하게는, 시험관 내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 조절된다. 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고, 이를 시험관 내 전사를 위하여 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득될 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.
용어 "번역(translation)"은 세포의 리보솜 내 과정에 관한 것으로, 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 조립을 명령하여 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 만든다.
본 발명의 문맥상, 핵산과 기능적으로 연결될 수 있는 발현 조절 서열(expression control sequences) 또는 조절 서열(regulatory sequences)은 상기 핵산과 동종 또는 이종일 수 있다. 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 함께 공유결합적으로 결합된 경우 함께 "기능적으로" 연결되어, 상기 코딩 서열의 전사 또는 번역이 상기 조절 서열의 영향 하에 있거나 조절 하에 있게 된다. 코딩 서열이, 조절 서열과 코딩 서열의 기능적 결합을 갖는 기능성 단백질로 번역되는 경우, 조절 서열의 유도는 코딩 서열에서의 리딩 프레임 이동(reading frame shift)을 일으키지 않거나 목적하는 단백질 또는 펩타이드로 번역되는 코딩 서열의 불능을 일으키지 않고 코딩 서열의 전사를 유도한다.
본 발명의 문맥상, 용어 "발현 조절 서열(expression control sequences)" 또는 "조절 서열(regulatory sequences)"은 핵산의 전사 또는 유래된 RNA의 번역을 조절하는 프로모터, 리보솜-결합 서열 및 기타 조절 요소들을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 조절 서열은 조절될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 TATA-박스(TATA-box), 캡핑-서열, CAAT-서열 등과 같은 전사 또는 번역의 개시에 관여하는 5'-전사되지 않은 및 5'- 및 3'- 번역되지 않은 서열을 포함한다. 특히, 5'-전사되지 않은 조절 서열은 기능적으로 결합된 유전자의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 조절 서열은 또한 인핸서(enhancer) 서열 또는 업스트림(upstream)에 활성자 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 세포에서 발현되는 RNA는 상기 세포 내로 도입된다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 세포 내로 도입되는 RNA는 적절한 DNA 템플릿의 시험관 내 전사에 의해 수득된다.
"…를 발현할 수 있는 RNA" 및 "…를 코딩하는 RNA"와 같은 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 RNA가 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생산하도록 발현될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는, RNA는 세포 번역 기계(cellular translation machinery)와 상호 작용하여 그것이 발현할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
"전달(transferring)", "도입(introducing)" 또는 "형질감염(transfecting)"과 같은 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 핵산, 특히 외인성(exogenous) 또는 이종 핵산, 특히 RNA를 세포 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포는 기관, 조직 및/또는 생물체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 핵산의 투여는 네이키드(naked) 핵산으로서 또는 투여 시약과의 조합으로서 달성된다. 바람직하게는, 핵산의 투여는 네이키드 핵산의 형태로 이루어진다. 바람직하게는, RNA는 RNase 억제제와 같은 안정화 물질과 조합하여 투여된다. 본 발명은 또한 핵산을 세포 내로 반복 도입하여 발현을 장기간 동안 지속되도록 하는 것을 구상한다.
세포는 RNA가 결합될 수 있는, 예를 들어 RNA와 복합체를 형성하거나 RNA가 봉입 또는 캡슐화된 소포를 형성함으로써 결합될 수 있는 임의의 담체로 형질감염되어, 네이키드 RNA에 비하여 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 유용한 담체는 양이온성 지질, 리포좀, 특히 양이온성 리포좀, 및 미셀, 및 나노입자와 같은 지질-함유 담체를 포함한다. 양이온성 지질은 음으로 하전된(charged) 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 임의의 양이온성 지질은 사용될 수 있다.
바람직하게는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 RNA의 세포, 특히 생체 내 존재하는 세포 내로의 도입은 상기 세포 내 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 초래한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 특정 세포에 대한 핵산의 표적화가 바람직하다. 이러한 구현예에서, 핵산을 세포에 투여하기 위해 적용되는 담체 (예를 들어, 레트로바이러스 또는 리포좀)는 표적화 분자를 나타낸다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자는 핵산 담체에 혼입되거나 그에 결합될 수 있다. 핵산이 리포좀에 의해 투여되는 경우, 엔도시토시스와 연관된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 포획(uptake)을 가능하게 하기 위하여 리포좀 제제에 혼입될 수 있다. 이러한 단백질은 특정 세포 유형에 특이적인 그의 단편의 캡시드(capsid) 단백질, 내재화된 단백질에 대한 항체, 세포 내 위치를 표적화하는 단백질 등을 포괄한다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 바람직하게는 온전한(intact) 세포, 즉 효소, 세포소기관(organelles) 또는 유전 물질과 같은 그의 정상적인 세포 내 성분들을 방출한 바 없는 온전한 막을 갖는 세포이다. 온전한 세포는 바람직하게는 생존(viable) 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아 있는 세포이다. 바람직하게는, 상기 용어는 외인성 핵산으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 용어 "세포"는 본 발명에 따라 원핵 세포 (예를 들어, E. coli) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, HEK293 세포, HELA 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 외인성 핵산은 세포 내부에서 (i) 자체적으로 자유롭게 분산되거나, (ii) 재조합 벡터에 혼입되거나, 또는 (iii) 숙주 세포 게놈 또는 미토콘드리아 DNA에 통합된 증상로 발견될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류의 세포와 같은 포유류 세포가 특히 바람직하다. 세포는 다수의 조직 유형에서 유래될 수 있으며, 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 특정 예시로는 케라티노사이트(keratinocytes), 말초 혈액 백혈구, 골수 줄기 세포 및 배아 줄기 세포가 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식세포이다.
핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 상기 핵산에 의해 인코딩되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현한다.
용어 "클론 확장(clonal expansion)"은 특정 대상체가 증식되는 과정을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 상기 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되어 증식하고, 상기 항원을 인식하는 특이적 림프구가 증폭되는, 면역학적 반응과 관련하여 사용된다. 바람직하게는, 클론 확장은 림프구의 분화를 유도한다.
"감소하는(reducing)" 또는 "억제하는(inhibiting)"과 같은 용어는 전체적인 감소, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상 수준의 감소를 일으키는 능력에 관한 것이다. 용어 "억제하는" 또는 이와 유사한 문구들은 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로의 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가하는(increasing)", "향상시키는(enhancing)", "촉진하는(promoting)" 또는 "연장시키는(prolonging)"과 같은 용어는 바람직하게는 약 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 100%, 바람직하게는 적어도 200%, 및 특히 적어도 300%로의 증가, 향상, 촉진 또는 연장에 관한 것이다. 이들 용어는 또한 0 또는 측정 불가하거나 검출 불가한 수준에서 0 이상의 수준 또는 측정 가능하거나 검출 가능한 수준까지의 증가, 향상, 촉진 또는 연장에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 공유결합적으로 연결된 2 개 이상, 바람직하게는 3 개 이상, 바람직하게는 4 개 이상, 바람직하게는 6 개 이상, 바람직하게는 8 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 바람직하게는 13 개 이상, 바람직하게는 16 개 이상, 바람직하게는 21 개 이상 및 바람직하게는 최대 8, 10, 20, 30, 40 또는 50 개, 특히 100 개의 아미노산을 포함하는 물질을 의미한다. 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 큰 펩타이드, 바람직하게는 100 개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 의미하지만, 일반적으로 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 동의어이며 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명에 따르면, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련하여 용어 "변형(modification)" 또는 "서열 변화"는 야생형 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 서열과 같은 어버이(parental) 서열과 비교하여 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 서열 변화에 관한 것이다. 상기 용어는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및 아미노산 치환 변이체를 포함하며, 바람직하게는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 이들 모든 서열 변화는 잠재적으로 새로운 에피토프를 생성할 수 있다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2 개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다.
아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상의 아미노산의 제거를 특징으로 한다.
아미노산 치환 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법의 실험에 사용된 변형 또는 변형된 펩타이드는 변형을 포함하는 단백질로부터 유래된 것일수도 있다.
용어 "유래된(derived)"은 본 발명에 따라 특정 대상체, 특히 특정 펩타이드 서열이 그것이 유래된 대상 내에 존재하는 것을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특정 서열 영역의 경우, "유래된"은 관련 아미노산 서열이 그것이 존재하는 아미노산 서열로부터 유래된 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 작용제(agents), 조성물 및 방법은 질병, 예를 들어, 항원을 발현하고 항원 펩타이드를 제시하는 질병에 걸린 세포의 존재를 특징으로 하는 질병을 가진 개체를 치료하기 위해 사용될 수있다. 특히 바람직한 질병은 암 질병이다. 본 명세서에 기재된 작용제, 조성물 및 방법은 또한 본 명세서에 기재된 질병을 예방하기 위한 예방접종 또는 백신접종에 사용될 수 있다.
이러한 하나의 제제는 본 발명의 방법에 의해 동정된 면역 탈출에 저항하는 적합한 네오에피토프에 기초하여 고안된 암 백신과 같은 백신이다.
본 발명에 따르면, 용어 "백신"은 투여시 암 세포와 같은 질병 세포 또는 병원체를 인식하고 공격하는 면역 반응, 특히 세포성 면역 반응을 유도하는 약제학적 제제 (약제학적 조성물) 또는 제품에 관한 것이다. 백신은 질병을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 용어 "개인 맞춤화된 암 백신(personalized cancer vaccine)" 또는 "개별화된 암 백신(individualized cancer vaccine)"은 특정 암 환자에 관한 것이며, 암 백신이 개별적인 암 환자의 필요 또는 특수 상황에 알맞게 조절된 것을 의미한다.
본 발명에 따라 제공된 암 백신은 환자에 투여될 때 바람직하게는 환자의 종양에 특이적인 T 세포를 자극, 프라이밍 및/또는 확장시키기 위한 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제공한다. T 세포는 바람직하게는 T 세포 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포로 향한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 백신은 바람직하게는 클래스 I MHC로 하나 이상의 종양-관련 신생항원(neoantigen)의 제시를 특징으로 하는 암 질병에 대한, 세포성 반응, 바람직하게는 세포독성 T 세포 활성을 유도 또는 촉진할 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 백신은 암 특이적 돌연변이를 표적으로 하기 때문에, 환자의 종양에 대해 특이적일 것이다.
본 발명의 문맥상, 백신은 환자에 투여될 때 바람직하게는 하나 이상의 T 세포 에피토프 (본 명세서에서 동정된 네오에피토프, 적합한 네오에피토프, 적합한 네오에피토프의 조합), 예를 들어 2 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상 및 바람직하게는 최대 60 개, 최대 55 개, 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개, 최대 30 개의 T 세포 에피토프를 제공하는 백신에 관한 것이며, 이는 적합한 네오에피토프인 것으로 예측된 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드를 포괄한다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의한 이들 에피토프의 제시는 바람직하게는 MHC에 결합되는 경우에 에피토프를 표적화하는 T 세포를 유도하고, 이로써 환자의 종양, 바람직하게는 종양 전이뿐만 아니라 원발성 종양도 표적화하고, T 세포 에피토프가 유래된 항원을 발현하며, 상기 동일한 에피토프를 종양 세포의 표면에 제시한다.
본 발명의 방법은 암 백신 접종을 위하여 본 발명에서 동정된 적합한 네오에피토프를 함유하는 동정된 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드의 유용성을 결정하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 추가적인 단계는 다음과 같은 하나 이상의 단계를 포함한다: (i) 변형이 공지 또는 예측된 MHC 제시된 에피토프 내에 위치하는지 여부를 평가하는 단계, (ii) 변형이 MHC 제시된 에피토프 내에 위치하는지 여부를 시험관 내 및/또는 인실리코(in silico) 시험하는 단계, 예를 들어 변형이 MHC 제시된 에피토프로 처리 및/또는 제시되는 펩타이드 서열의 일부인지 여부를 시험하는 단계, 및 (iii) 구상된 변형된 에피토프, 특히 이들이 천연 서열 콘텍스트(sequence context)로 존재할 때, 예를 들어 자연 발생 단백질에서 상기 에피토프 또한 인접하고 있는 아미노산 서열에 인접된 경우, 및 항원 제시 세포에서 발현될 때)가, T 세포, 예를 들어 원하는 특이성을 갖는 환자의 T 세포를 자극할 수 있는지 여부를 시험관 내 시험하는 단계. 이러한 인접 서열(flanking sequences)은 각각 3 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있으며, N-말단 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열에 인접할 수 있다.
본 발명에 따라 결정된 변형된 펩타이드는 암 백신 접종을 위한 에피토프로서 이들의 유용성에 대해 순위화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 방법은 동정된 변형된 펩타이드를, 제공되는 각 백신에서의 이들의 유용성에 대해 분석 및 선택하는 수동 또는 컴퓨터-기반 분석 과정을 포함한다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 분석 프로세스는 컴퓨터를 이용한 알고리즘-기반 프로세스이다. 바람직하게는, 상기 분석 프로세스는 이들이 면역원성일 가능성에 대한 예측에 따라 에피토프를 결정 및/또는 순위화하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라 동정되고 백신에 제공된 에피토프는 바람직하게는 에피토프 (본 명세서에서 동정된 네오에피토프, 적합한 네오에피토프, 적합한 네온에피토프의 조합에서 발견된 네오에피토프)를 포함하는 폴리펩타이드, 예를 들어 폴리에피토프(polyepitopic) 폴리펩타이드의 형태, 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 특히 RNA의 형태로 존재한다. 게다가, 에피토프는 백신 서열의 형태로 폴리펩타이드에 존재할 수 있으며, 즉 이들의 천연 서열 콘텍스트로, 예를 들어 자연 발생 단백질에서 상기 에피토프 또한 인접하고 있는 아미노산 서열에 인접한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 인접 서열은 각 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있으며, N-말단 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열에 인접할 수 있다. 따라서, 백신 서열은 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상, 35 개 이상, 40 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 네오에피토프 및/또는 백신 서열은 폴리펩타이드 머리에서 꼬리까지(head-to-tail) 일렬로 배열된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 명세서에서 동정된 에피토프/적합한 네오에피토프 및/또는 백신 서열은 링커, 특히 중성 링커에 의해 이격되어(spaced) 있다. 본 발명에 따른 용어 "링커(linker)"는 에피토프 또는 백신 서열과 같은 두 개의 펩타이드 도메인들 사이에 첨가되어 상기 펩타이드 도메인들을 연결하는 펩타이드에 관한 것이다. 링커 서열에 관련하여 특별한 제한은 없다. 그러나, 링커 서열은 2 개의 펩타이드 도메인들 사이의 입체 장애(steric hindrance)를 감소시키고, 잘 번역되며, 에피토프의 처리를 지지 또는 가능하게 하는 것이 바람직하다. 또한, 링커는 면역원성 서열 요소를 갖지 않거나 거의 갖지 않아야 한다. 링커는 바람직하게는 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수 있는, 인접한(adjacent) 에피토프들 사이의 정션 결합(junction suture)으로부터 발생하는 것들과 유사한 비-내인성(non-endogenous) 에피토프를 생성하지 않아야 한다. 따라서, 폴리에피토프 백신은 바람직하게는 원치 않는 MHC 결합 정션 에피토프의 수를 감소시킬 수 있는 링커 서열을 함유하여야 한다. [Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006)] 및 [Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004)]은 글리신이 풍부한(glycine-rich) 서열이 프로테아좀 처리를 손상시키므로, 글리신이 풍부한 링커 서열의 사용이 프로테아좀에 의해 처리될 수 있는 링커 함유 펩타이드의 수를 최소화시킨다는 것을 보여주었다. 또한, 글리신은 MHC 결합 그루브 위치에서 강력한 결합을 억제하는 것으로 관찰되었다 (Abastado et al., 1993, J. Immunol. 151(7):3569-75). [Schlessinger et al., 2005, Proteins 61(1):115-26]은 아미노산 서열에 포함된 아미노산 글리신 및 세린이 프로테아좀에 의해 보다 효과적으로 번역 및 처리되는 보다 유연한 단백질을 야기하여, 인코딩된 에피토프에 대한 더 나은 접근을 가능하게 한다는 것을 밝혀냈다. 링커는 각각 3 개 이상, 6 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 풍부하다. 바람직하게는, 링커의 아미노산의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 글리신 및/또는 세린이다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 링커는 실질적으로 아미노산 글리신 및 세린으로 구성된다. 본 발명의 일 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e를 포함하고, 여기서 a, b, c, d 및 e는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 중에서 독립적으로 선택되는 숫자이고, 여기서 a + b + c + d + e는 0이 아니며, 바람직하게는 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상이다. 본 발명의 일 구현예에서, 링커는 실시예에 기재된 링커 서열, 예를 들어 서열 GGSGGGGSG를 비롯하여 본원에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 동정된 하나 이상의 적합한 네오에피토프가 혼입된 폴리펩타이드, 예를 들어 폴리에피토프 폴리펩타이드는 환자의 세포, 예를 들어 항원 제시 세포에서 발현되어 상기 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 핵산, 바람직하게는 RNA, 예를 들어 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA의 형태로 환자에게 투여된다. 본 발명은 또한 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "폴리에피토프 폴리펩타이드(polyepitopic polypeptide)"로 이루어지는 하나 이상의 멀티에피토프 폴리펩타이드(multiepitopic polypeptides)를, 바람직하게는 환자의 세포, 예를 들어 항원 제시 세포에서 발현되어 상기 하나 이상의 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 핵산, 바람직하게는 RNA, 예를 들어 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA의 형태로 투여하는 것을 구상한다. 하나 이상의 멀티에피토프 폴리펩타이드를 투여하는 경우, 상이한 멀티에피토프 폴리펩타이드에 의해 제공되는 적합한 네오에피토프는 상이하거나 부분적으로 중복될 수 있다. 일단 환자의 세포, 예를 들어 항원 제시 세포에 존재하면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 발명에 따라 동정된 적합한 네오에피토프를 생산하도록 처리된다. 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는, 바람직하게는 MHC 제시 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대한 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 II-제시 에피토프를 제공한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는, MHC 제시 네오에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대한 CD8+ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 I-제시 네오에피토프를 제공할 수도 있다. 게다가, 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는, 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지는 않지만 암 세포에 의해 발현되고 바람직하게는 암 세포에 대한 면역 반응, 바람직하게는 암 특이적 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프 뿐만 아니라, 하나 이상의 네오에피토프 (공지된 네오에피토프 및 본 발명에 따라 동정된 네오에피토프를 포함함)를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 제공되는 백신의 투여는 암-특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않으며, MHC 클래스 I-제시 에피토프이고 및/또는 MHC 제시 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대한 CD8+ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 에피토프 뿐만 아니라 MHC 클래스 II-제시 에피토프이고 및/또는 MHC 제시 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대한 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 네오에피토프를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 암-특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프는 종양 항원으로부터 유래된다. 본 발명의 일 구현예에서, 암-특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 네오에피토프 및 에피토프는 암 치료에 시너지 효과를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 제공되는 백신은 세포독성 및/또는 헬퍼 T 세포 반응의 폴리에피토프 자극에 유용하다.
본 발명에 따라 제공된 백신은 재조합 백신일 수 있다.
다른 유형의 작용제는 면역 세포, 예를 들어 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포, 또는 T 세포 수용체를 재조합적으로 발현하는 T 세포, 또는 인공 또는 키메라 T 세포 수용체 (CAR)를 발현하는 것인데, 이 수용체는 항원, 예를 들어 적합한 질병-특이적 표적으로서 본 발명의 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프를 표적으로 하고, 바람직하게는 이러한 네오에피토프는 MHC 분자와의 복합체 내 세포의 표면 상에 발현된다. 바람직하게는, 일단 면역 세포가 수용체-항원 결합에 의해 항원을 인식하면, 면역 세포 (면역반응성 세포)는 자극, 프라이밍 및/또는 확대되거나 상기 기재한 바와 같이 면역 반응 세포의 효과기 기능을 발휘한다.
용어 "항원-특이적 T 세포" 또는 이와 유사한 용어는 항원, 예를 들어 MHC 클래스 I 분자 내에서 복합체화되고, 상기 기재한 바와 같이 상기 항원에 결합 시에 바람직하게는 T 세포의 효과기 기능을 발휘하는 적합한 네오에피토프를 인식하는 T 세포에 관한 것이다. T 세포 및 다른 림프 세포는 세포가 항원을 발현하는 표적 세포를 죽이는 경우에 항원에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 예를 들어, 크롬 방출 분석 또는 증식 분석과 같은 다양한 표준 기술 중 임의의 방법을 사용하여 평가할 수도 있다. 대체적으로, 림포카인 (인터페론-γ과 같은)의 합성을 측정할 수 있다.
T 세포 수용체 및 다른 항원 수용체는 상기 기재한 바와 같다. 용어 "CAR"(또는 "키메라 항원 수용체")은 암 세포와 같은 표적 세포 상의 표적 구조 (예를 들어, 항원)를 인식, 즉 결합하고 (예를 들어, 표적 세포의 표면 상에 발현되는 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합에 의해), 세포 표면 상에 상기 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 면역 효과기 세포 상에 특이성을 부여할 수도 있는 분자의 단일 분자 또는 복합체를 포함하는 인공 수용체에 관한 것이다. 바람직하게는, CAR에 의한 표적 구조의 인식은 상기 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포의 활성화를 유발한다. CAR은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 도메인을 포함하는 상기 단백질 단위를 하나 이상의 단백질 단위로 포함할 수도 있다. 용어 "CAR"는 T 세포 수용체를 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 모노클로날 항체로부터 유래된 단일-사슬 가변 단편 (scFv)은 CD3- 제타 막 관통(transmembrane) 및 엔도도메인(endodomain)에 융합된다. 이러한 분자는 표적 세포 상에서 항원 표적의 scFv에 의한 인식에 대한 반응에서 제타 신호의 전이 및 표적 항원을 발현하는 표적 세포의 사멸을 유발한다. 사용될 수 있는 항원 인식 도메인은 다른 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 단일 사슬 중에서 포함한다. 실제로, 주어진 표적에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 것이 항원 결합 도메인으로 사용될 수 있다.
항원 인식 후, 수용체가 모여 세포로 신호가 전달된다. 이러한 점에서, "T 세포 신호 전달 도메인"은 항원이 결합 된 후에 활성화 신호를 T 세포로 전송하는 도메인, 바람직하게는 엔도도메인이다. 가장 일반적으로 사용되는 엔도도메인 성분은 CD3-제타이다.
키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-조작 T 세포를 이용한 입양 세포 전이 요법은 CAR-변형 T 세포가 질병에 걸린 세포, 예를 들어 종양 항원 상에 발현된 임의의 항원을 거의 표적으로 하도록 조작될 수 있기 때문에 유망한 요법이다. 바람직하게는, 종양 항원은 적합한 종양-특이적 표적으로서 본 발명의 방법에 의해 동정된 종양-특이적 돌연변이로부터 생성된 네오에피토프이다. 예를 들어, 환자의 T 세포는 환자의 종양 세포의 표면 상에 MHC 분자와 복합체를 형성한 종양-특이적 네오에피토프에 대하여 특이적으로 CAR을 발현하도록 유전공학적으로 조작 (유전공학적으로 변형)되고 나서, 환자에게 다시 주입 될 수 있다.
CAR은 T 세포 수용체의 기능을 대체할 수 있으며, 특히 세포용해 활성과 같은 반응성을 T 세포와 같은 세포에 부여할 수도 있다. 그러나, 상기 기재한 바와 같은 항원 펩타이드-MHC 복합체에 대한 T 세포 수용체의 결합과는 대조적으로, CAR은 또한 항원에, 특히 세포 표면에서 발현 될 때 결합할 수 있다.
본 발명에 따르면, CARs은 일반적으로 세 개의 도메인을 포함할 수도 있다. 첫 번째 도메인은 항원을 인식하고 결합하는 결합 도메인이다. 두 번째 도메인은 공-자극 도메인이다. 공-자극 도메인은 CAR이 표적 부분에 결합 시에 세포독성 림프구의 증식 및 생존을 향상시키는 역할을 한다. 공-자극 도메인의 상동성은 CAR에 의한 표적 부분의 결합 시에 세포 증식 및 생존을 향상시키는 능력이 있다는 점에서만 제한된다. 적합한 공-자극 도메인은 CD28, CD137 (4-1BB), 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 과(family)의 구성체, CD134 (OX40), 수용체의 TNFR-상과(superfamily)의 구성체, 및 CD278 (ICOS), 활성화된 T 세포 상에서 발현되는 CD28-상과 공-자극 분자를 포함한다. 세 번째 도메인은 활성화 신호 도메인 (또는 T 세포 신호 도메인)이다. 활성화 신호 도메인은 항원에 CAR의 결합 시에 세포독성 림프구를 활성화시키는 역할을 한다. 활성화 신호 도메인의 상동성은 CAR에 의한 항원의 결합 시에 선택된 세포독성 림프구의 활성화를 유도 할 수 있는 능력이 있다는 점에서만 제한된다. 적합한 활성화 신호 도메인은 T 세포 CD3 [제타] 사슬 및 Fc 수용체 [감마]를 포함한다.
CARs은 세 개의 도메인을 함께 융합 단백질의 형태로 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 N- 말단에서 C- 말단 방향으로 연결된 결합 도메인, 하나 이상의 공-자극 도메인 및 활성화 신호 도메인을 포함할 것이다. 그러나, CARs은 이러한 배열에 한정되지 않고 다른 배열이 허용 가능하며 결합 도메인, 활성화 신호 도메인 및 하나 이상의 공-자극 도메인을 포함한다. 결합 도메인이 항원에 자유롭게 결합해야 하기 때문에, 융합 단백질에서의 결합 도메인의 배치는 일반적으로 세포 외부 상의 영역에 디스플레이가 달성되는 것으로 이해될 것이다. 동일한 방식으로, 공-자극 및 활성화 신호 전달 도메인이 세포독성 림프구의 활성 및 증식을 유도하기 때문에, 융합 단백질은 일반적으로 세포 내부에 이들 두 개의 도메인을 디스플레이할 것이다. CARs은 세포 표면에 융합 단백질의 적절한 방출을 보장하기 위한 신호 펩타이드, 융합 단백질이 필수적인 막 단백질로 유지될 수 있도록 보장하기 위한 막 관통 도메인, 및 결합 도메인에 유연성을 부여하고 항원에 강하게 결합할 수 있도록 하는 힌지 도메인(hinge domain) (또는 스페이서 영역(spacer region))과 같은, 추가적인 요소를 포함할 수도 있다.
CARs 및 다른 인공 항원 수용체와 관련하여 사용되는 세포는 바람직하게는 T 세포, 특히 세포독성 림프구, 바람직하게는 세포독성 T 세포, 자연 살해 세포 (NK) 및 림포카인-활성화 킬러 (LAK) 세포 중에서 선택된다. 활성화 시에, 이들 각각의 세포독성 림프구는 표적 세포의 파괴를 유발한다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 다음 수단 중 하나 또는 둘 모두에 의해 표적 세포의 파괴를 유발한다. 첫째, 활성화 시에, T 세포는 퍼포린, 그랜자임 (granzymes) 및 그라눌리신 (granulysin)과 같은 세포 독소를 방출한다. 퍼포린과 그라눌리신은 표적 세포에 공극을 만들고 그랜자임은 세포에 들어가 세포의 세포사멸 (예정된 세포 사멸)을 유도하는 세포질에서 카스파제 캐스케이드(caspase cascade)를 유발한다. 둘째, T 세포와 표적 세포 사이의 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 세포사멸이 유도될 수 있다. 세포독성 림프구는 이종 세포 또는 동종 세포가 사용될 수도 있으나, 바람직하게는 자가 세포이다.
CAR 내에 존재할 수도 있는 항원에 대한 결합 도메인은 항원에 결합하는 (표적화하는) 능력, 즉 항원 내에 에피토프에 결합하는 (표적화하는) 능력, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 질병-특이적 표적으로서 동정된 네오에피토프에 결합하는 (표적화하는) 능력을 가지며, 네오에피토프는 세포 표면 상에서 MHC의 콘텍스트 내에 존재한다. 바람직하게는, 항원에 대한 결합 도메인은 항원에 특이적이다.
다른 유형의 작용제는 본 발명의 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프를 함유하는 펩타이드가 로딩된 면역 세포, 예를 들어 림프 세포이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 림프 세포는 수지상 세포이다. 본 발명의 문맥상, 바람직하게는 치료될 환자로부터 단리된 림프 세포는 표적화될 항원과 함께 배양되고 나서, 배양된 세포는 환자에게 투여되어 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응이 유도된다. 따라서, 적합한 에피토프를 포함하는 펩타이드는 수지상 세포와 함께 배양될 수 있고, 적합한 네오에피토프를 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 배양 된 세포가 투여될 수 있다.
본 발명의 문맥상, 용어 "재조합(recombinant)"은 "유전 공학을 통해 제조된 "을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, 재조합 폴리펩타이드와 같은 "재조합 개체(recombinant entity)"는 자연 발생적이지 않고, 바람직하게는 자연적으로 조합되지 않는 아미노산 또는 핵산 서열과 같은 개체들을 조합한 결과이다. 예를 들어, 본 발명의 문맥상 재조합 폴리펩타이드는, 상이한 단백질로부터 유래되거나 또는 예를 들어 펩타이드 결합 또는 적절한 링커에 의해 함께 융합된 동일한 단백질의 상이한 부분으로부터 유래된, 네오에피토프 또는 백신 서열과 같은 몇몇 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "자연 발생적인(naturally occurring)"은 객체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 생물체 (바이러스 포함) 내에 존재하고 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 실험실 내에서 인간에 의해 의도적으로 변형된 바 없는 펩타이드 또는 핵산은 자연 발생적이다.
본 발명에 따르면, 용어 "질병"은 암 질병, 특히 본 명세서에 기재된 암 질병의 형태를 포함하는, 임의의 병적인 상태를 의미한다.
용어 "정상(normal)"은 건강한 개체 또는 조직의 건강한 증상 또는 조건, 즉 비-병적인 조건을 의미하며, 여기서 "건강한"은 바람직하게는 비-암성(non-cancerous)을 의미한다.
"항원을 발현하는 세포를 수반하는 질병"은 질병에 걸린 조직 또는 기관의 세포에서 항원의 발현이 검출된다는 것을 의미한다. 질병에 걸린 조직 또는 기관의 세포에서의 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 증상에 비하여 증가될 수 있다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상 증가하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 한편, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 항원을 발현하는 세포를 수반하거나 이에 관련된 질병은 암 질병을 포함한다.
암 (의학 용어: 악성 신생물(malignant neoplasm))은 세포군이 통제되지 않은 성장 (정상 범위를 넘어서는 분열), 침입 (인접한 조직의 침입과 파괴), 때로는 전이 (림프 또는 혈액을 통항 신체의 다른 위치로 확산)를 나타내는 질병의 한 종류이다. 이러한 암의 세 가지 악성 특징은 자가-한정적인, 양성 종양과 구분되며, 침투하거나 전이하지 않는다. 대부분 암은 종양을 형성하지만 일부는 백혈병와 같이, 형성하지 않는다.
악성 종양은 본질적으로 암과 동의어이다. 악성 종양, 악성 신생물 및 악성 종양은 본질적으로 암과 동의어이다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양" 또는 "종양 질병"은 바람직하게는 종창(swelling) 또는 병변(lesion)을 형성하는 세포 (신생 세포, 종양 발생 세포 또는 종양 세포라고 불림)의 비정상적인 성장을 의미한다. "종양 세포"란 급속한, 조절되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고, 새로운 성장을 개시하는 자극이 중단된 후에도 지속적으로 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 기능적 연계 및 구조적 조직화가 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있으며 대체로 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직의 덩어리를 형성한다.
양성 종양은 암의 세 가지 악성 특징이 모두 없는 종양이다. 따라서, 정의에 의하면, 양성 종양은 무제한적이고 공격적인 방식으로 성장하지 않으며, 주변 조직에 침투하지 않으며, 비-인접한 조직으로 확산 (전이화)하지 않는다.
신생물은 종양 형성(neoplasia)으로 인한 비정상 조직 덩어리이다. 신생물 (그리스어로 새로운 성장)은 세포의 비정상적인 증식이다. 세포의 성장은 그 주위의 정상적인 조직의 성장을 초과하고 조화를 이루지 못한다. 성장은 자극을 멈춘 후에도 동일한 초과적인 방식으로 지속된다. 대개 덩어리나 종양을 유발한다. 신생물은 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있다.
본 발명의 문맥상 "종양의 성장" 또는 "종양 성장"은 종양이 크기를 증가시키는 경향 및/또는 종양 세포가 증식하는 경향에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 위하여, 용어 "암" 및 "암 질병"은 용어 "종양" 및 "종양 질병"과 상호 교환적으로 사용된다.
암은 종양과 유사한 세포 유형, 따라서 종양의 기원으로 추정되는 조직으로 분류된다. 이들은 각각 조직학 및 위치이다.
본 발명에 따른 용어 "암"은 백혈병, 정상피종(seminomas), 흑색종(melanomas), 기형종(teratomas), 림프종, 신경모세포종(neuroblastomas), 신경교종(gliomas), 직장 암, 자궁내막 암, 신장 암, 부신 암, 갑상선 암, 혈액 암, 피부암, 뇌 암, 자궁경부 암, 장 암(intestinal cancer), 간 암, 대장 암, 위암, 장 암(intestine cancer), 두경부 암, 위장 암, 림프절 암, 식도 암, 대장 암( colorectal cancer), 췌장 암, 귀, 코 및 목 (ENT) 암, 유방 암, 전립선 암, 자궁암(cancer of the uterus), 난소 암 및 폐암 및 이들의 전이를 포함한다. 이의 예시로는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 대장 암종, 신 세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 상기 기재한 암의 종류 또는 종양의 전이이다. 본 발명에 따른 암은 또한 암 전이 및 암 재발을 포함한다.
"전이(metastasis)"란 암 세포가 그의 원래 부위에서 신체의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 원발성 종양으로부터의 악성 세포의 탈착, 세포외 기질의 침입, 내피 기저막의 침투에 의한 체강 및 혈관으로의 유입, 및 이어서, 혈액에 의해 운반된 후 표적 기관으로의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 새로운 종양, 즉 2차 종양 또는 전이 종양의 표적 부위에서의 성장은 혈관 신생(angiogenesis)에 의존한다. 종양 전이는 원발성 종양의 제거 후에도, 종양 세포 또는 성분이 남아있을 수 있고 전이 잠재능을 발달시키기 때문에 종종 발생한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 부위 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 것인 "원격 전이(distant metastasis)"에 관한 것이다.
2차 또는 전이 종양의 세포는 원래의 종양의 세포와 유사하다. 예를 들어, 이는 난소암이 간으로 전이된 경우, 2차 종양은 비정상적인 간세포가 아닌 비정상적인 난소 세포로 구성된다는 것을 의미한다. 상기 간에서의 종양은 따라서 간암이 아니라 전이 난소암으로 불린다.
용어 "순환 종양 세포(circulating tumor cells)" 또는 "CTCs"는 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 탈착되어 혈류를 순환하는 세포에 관한 것이다. CTCs는 상이한 조직에서 추가적인 종양의 후속적인 성장 (전이)을 위한 씨앗을 구성할 수 있다. 순환 종양 세포는 전이성 질병이 있는 환자의 전혈 mL 당 1-10 CTC 순의 빈도로 발견된다. CTC를 단리하기 위한 연구 방법들이 개발되었다. 당해 기술분야에 CTCs를 단리하기 위한 여러 연구 방법들, 예를 들어 상피 세포가 정상 혈액 세포에서는 결여되어 있는 세포 부착 단백질 EpCAM을 공통적으로 발현한다는 사실을 이용하는 기술이 기재되어 있다. 면역 자성 비드-기반 포획법(immunomagnetic bead-based capture)은 자성 입자와 컨쥬게이션된 EpCAM에 대한 항체로 혈액 검체를 처리한 후, 태그된 세포를 자기장에서 분리하는 것을 수반한다. 이어서, 단리된 세포를 흔한 백혈구 마커 CD45 및 다른 상피 마커 사이토케라틴(cytokeratin)에 대한 항체로 염색하여, 오염된 백혈구로부터 드문 CTC를 구별한다. 이 견고하고 반-자동화된 접근법은 CTCs를 약 1 CTC/mL의 평균 수율 및 0.1%의 순도로 동정한다 (Allard et al., 2004, Clin Cancer Res 10:6897-6904). CTC를 단리하기 위한 두 번째 방법은 EpCAM에 대한 항체로 코팅함으로써 기능성이 부여된 80,000 개의 마이크로포스트(microposts)가 내장된 챔버(chamber)를 통해 전체 혈액을 흐르게 하는 것을 수반하는 마이크로 유체-기반(microfluidic-based) CTC 포획 장치를 사용한다. 이어서, CTCs를 전립선암에서의 PSA 또는 유방암에서의 HER2와 같은 조직 특이적 마커 또는 사이토케라틴에 대한 2차 항체로 염색하고, 3차원 좌표를 따라 다중 평면에서 마이크로포스트를 자동 스캐닝함으로써 시각화한다. CTC-칩은 환자 내 사이토케라틴-양성 순환 종양 세포를 50 세포/mL의 중간 수율 및 1-80%의 순도로 동정할 수 있다 (Nagrath et al., 2007, Nature 450:1235-1239). CTCs를 단리하기 위한 또 다른 가능성은 혈액 튜브에서 CTC를 포획, 동정 및 계수하는 Veridex, LLC (Raritan, NJ)의 CellSearchTM Circulating Tumor Cell (CTC) Test를 사용하는 것이다. 상기 CellSearchTM 시스템은 면역 자성 라벨링 및 자동화된 디지털 현미경 검사의 조합에 기반하여, 전체 혈액에서의 CTC의 측정에 대하여 미국 식품의약국 (FDA) 승인된 방법론이다. 문헌에 기재된 CTCs를 단리하기 위한 기타 방법들은 모두 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
재발(relapse 또는 recurrence)은 사람이 과거에 영향을 받았던 질병에 의해 이들이 다시 영향을 받게 될 때 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질병을 앓고, 상기 질병에 대하여 성공적인 치료를 받은 바 있는데 다시 상기 질병이 발병한다면, 상기 새로 발병한 질병은 재발로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 종양 질병의 재발은 원래의 종양 질병 부위에서 발생할 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소암을 앓고 성공적인 치료를 받은 바 있는 경우, 재발은 난소와 상이한 부위에서의 난소암의 발생 또는 종양의 발생일 수 있다. 또한, 종양의 재발은 원래의 종양의 부위에서뿐만 아니라 원래의 종양의 부위와 상이한 부위에서 종양이 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 원래의 종양은 원발성 종양이고 원래의 종양의 부위와 상이한 부위에서의 종양은 2차 종양 또는 전이 종양이다.
용어 "면역 반응"은 박테리아 또는 바이러스, 세포 또는 물질과 같은 면역 원성 생물체와 같은 면역계의 반응에 관한 것이다. 용어 "면역 반응"은 타고난 면역 반응과 적응 면역 반응을 포함한다. 바람직하게는, 면역 반응은 면역 세포의 활성화, 사이토카인 생합성 및/또는 항체 생산의 유도와 관련이 있다.
본 발명의 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포의 활성화, 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 그의 단편의 제시 및 이 발현으로 인한 T 세포의 세포독성의 활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
용어 "면역 세포"는 개인의 신체를 방어를 수반하는 면역계의 세포를 의미한한다. 용어 "면역 세포"는 대식세포, 단구 (대식세포의 전구체), 호중구, 호산구 및 호염기구와 같은 과립구, 수지상 세포, 비만 세포 및 B 세포, T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포와 같은 림프구를 포함하는 백혈구를 포함하는 면역 세포 및 그 전구체의 특정 유형을 포괄한다.
용어 "면역요법(immunotherapy)"은 면역 반응을 유도, 향상 또는 억제함으로써 질병 또는 증상의 치료에 관한 것이다. 면역 반응을 이끌어내거나 증폭하도록 설계된 면역요법은 활성화 면역요법으로 분류되는 한편, 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 면역요법은 억제 면역요법으로 분류된다. 용어 "면역요법"은 항원 면역화 즉 항원 백신접종, 또는 종양 면역화 즉 종양 백신접종을 포함한다. 또한 용어 "면역요법"은 면역 반응의 조작에 관한 것이기 때문에, 류마티스성 관절염, 알레르기, 당뇨병 또는 다발성 경화증과 같은 자가 면역 질병과 관련하여, 부적절한 면역 반응은 보다 적절한 면역 반응으로 조절된다.
용어 "면역화(immunization)" 또는 "백신접종(vaccination)"은 예를 들어, 치료적 또는 예방적 이유로, 면역 반응을 유도할 목적으로 개인에게 항원을 투여하는 과정을 설명한다.
"치료(treat)"는 것은 개체의 종양 크키 또는 종양의 수를 감소시키는 것; 개체의 질병을 억제하거나 느리게 하는 것; 개체 내에서 새로운 질병의 발명을 억제하거나 느리게 하는 것; 현재 질병에 앓거나 이전에 질병을 앓았던 개체의 증상 및/또는 재발의 빈도 또는 심각성을 감소시키는 것; 및/또는개체의 수명을 연장, 즉 증가시키는 것을 포함하여, 질병을 예방 또는 제거하기 위해 본 명세서에 기재된 화합물 또는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 특히, 용어 "질병의 치료"는 용어는 치유(curing), 지속 기간의 단축, 진행 또는 악화의 개선, 예방, 감속 또는 질병 또는 증상의 예방 또는 지연을 포함한다.
"위험에 있는"이란 일반적인 집단과 비교하여 질병, 특히 암이 발병할 확률이 정상 보다 높은 것으로 확인된 개체, 즉 환자를 의미한다. 게다가, 질병, 특히 암을 앓았거나 현재 앓고 있는 개체는 계속하여 질병이 발병할 수 있는 것과 같이, 질병이 발병할 위험이 높은 개체이다. 현재 암이 있거나 암에 걸렸던 개체도 암 전이에 대한 증가된 위험을 갖는다.
면역요법의 예방적 투여, 예를 들어, 본 발명의 조성물의 투여는 바람직하게는 질병의 발병으로부터 수용체를 보호한다. 면역요법의 치료요법 투여, 예를 들어, 본 발명의 조성물의 치료요법 투여는 질병의 진행/성장의 억제를 유발한다. 이는 질병의 진행/성장의 감속, 바람직하게는 질병의 제거를 유발하는, 특히 질병의 진행의 붕괴를 포함한다.
면역요법은 다양한 기술 중 임의의 기술을 사용하여 수행될 수도 있으며, 본 명세서에서 제공되는 작용제는 환자로부터 질병에 걸린 세포를 제거하는 기능을 한다. 이러한 제거는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 환자에서 면역 반응을 향상시키거나 유도한 결과로서 발생할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 면역요법은 치료가 면역 반응-변형 작용제 (본 명세서에서 제공된 폴리펩타이드 및 핵산과 같은)의 투여로 질병에 걸린 세포에 대하여 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체 내 자극에 의존하는, 활성 면역요법 일 수도 있다.
본 명세서에서 제공된 작용제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선조사, 화학요법 및/또는 골수 이식 (자가, 선천성, 동종 또는 관련없는)과 같은 통상적 인 치료 요법과 병행하여 사용될 수도 있다.
용어 "생체 내 (in vivo)"는 개체의 상황과 관련된다.
용어 "개체(subject)", "개인(individual)", "생물체(organism)" eh는 "환자"는 척추동물, 특히 포유류에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 문맥상, 포유류는 인간, 비인간 영장류, 가축 포유류 (예를 들어, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등), 실험 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 등) 뿐만 아니라 우리(captivity) 안의 동물 (예를 들어, 동물원의 동물)을 말한다. 용어는 또한 포유류가 아닌 척추동물, 예를 들어 조류 (특히 닭, 오리, 거위, 칠면조와 같은 가축화된 조류) 및 어류 (특히 연어 또는 메기와 같은 양식 어류)에 관한 것이기도 하다. 본 명세서에서 사용된 용어 "동물(animal)"은 또한 인간도 포함한다.
용어 "자가(autologous)"는 동일한 개체에서 유래된 모든 것을 기재하는 데 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 개체에서 유래된 조직 또는 장기의 이식을 의미한다. 이러한 절차는 거부 반응을 유발하지 않는다면 면역 장벽을 극복하기 때문에 이점이 있다.
용어 "이종(heterologous)"는 다양한 상이한 요소들로 구성된 것을 기재하는데 사용된다. 예를 들어, 한 개인의 골수를 다른 개인으로 이동하는 것은 이종 이식을 구성한다. 이종 유전자는 개체 이외의 근원으로부터 유래된 유전자이다.
면역화 또는 백신접종을 위한 조성물의 일부로서, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 작용제가 면역 반응을 유도하거나 면역 반응을 증가시키기 위하여 하나 이상의 보조제와 함께 투여된다. 용어 "아쥬반트(adjuvant)"는 면역 반응을 연장 또는 향상 또는 촉진시키는 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 아쥬반트의 첨가 없이도 그 효과를 발휘한다. 여전히, 본 발명의 조성물 적용은 임의의 알려진 아쥬반트를 함유한다. 아쥬반트는 오일 에멀젼 (예를 들어, 프로인트(Freund's) 아쥬반트), 미네랄 화합물 (예를 들어, 명반(alum)), 박테리아 산물 (예를 들어, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 독소) 리포좀 및 면역-자극 복합체와 같은 화합물들의 이질적인 그룹을 포함한다. 아쥬반트의 예시로는 모노포스포릴-지질-A(monophosphoryl-lipid-A (MPL SmithKline Beecham)), QS21 (SmithKline Beecham)와 같은 사포닌, DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, and QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), 불완전 프로인트 아쥬반트, 완전 프로인트 아쥬반트, 비타민 E, 몬타니드(montanid), 명반, CpG 올리고뉴클레오타이드 (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), 및 스쿠알렌(squalene) 및/또는 토코페놀(tocopherol)과 같은 생물학적으로 분해 가능한 오일로부터 제조된, 다양한 유중수 에멀전이다.
환자의 면역 반응을 자극하는 다른 물질 또한 투여될 수도 있다. 예를 들어, 림프구에 대한 조절적인 특성 때문에 백신접종에 사이토카인을 사용할 수 있다. 이러한 사이토카인은 백신의 보호 작용을 증가시키는 것으로 밝혀진 인터루킨-12 (IL-12) (Hall, 1995, IL-12 at the crossroads, Science 268:1432-1434 참조), GM-CSF 및 IL-18을 포함한다.
면역 반응을 향상시키는 많은 화합물이 있으며 이는 백신접종에 사용될 수도 있다. 상기 화합물은 B7-1 및 B7-2 (각각 CD80 및 CD86)와 같은 단백질 또는 핵산의 형태로 제공되는 공-자극 분자를 포함한다.
본 발명에 따라, "종양 표본(tumor specimen)"은 순환 종양 세포 (CTC), 특히 체액을 포함하는 종양 샘플과 같은 종양 또는 암 세포를 함유하는 신체적 샘플, 및/또는 세포성 샘플과 같은 샘플이다. 본 발명에 따르면, "비-종양성 표본"은 순환 종양 세포 (CTC), 특히 체액을 포함하는 종양 샘플과 같은 종양 또는 암 세포를 함유하지 않는 신체적 샘플, 및/또는 세포성 샘플과 같은 샘플이다. 이러한 신체적 샘플은 펀치 생검(punch biopsy)을 포함하는 조직 생검, 및 혈액, 기관지 흡입액(bronchial aspirate), 객담, 소변, 대변 또는 다른 체액을 채취하는 것과 같은 통상적인 방식으로 수득될 수 있다.
본 명세서에 기재된 치료학적 활성제, 백신 및 조성물은 주사 또는 주입을 포함하는, 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어, 경구, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 경피로 수행될 수도 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 투여는 림프절 내로의 주사와 같은 결절 내로 수행된다. 다른 투여 형태는 항원 제시 세포의 투여 후에 본 명세서에 기재된 핵산으로 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포의 시험관 내 형질감염을 유도한다.
본 명세서에 기재된 작용제는 유효량(effective amounts)으로 투여된다. "유효량"은 단독으로 또는 추가 복용량과 함께 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질병 또는 특정 증상을 치료하는 경우, 목적하는 반응은 바람직하게는 질병의 경과를 억제하는 것에 관한 것이다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병의 치료에서 목적하는 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 증상의 발병 지연 또는 발병 예방일 수도 있다.
본 명세서에 기재된 작용제의 유효량은 치료하고자 하는 증상, 질병의 중증도, 환자의 개별적인 파라미터들 (예를 들어, 연령, 생리학적 증상, 크기 및 체중), 치료 기간, 동반하는 치료 유형 (존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 유사 요인들에 의존한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 작용제의 투여량은 이러한 다양한 파라미터들에 따라 다양하게 의존할 수도 있다. 환자의 반응이 초기 복용량으로 불충분한 경우, 더 많은 복용량 (또는 상이한, 보다 국소적인 투여 경로에 의해 효과적으로 달성되는 보다 높은 복용량)이 사용될 수도 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)"은 약제학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 무독성을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 담체 및 경우에 따라 기타 치료적 제제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "부형제(excipient)"는 결합제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 방향제 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 약제학적 조성물 내의 모든 물질을 나타내고자 한다.
용어 "희석제(diluent)"는 희석 제제 및/또는 감점(thinning) 제제에 관한 것이다. 또한, 용어 "희석제"는 임의의 하나 이상의 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매체를 포함한다.
용어 "담체(carrier)"는 인간에게 투여하는 데 적합한, 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충진제 또는 희석제에 관한 것이다. 용어 "담체"는 활성 성분의 적용을 용이하게 하기 위한, 활성 성분과 결합된 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분에 관한 것이다. 바람직하게는, 담체 성분은 물 또는 오일과 같은 무균 액체이며, 예를 들어 땅콩 기름, 콩기름, 참기름, 해바라기유 등과 같은 광유, 동물 또는 식물에서 유래된 것들을 포함한다. 염용액 및 수성 덱스트로스(dextrose) 및 글리세린 용액 또한 수성 담체 화합물로서 사용될 수 있다.
치료적 사용을 위한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 제약 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예시로는 예를 들어 탄산 마그네슘(magnesium carbonate), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 활석, 당류, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔스(tragacanth), 메틸셀룰로스(methylcellulose), 카복시메틸셀룰로스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 저융점 왁스(low melting wax), 코코아 버터 등이 있다. 적합한 희석제의 예시로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 있다.
약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 제약 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들), 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화 제제(들), 코팅 제제(들), 및/또는 가용화제(들)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예시로는 전분, 젤라틴, 천연 설탕, 예를 들어 글루코스, 무수 락토스, 프리-플로우 락토오스(free-flow lactose), 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 천연 또는 합성 검, 예를 들어 아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산 나트륨(sodium alginate), 카복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이 있다. 적합한 윤활제의 예시로는 올레산 나트륨(sodium oleate), 스테아린산 나트륨(sodium stearate), 스테아린산 마그네슘, 벤조산 나트륨(sodium benzoate), 아세트산 나트륨, 염화 나트륨(sodium chloride) 등이 있다. 방부제, 안정화제, 염료 및 심지어 방향제 조차도 약제학적 조성물에 제공될 수 있다. 방부제의 예시로는 벤조산 나트륨, 소르브산(sorbic acid) 및 p-하이드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)의 에스테르가 있다. 항산화제 및 현탁화 제제 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 경우에 따라 용질, 예를 들어 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 동결-건조 조성물의 형태로 존재한다. 동결-건조 조성물은 각 수성 조성물을 동결-건조시킴으로써 얻을 수 있다.
본 명세서에서 제공된 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학 요법 및/또는 골수 이식 (자가, 동질, 동종 또는 비관계) 등의 다른 치료 요법들과 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명은 도면과 실시예에 의해 상세히 기재되고 설명되나, 이들은 설명의 목적으로만 사용될 뿐 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 설명 및 실시예에 기반하여, 통상의 기술자는 본 발명에 마찬가지로 포함된 추가적인 구현예들에 접근 가능하다.
높은 카피 수를 갖는 유전자에서 질병-특이적 돌연변이의 표적화
교모세포종(glioblastoma) 샘플에 대한 게놈 정보 (Chin et al., 2008, Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways, Nature 455:1061-1068)는 높은 카피 수를 가지고 유전자의 적어도 하나의 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 조사함으로써 분석되었다. 품질 분석은 분석된 11,574 개의 개별 유전자에 대한 카피 수 지정의 높은 정확도가 있었으며, 샘플의 게놈의 배수성은 1.95로 결정된 것으로 나타났다. 도 1a는 알려진 원인 유전자이며 치료의 표적이 되는 염색체 7 상의 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 둘러싼 국소적인 유전자의 그래픽 표현을 나타낸다. 이 게놈 내의 EGFR은 오차 수정된 절대 카피 수가 76이며, 그 중 13 카피는 질병-특이적 단일 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것으로 나타났다. 도 1b는 가장 큰 절대 카피 수를 갖는 이 게놈 샘플 내의 유전자 목록을 제공한다. 2 보다 큰 절대 카피 수를 갖는 네 개의 추가적인 유전자가 있다. 실제로, EGFR 증폭은 초기의 교모세포종의 유전적 특징으로 알려졌으며 (Benito et al., 2009, Neuropathology 30 (4):392-400), 이 유전자는 치료의 표적으로 고려된다 (Taylor, 2012, Curr Cancer Drug Targets. Mar; 12(3):197-209).
높은 접합성을 갖는 질병-특이적 돌연변이의 표적화
인간 종양으로부터 흑색종 세포 샘플로부터 수득된 엑솜은 유전자가 돌연변이를 갖고 있는지 여부와 상관없이, 유전자의 적어도 하나의 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 조사하고, 유전자의 전체적인 카피 수 뿐만 아니라 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자의 카피 수를 조사함으로써 분석되었다. 도 2는 접합성에 의해 분류된 유전자 목록을 제공하며, 질병-특이적 돌연변이가 유전자의 다양한 카피에서 발견되었다. 예를 들어, OXGR1 유전자의 질병-특이적 돌연변이는 (4)의 가장 높은 접합성을 가지며, 특히 총 5 개의 OXGR1 유전자 카피 중에서 4 개의 카피가 질병-특이적 돌연변이를 함유하므로 4/5 또는 0.8의 가장 높은 분획 접합성 또한 갖는다. 목록은 총 4 개의 카피 중 3 개의 유전자 카피에 돌연변이가 있는 10 개의 추가적인 유전자를 제공하고, 이는 이 유전자의 질병-특이적 돌연변이가 3/4 또는 0.75의 분획 접합성을 가지는 것을 나타낸다. 나머지 열거된 유전자는 돌연변이가 있는데 총 3 개의 카피 중 2 개의 카피가 돌연변이를 가지고 있기 때문에 2/3 또는 0.66의 분획 접합성을 가진다.
필수 유전자의 모든 카피에 존재하는 질병-특이적 돌연변이의 표적화
인간 종양으로부터 흑색종 세포 샘플로부터 수득된 엑솜은 유전자의 모든 목제가 동일한 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 조사하고 이들 유전자가 필수 유전자인지를 결정함으로써 분석되었다. 이 유전자는 마우스에서 필수적이라는 지식으로부터 인간에서의 필수성을 추론함으로써 필수적이라고 결정되었다 (Georgi et al., 2013, From mouse to human: evolutionary genomics analysis of human orthologs of essential genes, PLoS Genetics 9 (5):e1003484; Liao et al., 2007, Mouse duplicate genes are as essential as singletons, Trends Genet. 23:378-381). 도 3은 모든 유전자 카피가 동일한 질병-특이적 돌연변이를 갖는 많은 유전자를 열거한다. 게다가, 강조 표시된 세 가지 유전자는 마우스 데이터로부터 필수적임을 추론하여 필수적이라고 결정되었다.
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH <120> Selecting Neoepitopes as Disease-Specific Targets for Therapy with Enhanced Efficacy <130> 755-2 PCT2 <140> PCT/EP2017/068226 <141> 2017-07-19 <150> PCT/EP2016/067348 <151> 2016-07-20 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more <220> <221> REPEAT <222> (4)..(6) <223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (7)..(9) <223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (10)..(12) <223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (13)..(15) <223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5

Claims (59)

  1. 유전자의 대립유전자 (돌연변이 대립유전자)에서 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프(neoepitope)의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 상기 네오에피토프를 인코딩(encoding)하는 돌연변이 대립유전자의 카피 수를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자의 높은 카피 수는 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타내는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자의 카피 수가 높을수록, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성이 높은 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자의 카피 수가 2보다 큰 경우에, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타내는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자의 카피 수가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 보다 큰 경우에, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타내는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자는 적어도 하나의 카피가 돌연변이 대립유전자를 갖는 유전자의 카피의 높은 분율로 발견되고 (분획 접합성(fractional zygosity)), 이 분획 접합성은 돌연변이가 매핑되는(map) 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수에 대한 돌연변이 대립유전자의 카피 수의 비율인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 분획 접합성이 높을수록, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성이 높은 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 분획 접합성은 0.5 보다 크고, 바람직하게는 1인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자의 카피 수 및/또는 상기 분획 접합성 및/또는 상기 돌연변이 대립유전자가 매핑되는 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수는 질병에 걸린 세포에서 높은 분율로 발견되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자의 카피 수 및/또는 상기 분획 접합성 및/또는 상기 돌연변이 대립유전자가 매핑되는 뉴클레오타이드 부위의 전체 카피 수를 갖는 질병에 걸린 세포의 분율이 높을수록, 질병-특이적 표적으로서의 상기 네오에피토프의 적합성도 높은 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 질병에 걸린 세포의 분율은 1인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자는 발현될 경우 세포를 암 표현형으로 형질전환하도록 유발하고 발현되지 않을 경우 암 세포가 그의 암 표현형을 상실하도록 유발하는 원인 유전자(driver gene)인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자는 필수 유전자인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 필수 유전자는 침묵되거나 유전자의 발현이 감소한 경우에, 적어도 상기 필수 유전자가 발현되는 세포, 바람직하게는 질병에 걸린 세포의 성장 장애 또는 감소된 적합성을 유발하는 유전자인 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 필수 유전자는 다양한 상이한 조직에서 발현되고 0 보다 큰 최소의 RPKM 임계값으로 발현되는 것인 방법.
  16. 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 적어도 하나의 카피에는 질병-특이적 돌연변이를 갖는 것인, 유전자의 카피 수를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유전자의 높은 카피 수는 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타내는 것인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 유전자의 카피 수가 높을수록, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성도 높은 것인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자는 발현될 경우 세포를 암 표현형으로 형질전환하도록 유발하고 발현되지 않을 경우 암 세포가 그의 암 표현형을 상실하도록 유발하는 원인 유전자인 것인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자의 카피 수는 질병에 걸린 세포에서 높은 분율로 발견되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 카피 수를 갖는 질병에 걸린 세포의 분율이 높을수록, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성도 높은 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 질병에 걸린 세포의 분율은 1인 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 카피 수는 절대 카피 수인 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 절대 카피 수는 오차 수정된 절대 카피 수인 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 절대 카피 수 또는 상기 오차 수정된 절대 카피 수는 배수성(ploidy), 바람직하게는 질병에 걸린 세포 게놈의 배수성, 또는 염색체 또는 질병에 걸린 세포 내에 돌연변이 또는 돌연변이 유전자가 위치한 염색체 부분의 배수성에 대하여 표준화된 것인 방법.
  26. 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 질병에 걸린 세포 또는 질병에 걸린 세포군 내에서, 질병-특이적 돌연변이를 갖는 유전자가 필수 유전자인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 필수 유전자는 침묵되거나 유전자의 발현이 감소한 경우에, 적어도 상기 필수 유전자가 발현되는 세포, 바람직하게는 질병에 걸린 세포의 성장 장애 또는 감소된 적합성을 유발하는 유전자인 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 필수 유전자는 다양한 상이한 조직에서 발현되고 0 보다 큰 최소의 RPKM 임계값으로 발현되는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자는 필수 유전자이고 상기 필수 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 경우 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성을 나타내는 것인 방법.
  30. 제26항 또는 제29항에 있어서, 질병에 걸린 세포의 높은 분율은 상기 필수 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 상기 필수 유전자의 카피를 함유하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 필수 유전자의 모든 카피가 질병-특이적 돌연변이를 갖는 것인, 상기 필수 유전자의 카피를 함유하는 질병에 걸린 세포의 분율이 높을수록, 상기 네오에피토프의 질병-특이적 표적으로서의 적합성도 높은 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 질병에 걸린 세포의 분율은 1인 것인 방법.
  33. 적어도 두 개의 유전자의 질병-특이적 돌연변이로부터 생성되는 적어도 두 개의 네오에피토프의 조합의 질병-특이적 표적의 조합으로서의 적합성을 결정하는 방법으로서, 각각 질병-특이적 돌연변이를 갖는 적어도 두 개의 유전자의 조합이 합성 치사 또는 합성 병(synthetic sick) 유전자인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 적어도 두 개의 유전자의 조합이 합성 치사 또는 합성 병인 경우에 상기 네오에피토프의 조합이 질병-특이적 표적의 조합으로서의 적합성을 나타내는 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 적어도 두 개의 유전자의 모든 카피는 상기 질병-특이적 돌연변이를 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 질병에 걸린 세포의 높은 분율은 상기 질병-특이적 돌연변이를 갖는 적어도 두 개의 유전자를 함유하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 질병에 걸린 세포의 분율은 1인 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병-특이적 돌연변이는 단일 뉴클레오타이드 변이인 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병은 암인 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 네오에피토프는 질병에 걸린 세포의 게놈 또는 게놈의 일부를 서열화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 동정되는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 있어서, 약제의 제조에 사용하기 위한 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 있어서, 백신의 제조에 사용하기 위한 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 백신은 하나 이상의 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프의 조합으로부터 유도된 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 백신은 하나 이상의 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프의 조합을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프의 조합을 동정하는 단계를 포함하는 백신을 제공하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 백신은 하나 이상의 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프의 조합을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 제조된 백신.
  48. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프들의 조합 중 하나의 네오에피토프를 표적으로 하는 항원 수용체를 발현하는 재조합 면역 세포의 제조에 사용하기 위한 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포이고 상기 항원 수용체는 T 세포 수용체인 것인 방법.
  50. 적합한 네오에피토프 또는 적합한 네오에피토프들의 조합 중 하나의 에피토프를 표적으로 하는 재조합 면역 세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 면역 세포를 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 동정된 적합한 네오에피토프 또는 적합한 에피토프들의 조합 중 하나의 에피토프를 표적으로 하는 재조합 항원 수용체로 형질감염시키는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포이고 상기 항원 수용체는 T 세포 수용체인 것인 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 면역 세포.
  53. 포유동물에서 하나 이상의 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직에 대한 면역 반응을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게:
    (a) 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 표적으로 하는 하나 이상의 항원 수용체를 발현하는 하나 이상의 면역 세포;
    (b) 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 인코딩하는 핵산; 또는
    (c) 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드
    를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포이고 상기 항원 수용체는 T 세포 수용체인 것인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 세포-매개 면역 반응인 것인 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역 반응은 항-종양 면역 반응이고 상기 하나 이상의 적합한 네오에피토프를 발현하는 표적 세포군 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직인 것인 방법.
  57. 네오에피토프의 발현과 관련된 질병, 장애 또는 증상을 갖는 포유동물을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게:
    (a) 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 표적으로 하는 하나 이상의 항원 수용체를 발현하는 하나 이상의 면역 세포;
    (b) 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 인코딩하는 핵산; 또는
    (c) 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 동정된 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드
    를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포이고 상기 항원 수용체는 T 세포 수용체인 것인 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 암인 것인 방법.
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