KR20190073376A - 면역 요법제에 대한 용량 결정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역 요법용 화합물의 투여를 위한 적합한 용량을 결정하는 방법에 관한 것이며, 이 면역 요법용 화합물의 유효성 및 독성은 그러한 면역 요법용 화합물의 투여에 응답하는 면역계의 반응의 차이와 같은 개개의 대상체 내에서의 자연적 차이로 인해 동일한 용량에서 개체마다 달라질 수 있다.
Description
발명의 기술 분야
본 발명은 면역 요법용 화합물에 대한 적합한 용량을 결정하는 방법에 관한 것이며, 이 면역 요법용 화합물의 유효성 및 독성은 그러한 면역 요법용 화합물의 투여에 응답하는 면역계의 반응의 차이와 같은 개개의 대상체 내에서의 자연적 차이로 인해 동일한 용량에서 개체마다 유의하게 달라질 수 있다.
발명의 배경
통상적으로, 치료용 화합물에 대한 치료적 유효량은 쉽게 결정된다. 항생제 또는 진통제와 같은 치료용 화합물의 유효량을 결정하기 위해, 증가하는 양의 치료용 화합물로 원하는 치료 효과가 관찰될 때까지 대상체의 코호트에 부여되며, 용량이 높을수록 치료 효과가 클 것으로 예상된다. 그러나, 주어질 수 있는 치료용 화합물의 용량을 제한하는 하나의 인자는 더 고용량이지만 여전히 치료적인 양의 화합물의 투여에 따라 관찰되는 원하지 않는 부작용이 나타난다는 것이다. 그러한 양 또는 독성 용량은 발열, 메스꺼움, 또는 기관 장애, 쇼크 등과 같은 더욱 심각한 결과와 같은 부작용이 관찰될 때까지 단순히 점점 더 많은 양의 화합물을 제공함으로써 또한 쉽게 결정된다. 그러한 치료적 유효량 및 독성 용량은 통상적으로 체중 1 킬로그램당 기준으로 결정되거나 개체와 관련된 일부 다른 변수에 대해 정규화되기 때문에, 효과적이면서 비독성인 치료용 화합물에 대한 용량은 임의의 환자에 대해 쉽게 외삽된다.
그러나, 유효한 치료적 및/또는 독성 용량 및/또는 모든 개체로의 그의 외삽이 표준 방법을 이용하여 결정될 수 없는 상황이 존재하는데, 예를 들어 투여되는 양이 많을수록 더 큰 치료 효과가 관찰될 것이라는 예상을 치료제가 충족시키지 않는 경우가 그러하다. 본 발명자들은, Toll 유사 수용체 효능제인 면역 요법제를 투여하는 것과 관련하여, 상이한 개체에 투여된 동일한 용량이 상이한 결과, 예를 들어 상이한 수준의 치료 효과 및/또는 상이한 수준의 부작용을 가져온다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 상이한 개체로부터 분리된 세포가 동일한 양의 면역 요법제에 대한 사이토카인 발현에 의해 측정된 바와 같이 세포 활성화 측면에서 상이하게 응답한다는 것을 또한 관찰하였다. 본 발명은, 면역 요법제에 대한 면역학적 반응이 개체의 면역계 내의 자연적 차이에 영향을 받는 바, 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 보장하고, 바람직하게는 허용 가능한 독성 프로파일을 제공하는, 중량, 표면적과 같은 단위당 기준에 기초한 모든 개체에 대한 보편적인 투여량은 존재하지 않음을 나타내는 이러한 관찰에 부분적으로 기초한다.
발명의 요약
본 발명은 면역 요법제의 적합한 용량을 결정하는 방법에 관한 것이며, 이 면역 요법제의 양은 개체에 대해 치료적이면서 비독성인 것이 바람직하다. 특정 메커니즘에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 치료 효과를 제공하기 위해, 면역 요법제, 예를 들어, RNA 기반 분자는 개체마다 활성 및 양이 달라지는 많은 타고난 인자에 의존하며, 이에 따라 동일한 작용제가 동일한 용량으로 투여될 때 상이한 개체에서 관찰되는, 치료 효과 및 원하지 않는 효과 둘 모두인 가변적 효과를 가져오는 것으로 여겨진다.
특히, 본 발명은 개체에게 투여하기 위한 면역 요법제의 적합한 용량을 결정하는 방법으로서, (a) 다수의 상이한 용량의 면역 요법제를 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 단계, 및 (b) 다수의 상이한 용량의 면역 요법제에 의해 유발되는 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 단계 (b)는 적어도 하나의 면역학적 반응을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하는 것, 바람직하게는 적어도 하나의 면역학적 반응을 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 사용되는 용량은 면역 요법제의 양이다. 용량은, 예를 들어, 피코그램, 나노그램, 마이크로그램, 밀리그램 및 그램의 양이거나 다른 단위 체계에서의 그의 등가량일 수 있다. 용량 또는 양은 절대량일 수 있는데, 즉, 용량은 개체의 연령, 성별, 중량, 지방 조직의 양을 반영하는 체질량 지수, 피부의 표면적 등과 관련하여 변하지 않는다. 대안적으로, 용량은 연령, 성별, 중량, 지방 조직의 양을 반영하는 체질량 지수, 피부의 표면적 등과 같은 개체 사이의 차이를 고려할 수 있다. 다수의 상이한 용량은 상이한 양의 개별적 용량을 나타내며, 바람직하게는 상이한 양은 동일한 방식으로 정량화되는데(동일한 단위로 표현됨), 예를 들어, 모든 다수의 상이한 용량은 체중 kg당 mg의 단위이거나 모두 절대량이다. 다수의 상이한 용량을 접촉시키는 단계가 시험관내에서 일어나는 구체예에서, 용량은 절대량일 수 있거나 면역 반응성 물질의 유형을 고려할 수 있는데, 예를 들어 면역 반응성 물질이 면역 세포를 포함하는 경우, 용량은 면역 세포의 수 또는 면역 세포의 아형의 수를 고려할 수 있다.
면역 요법제를 개체의 면역 반응성 물질과 접촉시키거나 면역학적 반응을 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 이용될 수 있다. 예시적인 구체예는 면역 반응성 물질이 개체로부터 분리된 면역 세포, 예를 들어 전혈, 또는 개체로부터 분리된 면역 세포의 정제된 집단을 포함하는 세포 조성물인 경우를 포함한다. 다수의 상이한 용량의 면역 요법제가 개체에게 투여되는 구체예에서, 면역 반응성 물질은 면역계 자체이고, 개체의 체내 면역 세포에 의해 생성된 면역학적 반응이 측정된다. 예를 들어, 면역 요법제의 투여 후, 혈액 또는 림프는 개체로부터 분리될 수 있고, 원하는 면역학적 반응, 예를 들어 사이토카인의 발현에 대해 시험될 수 있다. 면역 요법제가 개체에게 투여되는 일 구체예에서, 그러한 투여는 피부 상에서 이루어질 수 있는데, 즉, 피부 소피 또는 피부 단자 시험일 수 있다.
일 구체예에서, 방법은 생체내에서 수행되거나 시험관내에서 수행되거나, 또는 단계들 중 적어도 하나는 생체내에서 수행되고 나머지 단계는 시험관내에서 수행되는데, 예를 들어, 접촉 단계는 생체내에서 수행되고, 면역학적 응답의 측정은, 예를 들어 개체로부터 혈액을 채취하고 혈액 또는 혈액으로부터 분리된 세포에서 면역학적 반응을 측정함으로써 시험관내에서 일어난다. 바람직하게는, 방법의 모든 단계가 시험관내에서 수행된다.
본 발명의 방법에서 유용한 면역 요법제는 동물, 바람직하게는 인간의 면역계의 적어도 하나의 성분에서 변화를 일으킬 수 있는 임의의 작용제, 분자, 화합물, 조성물 등이다. 예를 들어, 면역 요법제는 특정 유형의 면역 세포를 활성화시킬 수 있거나 특정 유형의 면역 세포를 정지 상태가 되게 할 수 있으며, 이러한 면역 세포의 활성화 또는 정지는 예를 들어 사이토카인 발현의 변화에 의해 측정될 수 있다. 면역계의 적어도 하나의 성분에 대한 다른 효과는 면역 세포가 증식하거나 분화되도록 하는 것, 예를 들어 혈액 내 면역 세포 수의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 더욱이, 면역 요법제는 항체의 생성을 유도하거나 세포독성 T 세포와 같은 면역 세포를 활성화시켜 세포독성 효과를 유도할 수 있다. 사이토카인 발현의 변화가 하기 기술된 바와 같은 본 발명의 방법과 관련하여 면역학적 반응으로서 유용하지만, 일 구체예에서, 사이토카인은 면역계에 변화를 일으키는(면역학적 반응을 유발하는) 그의 능력을 고려할 때 또한 면역 요법제일 수 있다. 본 발명의 방법에서 유용한 예시적인 면역학적 반응은 하기에 논의된다.
일 구체예에서, 면역 요법제는 Toll 유사 수용체(TLR)의 효능제, 예를 들어 TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9, TLR-10, TLR-11, TLR12 또는 TLR13 효능제인 화합물이다. 바람직하게는, TLR은 세포 내부에 위치하는 것, 예를 들어 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 TLR-9 이다. 또한 바람직하게는, 면역 요법제는 Toll 유사 수용체-7(TLR-7) 또는 Toll 유사 수용체-8(TLR-8)의 효능제이다. TLR-7 효능제는 공지되어 있고, 단일 가닥 RNA 분자와 같은 화합물 및 티아졸로퀴놀론과 같은 이미다조-퀴놀린 화합물, 항바이러스 화합물인 이미퀴모드(imiquimod) 및 레시퀴모드(resiquimod)를 포함한다. 다른 TLR-7 효능제 화합물은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드, N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드, N-(4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(1,1-다이옥사이도티에탄-3-일)아세트아미드, 폴리(d티미딘), 구아노신 유사체인 록소리빈, 및 브로피리민뿐만 아니라 다른 뉴클레오타이드-염기 유사체를 포함한다. TLR-8 효능제는 또한 단일 가닥 RNA 분자뿐만 아니라 2-에틸-1-(4-((2-메틸테트라하이드로푸란-3-일)아미노)부틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 1-(4-(사이클로헥실아미노)부틸)-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민을 포함한다. 프로타민 및 RNA를 포함하는 입자는, 예를 들어 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 수지상 세포에 의해 흡수될 때 TLR-7을 활성화시키거나, 예를 들어 단핵구(WO 2009/144230호)에 의해 흡수될 때 TLR-8을 활성화시킬 수 있다는 것이 관찰되었다. 일 구체예에서, 면역 요법제는 바이러스, 예를 들어 RNA 바이러스일 수 있다. 면역 요법제는 바람직하게는 단일 가닥 RNA 분자 또는 다른 RNA 기반 분자와 같은 핵산 분자일 수 있으며, 이러한 핵산 분자는 면역 반응성 펩타이드 또는 단백질을 코딩한다. 더욱 바람직하게는, 면역학적 반응이 측정되는 면역 요법제는 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 단일 가닥 RNA 분자이며, 각각의 펩타이드는 질병 세포 또는 종양 조직과 같은 조직 상에서 특이적으로 발현되는 에피토프를 포함한다. RNA로부터 이러한 펩타이드(면역 반응성 펩타이드)의 발현은 MHC 분자와의 복합체에서 세포 표면 상의 이의 제시를 가져오고, 궁극적으로는 에피토프를 발현하는 질병 세포 또는 조직에 대한 면역 응답의 유도를 가져온다. 바람직한 구체예에서, RNA 분자는 양이온성 지질, 양이온성 중합체 및 음 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 양전하를 갖는 다른 물질과 복합체를 형성할 수 있다. 추가의 예시적인 면역 요법제는 하기에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 유용한 면역 반응성 물질은 면역 요법제와 접촉할 때 일부 특성의 변화(면역학적 반응)가 측정될 수 있는 개체의 면역계의 전부 또는 일부를 포함한다. 바람직하게는, 면역 반응성 물질은 면역계의 세포, 예를 들어, 면역 세포 또는 면역 반응성 세포, 또는 전혈 또는 림프액과 같은 면역 세포 또는 면역 반응성 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 면역 세포는 또한 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 순도로 실질적으로 정제될 수 있다. "면역 세포"라는 용어는 개체의 신체를 방어하는데 관여하는 면역계의 세포를 지칭한다. "면역 세포"라는 용어는 특정 유형의 면역 세포 및 그 전구체를 포함하며, 대식세포를 포함하는 백혈구, 단핵구(대식세포의 전구체), 호중구, 호산구 및 호염기구와 같은 과립구, 수지상 세포, 비만 세포, 및 B 세포, T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 림프구를 포함한다. 대식세포, 단핵구(대식세포의 전구체), 호중구, 수지상 세포, 및 비만 세포는 포식세포이다. 일 구체예에서, 개체의 면역 반응성 물질은 개체의 혈액으로부터 분리된 세포를 포함하거나, 면역 반응성 물질은 개체로부터 분리된 전혈을 포함하거나, 면역 반응성 물질은 개체로부터 분리된 림프액을 포함한다. 방법이 시험관내에서 수행되는 구체예에서, 개체의 면역 반응성 물질은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 면역 반응성 물질이 전혈인 경우, 전혈은 선택적으로 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC) 및/또는 단핵구 유래 미성숙 수지상 세포(iDC)와 같은 수지상 세포로 보충될 수 있다. 수지상 세포는 이종 또는 동계 원천으로부터 유래될 수 있거나 자가 유래될 수 있고, 바람직하게는 자가 유래된다. 면역 요법제가 면역 세포일 수 있으므로, 본 발명의 일 구체예에서, 면역 반응성 물질과 면역 요법제는 모두 면역 세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 방법과 관련하여 면역학적 반응은 면역계의 측정 가능한 특성 또는 면역계의 성분의 변화이고, 바람직하게는 면역 요법제의 투여로 인해 치료 효과를 나타내는 것으로 공지된 것이다. 예를 들어, 면역학적 반응은 면역 세포의 활성의 변화를 포함하며, 이 활성은 면역 세포의 분화 표현형의 변화 또는 면역 세포의 증식 능력의 변화일 수 있거나, 핵산 또는 단백질 수준에서의 면역 세포에 의해 생성되는 하나 이상의 사이토카인의 발현 또는 양의 변화일 수 있다. 면역학적 반응은 림프구 또는 T 세포와 같은 개체 내의 특정 유형의 면역 세포의 양의 변화일 수 있다. 면역학적 반응은 또한 개체 내의 혈소판 수 또는 혈소판 활성화 동력학의 변화일 수 있다. 면역학적 반응은 또한 피부 상의 염증 반응, 예를 들어, 접촉성 피부염과 같은 개체의 염증 상태의 변화일 수 있다. 면역학적 반응은 또한 항원에 대한 세포독성 T 세포 응답의 유도와 같은 표적 항원에 대한 면역 응답의 유도를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 측정되는 면역학적 반응은, 예를 들어 사이토카인 자체를 검출하거나 사이토카인을 코딩하는 핵산을 검출함으로써 측정되는 면역 세포에 의해 분비된 하나 이상의 사이토카인의 양/농도의 변화이다.
사이토카인은 세포에 의해 방출되어 다른 세포의 거동에 영향을 미친다는 점에서 세포 신호 전달에 중요한 작은 단백질들의 광범위한 범주이지만, 사이토카인은 또한 자가분비 신호 전달에 관여할 수 있다. 사이토카인은 광범위한 면역 세포뿐만 아니라 내피 세포, 섬유아세포, 및 다양한 기질 세포를 포함하는 광범위한 세포에 의해 생성되고, 주어진 사이토카인은 하나 초과의 유형의 세포에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 사이토카인은 모노카인, 림포카인, 인터루킨 또는 케모카인, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, INF-α, INF-γ, GM-CSF를 포함한다. 일 구체예에서, 사이토카인은 림프 항상성을 조절하는데 관여하며, 바람직하게는 사이토카인은 T 세포의 발생, 프라이밍, 확장, 분화 및/또는 생존에 관여하고, 바람직하게는 이를 유도하거나 향상시킨다. 일 구체예에서, 사이토카인은 인터루킨이다. 바람직한 구체예에서, 사이토카인은 다음 중 하나 이상이다: 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-12(IL-12), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터페론-알파(IFN-α), 예를 들어 인터페론-알파 2a(IFN-α2a), 인터페론-감마(IFN-γ), 인터페론 감마 유도 단백질(IP10), 인터루킨 1-베타(IL-1β), 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 12p70(IL-12p70).
인터루킨 1-베타(IL-1β)는 인터루킨 1 계열의 사이토카인의 구성원이며, 이는 활성화된 대식세포에 의해 전단백질(proprotein)로서 생성되고, 이 전단백질은 카스파제 1(CASP1/ICE)에 의해 그의 활성 형태로 단백질분해 처리된다. 이 사이토카인은 염증 응답의 중요한 매개체이고, 세포 증식, 분화 및 아폽토시스를 포함하는 다양한 세포 활동에 관여한다. 중추 신경계(CNS)에서 이 사이토카인에 의한 사이클로옥시게나제-2(PTGS2/COX2)의 유도는 염증성 통증 과민증에 기여하는 것으로 밝혀져 있다.
인터루킨-2(IL-2)는 면역을 담당하는 백혈구(종종 림프구)의 활동을 조절하는 단백질이다. IL-2는 미생물 감염에 대한 신체의 자연적 응답의 일부로서, 외래("비자기")와 "자기"를 구별한다. IL-2는 주로 T 세포에 대한 그의 직접적인 효과를 통해 면역계의 핵심적인 기능, 예를 들어 관용과 면역에서 핵심적인 역할을 한다. T 세포가 성숙되는 흉선에서, 이는 조절 T 세포로의 특정 미성숙 T 세포의 분화를 촉진시켜, 그렇지 않은 경우 체내의 정상적인 건강한 세포를 공격하도록 프라이밍되는 다른 T 세포를 억제함으로써 자가면역 질환을 예방한다. IL-2는 초기 T 세포가 항원에 의해 또한 자극될 때 T 세포가 이펙터 T 세포 및 기억 T 세포로의 T 세포의 분화를 또한 촉진시킴으로써 신체가 감염과 싸우도록 돕는다.
인터루킨 6(IL-6)는 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 항염증성 미오카인 둘 모두로 작용하고, 예를 들어, 감염 동안 그리고 외상, 특히 화상 또는 염증을 초래하는 기타 조직 손상 후에 T 세포 및 대식세포에 의해 분비되어 면역 응답을 자극한다. IL-6는 또한 감염과 싸우는데 역할을 하는데, 이는 세균인 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 내성이 요구되는 마우스에서 IL-6이 나타났기 때문이다. 항염증성 사이토카인으로서의 IL-6의 역할은 TNF-α 및 IL-1에 대한 그의 저해 효과를 통해 그리고 IL-1RA 및 IL-10의 활성화를 통해 매개된다.
인터루킨 12(IL-12)는 항원 자극에 응답하여 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 및 인간 B-림포블라스토이드(B-lymphoblastoid) 세포에 의해 자연적으로 생성된다. IL-12는 2개의 별개의 유전자인 IL-12A(p35)와 IL-12B(p40)에 의해 코딩되는 이종이량체 사이토카인이다. 활성 이종이량체('p70'로 지칭됨) 및 p40의 동종이량체는 단백질 합성 후에 형성된다. IL-12는 Th1 세포로의 미경험(naive) T 세포의 분화에 관여하고, T 세포의 성장과 기능을 자극할 수 있는 T 세포 자극 인자로 알려져 있다. IL-12는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포로부터 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 생성을 자극하고, NK 세포 및 CD8+ 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성의 향상을 매개하고, 또한 항-혈관신생 활성을 갖는다.
종양 괴사 인자-알파(TNF-α)(카켁신(cachexin) 또는 카켁틴(cachectin))는 전신성 염증에 관여하고, 급성기 반응을 구성하는 사이토카인들 중 하나이다. TNF-α 는 주로 활성화된 대식세포에 의해 생성되지만, 수지상 세포, 단핵구, CD4+ 림프구, NK 세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 및 뉴런과 같은 많은 다른 세포 유형에 의해 생성될 수 있다. TNF-α의 주요 역할은 면역 세포의 조절에 있다. 내인성 발열원인 TNF-α는 발열, 아폽토시스성 세포 사멸, 악액질, 염증을 유도할 수 있고 종양형성 및 바이러스 복제를 저해할 수 있고, IL-1 및 IL-6 생성 세포를 통해 패혈증에 응답할 수 있다.
인간 I 형 인터페론(IFN)은 면역계의 활성을 조절하는데 도움이 되는 인터페론 단백질의 큰 하위 그룹에 속한다. 포유류 유형은 IFN-α(알파), IFN-β(베타), IFN-κ(카파), IFN-δ(델타), IFN-ε(엡실론), IFN-τ(타우), IFN- ω(오메가), 및 IFN-ζ(제타, 리미틴으로도 알려져 있음)으로 명명된다. 인터페론은 주로 바이러스 감염에 대한 선천성 면역 응답에 관여한다. 인터페론의 합성을 담당하는 유전자는 IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21으로 일컬어지는 13 개의 아형으로 존재한다. 이들 유전자는 9 번 염색체 상의 클러스터에서 함께 발견된다. IFN-β 단백질은 선천성 면역 응답에 주로 관여하는 항바이러스 활성을 갖는다. 두 가지 유형의 IFN-β, 즉, IFN-β1(IFNB1)과 IFN-β3(IFNB3)가 기재되어 있다. IFN-α 및 IFN-β는 수지상 세포, 림프구(NK 세포, B 세포 및 T 세포), 대식세포, 섬유아세포, 내피 세포, 골모세포 및 기타를 포함하는 많은 세포 유형에 의해 분비된다. 이 인터페론들은 대식세포와 NK 세포 모두를 자극하여 항바이러스 응답을 유도하고, 종양에 대해서도 활성이다. 플라스마사이토이드 수지상 세포는 Toll 유사 수용체(TLR), 예를 들어 TLR-7, 8 및/또는 9의 활성화에 응답하는 I 형 IFN의 가장 강력한 생성인자로 확인되었고, 이에 따라 자연적 IFN 생성 세포로 일컬어져 왔다.
인터페론 감마(IFN-γ)는 인터페론의 II 형 부류의 유일한 구성원인 이량체화된 가용성 사이토카인이다. IFN-γ는 바이러스, 일부 세균 및 원충 감염에 대한 선천성 면역 및 적응성 면역을 위해 중요하다. IFN-γ는 대식세포의 중요한 활성제이고 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 발현의 유도제이다. 비정상적인 IFN-γ 발현은 많은 자가염증 및 자가면역 질환과 관련된다. 면역계에서 IFN-γ의 중요성은 바이러스 복제를 직접적으로 저해하는 그의 능력에 부분적으로 기인하고, 가장 중요하게는 그의 면역자극 및 면역조절 효과에 기인한다. IFN-γ는 선천성 면역 응답의 일부로서 대식세포, 자연 살해(NK) 및 자연 살해 T 세포(NKT)에 의해 주로 생성되고, 일단 항원 특이적 면역이 발생하면 CD4+ Th1 및 CD8+ 세포독성 T 림프구 이펙터 T 세포(CTL)에 의해 주로 생성된다.
C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10) 또는 작은 유도성 사이토카인 B10으로도 알려진 인터페론 감마 유도 단백질 10(IP-10)은 CXC 케모카인 계열에 속하는 작은 사이토카인이며, 이는 예를 들어 IFN-γ에 응답하여 여러 세포 유형에 의해 분비된다. 이러한 세포 유형은 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함한다. IP-10은 단핵구/대식세포, T 세포, NK 세포, 및 수지상 세포에 대한 화학유인, 내피 세포로의 T 세포 부착의 촉진, 항종양 활성, 및 골수 콜로니 형성 및 혈관신생의 저해와 같은 몇몇 역할에 기여한다.
일 구체예에서, 면역학적 반응의 측정은 분자에 특이적으로 결합하는 표지된 리간드, 예를 들어 핵산에 하이브리드화하는 표지된 핵산 프로브 및/또는 사이토카인과 같은 펩타이드에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 또는 그의 단편/유도체의 사용을 포함한다.
본 발명에 따르면, 핵산의 존재 또는 양을 측정하는 것은 공지된 핵산 검출 방법, 예컨대 하이브리드화 또는 핵산 증폭 기술을 포함하는 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, mRNA 전사체가 검출되거나 그의 양이 RT-PCR 또는 노던 블롯 분석을 이용하여 결정된다. 그러한 핵산 검출 방법은 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함할 수 있다. 적합한 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 길이가 5 개 내지 수백 개의 뉴클레오타이드, 더욱 전형적으로 길이가 약 20 개 내지 70 개 또는 그보다 짧은 뉴클레오타이드, 더욱더 전형적으로 길이가 약 10 개 내지 30 개의 뉴클레오타이드로 다양하다.
본 발명에 따르면, 사이토카인과 같은 펩타이드의 존재 또는 양을 측정하는 것은 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 면역 검출을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 펩타이드를 검출하기 위해 항체를 사용하는 방법은 잘 알려져 있고, ELISA, 경쟁 결합 검정 등을 포함한다. 일반적으로, 그러한 검정은 검출을 제공하는 표지, 예를 들어 지시 효소, 방사성 표지, 형광단, 또는 상자성 입자에 직접 또는 간접적으로 결합된 펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 사용한다.
본 발명에 따르면, 면역학적 반응이 세포 성장 또는 그의 결핍, 또는 세포의 분화 상태의 변화를 측정함으로써 검출되는 경우, 그러한 측정은 세포 수의 계수, 또는 세포 증식을 결정하기 위한 세포 DNA 내로의 3H 흡수량의 측정을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 분화의 변화는 특정 분화 상태와 관련된 세포 단백질의 발현의 변화를 관찰하거나 특정 분화 상태와 관련된 세포의 시각적 표현형의 변화를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 추가의 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본원의 방법에서 용이하게 이용될 수 있다.
방법의 일 구체예에서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 측정되거나, 2 개 이상의 면역학적 반응이 측정되거나, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 또는 그 초과의 면역학적 반응이 측정된다.
방법의 특정 구체예에서, 면역 요법제의 다수의 상이한 용량은 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 또는 10 개 초과의 상이한 용량일 수 있다. 또한, 면역 요법제의 다수의 상이한 용량은 용량 상승, 바람직하게는 선형 또는 대수 용량 상승, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 등, 또는 1, 3, 9, 27, 81, 243 등 또는 0.1, 1, 10, 100, 1,000 등을 나타낼 수 있다. 일 구체예에서, 단계 (a) 및 (b)는 순차적으로 수행된다. 바람직하게는, 단계 (b)는 단계 (a) 후 2 시간 내지 48 시간째에, 바람직하게는 단계 (a) 후 4 시간 내지 24 시간째에 수행된다.
바람직한 일 구체예에서, (다수의 상이한 용량의 면역 요법제를 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는) 방법의 단계 (a)는 생체내에서 수행되고, 개별적인 투여 단계들로 다수의 상이한 용량의 면역 요법제를 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 것을 특징으로 하며, 각각의 투여 단계는 하나의 용량의 면역 요법제를 개체에 투여하는 것을 특징으로 한다. 개별적인 투여 단계들는 후속하여 수행될 수 있고, 서로 2 일 내지 30 일, 예를 들어 7 일 내지 28 일의 시간 간격만큼 떨어져 있고, 바람직하게는 7 일, 14 일, 21 일 또는 28 일, 더욱 바람직하게는 7 일 또는 14 일만큼 떨어져 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 것은 각각의 개별적인 투여 단계 후에 개별적으로 수행된다. 일 구체예에서, 개별적인 투여 단계들는 실질적으로 동시에, 예를 들어, 다수의 상이한 용량을 피부에 실질적으로 동시에 투여함으로써 수행될 수 있다. 이 구체예에서, 측정된 면역학적 반응은, 예를 들어 시각적으로 검출될 수 있는 접촉성 피부염일 수 있다.
많은 유형의 면역 요법제가 치료 효과를 제공하기 위해 환자에게 주어졌으며, 그러한 지식을 고려하여, 치료 효과를 제공하는 그러한 유형의 면역 요법제에 대한 표준 용량 또는 표준 용량 범위가 공지되어 있다. 그러한 표준 용량 또는 용량의 범위가 공지된 경우, 단계 (a)에서 접촉되는 다수의 상이한 용량은 바람직하게는 표준 용량 또는 범위 미만인 용량 및/또는 표준 용량 범위 내에 있는 용량 및/또는 표준 용량 또는 범위를 초과하는 용량을 포함할 것이다. 예를 들어, 암 백신으로서 개체에게 주어지는 RNA 분자의 표준 용량 범위가 5 μg 내지 100 μg 인 경우, 단계 (a)에서 접촉되는 예시적인 다수의 상이한 용량은 2 μg, 10 μg, 및 150 μg일 수 있다. 표준 용량 또는 용량의 범위가 특정 유형의 면역 요법약을 위해 알려져 있지 않은 경우, 유사한 유형의 면역 요법약을 위해 공지된 용량 또는 용량의 범위가 본 발명의 방법에 사용될 수 있거나, 표준 용량 또는 용량의 범위가 경험적으로 결정되고 이어서 개체를 위한 면역 요법제의 적합한 용량을 결정하는 본 발명에 따라 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 다수의 상이한 용량은 면역 요법제에 대한 표준 용량 범위 미만인 적어도 하나의 용량을 포함한다. 일 구체예에서, 다수의 상이한 용량은 면역 요법제에 대한 표준 용량 범위 내에 있는 적어도 하나의 용량을 포함한다. 일 구체예에서, 개별적인 투여 단계들 중 첫 번째 단계는 면역 요법제에 대한 표준 용량 범위 미만인 면역 요법제의 용량의 투여를 특징으로 하고, 개별적인 투여 단계들 중 후속 단계에서 투여되는 용량은 개별적인 투여 단계들 중 첫 번째 단계에서 투여되는 용량보다 선택적으로 높다.
접촉 단계가 시험관내에서 일어나는 구체예에서, 면역 요법제에 대한 표준 용량 또는 용량의 범위는 동일한 면역 요법제에 대한 생체내 표준 용량과 등가인 것으로 공지된 것이다. 그러한 등가물은 당업계에 공지되어 있거나 당업계에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 표준 용량은 생체내에서 투여(접촉)되었을 때의 용량과 동일할 수 있지만, 예를 들어, 시험관내에서 사용된 면역 반응성 물질의 양(예를 들어, 면역 세포의 수) 및/또는 생체내 접촉과 비교되는 면역 반응성 물질의 부피에 의해 조정될 수 있다. 일 구체예에서, 시험관내 접촉을 위한 표준 용량은 공지된 표준 용량이 개체에게 투여될 때 개체에서 관찰되는 혈액 또는 림프의 ml당 또는 특정 유형의 면역 세포의 수당 면역 요법제의 양/농도와 동일하다. 일 구체예에서, 표준 "시험관내" 용량은 표준 "생체내" 용량이 개체에게 투여될 때 전혈에서 달성되는 면역 요법제의 농도와 등가이다. 예를 들어, 1 mg/kg의 표준 용량이 전혈에서 10 μg/ml의 면역 요법제의 농도를 가져오는 경우, 1 mg/kg 생체내 표준 용량의 시험관내 등가 표준 용량은 10 μg/ml이며, 여기서 면역 반응성 물질은 전혈이다.
본 발명의 방법은 면역 요법제를 면역 반응성 물질과 접촉시킴으로써 야기되는, 예를 들어 개체에게 면역 요법제를 투여함으로써 야기되는, 적어도 하나의 원하지 않는 반응, 예컨대 너무 높거나 너무 낮은 수준의 사이토카인의 발현과 같은 원하지 않는 면역학적 반응, 또는 기관 독성과 같은 부작용 또는 불리한 사건 또는 반응의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 단계는 면역 요법제를 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응성 물질과 접촉시키는 각 단계 후에 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 달성될 치료 효과가 특정 유형의 세포의 양의 감소인 경우, 원하지 않는 반응은 치료적이 되는 면역 요법제의 능력을 감소시키는 것으로 공지된 사이토카인의 증가된 발현일 수 있다. 부작용은 접촉 단계가 생체내에서 수행될 때 검출될 수 있는 원하지 않는 반응의 서브세트(subset)이고, 개체에 대한 어느 정도 수준의 불편함을 반영하고 심각도가 달라질 수 있는 원하지 않는 반응이다. 더욱 심각한 부작용은 본원에서 용인 가능하지 않은 부작용으로 지칭된다. 예시적인 부작용으로는 감각이상, 피로, 두통, 근육통, 흉부 압박감 또는 흉부 통증, 떨림, 고열 또는 발열, 이명, 관절 통증, 현기증, 발한, 근긴장저하(hypotonia) 및/또는 빈맥이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 예시적인 용인 가능하지 않은 부작용은 궁극적으로 기관 부전을 초래할 수 있는 전신성 염증 응답 증후군과 같은 개체의 생명을 위협하는 부작용일 수 있다.
일 구체예에서, 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 모든 후속 용량은 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 용인 가능하지 않은 부작용이 검출되는 경우, 모든 후속 용량은 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여될 것이다. 후속 용량은 적어도 하나의 항독성제의 투여를 촉발시킨 용인 가능한 또는 용인 가능하지 않은 부작용을 유발한 용량과 동일하거나 더 낮을 수 있다. 용량이 항독성제의 부재 하에서 용인 가능한 또는 용인 가능하지 않은 부작용을 유발하지만 항독성제의 존재 하에 투여될 때 용인되는 경우, 다음 용량은 더 높을 수 있지만 항산화제의 존재 하에서만 투여될 수 있다. 항독성제는 바람직하게는 해열제, 예컨대 NSAID, 예를 들어, 이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 및 니메설라이드; 아스피린 및 관련 살리실레이트, 예컨대 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트 및 소듐 살리실레이트; 파라세타몰(아세트아미노펜); 메타미졸; 나부메톤;및 페나존이다.
적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되지 않는 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 구체예에서, 후속 투여될 면역 요법제의 다음 용량은 이전 투여 단계에서 투여된 용량과 동일하거나 그 미만이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 원하지 않는 반응이 용인 가능하지 않은 부작용인 경우, 후속 투여될 면역 요법제의 다음 용량은 이전 투여 단계에서 투여된 용량 미만이다. 이전의 투여 단계에 바로 이어지는 후속 투여 단계에, 단계별로 용량 상승 계획을 선택적으로 나타내는 하나 이상의 추가의 투여 단계가 추가로 뒤따를 수 있다.
적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 구체예에서, 후속 투여될 면역 요법제의 다음 용량은 이전 투여 단계에서 투여된 용량 미만이다.
일 구체예에서, 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 부작용이 검출되지 않는 경우, 적어도 하나의 면역학적 반응이 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은 개체에게 면역 요법제를 투여하기 위한 적합한 용량을 반영한다. 하나 초과의 용량이 적합한 용량으로 결정되는 구체예에서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시를 제공하는 용량이 개체에 투여되는 면역 요법제의 용량이다. 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시는 측정되는 면역학적 반응에 좌우될 것이다. 예를 들어, 가장 강한 표시는 사이토카인의 발현이 투여된 다수의 상이한 용량 중에서 관찰된 가장 많거나 가장 적은 것이다. 허용 가능한 치료 효과를 제공하는 투여된 최고 용량은 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시가 제공되는 것과 반드시 동일한 용량은 아니다.
다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 구체예에서, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되고 적어도 하나의 면역학적 반응이 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는, 후속 투여 단계에서의 용량이 개체에게 면역 요법제를 투여하기 위한 적합한 용량을 반영한다. 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 부작용이 검출되지 않는 이 구체예의 일 양태에서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시를 제공하는 용량이 개체에게 면역 요법제를 투여하기 위한 적합한 용량이다. 이 양태는 항독성제와 함께 투여된 이들 용량에서 부작용이 검출되지 않기 때문에 적합한 용량인 다수의 상이한 용량이 존재하는 상황에 관한 것이다. 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시는 측정되는 면역학적 반응에 좌우될 것이다. 예를 들어, 가장 강한 표시는 사이토카인의 발현이 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 다수의 상이한 용량 중에서 관찰되는 가장 많거나 가장 적은 것일 수 있다. 부작용이 검출되지 않는 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 최고 용량은 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시가 제공되는 것과 반드시 동일한 용량은 아니다. 이 구체예의 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 부작용이 검출되지 않거나 가장 덜 심각하거나 그렇지 않으면 질병의 중증도를 고려하여 허용 가능한 것으로 간주되는 최고 용량이 게체로의 면역 요법제의 투여를 위한 적합한 용량이다. 이 양태는 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 용량 중 일부가 부작용을 초래하거나 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 모든 용량에서 부작용이 검출되는 상황에 관한 것이다. 따라서, 적합한 용량은 치료학적으로 유효하고, 부작용이 검출되지 않거나, 부작용이 가장 덜 심각하거나, 그렇지 않으면 부작용이 질병의 중증도를 고려하여 허용 가능한 것으로 간주되는 용량이다.
본 발명에 따르면, 특정 개체를 위한 특정 면역 요법제에 대해 적합한 용량으로 결정된 용량은, 그 면역 요법제에 대해 개체에서 허용 가능한, 바람직하게는 최적의 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 적어도 하나의 면역학적 반응이 개체에게 면역 요법제를 투여하기 위한 적합한 용량을 반영하는 용량이다. 바람직하게는, 적합한 용량은, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되는지 여부와 관계없이, 개체에서 최소한의 원하지 않는 반응 또는 부작용을 또한 초래한다. 면역 요법제를 면역 반응성 물질과 접촉시키는 것이 생체내에서 발생하는 구체예에서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은 적합한 용량을 직접적으로 반영하는데, 즉, 개체에게 면역 요법제를 투여하기 위한 적합한 용량은 면역 반응성 물질과 접촉하는 다수의 상이한 용량 중 하나 이상과 동일하거나 유사할 것이다. 면역 요법제를 면역 반응성 물질과 접촉시키는 것이 시험관내에서 발생하는 구체예에서, 시험관내 방법에서 사용된 다수의 상이한 용량은 허용 가능한 치료 효과를 제공하는 개체에게 투여될 용량과 반드시 동일하지는 않다. 따라서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 시험관내에서 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은 적합한 용량을 간접적으로 반영할 수 있다. 시험관내에서 접촉된 용량과 그의 생체내 등가 용량 사이의 관계는 공지되어 있거나 당업계에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 시험관내에서 접촉된 면역 요법제의 용량이 접촉하는 면역 세포의 수에 대한 양(예를 들어, 10 ng/108 개 세포)인 경우, 생체내 등가 용량은 동일한 수의 동일한 면역 세포에 대해 혈액 내에서 동일한 또는 유사한 양의 면역 요법제를 가져오는 용량(10 ng/108 개의 동일한 세포)이다.
치료 효과는 면역 요법제에 의해 제공될 것으로 예상되는 치료 효과에 좌우될 것이다. 일 구체예에서, 허용 가능한 치료 효과는 질병의 진행을 저지하거나 늦추는 것; 개체에서 새로운 질병의 발병을 저해하거나 늦추는 것; 현재 질병에 걸려 있거나 과거에 질병에 걸린 적이 있는 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 및/또는 재발을 감소시키는 것; 그리고/또는 개체의 수명을 연장, 즉 증가시키는 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 예시적인 최적 치료 효과는 질병이 제거되어 추가의 처리가 요구되지 않는 것이다. 질병이 암인 구체예에서, 허용 가능한 치료 효과는 적어도 종양의 크기 및/또는 수가 증가하지 않는 것이고, 바람직하게는 종양의 크기 및/또는 수가 감소하는 것이고, 최적의 치료 효과는 임의의 및 모든 종양의 완전한 소멸로서, 면역 요법제의 추가 투여가 요구되지 않는 것이다.
적어도 하나의 면역학적 반응 또는 적어도 하나의 면역학적 반응의 특정 변화가 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 것으로 결정된 경우, 동일한 반응 또는 그의 변화를 가져오는 용량은 이 용량이 허용 가능한 치료 효과를 제공하는 적합한 용량임을 나타낸다. 또한, 적어도 하나의 면역학적 반응 또는 그의 변화의 강함 또는 약함은 또한 그 용량에서의 치료 효과의 강함 또는 약함을 나타낼 수 있다. 많은 면역 요법제에 대해 적어도 하나의 면역학적 반응과 치료 효과 간의 상관 관계가 알려져 있다. 더욱이, 그러한 상관 관계는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료 효과, 바람직하게는 허용 가능한 치료 효과를 가져오는 용량으로 면역 요법제가 투여된 하나 이상의 개체에서 적어도 하나의 면역학적 반응이 측정될 수 있고, 개체 사이에 일관되게 관찰된 적어도 하나의 면역학적 반응은 그 면역 요법제에 대한 치료 효과, 바람직하게는 허용 가능한 치료 효과를 나타낸다. 예를 들어, 허용 가능한 치료 효과를 가져오는 면역 요법제의 용량이 3 개의 상이한 사이토카인의 발현의 증가 및 특정 유형의 면역 세포의 더욱 성숙한 면역 세포로의 분화와 일관되게 상관 관계를 갖는 경우, 3 개의 상이한 사이토카인의 발현의 증가 및 면역 세포의 분화는 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 면역학적 반응이다. 그러한 방식으로, 임의의 면역 요법제에 대한 치료 효과를 나타내는 일련의 면역학적 반응 또는 "일련의 매개변수"가 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 공지된 일련의 면역학적 반응이 면역 요법제의 용량이 투여된 개체에서 관찰된 것과 동일하거나 실질적으로 동일한 경우, 투여된 용량은 개체에게 면역 요법제를 투여하기 위한 적합한 용량을 반영한다.
본 발명의 예시적인 구체예는 (i) 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과가 특정 사이토카인의 최고 수준의 발현에 의해 나타나는 것으로 알려진 경우, 개체를 위한 적합한 용량이 그 특정 사이토카인의 최고 수준의 발현을 가져오는 용량에 의해 반영되는 것, (ii) 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과가 특정 사이토카인의 최저 수준의 발현에 의해 나타나는 것으로 알려진 경우, 개체를 위한 적합한 용량이 그 특정 사이토카인의 최저 수준의 발현을 가져오는 용량에 의해 반영되는 것, (ⅲ) 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과가 특정 사이토카인의 발현의 유도에 의해 나타나는 것으로 알려진 경우, 개체를 위한 적합한 용량이 그 특정 사이토카인의 발현의 유도를 가져오는 용량에 의해 반영되는 것, (iv) 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과가 다수의 사이토카인의 특이적 발현 패턴에 의해 나타나는 것으로 알려진 경우, 개체를 위한 적합한 용량이 다수의 사이토카인의 실질적으로 동일한 특이적 발현 패턴을 가져오는 용량에 의해 반영되는 것, (v) 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과가 특정 면역 세포의 분화의 유도에 의해 나타나는 것으로 알려진 경우, 개체를 위한 적합한 용량이 특정 면역 세포의 분화의 동일한 또는 유사한 유도를 가져오는 용량에 의해 반영되는 것, 또는 (vi) 특정 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과가 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 이펙터 기능의 유도 또는 향상에 의해 나타나는 것으로 알려진 경우, 개체를 위한 적합한 용량이 면역 세포의 이펙터 기능의 동일한 또는 유사한 유도 또는 향상을 가져오는 용량에 의해 반영되는 것을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
추가로 본 발명은 개체를 적합한 용량의 면역 요법제로 처리하는 방법으로서, 본 발명의 방법에 따라 적합한 것으로 결정된 면역 요법제의 용량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 면역 요법제는 TLR 효능제이다. 일 구체예에서, 개체를 적합한 용량의 면역 요법제로 처리하는 방법은 (a) 다수의 상이한 용량의 면역 요법제를 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 단계, (b) 다수의 상이한 용량의 면역 요법제에 의해 유발된 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 단계로서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은 개체에게 투여하기 위한 적합한 용량을 반영하는 단계, 및 (c) 면역 요법제를 적합한 용량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 개체를 적합한 용량의 면역 요법제로 처리하는 방법은 면역 요법제를 적합한 용량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 적합한 용량은 (a) 다수의 상이한 용량의 면역 요법제를 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 단계, 및 (b) 다수의 상이한 용량의 면역 요법제에 의해 유발된 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 단계로서, 적어도 하나의 면역학적 반응이 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량이 개체에게 투여하기 위한 적합한 용량을 반영하는 단계에 의해 결정된다.
일 구체예에서, 적합한 용량의 면역 요법제가 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된다. 이 구체예는 면역 요법제의 적합한 용량이 적어도 하나의 항독성제의 투여없이 적어도 하나의 부작용이 검출되는 용량인 경우이다.
바람직한 구체예에서, 방법은 암을 치료하기 위한 면역 요법용 방법이고, 면역 요법제는 핵산, 바람직하게는 암 세포 상에서 특이적으로 발현되는 하나 이상의 에피토프를 코딩하는 단일 가닥 RNA이다. 바람직하게는, 하나 이상의 에피토프는 네오에피토프(neoepitope)이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도면
도 1a 내지 도 1f는 15 명의 개별 환자에게 다양한 용량의 4가 RNA(LIP) 백신을 투여하기 전(pre) 및 투여한 후(2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간)의 전신 림프구 수(도 1a), 전신 혈소판 수(도 1b), 및 전신 혈청 사이토카인 수준(IFN-α, IL-6, IFN-γ, IP-10)(각각 도 1c 내지 도 1f)를 나타내는 히스토그램이다. 도시된 값은 이중시료(duplicate)의 평균값이다. V는 방문인 한편, V2는 제1 투여를, V3는 제2 투여를, V4는 제3 투여를, V5는 제4 투여를, V6은 제5 투여를, V7은 제6 투여를, V8은 제7 투여를, 및 V9는 제8 투여를 각각 나타낸다. 코호트 I 환자는 단지 6 회의 투여(V2 내지 V7)를 받았다. 혈액 샘플링 및 분석은 표준 방법에 따라 수행되었다.
도 2a 내지 도 2h는 분리된 PBMC를 RNA-리포솜 제형과 함께 6 시간 동안 인큐베이션한 후(검은 점) 및 24 시간 동안 인큐베이션한 후(하얀 점)의 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료(triplicate) 실험의 평균값이다.
도 3a 내지 도 3h는 전혈을 RNA-리포솜 제형과 함께 6 시간 동안 인큐베이션한 후(검은 점) 및 24 시간 동안 인큐베이션한 후(하얀 점)의 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료 실험의 평균값이다.
도 4a 내지 도 4c는 전혈(검은 원), pDC가 농축된 전혈(검은 사각형) 및 iDC가 농축된 전혈(검은 삼각형)에서 RNA-리포솜 제형을 6 시간 동안 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료 실험의 평균값이다.
도 5a 내지 도 5c는 전혈(검은 원), pDC가 농축된 전혈(검은 사각형) 및 pDC(검은 삼각형)에서 RNA-리포솜 제형을 24 시간 동안 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료 실험의 평균값이다.
도 6a 내지 도 6j는 PBMC를 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 7a 내지 도 7j는 전혈을 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 8a 내지 도 8e는 PBMC를 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 상대적 CD69 발현에 의해 측정된 바와 같은 특정 면역 세포의 활성화 수준을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 9a 내지 도 9e는 전혈을 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 상대적 CD69 발현에 의해 측정된 바와 같은 특정 면역 세포의 활성화 수준을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 10a 내지 도 10kk는 소분자 TLR-7 효능제인 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)를 정맥내 투여한 후 시점에 따른 수컷 또는 암컷 사이노몰거스 원숭이의 혈액 중의 사이토카인 분비 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 도 11m은 소분자 TLR-7 효능제인 N-(4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(1,1-다이옥사이도티에탄-3-일)아세트아미드(SM3)를 정맥내 투여한 후 시점에 따른 수컷 사이노몰거스 원숭이의 혈액 중의 사이토카인 분비 수준을 나타내는 그래프이다.
도 12a 내지 도 12f는 상이한 인간 개체로부터 분리된 PMBC를 TLR-8의 소분자 효능제인 2-에틸-1-(4-((2-메틸테트라하이드로푸란-3-일)아미노)부틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(SM4)과 함께 24 시간 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 그래프이다.
도 13a 내지 도 13h는 상이한 인간 개체로부터 분리된 PMBC를 TLR-8의 소분자 효능제인 1-(4-(사이클로헥실아미노)부틸)-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(SM5)과 함께 24 시간 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 그래프이다.
도 1a 내지 도 1f는 15 명의 개별 환자에게 다양한 용량의 4가 RNA(LIP) 백신을 투여하기 전(pre) 및 투여한 후(2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간)의 전신 림프구 수(도 1a), 전신 혈소판 수(도 1b), 및 전신 혈청 사이토카인 수준(IFN-α, IL-6, IFN-γ, IP-10)(각각 도 1c 내지 도 1f)를 나타내는 히스토그램이다. 도시된 값은 이중시료(duplicate)의 평균값이다. V는 방문인 한편, V2는 제1 투여를, V3는 제2 투여를, V4는 제3 투여를, V5는 제4 투여를, V6은 제5 투여를, V7은 제6 투여를, V8은 제7 투여를, 및 V9는 제8 투여를 각각 나타낸다. 코호트 I 환자는 단지 6 회의 투여(V2 내지 V7)를 받았다. 혈액 샘플링 및 분석은 표준 방법에 따라 수행되었다.
도 2a 내지 도 2h는 분리된 PBMC를 RNA-리포솜 제형과 함께 6 시간 동안 인큐베이션한 후(검은 점) 및 24 시간 동안 인큐베이션한 후(하얀 점)의 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료(triplicate) 실험의 평균값이다.
도 3a 내지 도 3h는 전혈을 RNA-리포솜 제형과 함께 6 시간 동안 인큐베이션한 후(검은 점) 및 24 시간 동안 인큐베이션한 후(하얀 점)의 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료 실험의 평균값이다.
도 4a 내지 도 4c는 전혈(검은 원), pDC가 농축된 전혈(검은 사각형) 및 iDC가 농축된 전혈(검은 삼각형)에서 RNA-리포솜 제형을 6 시간 동안 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료 실험의 평균값이다.
도 5a 내지 도 5c는 전혈(검은 원), pDC가 농축된 전혈(검은 사각형) 및 pDC(검은 삼각형)에서 RNA-리포솜 제형을 24 시간 동안 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이다. 단일 데이터 지점은 삼중시료 실험의 평균값이다.
도 6a 내지 도 6j는 PBMC를 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 7a 내지 도 7j는 전혈을 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 8a 내지 도 8e는 PBMC를 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 상대적 CD69 발현에 의해 측정된 바와 같은 특정 면역 세포의 활성화 수준을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 9a 내지 도 9e는 전혈을 TLR-7의 소분자 효능제와 함께 24 시간 후 인큐베이션한 후 상대적 CD69 발현에 의해 측정된 바와 같은 특정 면역 세포의 활성화 수준을 나타내는 히스토그램이며, 검은 원은 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)이고, 하얀 원은 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(SM2)이다.
도 10a 내지 도 10kk는 소분자 TLR-7 효능제인 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1)를 정맥내 투여한 후 시점에 따른 수컷 또는 암컷 사이노몰거스 원숭이의 혈액 중의 사이토카인 분비 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 도 11m은 소분자 TLR-7 효능제인 N-(4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(1,1-다이옥사이도티에탄-3-일)아세트아미드(SM3)를 정맥내 투여한 후 시점에 따른 수컷 사이노몰거스 원숭이의 혈액 중의 사이토카인 분비 수준을 나타내는 그래프이다.
도 12a 내지 도 12f는 상이한 인간 개체로부터 분리된 PMBC를 TLR-8의 소분자 효능제인 2-에틸-1-(4-((2-메틸테트라하이드로푸란-3-일)아미노)부틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(SM4)과 함께 24 시간 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 그래프이다.
도 13a 내지 도 13h는 상이한 인간 개체로부터 분리된 PMBC를 TLR-8의 소분자 효능제인 1-(4-(사이클로헥실아미노)부틸)-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(SM5)과 함께 24 시간 인큐베이션한 후 사이토카인 발현 양을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
이하에 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 하는데, 이는 이러한 방법, 프로토콜 및 시약이 달라질 수 있기 때문이다. 본원에 사용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아님을 또한 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 학술적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이 요소들은 특정 구체예와 함께 나열되지만, 이들 요소는 임의의 방식 및 임의의 수로 조합되어 추가의 구체예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 바람직한 구체예는 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이러한 설명은 명시적으로 설명된 구체예와 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소를 조합하는 구체예를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원의 모든 설명된 요소들의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 지시되지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
바람직하게는, 본원에 사용된 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Klbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland] 에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실시에는 달리 지시되지 않는 한, 본 기술분야의 문헌(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, M.R. Green, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2012] 참조)에서 설명되는 생화학, 세포 생물학, 면역학, 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법이 이용될 것이다.
이하의 본 명세서와 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함한다" 및 그 변화형, 예컨대 "포함하고" 및 "포함하는"라는 단어는 명시된 부재, 정수 또는 단계 또는 부재들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하나 임의의 다른 부재, 정수 또는 단계 또는 부재들, 정수들 또는 단계들의 군을 제외하는 것은 아님을 암시하지만, 일부 구체예에서, 그러한 다른 부재, 정수 또는 단계 또는 부재들, 정수들 또는 단계들이 제외될 수 있는데, 즉, 대상 내용은 명시된 부재, 정수 또는 단계 또는 부재들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 데에 있는 것으로 이해될 것이다. 본 발명을 설명하는 것과 관련하여(특히 청구범위와 관련하여) 사용된 단수형 및 유사한 언급은 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 언급은 단지 범위에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법의 역할을 하도록 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
본원에 설명된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 의도된 것이고, 청구된 본 발명의 범위를 달리 한정하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 몇몇 문서가 인용된다. (모든 특허, 특허 출원, 학술 간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등을 포함하는) 본원에 인용된 각 문서는 상기한 것이든 하기한 것이든 간에 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 것도 선행 발명임을 이유로 본 발명이 그러한 개시내용에 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명은 적합한 용량의 면역 요법제를 투여함으로써 질병의 면역 요법을 고려하며, 이 적합한 용량은 본원에 기재된 방법에 의해 결정된다. 면역 요법제의 유효성이 면역계에 관한 개체들 사이의 자연적 차이에 좌우되기 때문에, 적합한 치료학적으로 유효한, 바람직하게는 비독성인 용량은 각 환자를 위해 개별적으로 결정될 필요가 있다. 바람직한 구체예에서, 면역 요법제는 암을 치료하기 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 면역 요법은 능동 면역 요법용 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 구체적으로 개체를 위한 면역 요법제의 적합한 용량의 결정에 관한 것이다. 일단 그러한 적합한 용량이 확인되면, 면역 요법제는 특정 표적에 대한 면역학적 반응, 예컨대 면역 응답을 유도하기 위해 그 용량으로 개체에게 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 면역 응답은, T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체와 같은 적절한 항원 수용체를 통해 종양 세포 상에서 발현되는 에피토프를 인식하는 T 세포와 같은 적절한 이펙터 세포를 유도 및/또는 활성화하여, 그 에피토프를 발현하는 질병 세포의 사멸을 가져오는 것이다.
본 발명에 포함되는 면역 요법용 접근법은 i) 에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, ii) 에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 및 iii) 에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 바이러스에 의한 면역화를 포함한다.
수지상 세포(DC)는 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로를 통해 말초 조직에서 포획된 항원을 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. DC가 면역 응답의 강력한 유도인자이고 이러한 세포의 활성화가 항종양 면역의 유도에 중요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포는 "미성숙" 및 "성숙"세포로 편리하게 분류되며, 이는 2 개의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 이용될 수 있다. 그러나, 이 명명법은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리를 위한 고도의 능력을 갖는 항원 제시 세포로서 특성화되며, 이는 Fcγ 수용체 및 만노오스 수용체의 높은 발현과 상관 관계를 갖는다. 성숙한 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 발현은 낮지만 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 보조 자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 발현은 높은 것을 특징으로 한다. DC 성숙은 그러한 항원 제시 DC가 T 세포 프라이밍을 가져오는 DC 활성화의 상태로 지칭되는 한편, 미성숙 DC에 의한 그의 제시는 관용을 가져온다. DC 성숙은 선천성 수용체(패턴 인식 수용체)에 의해 검출되는 미생물 특징(세균 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등)을 갖는 생체분자, 전염증성 사이토카인(TNF, IL-1, IFN), CD40L에 의한 DC 표면 상에서의 CD40의 라이게이션, 및 스트레스성 세포 사멸을 겪는 세포로부터 방출된 물질에 의해 주로 유발된다. DC는 골수 세포뿐만 아니라 백혈구 연층(buffy coat) 또는 전혈로부터 유래된 세포를 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 IL-4와 같은 사이토카인과 함께 시험관내에서 배양함으로써 유래될 수 있다.
바람직한 면역 요법제는 면역 반응성 펩타이드 또는 하나 이상의 그러한 펩타이드를 코딩하는 핵산이며, 이 펩타이드는 에피토프, 바람직하게는 질병 특이적 돌연변이로 인한 네오에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명과 관련하여 "질병 특이적 돌연변이"라는 용어는 질병 세포의 핵산에는 존재하지만 질병에 걸리지 않은 상응하는 정상 세포의 핵산에는 존재하지 않는 체세포 돌연변이와 관련된다. 질병은 암일 수 있으므로 "종양 특이적 돌연변이" 또는 "암 특이적 돌연변이"라는 용어는 종양 또는 암 세포의 핵산에는 존재하지만 상응하는 정상, 즉, 비종양성 또는 비암성 세포의 핵산에는 존재하지 않는 체세포 돌연변이를 지칭한다. 용어 "종양 특이적 돌연변이"와 "종양 돌연변이" 및 용어 "암 특이적 돌연변이"와 "암 돌연변이"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
면역 요법제가 항원 또는 상기 항원을 코딩하는 핵산인 구체예에서, "세포성 면역 응답", "세포성 응답", "항원에 대한 세포성 응답" 또는 유사한 용어는 클래스 I 또는 클래스 II MHC에 의한 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대해 유도된 세포성 면역학적 응답을 포함하도록 의도된다. 세포성 응답은 "헬퍼(helper)" 또는 "킬러(killer)"로 작용하는 T 세포 또는 T-림프구라고 일컬어지는 세포와 관련된다. 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포로도 명명됨)는 면역 응답을 조절함으로써 중추적인 역할을 하고, 킬러 세포(세포독성 T 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로도 명명됨)는 암 세포와 같은 질병 세포를 치사시켜, 더 많은 질병 세포의 생성을 방지한다. 바람직하게는, 항-종양 CTL 응답은 하나 이상의 종양 발현 항원을 발현하는 종양 세포에 대해 자극되고, 바람직하게는 그러한 종양 발현 항원을 클래스 Ⅰ MHC에 의해 제시한다.
본 발명에 따른 "항원"은 항체 또는 T-림프구(T 세포)와의 특이적 반응과 같은 면역 응답의 표적이고/거나 이러한 면역 응답을 유도하는 임의의 물질, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 항원은 T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 항원은, 선택적으로 처리 후, 바람직하게는 항원(항원을 발현하는 세포를 포함함)에 특이적인, 면역 반응을 유도하는 분자이다. 항원 또는 그의 T 세포 에피토프는 MHC 분자와 관련하여 세포에 의해, 바람직하게는 질병 세포, 특히 암 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 제시되어, 항원(항원을 발현하는 세포를 포함함)에 대한 면역 응답을 가져오는 것이 바람직하다. 항원은 바람직하게는 자연 발생적인 항원에 상응하거나 이로부터 유래된 생성물이다. 그러한 자연 발생적인 항원은 알레르겐, 바이러스, 세균, 진균, 기생충 및 기타 감염성 인자 및 병원체를 포함하거나 이로부터 유래 될 수 있거나, 항원은 또한 종양 항원 일 수 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생적인 생성물, 예를 들어, 바이러스 단백질 또는 그의 일부에 상응할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항원은 표면 폴리펩타이드, 즉, 세포, 병원체, 세균, 바이러스, 진균, 기생충, 알레르겐, 또는 종양의 표면 상에 자연적으로 나타나는 폴리펩타이드이다. 항원은 세포, 병원체, 세균, 바이러스, 진균, 기생충, 알레르겐 또는 종양에 대한 면역 응답을 유도할 수 있다.
"질병 관련 항원" 또는 "질병 특이적 항원"이라는 용어는 질병과 관련되거나 질병에 특이적인 임의의 항원을 지칭하도록 가장 넓은 의미로 사용된다. 그러한 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 질병에 대한 세포성 항원 특이적 면역 응답 및/또는 체액성 항체 응답을 일으키는 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서, 질병 관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질병 관련 항원은 바람직하게는 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나, 암, 전형적으로 종양과 관련된다.
"병원체"라는 용어는 유기체, 바람직하게는 척추 동물 유기체에서 질병을 유발할 수 있는 병원성 생물학적 물질을 지칭한다. 병원체는 세균, 단세포 진핵 유기체(원생 동물), 진균뿐만 아니라 바이러스와 같은 미생물을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "종양 항원" 또는 "종양 관련 항원"은 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 정상 조건 하에 특이적으로 발현되는 단백질과 관련되는데, 예를 들어 종양 항원은 위 조직, 바람직하게는 위 점막에서, 생식 기관, 예를 들어 고환에서, 영양막세포 조직, 예를 들어 태반에서, 또는 생식선 세포에서 정상적인 조건 하에 특이적으로 발현될 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 이와 관련하여, "제한된 수"는 바람직하게는 3 개 이하, 더욱 바람직하게는 2 개 이하를 의미한다. 본 발명과 관련하여 종양 항원은, 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉, 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형에서 정상적인 조건 하에 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉, 고환 및 때때로 태반에서 정상적인 조건 하에 특이적으로 발현되는 단백질, 및 생식선 특이적 항원을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 종양 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면과 관련되고, 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 단지 드물게 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적 발현은 암 세포를 확인한다. 본 발명과 관련하여, 대상체, 예를 들어, 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은 자기 단백질 또는 비자기 단백질일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명과 관련하여 종양 항원은 암성 조직에서 또는 비필수적인 조직 또는 기관, 즉, 면역계에 의해 손상된 경우 대상체의 사망을 야기하지 않는 조직 또는 기관에서, 또는 면역에 의해 접근 가능하지 않거나 단지 가까스로 접근 가능하거나, 예를 들어 고농도의 Treg 세포의 존재를 통해 관용 메커니즘을 통해 보호되는 신체의 기관 또는 구조체에서 정상적인 조건 하에 특이적으로 발현된다. 종양 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 사이에 동일할 수 있거나, 아미노산 서열은, 예를 들어 단지 하나의 아미노산 또는 1 개 초과의 아미노산에서, 바람직하게는 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 또는 10 개 초과의 아미노산에서 상이할 수 있다. 용어 "종양 항원", "종양 발현 항원", "암 항원" 및 "암 발현 항원"은 등가의 용어이고, 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "에피토프", "항원 펩타이드", "항원 에피토프", "면역원성 펩타이드" 및 "MHC 결합성 펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉, 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우, 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어 T 세포에 의해 인식되는 면역학적으로 활성인 화합물 내의 일부 또는 그 화합물의 단편을 지칭한다. 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고, 길이가 바람직하게는 5 개 내지 100 개, 바람직하게는 5 개 내지 50 개, 더욱 바람직하게는 8 개 내지 30 개, 가장 바람직하게는 10 개 내지 25 개의 아미노산인데, 예를 들어 에피토프는 길이가 바람직하게는 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24개, 또는 25 개의 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따르면, 에피토프는 세포 표면상의 MHC 분자와 같은 MHC 분자에 결합할 수 있고, 이에 따라 "MHC 결합성 펩타이드" 또는 "항원 펩타이드"일 수 있다. 용어 "주요 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 모든 척추 동물에 존재하는 유전자들의 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병 세포 사이의 신호 전달에 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드와 결합하여 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이러한 펩타이드를 제시한다. MHC에 의해 코딩되는 단백질은 세포 표면 상에서 발현되어 T 세포에 자기 항원(세포 자체로부터의 펩타이드 단편)과 비자기 항원(예를 들어, 침입 미생물의 단편)을 나타낸다. 바람직한 그러한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역원성 부분은 당업계에 공지된 임의의 검정을 이용하여 그러한 결합이 검출 가능한 경우 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합"한다고 한다. 용어 "MHC 결합성 펩타이드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드와 관련된다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합성 펩타이드는 전형적으로 8 개 내지 10 개의 아미노산 길이이지만, 더 길거나 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합성 펩타이드는 전형적으로 10개 내지 25 개의 아미노산 길이이고, 특히 13 개 내지 18 개의 아미노산 길이이지만, 더 길고 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "네오에피토프"는 정상 비암성 또는 생식선 세포와 같은 기준에는 존재하지 않지만 암 세포와 같은 질병 세포에서는 발견되는 에피토프를 지칭한다. 이는 특히 정상적인 비암성 또는 생식선 세포에서 상응하는 에피토프가 발견되는 상황을 포함하지만, 암 세포에서의 하나 이상의 돌연변이로 인해 에피토프의 서열이 변화되어 네오에피토프를 생성시킨다. 더욱이, 네오에피토프는 질병 세포에 특이적일뿐만 아니라 질병에 걸린 환자에도 특이적일 수 있다.
본 발명의 하나의 특히 바람직한 구체예에서, 에피토프 또는 네오에피토프는 T 세포 에피토프이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포 에피토프"는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 형태로 MHC 분자에 결합하는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, T 세포 에피토프는 항원 제시 세포의 표면 상에 제시된다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역원성 아미노산 변형을 예측"한다는 용어는 그러한 아미노산 변형을 포함하는 펩타이드가 면역원성이고 이에 따라 백신 접종시에 에피토프, 특히 T 세포 에피토프로 유용할 것인지에 대한 예측을 지칭한다.
본 발명에 따르면, T 세포 에피토프는 1개 초과의 T 세포 에피토프를 포함하는 백신 서열 및/또는 폴리펩타이드와 같은 더 큰 엔티티(entity)의 일부로서 백신에 존재할 수 있다. 제시된 펩타이드 또는 T 세포 에피토프는 적합한 처리 후에 생성된다.
T 세포 에피토프는 TCR 인식 또는 MHC와의 결합에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 변형될 수 있다. 그러한 변형된 T 세포 에피토프는 면역학적으로 등가인 것으로 간주될 수 있다.
바람직하게는, MHC에 의해 제시되고 T 세포 수용체에 의해 인식되는 경우 T 세포 에피토프는 적절한 보조 자극 신호의 존재 하에 펩타이드/MHC-복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 지닌 T 세포의 클론 확장(clonal expansion)을 유도할 수 있다.
바람직하게는, T 세포 에피토프는 항원 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항원 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드이다.
본 발명에 따른 T 세포 에피토프는 바람직하게는 면역 응답, 바람직하게는 항원 또는 항원의 발현을 특징으로 하는 세포, 바람직하게는 질병 세포, 특히 암 세포와 같은 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 응답을 자극할 수 있는 항원의 일부분 또는 단편과 관련된다. 바람직하게는, T 세포 에피토프는 클래스 I MHC에 의한 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 응답을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원 응답성 세포독성 T-림프구(CTL)를 자극할 수 있다.
일부 구체예에서, 항원은 자기 항원, 특히 종양 항원이다. 종양 항원 및 그의 결정은 당업자에게 공지되어 있다.
"면역원성"이라는 명사형 용어는 바람직하게는 암에 대한 치료법과 같은 치료적 처리와 관련된 면역 응답을 유도하는 상대적인 유효성과 관련된다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역원성"이라는 형용사형 용어는 면역원성을 갖는 특성과 관련된다. 예를 들어, "면역원성 변형"이라는 용어는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련하여 사용되는 경우 상기 변형에 의해 유발되거고/되거나 그러한 변형에 대해 유도된 면역 응답을 유도하는 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 유효성과 관련된다. 바람직하게는, 비변형된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 면역 응답을 유도하지 않거나, 상이한 면역 응답을 유도하거나, 상이한 수준, 바람직하게는 더 낮은 수준의 면역 응답을 유도한다.
본 발명에 따르면, 명사형 용어 "면역원성" 또는 형용사형 용어 "면역원성"은 바람직하게는 생물학적으로 관련된 면역 응답, 특히 백신 접종에 유용한 면역 응답을 유도하는 상대적인 유효성과 관련된다. 따라서, 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드는 대상체에서 표적 변형에 대해 면역 응답을 유도하는 경우 면역원성이며, 이 면역 응답은 치료 또는 예방 목적으로 유익할 수 있다.
"항원 처리" 또는 "처리"는 폴리펩타이드 또는 항원의 처리 생성물로의 분해로서, 이 처리 생성물이 상기 폴리펩티드 또는 항원의 단편인 분해(예를 들어, 폴리펩티드의 펩티드로의 분해), 및 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의한 특정 T 세포로의 제시를 위한(예를 들어, 결합을 통한) 하나 이상의 이러한 단편과 MHC 분자와의 회합을 지칭한다.
일 구체예에서, 면역 요법제는 세포 표면 상에 MHC 분자와 회합된 단백질 항원의 펩타이드 단편을 제시하는 세포인 항원 제시 세포(APC)를 포함할 수 있다. 일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 전문 항원 제시 세포는 포식 작용, 음세포 작용에 의해 또는 수용체 매개 세포내이입에 의해 항원을 내재화하고, 이어서 클래스 II MHC 분자에 결합된 항원의 단편을 막 상에 나타내는데 매우 효율적이다. T 세포는 항원 제시 세포의 막 상의 항원-클래스 II MHC 분자 복합체를 인식하고 이와 상호 작용한다. 이어서 항원 제시 세포에 의해 추가의 보조 자극 신호가 생성되어, T 세포의 활성화를 가져온다. 보조 자극 분자의 발현은 전문 항원 제시 세포의 규정적인 특징이다. 전문 항원 제시 세포의 주요 유형은 가장 넓은 항원 제시 범위를 가지며 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포인 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 및 특정 활성화 상피 세포이다.
비전문 항원 제시 세포는 미경험 CD4+ T 세포와의 상호 작용에 필요한 MHC 클래스 II 단백질을 항시적으로 발현하지 않으며, 이러한 단백질은 IFNγ와 같은 특정 사이토카인에 의한 비전문 항원 제시 세포의 자극시에만 발현된다.
항원 제시 세포는, 펩타이드 또는 제시될 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 RNA, 예를 들어 항원을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질도입시킴으로써 MHC 클래스 I 및 클래스 II 제시 펩타이드로 로딩될 수 있다.
일부 구체예에서, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클을 포함하는 본 발명의 면역 요법제가 환자에게 투여되어, 생체내에서 일어나는 형질감염을 가져올 수 있다. 수지상 세포의 생체내 형질감염은, 예를 들어, WO 97/24447호에 기술된 방법 또는 문헌[Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 총 접근법과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 일반적으로 수행될 수 있다.
용어 "항원 제시 세포"는 또한 표적 세포를 포함한다.
"표적 세포"는 세포성 면역 응답과 같은 면역 응답을 위한 표적인 세포를 의미하고자 한다. 표적 세포는 항원 또는 항원 에피토프, 즉 항원으로부터 유래된 펩타이드 단편을 제시하는 세포를 포함하고, 암 세포와 같은 바람직하지 않은 임의의 세포를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적 세포는 본원에 기술된 바와 같은 항원을 발현하고 바람직하게는 클래스 I MHC에 의해 상기 항원을 제시하는 세포이다.
용어 "일부분"은 분획을 지칭한다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조체와 관련하여, 그의 "일부분"이라는 용어는 상기 구조체의 연속 또는 불연속 분획을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 일부분은 상기 아미노산 서열의 아미노산의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱더 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%를 포함한다. 바람직하게는, 일부분이 불연속 분획인 경우, 상기 불연속 분획은 구조체의 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 또는 그 초과의 부분으로 구성되며, 각 부분은 구조체의 연속 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속 분획은 상기 아미노산 서열의 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 그 초과의 부분, 바람직하게는 4 개 이하의 부분으로 구성될 수 있으며, 각 부분은 바람직하게는 아미노산 서열의 적어도 5 개의 연속 아미노산, 적어도 10 개의 연속 아미노산, 바람직하게는 적어도 20 개의 연속 아미노산, 바람직하게는 적어도 30 개의 연속 아미노산을 포함한다.
용어 "부분"및 "단편"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 연속적인 요소를 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조체의 부분은 상기 구조체의 연속적인 요소를 지칭한다.
구조체의 일부분, 부분 또는 단편은 바람직하게는 상기 구조체의 하나 이상의 기능적 특성을 포함한다. 예를 들어, 에피토프, 펩타이드 또는 단백질의 일부분, 부분 또는 단편은 그것이 유래되는 에피토프, 펩타이드 또는 단백질과 면역학적으로 등가인 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여, 아미노산 서열과 같은 구조체의 "부분"은 바람직하게는 전체 구조체 또는 아미노산 서열의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%를 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어진다.
일 구체예에서, 면역 요법제는 면역 반응성 세포일 수 있다. 면역 반응성 세포는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포라는 점에서 면역 반응성 물질과 관련된다. 면역 반응성 세포는 항원, 또는 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩티드의 제시를 특징으로 하는 세포와 결합하고 면역 응답을 매개할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 그러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 항체를 분비하고, 암성 세포를 인식하고, 그러한 세포를 선택적으로 제거한다. 예를 들어, 면역 반응성 세포는 T 세포(세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤성 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여, "면역 반응성 세포"는 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 본 발명의 일 구체예에서, 개체의 면역 반응성 물질은 바람직하게는 면역 반응성 세포 또는 면역 반응성 세포를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
"면역 반응성 세포"는, 특히 MHC 분자와 관련하여 예컨대 항원 제시 세포 또는 암 세포와 같은 질병 세포의 표면 상에서 제시되는 경우, 어느 정도의 특이성을 보이면서 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 또한 인식할 수 있다. 바람직하게는, 상기 인식은 항원 또는 상기 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식하는 세포가 응답성 또는 반응성이 되도록 할 수 있다. 세포가 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식하는 수용체를 지닌 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포)인 경우, 그러한 응답성 또는 반응성은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구(CTL) 및/또는 B 세포의 활성화를 포함할 수 있다. 세포가 CTL 인 경우, 그러한 응답성 또는 반응성은, 예를 들어 아폽토시스 또는 퍼포린(perforin) 매개 세포 용해를 통한, MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시되는 세포, 즉, 클래스 I MHC에 의한 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 제거를 포함할 수 있다. CTL 응답성은 지속적인 칼슘 플럭스(calcium flux), 세포 분열, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향 조절, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포용해성 치사를 포함할 수 있다. CTL 응답성은 CTL 응답성을 정확히 나타내는 인공 리포터를 사용하여 또한 결정될 수 있다. 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드를 인식하고, 응답성 또는 반응성인 그러한 CTL은 본원에서 "항원 응답성 CTL"로도 명명된다. 세포가 B 세포인 경우, 그러한 응답성은 면역글로불린의 방출을 포함할 수 있다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, T 헬퍼 세포(CD4+ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포(CTL, CD8+ T 세포)를 포함한다.
T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 군에 속하고, 세포 매개 면역에서 중추적인 역할을 한다. 이러한 T 세포는 T 세포 수용체(TCR)라고 불리는 그 세포 표면 상의 특별한 수용체의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살해 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 주요 기관이다. 몇몇 상이한 T 세포의 서브세트가 발견되었으며, 각각은 구별되는 기능을 갖는다.
T 헬퍼 세포는 다른 기능들 중에서 B 세포의 혈장 세포로의 분화 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는 면역학적 작용에서 다른 백혈구를 보조한다. 이러한 세포는 그 표면 상에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 보조 자극와 관련하여 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원과 함께 제시되는 경우 활성화된다. 일단 활성화되면, 이러한 세포는 빠르게 분열하고 능동 면역 응답을 조절하거나 보조하는 사이토카인이라 일컬어지는 작은 단백질을 분비한다.
세포독성 T 세포는 바이러스에 감염된 세포와 종양 세포를 파괴하고, 이식 거부에서도 관련된다. 이러한 세포는 그 표면 상에 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이러한 세포는, 신체의 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는, 보조 자극과 관련된 MHC 클래스 I와 회합된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다.
대다수의 T 세포는 여러 단백질의 복합체로 존재하는 T 세포 수용체(TCR)를 갖는다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타(TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생성되고 α- 및 β-TCR 사슬로 일컬어지는 2 개의 별개의 펩타이드 사슬로 구성된다. γδ T 세포(감마 델타 T 세포)는 그 표면 상에 구별되는 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포의 작은 서브세트를 나타낸다. 그러나, γδ T 세포에서, TCR은 하나의 γ-사슬과 하나의 δ 사슬로 구성된다. 이 T 세포 군은 αβ T 세포보다 훨씬 덜 흔하다(총 T 세포의 2%).
본 발명에 따르면, 용어 "항원 수용체"는, T 세포와 같은 면역 이펙터 세포 상으로 모노클로날 항체의 특이성과 같은 임의의 특이성을 부여하는, T 세포 수용체와 같은 자연 발생적인 수용체뿐만 아니라 조작된(engineered) 수용체 를 포함한다. 이러한 방식으로, 많은 수의 항원 특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 수용체는, 예를 들어 T 세포 자체의 T 세포 수용체 대신 또는 이에 부가하여, T 세포 상에 존재할 수 있다. 그러한 T 세포는 표적 세포의 인식을 위해 항원의 처리 및 제시를 반드시 필요로 하지는 않지만, 오히려 바람직하게는 특이성을 보이며 표적 세포 상에 존재하는 임의의 항원을 인식할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 수용체는 세포의 표면 상에서 발현된다. 본 발명의 목적을 위해, 항원 수용체를 포함하는 T 세포는 본원에 사용된 바와 같은 "T 세포"라는 용어에 포함된다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, "항원 수용체"라는 용어는, 암 세포와 같은 표적 세포 상의 표적 구조(예를 들어, 항원)를 (예를 들어, 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원으로의 항원 결합 부위 또는 항원 결합 도메인의 결합에 의해) 인식, 즉, 이와 결합하고, 세포 표면 상에서 상기 항원 수용체를 발현하는 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포 상으로 특이성을 부여할 수 있는, 단일 분자 또는 분자들의 복합체를 포함하는 인공 수용체를 포함한다. 바람직하게는, 항원 수용체에 의한 표적 구조의 인식은 상기 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포의 활성화를 가져온다. 항원 수용체는 하나 이상의 단백질 단위를 포함할 수 있으며, 상기 단백질 단위는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항원 수용체"는 또한 "키메라 항원 수용체(CAR)", "키메라 T 세포 수용체" 또는 "인공 T 세포 수용체"일 수 있다.
항원은 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 임의의 항원 인식 도메인(본원에서 간단히 "도메인"으로도 지칭됨)을 통해, 예컨대 동일하거나 상이한 펩티드 사슬에 존재할 수 있는 T 세포 수용체 및 항체의 항원 결합성 부분을 통해 항원 수용체에 의해 인식될 수 있다. 일 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 2 개의 도메인은 면역글로불린으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 2 개의 도메인은 T 세포 수용체로부터 유래된다. 항체 가변 도메인, 예컨대 모노클로날 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편(scFv) 및 T 세포 수용체 가변 도메인, 특히 TCR 알파 및 베타 단일 사슬이 특히 바람직하다. 실제로, 높은 친화도로 주어진 표적과 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 도메인으로 사용될 수 있다.
T 세포의 활성화에서 첫 번째 신호는 또 다른 세포 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 제시되는 짧은 펩타이드로의 T 세포 수용체의 결합에 의해 제공된다. 이는 그 펩타이드에 특이적인 TCR을 가진 T 세포만 활성화됨을 보장한다. 파트너 세포는 통상적으로 전문 항원 제시 세포(APC)이고, 미경험 응답의 경우 통상적으로 수지상 세포이지만, B 세포 및 대식세포가 중요한 APC일 수 있다. MHC 클래스 I 분자에 의해 CD8+ T 세포에 제시된 펩타이드는 전형적으로 길이가 8 개 내지 10 개의 아미노산이고; MHC 클래스 II 분자에 의해 CD4+ T 세포에 제시된 펩타이드가 전형적으로 더 긴데, 이는 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈(binding cleft)의 말단이 열려 있기 때문이다.
본 발명과 관련하여, 분자는 표적에 결합할 수 있는데, 이는 이 분자가 상기 미리 결정된 표적에 대해 유의한 친화성을 갖고 표준 검정에서 상기 미리 결정된 표적에 결합하는 경우에 그러하다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 종종 평형 해리 상수(KD)로 측정된다. 분자는 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없는데, 이는 이 분자가 상기 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않고 표준 검정에서 상기 표적에 유의하게 결합하지 않는 경우에 그러하다.
세포독성 T 림프구는 생체내에서의 항원 제시 세포 내로의 항원 또는 항원 펩타이드의 혼입에 의해 생체내에서 생성될 수 있다. 항원 또는 항원 펩타이드는 단백질로, (예를 들어, 벡터 내의) DNA로 또는 RNA로 나타날 수 있다. 항원은 MHC 분자에 대한 펩타이드 파트너를 생성하도록 처리될 수 있는 한편, 그의 단편은 추가의 처리에 대한 필요없이 제시될 수 있다. 후자는 특히 이러한 항원이 MHC 분자에 결합할 수 있는 경우이다. 일반적으로, 피내 주사에 의한 환자로의 투여가 가능하다. 그러나, 주사는 림프절 안으로 결절내로 수행되거나(문헌[Maloy et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303]) 정맥내로 주사될 수 있다. 다른 투여 방식은 근육내 및 피하 투여를 포함할 수 있다. 생성된 세포는 관심 대상의 복합체를 제시하고, 자가 세포독성 T 림프구에 의해 인식되며, 이 자가 세포독성 T 림프구는 이어서 전파된다.
CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 특정 T 세포 활성화를 검출하는 방법은 T 세포의 증식, 사이토카인(예를 들어, 림포카인)의 생성, 또는 세포용해 활성의 생성을 검출하는 것을 포함한다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하기 위한 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 검출하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하기 위한 바람직한 방법은 세포용해 활성의 생성을 검출하는 것이다.
"항원의 제시를 특징으로 하는 세포", "항원을 제시하는 세포", 또는 유사한 표현은 세포, 예컨대, 질병 세포, 예를 들어 암 세포, 또는 항원 제시 세포로서, 이 세포가 발현하는 항원 또는 MHC 분자, 특히 MHC 클래스 I 분자와 관련하여, 예를 들어 항원의 처리에 의해 상기 항원으로부터 유래된 단편을 제시하는 세포를 의미한다. 유사하게, 용어 "항원의 제시를 특징으로 하는 질병"은, 특히 클래스 I MHC에 의한, 항원의 제시를 특징으로 하는 세포를 포함하는 질병을 의미한다. 세포에 의한 항원의 제시는 항원을 코딩하는 RNA와 같은 핵산으로 세포를 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다.
"제시되는 항원의 단편" 또는 유사한 표현은, 예를 들어 항원 제시 세포에 직접 첨가되는 경우, 단편이 MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 바람직하게는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있음을 의미한다. 일 구체예에서, 단편은 항원을 발현하는 세포에 의해 자연적으로 제시되는 단편이다.
용어 "면역학적으로 등가"는, 예를 들어, 체액성 및/또는 세포성 면역 응답의 유도와 같은 면역학적 효과의 유형, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 지속 시간, 또는 유도된 면역 반응의 특이성과 관련하여, 면역학적으로 등가의 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 등가의 분자가 동일한 또는 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고/거나 동일한 또는 본질적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘한다는 것을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "면역학적으로 등가"는 면역화에 사용된 펩타이드의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열이 대상체의 면역계에 노출될 때 기준 아미노산 서열과 반응하는 특이성을 갖는 면역 반응을 유도하는 경우, 상기 아미노산 서열은 기준 아미노산 서열과 면역학적으로 등가이다.
본 발명과 관련하여 "면역 이펙터 기능"이란 용어는 본원에 사용된 바와 같은 "면역학적 반응"이라는 용어에 포함되고, 예를 들어 종양 세포의 치사 또는 종양 파종 및/또는 전이의 저해를 포함하는 종양 성장의 저해 및/또는 종양 발생의 저해를 가져오는 면역계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 면역 이펙터 기능은 T 세포 매개 이펙터 기능이다. 그러한 기능은, 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포)의 경우, T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 분자와 관련된 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드의 인식, 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구(CTL) 및/또는 B 세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우, T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 I 분자와 관련된 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드의 인식, 예를 들어 아폽토시스 또는 퍼포린 매개 세포 용해를 통한, MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시된 세포, 즉, 클래스 I MHC에 의한 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 제거, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포용해성 치사를 포함한다.
용어 "주요 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 모든 척추 동물에서 발생하는 유전자들의 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병 세포 사이의 신호 전달에 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드와 결합하여 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이러한 펩타이드를 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포 표면 상에서 발현되고, T 세포에 자기 항원(세포 자체로부터의 펩타이드 단편)과 비자기 항원(예를 들어, 침입 미생물의 단편)을 모두 나타낸다.
MHC 영역은 3 가지 하위 그룹, 즉, 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III로 나뉜다. MHC 클래스 I 단백질은 (15 번 염색체에 의해 코딩된 MHC의 일부는 아닌) α-사슬과 β2-마이크로글로불린을 함유한다. 이러한 단백질은 세포독성 T 세포에 항원 단편을 제시한다. 대부분의 면역계 세포 상에서, 구체적으로 항원 제시 세포 상에서, MHC 클래스 II 단백질은 α-사슬 및 β-사슬을 함유하고, T-헬퍼 세포에 항원 단편을 제시한다. MHC 클래스 III 영역은 보체 성분과 같은 다른 면역 성분을 코딩하고, 일부는 사이토카인을 코딩한다.
MHC는 다유전자성(여러 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 유전자가 존재함)과 다형성(각 유전자의 다중 대립 유전자가 존재함) 둘 모두이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "일배체형"은 하나의 염색체 상에서 발견되는 HLA 대립 유전자 및 이에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다. 일배체형은 또한 MHC 내의 임의의 하나의 유전자좌에 존재하는 대립 유전자를 지칭할 수있다. MHC의 각 클래스는 여러 유전자좌에 의해 표현되는데, 예를 들어, 클래스 I의 경우 HLA-A(인간 백혈구 항원-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P 및 HLA-V로 표현되고, 클래스 II의 경우 HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로 표현된다. 용어 "HLA 대립 유전자" 및 "MHC 대립 유전자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
MHC는 극단적인 다형성을 나타낸다. 인간 집단 내에서, 각각의 유전자좌에 구별되는 대립 유전자를 포함하는 다수의 일배체형이 존재한다. 클래스 I 및 클래스 II 둘 모두의 상이한 다형성 MHC 대립 유전자는, 각각의 대립 유전자가 특정 서열 패턴을 나타내는 펩타이드와 결합하는 단백질을 코딩한다는 점에서 상이한 펩타이드 특이성을 갖는다.
본 발명과 관련하여, MHC 분자는 바람직하게는 HLA 분자이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "MHC 결합성 펩타이드"는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 결합성 펩타이드 또는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 결합성 펩타이드를 생성하도록 처리될 수 있는 펩티드를 포함한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합성 펩타이드는 전형적으로 8개 내지 12 개, 바람직하게는 8개 내지 10 개의 아미노산 길이이지만, 더 길거나 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합성 펩타이드는 전형적으로 9개 내지 30 개, 바람직하게는 10 개 내지 25 개의 아미노산 길이이고, 특히 13 개 내지 18 개 아미노산 길이이지만, 더 길고 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 면역 요법제는 항원 펩타이드 또는 항원 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는 "항원 펩타이드"는 항원, 또는 항원의 발현, 바람직하게는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포, 예컨대 질병 세포, 특히 암 세포에 대한 면역 응답, 바람직하게는 세포성 응답을 자극할 수 있는 항원의 일부분 또는 단편과 관련된다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 클래스 I MHC에 의한 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 응답을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원 응답성 세포독성 T-림프구(CTL)를 자극할 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드이거나 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드를 생성하도록 처리될 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 항원 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항원 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드이다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 그러한 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 그러한 단편, 즉, 항원으로부터 유래된 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩타이드를 생성하도록 처리된다.
펩타이드가 직접적으로, 즉, 처리없이, 특히 절단없이, 제시되어야 하는 경우, 이 펩타이드는 MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자와 결합하기에 적합한 길이를 갖고, 바람직하게는 7 개 내지 20 개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 7 개 내지 12 개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 8 개 내지 11 개의 아미노산 길이, 특히 9 개 또는 10 개의 아미노산 길이이다.
펩타이드가 추가 서열를 포함하는 더 큰 엔티티, 예를 들어 백신 서열 또는 폴리펩타이드의 일부이고, 처리 후, 특히 절단 후에 제시되어야 하는 경우, 처리에 의해 생성된 펩타이드는 MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자와 결합하기에 적합한 길이를 갖고, 바람직하게는 7 개 내지 20 개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 7 개 내지 12 개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 8 개 내지 11 개의 아미노산 길이, 특히 9 개 또는 10 개의 아미노산 길이이다. 바람직하게는, 처리 후에 제시되어야 하는 펩타이드의 서열은 항원의 아미노산 서열로부터 유래되는데, 즉, 그의 서열은 항원의 단편에 실질적으로 상응하고, 바람직하게는 이와 완전히 동일하다. 따라서, MHC 결합성 펩타이드는 항원의 단편에 실질적으로 상응하고, 바람직하게는 이와 완전히 동일한 서열을 포함한다.
클래스 I MHC에 의해 제시되는 펩타이드의 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 바와 같은 펩타이드의 TCR 인식 또는 MHC와의 펩타이드 결합에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 상이할 수 있다. 그러한 실질적으로 상응하는 펩타이드는 또한 항원 응답성 CTL을 자극할 수 있고, 면역학적으로 등가인 것으로 간주될 수 있다. TCR 인식에 영향을 미치지 않지만 MHC와의 결합의 안정성을 개선시키는 잔기에서 제시된 펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 항원 펩타이드의 면역원성을 개선시킬 수 있고, 본원에서 "최적화된 펩타이드"로 지칭될 수 있다. 이들 잔기 중 어느 것이 MHC 또는 TCR과의 결합에 영향을 미칠 가능성이 더 높을 수 있는지에 대한 기존의 지식을 이용하여, 실질적으로 상응하는 펩타이드의 설계에 대한 합리적인 접근법이 사용될 수 있다. 기능성인 생성된 펩타이드는 항원 펩타이드로서 고려된다.
MHC에 의해 제시되는 경우, 항원 펩타이드는 T 세포 수용체에 의해 인식 가능해야 한다. 바람직하게는, T 세포 수용체에 의해 인식되는 경우, 항원 펩타이드는 적절한 보조 자극 신호의 존재 하에 항원 펩타이드를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 지닌 T 세포의 클론 확장을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 특히 MHC 분자와 관련하여 제시되는 경우, 항원 펩타이드는 이러한 펩타이드가 유래되는 항원 또는 항원의 발현, 바람직하게는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 면역 응답, 바람직하게는 세포성 응답을 자극할 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 클래스 I MHC에 의한 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 응답을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원 응답성 CTL을 자극할 수 있다. 그러한 세포는 바람직하게는 표적 세포이다.
용어 "게놈"은 유기체 또는 세포의 염색체 내의 유전 정보의 총량과 관련된다.
용어 "엑솜(exome)"은 발현된 유전자의 코딩 부분인 엑손에 의해 형성된 유기체의 게놈의 일부를 지칭한다. 엑솜은 단백질 및 기타 기능적 유전자 산물의 합성에 사용되는 유전자 청사진을 제공한다. 이는 게놈의 가장 기능적으로 관련된 부분이고, 이에 따라 유기체의 표현형에 기여할 가능성이 가장 높다. 인간 게놈의 엑솜은 전체 게놈의 1.5%를 차지하는 것으로 추정된다(문헌[Ng et al., 2008, PLoS Gen., 4(8):1-15]).
용어 "트랜스크립톰(transcriptome)"은 하나의 세포 또는 세포 집단에서 생성된 mRNA, rRNA, tRNA, 및 기타 비코딩 RNA를 포함한 모든 RNA 분자들의 세트와 관련된다. 본 발명과 관련하여, 트랜스크립톰은 하나의 세포, 세포 집단, 바람직하게는 암 세포 집단, 또는 특정 시점에서의 주어진 개체의 모든 세포에서 생성된 모든 RNA 분자들의 세트를 의미한다.
"핵산"은 바람직하게는 데옥시리보 핵산(DNA) 또는 리보 핵산(RNA), 더욱 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생성된 분자 및 화학 합성된 분자를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자 및 선형 또는 공유결합적으로 환형으로 폐쇄된 분자로서 존재할 수 있다. 핵산은 분리될 수 있다. "분리된 핵산"이란 용어는 핵산이 (i) 시험관내에서, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되거나, (iii) 예를 들어, 절단 및 겔 전기 영동에 의한 분리에 의해 정제되거나, (iv) 예를 들어 화학 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 핵산은, 특히 DNA 주형으로부터의 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA의 형태로, 세포 내로의 도입, 즉, 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 더욱이, RNA는 안정화 서열, 캡핑, 및 폴리아데닐화에 의한 적용 전에 변형될 수 있다.
"유전 물질"이라는 용어는 DNA 또는 RNA인 분리된 핵산, 이중 나선의 절편, 염색체의 절편, 또는 유기체 또는 세포의 전체 게놈, 특히 그의 엑솜 또는 트랜스크립톰을 지칭한다.
"돌연변이"라는 용어는 기준과 비교되는 핵산 서열의 변화 또는 차이(뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실)를 지칭한다. "체세포 돌연변이"는 생식 세포(정자 및 난자)를 제외한 신체의 임의의 세포에서 발생할 수 있고, 이에 따라 자손에게 전달되지 않는다. 이러한 변경은 (항상 그런 것은 아니지만) 암 또는 다른 질병을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 비동의(non-synonymous) 돌연변이이다. "비동의 돌연변이"라는 용어는 번역 산물에서 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화를 가져오는, 바람직하게는 네오에피토프의 형성을 가져오는 돌연변이, 바람직하게는 뉴클레오타이드 치환을 지칭한다.
"돌연변이"라는 용어는 점 돌연변이, 인델(indel), 융합, 염색체파열(chromothripsis) 및 RNA 편집을 포함한다.
"인델"이라는 용어는 뉴클레오타이드의 공동 국재화된(colocalized) 삽입 및 결실 및 뉴클레오타이드의 순 증가 또는 순 손실을 초래하는 돌연변이로 정의되는 특수한 돌연변이 종류를 칭한다. 게놈의 코딩 영역에서, 인델의 길이가 3의 배수가 아닌 경우, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이를 일으킨다. 인델은 점 돌연변이와 대조를 이룰 수 있는데; 인델이 서열로부터 뉴클레오타이드를 삽입 및 결실시키는 것이라면, 점 돌연변이는 뉴클레오타이드 중 하나를 대체하는 치환의 형태이다.
융합은 2 개의 이전에 분리된 유전자로부터 형성된 하이브리드 유전자를 생성시킬 수 있다. 이는 전좌, 간질성 결실(interstitial deletion) 또는 염색체 역위의 결과로 발생할 수 있다. 종종, 융합 유전자는 종양 유전자이다. 종양발생성 융합 유전자는 2 개의 융합 파트너로부터의 새로운 또는 상이한 기능을 갖는 유전자 산물을 가져올 수 있다. 대안적으로, 원종양 유전자(proto-oncogene)는 강한 프로모터에 융합되고, 이에 의해 종양발생 기능이 업스트림 융합 파트너의 강한 프로모터에 의해 유발된 상향 조절에 의해 기능하도록 설정된다. 종양발생성 융합 전사체는 또한 트랜스-스플라이싱(trans-splicing) 또는 리드-쓰루(read-through) 사건에 의해 유발될 수 있다.
"염색체파열"이라는 용어는 단일의 파괴적인 사건을 통해 게놈의 특정 영역이 산산조각 나고 이어서 함께 꿰어지는 유전 현상을 지칭한다.
"RNA 편집" 또는 "RNA 편집작업"이라는 용어는 RNA 분자 내의 정보 내용이 염기 구성의 화학적 변화를 통해 변경되는 분자 작용을 지칭한다. RNA 편집작업은 시티딘(C)에서 우리딘(U)으로 그리고 아데노신(A)에서 이노신(I)으로의 탈아미노화와 같은 뉴클레오사이드 변형뿐만 아니라 비주형(non-templated) 뉴클레오타이드 첨가 및 삽입을 포함한다. mRNA에서의 RNA 편집작업은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 효과적으로 변경시켜서 게놈 DNA 서열에 의해 예측된 것과 달라지게 한다.
"암 돌연변이 시그니처"라는 용어는 비암성 기준 세포와 비교할 때 암 세포에 존재하는 일련의 돌연변이를 지칭한다.
본 발명과 관련하여 "기준"은 종양 표본으로부터 얻어진 결과와 상관 관계를 갖게 하고 이와 비교하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, "기준"은, 환자 또는 하나 이상의 상이한 개체, 바람직하게는 건강한 개체, 특히 같은 종의 개체로부터 얻어지는, 하나 이상의 정상 표본, 특히 암 질환에 의해 영향을 받지 않는 표본을 기초로 얻어질 수 있다. "기준"은 충분히 많은 수의 정상 표본을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.
질병 특이적 돌연변이는 임의의 적합한 시퀀싱 방법에 의해 결정될 수 있으며, 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing, NGS) 기술이 바람직하다. 3 세대 시퀀싱 방법은 방법의 시퀀싱 단계를 빠르게 하기 위해 장래에 NGS 기술을 대체할 수 있다. 명확히 하기 위해, 본 발명과 관련하여 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"라는 용어는 상거(Sanger) 화학으로 알려진 "통상적인" 시퀀싱 방법과 대조적으로 전체 게놈을 작은 조각으로 분해함으로써 전체 게놈을 따라 핵산 주형을 무작위로 병렬적으로 판독하는 모든 신규한 고처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 그러한 NGS 기술(대용량 병렬 시퀀싱 기술로도 알려져 있음)은 매우 짧은 시간 내에, 예를 들어 1 주 내지 2 주 이내에, 바람직하게는 1 일 내지 7 일 이내에 또는 가장 바람직하게는 24 시간 미만 이내에 전체 게놈, 엑솜, 트랜스크립톰(게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(methylome)(게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 전달할 수 있고, 원칙적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 가능하게 한다. 상업적으로 이용 가능하거나 문헌에 언급되어 있는 다수의 NGS 플랫폼이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는데, 예를 들어 문헌[Zhang et al., 2011, The impact of next-generation sequencing on genomics, J. Genet Genomics 38(3):95-109] 또는 문헌[Voelkerding et al., 2009, Next generation sequencing: From basic research to diagnostics, Clinical chemistry 55:641-658]에 상세히 기재된 것들이 있다.
바람직하게는, DNA 및 RNA 제제는 NGS를 위한 출발 물질의 역할을 한다. 그러한 핵산은 생물학적 물질, 예를 들어 새로운, 급속 냉동된 또는 포르말린-고정 파라핀 포매된 종양 조직(FFPE), 새로 분리된 세포, 또는 환자의 말초 혈액에 존재하는 CTC로부터의 생물학적 물질과 같은 샘플로부터 쉽게 얻어질 수 있다. 정상적인 비돌연변이 게놈 DNA 또는 RNA는 정상의 체세포 조직으로부터 추출될 수 있지만, 본 발명과 관련하여 생식선 세포가 바람직하다. 생식선 DNA 또는 RNA는 비혈액학적 악성종양 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출된다. FFPE 조직 또는 새로 분리된 단일 세포로부터 추출된 핵산은 고도로 단편화되어 있지만, NGS 적용을 위해 적합하다.
엑솜 시퀀싱을 위한 몇몇 표적화된 NGS 방법은 문헌(검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Teer and Mullikin, 2010, Human Mol Genet 19(2):R145-51] 참조함)에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본 발명과 함께 사용될 수 있다. (예를 들어, 게놈 포획, 게놈 분할, 게놈 농축 등으로 설명된) 많은 이러한 방법은 하이브리드화 기술을 이용하고, 어레이 기반(예를 들어, 문헌[Hodges et al., 2007, Nat. Genet. 39:1522-1527]) 및 액체 기반(예를 들어, 문헌[Choi et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci USA 106:19096-19101]) 하이브리드화 접근법을 이용한다. DNA 샘플 준비 및 후속 엑솜 포획을 위한 상업용 키트가 또한 이용 가능한데, 예를 들어, Illumina Inc.(미국 캘리포니아주 샌디애고 소재)는 TruSeqTM DNA 샘플 준비 키트(Sample Preparation Kit) 및 엑솜 농축 키트(Exome Enrichment Kit) TruSeqTM 엑솜 농축 키트를 제공한다.
예를 들어 종양 샘플의 서열을 생식선 샘플의 서열과 같은 기준 샘플의 서열과 비교할 때 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 검출함에 있어서 위양성 결과의 수를 줄이기 위해, 이러한 샘플 유형 중 하나 또는 둘 모두의 복제물에서 서열을 결정하는 것이 바람직하다. 따라서, 생식선 샘플의 서열과 같은 기준 샘플의 서열이 2 회, 3 회 또는 그 초과의 횟수로 결정되는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 부가적으로, 종양 샘플의 서열은 2 회, 3 회, 또는 그 초과의 횟수로 결정된다. 생식선 샘플의 서열과 같은 기준 샘플의 서열 및/또는 종양 샘플의 서열을 1 회 초과의 횟수로 결정하는 것이 또한 가능할 수 있는데, 이는 게놈 DNA의 서열을 적어도 1 회 결정하고, 상기 기준 샘플 및/또는 상기 종양 샘플의 RNA의 서열을 적어도 1 회 결정함으로써 그렇게 할 수 있다. 예를 들어, 생식선 샘플과 같은 기준 샘플의 복제물 사이의 차이를 결정함으로써, 통계적 양으로서의 위양성(FDR) 체세포 돌연변이의 예상 비율이 추정될 수 있다. 샘플의 기술적인 반복은 동일한 결과를 생성시켜야 하고, 이 "동일 대 동일 비교"에서의 임의의 검출된 돌연변이는 위양성이다. 특히, 기준 샘플에 비한 종양 샘플에서 체세포 돌연변이 검출에 대한 오류 발견율을 결정하기 위해, 기준 샘플의 기술적 반복이 위양성의 수를 추정하기 위한 기준으로 사용될 수 있다. 또한, 다양한 품질 관련 메트릭(예를 들어, 적용 범위 또는 SNP 품질)이 기계 학습 접근법을 사용하는 단일 품질 점수로 합쳐질 수 있다. 주어진 체세포 변이에 대해, 초과 품질 점수를 갖는 다른 모든 변이가 계수될 수 있으며, 이는 데이터 세트 내의 모든 변이의 순위를 매길 수 있게 한다.
본 발명과 관련하여, "RNA"라는 용어는 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하고 바람직하게는 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오타이드 잔기로 구성된 분자와 관련된다. "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오타이드와 관련된다. "RNA"라는 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA와 같은 분리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생적인 RNA와 달라지는 변형된 RNA와 같은 재조합적으로 생성된 RNA를 포함한다. 그러한 변경은, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서, 예컨대 RNA의 말단(들) 또는 내부로의 비뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오타이드는 비자연 발생적인 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드와 같은 비표준 뉴클레오타이드를 또한 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생적인 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.
"RNA"라는 용어는 "mRNA"를 포함하고, 바람직하게는 "mRNA"와 관련된다. "mRNA"라는 용어는 "메신저-RNA"를 의미하고, DNA 주형을 사용하여 생성될 수 있고 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 "전사체"와 관련된다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포 내에서 그리고 시험관내에서 단지 제한된 반감기를 갖는다. 본 발명과 관련하여, mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 다양한 시험관내 전사 키트가 존재한다.
RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, RNA는 안정화될 수 있고, 그의 번역은 안정화 효과를 갖는 하나 이상의 변형에 의해 및/또는 RNA의 번역 효율을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 PCT/EP2006/009448호에 기재되어 있다. 본 발명의 구체예에 사용된 RNA의 발현을 증가시키기 위해, RNA는, 바람직하게는 발현되는 펩타이드 또는 단백질의 서열을 변경함이 없이, 코딩 영역, 즉, 발현된 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열 내에서 변형됨으로써, GC 함량을 증가시켜서 mRNA 안정성을 증가시키고, 코돈 최적화를 수행하여 세포에서 번역을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 RNA와 관련하여 "변형"이라는 용어는 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 그러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타아제로 처리함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA는 그의 안정성을 증가시키고 그리고/또는 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서, 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서, 슈도우리딘은 부분적으로 또는 완전히 우리딘으로 치환된다. 바람직한 구체예에서, 변형된 리보뉴클레오타이드를 갖는 본 발명에 따른 RNA는 여전히 Toll 유사 수용체 효능제로서 작용하는 능력을 갖는다.
일 구체예에서, "변형"이라는 용어는 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 갖는 RNA를 제공하는 것과 관련된다. "5'-캡"이라는 용어는 mRNA 분자의 5' 말단 상에서 발견되는 캡 구조를 지칭하고, 일반적으로 특이한 5' 대 5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. "통상적인 5'-캡"이라는 용어는 자연 발생적인 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, "5'-캡"이라는 용어는 RNA 캡 구조와 유사하고, 바람직하게는 생체내에서 및/또는 세포 내에서 RNA에 부착되는 경우 RNA를 안정화시키고 그리고/또는 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형되는 5'-캡 유사체를 포함한다.
RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 동시 전사적으로 혼입되거나, RNA는, 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어 우두 바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후에 RNA에 부착될 수 있다.
RNA는 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 RNA의 추가의 변형은 자연 발생적인 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절단 또는 5'- 또는 3'-비번역 영역(UTR)의 변경, 예컨대, 상기 RNA의 코딩 영역과 관련되지 않은 UTR의 도입, 예를 들어 글로빈 유전자, 예컨대 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더욱 바람직하게는 인간 베타-글로빈으로부터 유래된 하나 이상, 바람직한 2 개의 3'-UTR 카피에 의한 기존 3'-UTR의 교환 또는 그의 삽입일 수 있다.
언마스킹된(unmasked) 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스킹된(masked) 폴리-A 서열을 갖는 RNA보다 더욱 효율적으로 번역된다. "폴리(A) 꼬리" 또는 "폴리-A 서열"이라는 용어는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐(A) 잔기의 서열과 관련되고, "언마스킹된 폴리-A 서열"은 RNA 분자의 3' 말단에 있는 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 끝나고 폴리-A 서열의 3' 말단, 즉, 다운스트림에 위치한 A 이외의 뉴클레오타이드가 뒤따르지 않음을 의미한다. 또한, 약 120 개 염기 쌍의 긴 폴리-A 서열은 최적의 전사체 안정성 및 RNA의 번역 효율을 가져온다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위해, RNA는, 바람직하게는 10 개 내지 500 개, 더욱 바람직하게는 30 개 내지 300 개, 더욱더 바람직하게는 65 개 내지 200 개, 특히 100 개 내지 150 개의 아데노신 잔기의 길이를 갖는 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리-A 서열은 약 120 개의 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 안정성 및/또는 발현을 추가로 증가시키기 위해, 폴리-A 서열은 언마스킹될 수 있다.
또한, 3'-비번역 영역(UTR)의 RNA 분자의 3'-비번역 영역 내로의 혼입은 번역 효율의 향상을 가져올 수 있다. 상승 효과는 그러한 3'-비번역 영역 중 둘 이상을 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 3'-비번역 영역은 그것이 도입되는 RNA에 대해 자가 또는 이종일 수 있다. 하나의 특정 구체예에서, 3'-비번역 영역은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래된다.
상기 기술된 변형의 조합, 즉, 폴리-A 서열의 혼입, 폴리-A 서열의 언마스킹 및 하나 이상의 3'-비번역 영역의 혼입은 RNA의 안정성 및 번역 효율의 증가에 상승적인 영향을 미친다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"와 관련된다. "반감기"는 분자의 활동, 양, 또는 수의 절반을 제거하는데 필요한 시간과 관련된다. 본 발명과 관련하여, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현의 지속 시간"에 영향을 미칠 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 연장된 시간 동안 발현될 것으로 예상될 수 있다.
물론, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 감소시키는 것이 요망되는 경우, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는 전술한 바와 같은 요소의 기능을 간섭하도록 RNA를 변형시키는 것이 가능하다.
"발현"이라는 용어는 그의 가장 일반적인 의미로 사용되고, 예를 들어 전사 및/또는 번역에 의한, RNA 및/또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 생성을 포함한다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 특히 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 생성과 관련된다. 이는 또한 핵산의 부분적인 발현을 포함한다. 더욱이, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다.
발현이라는 용어는 또한 "비정상적 발현" 또는 "이상 발현"을 포함한다. "비정상적 발현" 또는 "이상 발현"은 기준, 예를 들어 종양 항원과 같은 특정 단백질의 비정상적 또는 이상 발현과 관련된 질병에 걸리지 않는 대상체의 상태와 비교하여 발현이 변경, 바람직하게는 증가되는 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100% 또는 그 초과의 증가를 지칭한다. 일 구체예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
"특이적으로 발현되는"이라는 용어는 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 위 점막에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 위 점막에서 주로 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 다른 조직 또는 기관 유형에서 유의한 정도로 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 오로지 위 점막의 세포에서 발현되고 고환과 같은 임의의 다른 조직에서는 유의하게 더 적은 정도로 발현되는 단백질은 위 점막의 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 하나 초과의 조직 유형 또는 기관에서, 예컨대 2 개 또는 3 개의 조직 유형 또는 기관에서 정상 조건 하에 또한 특이적으로 발현될 수 있지만, 바람직하게는 3 개 이하의 조직 또는 기관 유형에서 특이적으로 발현될 수 있다. 이 경우, 종양 항원은 이후 이들 기관에서 특이적으로 발현된다. 예를 들어, 종양 항원이, 바람직하게는 폐 및 위에서 대략 동등한 정도로, 정상 조건 하에 발현되는 경우, 상기 종양 항원은 폐 및 위에서 특이적으로 발현되는 것이다.
본 발명과 관련하여, "전사"라는 용어는 DNA 서열 내의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정과 관련된다. 후속하여, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, "전사"라는 용어는 "시험관내 전사"를 포함하며, "시험관내 전사"라는 용어는 RNA, 특히 mRNA가, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 무세포 시스템에서 시험관내에서 합성되는 과정과 관련된다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 명명되고, "벡터"라는 용어에 포함된다. 본 발명에서 사용되는 RNA는 바람직하게는 시험관내 전사 RNA(IVT-RNA)이고, 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 얻어질 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 중합효소의 특정 예는 T7, T3, 및 SP6 RNA 중합효소이다. 바람직하게는, 시험관내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 제어된다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 이를 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입함으로써 얻어질 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻어질 수 있다.
"번역"이라는 용어는 메신저 RNA의 가닥이 아미노산의 서열의 조립을 지시하여 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 만드는 세포의 라이보솜 내 과정과 관련된다.
본 발명과 관련하여 핵산과 기능적으로 연결될 수 있는 발현 제어 서열 또는 조절 서열은 그 핵산과 관련하여 동종이거나 이종일 수 있다. 코딩 서열과 조절 서열은, 코딩 서열의 전사 또는 번역이 조절 서열의 제어 하에 있거나 조절 서열의 영향 하에 있게 되도록 함께 공유 결합되는 경우 "기능적으로" 함께 연결된다. 코딩 서열과 조절 서열의 기능적 결합에 따라 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역될 경우, 조절 서열의 유도는 코딩 서열에서의 판독 프레임 시프트 또는 코딩 서열의 요망되는 단백질 또는 펩타이드로의 번역 불능을 야기하지 않고 코딩 서열의 전사를 가져온다.
"발현 제어 서열" 또는 "조절 서열"이라는 용어는, 본 발명과 관련하여, 핵산의 전사 또는 유래된 RNA의 번역을 제어하는, 프로모터, 라이보솜 결합 서열 및 다른 제어 요소를 포함한다. 일 구체예에서, 조절 서열은 제어절될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 전사 또는 번역의 개시에 관여하는 5'-비전사 서열 및 5'-비번역 및 3'-비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 특히, 5'-비전사 조절 서열은 기능적으로 결합된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 업스트림 활성제 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 세포에서 발현시키고자 하는 RNA가 상기 세포 내로 도입된다. 본 발명에 따른 방법의 일 구체예에서, 세포 내로 도입될 RNA는 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 얻어진다.
"~을 발현할 수 있는 RNA" 및 "~을 코딩하는 RNA"과 같은 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여, 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우 RNA가 발현되어 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, RNA는 세포 번역 기구와 상호 작용하여 그것이 발현할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
"전달", "도입" 또는 "형질감염"과 같은 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 핵산, 특히 외인성 또는 이종성 핵산, 특히 RNA를 세포 내로 도입시키는 것과 관련된다. 본 발명에 따르면, 세포는 기관, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 핵산의 투여는 나출형(naked) 핵산으로서 또는 투여 시약과 병용하여 달성된다. 바람직하게는, 핵산의 투여는 나출형 핵산의 형태이다. 바람직하게는, RNA는 RNase 저해제와 같은 안정화 물질과 병용하여 투여된다. 본 발명은 또한 연장된 시간 동안 지속적인 발현을 가능하게 하기 위해 세포 내로의 핵산의 반복 도입을 고려한다.
세포는, 예를 들어 RNA와 복합체를 형성하거나 RNA가 봉입되거나 캡슐화된 소포를 형성함으로써 RNA와 회합하여 나출형 RNA와 비교하여 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있는 임의의 담체로 형질감염될 수 있다. 유용한 담체는, 예를 들어, 지질 함유 담체, 예컨대 양이온성 지질, 리포솜, 특히 양이온성 리포솜, 및 미셀, 및 나노 입자를 포함한다. 양이온성 지질은 음 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 임의의 양이온성 지질이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 세포, 특히 생체내에 존재하는 세포 내로 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA의 도입은 세포에서 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 가져온다. 특정 구체예에서, 특정 세포로의 핵산의 표적화가 바람직하다. 그러한 구체예에서, 세포로의 핵산의 투여를 위해 적용되는 담체(예를 들어, 레트로바이러스 또는 리포솜)는 표적화 분자를 나타낸다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자가 핵산 담체 내로 혼입되거나 이와 결합될 수 있다. 핵산이 리포솜에 의해 투여되는 경우, 표적화 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위해 세포내이입과 관련된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 리포솜 제형 내로 혼입될 수 있다. 그러한 단백질은 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하는 단백질 등을 포함한다.
"세포" 또는 "숙주 세포"라는 용어는 바람직하게는 무손상 세포, 즉, 효소, 세포 소기관, 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 무손상 막을 갖는 세포이다. 무손상 세포는 바람직하게는 생존 가능한 세포, 즉, 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 바람직하게는, 상기 용어는 외인성 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 임의의 세포와 관련된다. "세포"라는 용어는 원핵 세포(예를 들어, 대장균) 또는 진핵 세포(예를 들어, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, HEK293 세포, HELA 세포, 효모 세포, 및 곤충 세포)를 포함한다. 외인성 핵산은 세포 내부에서 (i) 그 자체로 자유롭게 분산되거나, (ii) 재조합 벡터에 혼입되거나, (iii) 숙주 세포 게놈 또는 미토콘드리아 DNA 내로 통합된 상태로 발견될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 및 영장류로부터의 세포와 같은 포유 동물 세포가 특히 바람직하다. 세포는 많은 수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있고, 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 특정 예는 각화 세포, 말초 혈액 백혈구, 골수 줄기 세포, 및 배아 줄기 세포를 포함한다. 추가의 구체예에서, 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구, 또는 대식세포이다.
핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현한다.
"클론 확장"이라는 용어는 특정 엔티티가 증식되는 과정을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 이 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되고 증식하여 상기 항원을 인식하는 특이적 림프구가 증폭되는 면역학적 응답과 관련하여 사용된다. 바람직하게는, 클론 확장은 림프구의 분화를 가져온다.
"감소" 또는 "저해"와 같은 용어는, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 수준의 전반적인 감소를 유발하는 능력과 관련된다. "저해한다"라는 용어 또는 유사한 문구는 완전한 또는 본질적으로 완전한 저해, 즉, 0으로 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
바람직하게는 "증가", "향상", "촉진", 또는 "연장"과 같은 용어는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 100%, 바람직하게는 적어도 200%, 특히 적어도 300% 만큼의 증가, 향상, 촉진 또는 연장과 관련된다. 이러한 용어는 0 또는 측정 불가능하거나 검출 불가능한 수준에서 0보다 큰 수준 또는 측정 가능하거나 검출 가능한 수준으로의 증가, 향상, 촉진 또는 연장과 또한 관련될 수 있다.
본 발명에 따르면, "펩타이드"라는 용어는, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된, 2 개 이상, 바람직하게는 3 개 이상, 바람직하게는 4 개 이상, 바람직하게는 6 개 이상, 바람직하게는 8 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 바람직하게는 13 개 이상, 바람직하게는 16 개 이상, 바람직하게는 21 개 이상, 그리고 바람직하게는 최대 8 개, 10 개, 20 개, 30 개, 40 개 또는 50 개, 특히 100 개의 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. "폴리펩타이드" 또는 "단백질"이라는 용어는 큰 펩타이드, 바람직하게는 100 개가 넘는 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 지칭하지만, 일반적으로 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 동의어이고 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명에 따르면, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련된 용어 "변형" 또는 "서열 변화"는 야생형 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 서열과 같은 모(parental) 서열과 비교되는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 서열 변화와 관련된다. 이 용어는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및 아미노산 치환 변이체, 바람직하게는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 이러한 모든 서열 변화는 잠재적으로 새로운 에피토프를 생성시킬 수 있다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서의 단일 또는 2 개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다.
아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개, 또는 그 초과의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개, 또는 그 초과의 아미노산의 제거를 특징으로 한다.
아미노산 치환 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 또 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에서의 시험을 위해 사용되는 변형 또는 변형된 펩타이드는 변형을 포함하는 단백질로부터 유래될 수 있다.
"유래된"이라는 용어는 본 발명에 따르면 특정 엔티티, 특히 특정 펩타이드 서열이 그것이 유래되는 대상에 존재함을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특정 서열 영역의 경우, "유래된"은 관련 아미노산 서열이 그것이 존재하는 아미노산 서열로부터 유래됨을 특별히 의미한다.
면역 요법제는, 일단 본원에 기술된 방법에 의해 적합한 용량이 결정되면, 면역 요법제를 적합한 용량으로 투여함으로써 질병, 예를 들어 항원을 발현하고 항원 펩타이드를 제시하는 질병 세포의 존재를 특징으로 하는 질병을 가진 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 질병은 암 질환이다. 본원에 기재된 면역 요법제는 또한 본원에 기재된 질병을 예방하기 위한 면역화 또는 백신 접종에 사용될 수 있다.
그러한 하나의 면역 요법제는 암 세포에서만 발현되는 네오에피토프에 기초하여 고안된 암 백신과 같은 백신이다.
본 발명에 따르면, "백신"이라는 용어는, 투여시 병원체 또는 암 세포와 같은 질병 세포를 인식하고 공격하는 면역 응답, 특히 세포성 면역 응답을 유도하는 약제학적 제제(약제학적 조성물) 또는 생성물과 관련된다. 백신은 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. "개인 맞춤형 암 백신" 또는 "개체 맞춤형 암 백신"이라는 용어는 특정 암 환자와 관련되고, 암 백신이 개별 암 환자의 필요 또는 특수 상황에 맞추어짐을 의미한다.
본 발명에 따라 제공되는 암 백신은 환자에게 투여될 때 환자의 종양에 특이적인 T 세포를 자극, 프라이밍 및/또는 확장시키기 위해 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제공할 수 있다. T 세포는 바람직하게는 T 세포 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 유도된다. 따라서, 바람직하게는 본원에 기재된 백신은 클래스 Ⅰ MHC에 의한 하나 이상의 종양 관련 신생항원(neoantigen)의 제시를 특징으로 하는 암 질환에 대해 세포성 응답, 바람직하게는 세포독성 T 세포 활성을 유도하거나 촉진할 수 있다. 본원에 제공된 백신은 암 특이적 돌연변이를 표적화하기 때문에 환자의 종양에 특이적일 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 백신은 바람직하게는, 환자에게 투여될 때 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 T 세포 에피토프(네오에피토프, 적합한 네오에피토프, 본원에서 확인된 적합한 네오에피토프들의 조합), 예컨대 2 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상, 그리고 바람직하게는 최대 60 개, 최대 55 개, 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 T 세포 에피토프 또는 적합한 에피토프인 것으로 예측된 변형된 펩타이드를 제공하는 백신과 관련된다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의한 이러한 에피토프의 제시는, 바람직하게는, MHC에 결합될 때 에피토프를 표적화하고, 이에 따라 환자의 종양, 바람직하게는 원발성 종양뿐만 아니라 종양 전이를 표적화하고, T 세포 에피토프가 유래되는 항원을 발현하고, 종양 세포의 표면 상에 동일한 에피토프를 제시하는 T 세포를 가져온다.
암 백신 접종을 위해 확인된 아미노산 변형 또는 에피토프를 함유하는 변형된 펩타이드의 유용성을 결정하기 위하여 추가 단계가 취해질 수 있다. 따라서, 추가 단계는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 변형이 공지되거나 예측된 MHC 제시 에피토프에 위치하는지의 평가, (ii) 변형이 MHC 제시 에피토프에 위치하는지에 대한 시험관내 및/또는 인 실리코(in silico) 시험, 예를 들어, 변형이 MHC 제시 에피토프로 처리되고/되거나 MHC 제시 에피토프로서 제시되는 펩타이드 서열의 일부인지에 대한 시험, 및 (iii) 예상된 변형된 에피토프가, 특히 그의 천연 서열 환경에서 존재할 때, 예를 들어 자연 발생적인 단백질에서 상기 에피토프를 또한 플랭킹하는 아미노산 서열에 의해 플랭킹될 때, 그리고 항원 제시 세포에서 발현될 때, 원하는 특이성을 갖는 환자의 T 세포와 같은 T 세포를 자극할 수 있는지에 대한 시험관내 시험. 그러한 플랭킹 서열은 각각 3 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 그리고 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있고, N 말단 및/또는 C 말단에서 에피토프 서열을 플랭킹할 수 있다.
본 발명에 따라 결정된 변형된 펩타이드는 암 백신 접종을 위한 에피토프로서의 그의 유용성에 대해 등급화될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 확인된 변형된 펩타이드를 분석하고, 제공될 각각의 백신에서 그의 유용성에 대해 선택하는 수동 또는 컴퓨터 기반 분석 공정이 사용될 수 있다. 바람직한 구체예예에서, 상기 분석 공정은 계산 알고리즘 기반 공정이다. 바람직하게는, 상기 분석 공정은 에피토프를 면역원성일 수 있는 그의 능력의 예측에 따라 결정하고/하거나 등급화하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라 확인되고 백신에 제공되는 에피토프는 상기 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 폴리에피토프성 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 특히 RNA의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 에피토프는 백신 서열의 형태의 폴리펩티드에 존재할 수 있고, 즉, 그의 천연 서열 환경에서 존재할 수 있는데, 예를 들어 자연 발생적인 단백질에서 상기 에피토프를 또한 플랭킹하는 아미노산 서열에 의해 플랭킹되어 있을 수 있다. 그러한 플랭킹 서열은 각각 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 그리고 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있고, N 말단 및/또는 C 말단에서 에피토프 서열을 플랭킹할 수 있다. 따라서, 백신 서열은 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상, 35 개 이상, 40 개 이상, 그리고 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 에피토프 및/또는 백신 서열은 폴리펩타이드에서 헤드-투-테일(head-to-tail)로 배열된다.
일 구체예에서, 본원에서 확인된 에피토프 및/또는 백신 서열은 링커, 특히 중성 링커에 의해 이격되어 있다. 본 발명과 관련하여 사용되는 "링커"라는 용어는 에피토프 또는 백신 서열과 같은 2 개의 펩타이드 도메인을 연결하기 위해 상기 펩타이드 도메인들 사이에 첨가된 펩타이드와 관련된다. 링커 서열에 관한 특별한 제한은 없다. 그러나, 링커 서열은 2 개의 펩타이드 도메인 사이의 입체 장애를 감소시키고, 잘 번역되고, 에피토프의 처리를 지원하거나 가능하게 하는 것이 바람직하다. 또한, 링커는 면역원성 서열 요소를 갖지 않거나 거의 갖지 않아야 한다. 링커는, 원하지 않는 면역 반응을 생성할 수 있는, 인접한 에피토프 사이의 접점 봉합부(juction suture)에서 생성된 것과 같은 비내인성 에피토프를 바람직하게는 생성하지 않아야 한다. 따라서, 바람직하게는 폴리에피토프성 백신은 원하지 않는 MHC 결합 접점 에피토프의 수를 감소시킬 수 있는 링커 서열을 함유해야 한다. 문헌[Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006)] 및 문헌[Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004)]에서는 글리신 풍부 서열이 프로테아좀 처리를 손상시키고, 이에 따라 글리신 풍부 링커 서열의 사용이 프로테아좀에 의해 처리될 수 있는 링커 함유 펩티드의 수를 최소화시키는 작용을 한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 글리신은 MHC 결합 홈(groove) 위치에서 강한 결합을 저해하는 것으로 관찰되었다(문헌[Abastado et al., 1993, J. Immunol. 151(7):3569-75]). 문헌[Schlessinger et al., 2005, Proteins 61(1):115-26]에서는 아미노산 서열에 포함된 아미노산인 글리신과 세린이 더욱 효율적으로 번역되고 프로테아좀에 의해 처리되는 더 유연한 단백질을 생성시켜서 코딩된 에피토프에 대한 더 나은 접근을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 링커는 각각 3 개 이상, 6 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 그리고 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 농축된 것이다. 바람직하게는, 링커의 아미노산의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 글리신 및/또는 세린이다. 바람직한 일 구체예에서, 링커는 아미노산인 글리신과 세린으로 실질적으로 구성된다. 일 구체예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e 를 포함하며, a, b, c, d 및 e는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택된 수이고, a + b + c + d + e 는 0이 아니고, 바람직하게는 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상이다. 일 구체예에서, 링커는 서열 GGSGGGGSG와 같은 실시예에 기재된 링커 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 폴리에피토프성 폴리펩타이드와 같은 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 폴리펩타이드는 핵산, 바람직하게는 시험관내 전사 RNA 또는 합성 RNA와 같은 RNA의 형태로 환자에게 투여될 수 있는 면역 요법제이며, 이 핵산은 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에서 발현되어 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, 바람직하게는 핵산, 바람직하게는 시험관내 전사 RNA 또는 합성 RNA와 같은 RNA의 형태의, "폴리에피토프성 폴리펩타이드"라는 용어에 포함되는 하나 이상의 다중에피토프성 폴리펩타이드의 투여가 고려되며, 이 핵산은 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에서 발현되어 하나 이상의 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 1 개 초과의 다중에피토프성 폴리펩타이드의 투여의 경우, 상이한 다중에피토프성 폴리펩타이드에 의해 제공되는 적합한 네오에피토프는 상이하거나 부분적으로 중첩될 수 있다. 일단 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에 존재하면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 처리되어 본 발명에 따라 확인되는 적합한 네오에피토프를 생성시킨다. 본 발명에 따라 제공되는 백신의 투여는 MHC 제시 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4+ 헬퍼 T 세포 응답을 유도할 수 있는 MHC 클래스 II 제시 에피토프를 제공할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명에 따라 제공되는 백신의 투여는 MHC 제시 네오에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8+ T 세포 응답을 유도할 수 있는 MHC 클래스 I 제시 네오에피토프를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제공되는 백신의 투여는 (공지된 네오에피토프 및 본 발명에 따라 확인된 네오에피토프를 포함하는) 하나 이상의 네오에피토프뿐만 아니라 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않지만 암 세포에 의해 발현되고, 바람직하게는 암 세포에 대한 면역 응답, 바람직하게는 암 특이적 면역 응답을 유도하는, 하나 이상의 에피토프를 제공할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 제공되는 백신의 투여는 MHC 클래스 II 제시 에피토프이고/이거나 MHC 제시 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4+ 헬퍼 T 세포 응답을 유도할 수 있는 네오에피토프뿐만 아니라, MHC 클래스 I 제시 에피토프이고/이거나 MHC 제시 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8+ T 세포 응답을 유도할 수 있는, 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프를 제공한다. 일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프는 종양 항원으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 네오에피토프 및 에피토프는 암의 치료에서 상승 효과를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 제공되는 백신은 세포독성 및/또는 헬퍼 T 세포 응답의 폴리에피토프성 자극에 유용하다.
본 발명에 따라 제공되는 백신은 재조합 백신일 수 있다.
본 발명과 관련하여 "재조합"이라는 용어는 "유전 공학을 통해 만들어진"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 재조합 폴리펩타이드와 같은 "재조합 엔티티"는 자연적으로 발생하지 않고, 바람직하게는 자연에서 결합되지 않은 아미노산 또는 핵산 서열과 같은 엔티티들의 조합의 결과이다. 예를 들어, 본 발명과 관련하여 재조합 폴리펩타이드는, 예를 들어 펩타이드 결합 또는 적절한 링커에 의해 함께 융합된, 네오에피토프와 같은 몇몇 아미노산 서열 또는 상이한 단백질로부터 유래된 백신 서열 또는 동일한 단백질의 상이한 부분을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "자연 발생적"이라는 용어는 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, (바이러스를 포함하는) 유기체에 존재하고 자연에서 원천으로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 펩타이드 또는 핵산은 자연 발생적이다.
본 발명에 따르면, 용어 "질병"은 암 질환, 특히 본원에 기재된 암 질환의 형태를 포함하는 임의의 병리학적 상태를 지칭한다.
"정상"이라는 용어는 건강한 상태 또는 건강한 대상체 또는 조직의 상태, 즉, 비병리학적 상태를 지칭하며, "건강한"은 바람직하게는 비암성임을 의미한다.
"항원을 발현하는 세포를 수반하는 질병"은 질병 조직 또는 기관의 세포에서 항원의 발현이 검출됨을 의미한다. 질병 조직 또는 기관의 세포에서의 발현은 건강한 조직 또는 기관의 상태와 비교하여 증가될 수 있다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1,000%, 적어도 10,000% 또는 심지어 그 초과만큼의 증가를 지칭한다. 일 구체예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 항원을 발현하는 세포를 수반하거나 이와 관련된 질병은 암 질환을 포함한다.
암(의학 용어: 악성 신생물)은 세포의 군이 제어되지 않은 성장(정상적인 한계를 넘어서는 분열), 침습(인접 조직에 대한 침입과 그의 파괴), 및 때때로 전이(림프 또는 혈액을 통한 신체의 다른 위치로의 확산)를 나타내는 질병의 한 종류이다. 암의 이러한 세 가지 악성 특성은 암을 양성 종양과 차별화시키는데, 양성 종양은 자기 한정적이고 침습하거나 전이하지 않는다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 일부는 백혈병처럼 종양을 형성하지 않는다.
악성 종양은 본질적으로 암과 동의어이다. 악성종양, 악성 신생물 및 악성 종양은 본질적으로 암과 동의어이다.
본 발명에 따르면, "종양" 또는 "종양 질환"이라는 용어는, 바람직하게는 종창 또는 병변을 형성하는, 세포(신생물 세포, 종양형성 세포 또는 종양 세포로도 일컬어짐)의 비정상적인 성장을 지칭한다. "종양 세포"란 급속하고 조제어된 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 개시시킨 자극이 중단된 후에 계속 성장하는 비정상 세포를 의미한다. 종양은 구조적 체계 및 정상 조직과의 기능적 협응의 부분적인 또는 완전한 결여를 나타내고, 통상적으로 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 조직의 구별되는 덩어리를 형성한다.
양성 종양은 암의 모든 세 가지 악성 특성을 결여한 종양이다. 따라서, 정의상, 양성 종양은 무제한적이고 공격적인 방식으로 성장하지 않고, 주변 조직을 침습하지 않고, 비인접 조직으로 확산(전이)되지 않는다.
신생물은 네오플라시아(neoplasia)의 결과로서의 비정상적인 조직의 덩어리이다. 네오플라시아(그리스어로 새로운 성장)는 세포의 비정상적인 증식이다. 세포의 성장은 그 주위의 정상적인 조직의 성장을 초과하고 그와 협응을 이루지 못한다. 성장은 자극의 정지 후에도 동일하게 과도한 방식으로 지속된다. 이는 통상적으로 종괴 또는 종양을 유발한다. 신생물은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있다.
본 발명과 관련하여 "종양의 성장" 또는 "종양 성장"은 종양이 이의 크기를 증가시키는 경향 및/또는 종양 세포가 증식하는 경향과 관련된다.
본 발명의 목적상, "암" 및 "암 질환"이라는 용어는 "종양" 및 "종양 질환"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용된다.
암은 종양과 유사한 세포 유형에 의해 분류되고, 이에 따라 조직은 종양의 기원으로 추정된다. 이들은 각각 조직학 및 위치이다.
본 발명에 따른 "암"이라는 용어는 백혈병, 고환종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 창자암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후과(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들 암의 전이를 포함한다. 그 예로는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 전술한 암 유형 또는 종양의 전이가 있다. 본 발명에 따른 암이라는 용어는 또한 암 전이 및 암의 재발을 포함한다.
"전이"란 암 세포가 그의 원래 부위에서 신체의 또 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이고, 원발성 종양으로부터의 악성 세포의 박리, 세포외 기질의 침습, 체강 및 혈관으로 들어가기 위한 내피 기저막의 침투, 이어서, 혈액에 의해 운반된 후의, 표적 기관의 침윤에 달려있다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양, 즉, 2 차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관신생에 달려있다. 종양 전이는 종종 원발성 종양의 제거 후에도 발생하는데, 이는 종양 세포 또는 성분이 전이 잠재성을 유지하고 발달시킬 수 있기 때문이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 원발성 종양 및 국소적 림프절계로부터 멀리 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"와 관련된다.
2 차 또는 전이성 종양의 세포는 원래의 종양의 세포와 같다. 이는 예를 들어, 난소암이 간으로 전이되면, 2차 종양은 비정상적인 간세포가 아닌 비정상적인 난소 세포로 구성된다. 간에서의 종양은 이후 간암이 아닌 전이성 난소암으로 일컬어진다.
"순환성 종양 세포" 또는 "CTC"라는 용어는 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 박리되어 혈류를 순환하는 세포와 관련된다. CTC는 상이한 조직에서 추가적인 종양(전이)의 후속 성장을 위한 시드(seed)를 구성할 수 있다. 순환성 종양 세포는 전이성 질병을 갖는 환자에서 전혈 1 mL당 1 개 내지 10 개 정도의 CTC의 빈도로 발견된다. CTC를 분리하기 위한 연구 방법이 개발되었다. 여러 연구 방법, 예를 들어 상피 세포가 정상적인 혈액 세포에 부재하는 세포 부착 단백질인 EpCAM을 공통적으로 발현한다는 사실을 이용하는 기법이 CTC를 분리하기 위해 당업계에 기술되어 있다. 면역자성 비드 기반 포획은 자성 입자와 접합된 EpCAM에 대한 항체로 혈액 표본을 처리한 다음 자기장에서 태그가 부착된 세포를 분리하는 것을 포함한다. 이어서 분리된 세포는, 희소한 CTC를 오염성 백혈구와 구별하기 위해, 또 다른 상피 마커인 사이토케라틴뿐만 아니라 일반적인 백혈구 마커인 CD45에 대한 항체로 염색된다. 이 견고하고 반자동화된 접근법은 약 1 CTC/mL의 평균 수율과 0.1%의 순도로 CTC를 확인한다(문헌[Allard et al., 2004, Clin Cancer Res 10:6897-6904]). CTC를 분리하기 위한 두 번째 방법은 EpCAM에 대한 항체로 코팅함으로써 기능성으로 된 80,000 개의 마이크로포스트(micropost)가 내장된 챔버를 통해 전혈을 유동시키는 것을 포함하는 마이크로유체 기반 CTC 포획 장치를 사용한다. 이어서 CTC는 전립선 암의 PSA 나 유방암의 HER2와 같은 사이토케라틴 또는 조직 특이적 마커에 대한 2 차 항체로 염색되고 3 차원 좌표를 따라 다수의 평면에서 마이크로포스트의 자동 스캐닝에 의해 시각화된다. CTC 칩은 50 개 세포/ml의 중간 수율 및 1% 내지 80% 범위의 순도로 환자에서 사이토케라틴 양성 순환성 종양 세포를 확인할 수 있다(문헌[Nagrath et al., 2007, Nature 450:1235-1239]). CTC를 분리하는 또 다른 가능성은 혈액 튜브에서 CTC를 포착, 확인 및 계수하는 Veridex, LLC(미국 뉴저지주 래리턴 소재)의 CellSearchTM 순환성 종양 세포(CTC) 시험을 사용하는 것이다. CellSearchTM 시스템은, 면역자성 표지화와 자동화된 디지털 현미경검사의 조합을 기반으로 하는, 전혈 중의 CTC의 계수를 위해 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 방법이다. 문헌에 기술된 CTC를 분리하는 다른 방법이 존재하며, 이들 모두는 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
재발 또는 반복은 개인이 과거에 영향을 받은 질환에 의해 다시 영향을 받을 때 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질환을 앓았고, 상기 질환에 대해 성공적인 치료를 받았는데 다시 상기 질환이 발병한다면, 상기 새롭게 발병한 질환은 재발 또는 반복으로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 종양 질환의 재발 또는 반복은 원래의 종양 질환 부위에서 발생할 수 있지만 반드시 그러한 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소 종양을 앓았고 성공적인 치료를 받은 경우, 재발 또는 반복은 난소 종양의 발생 또는 난소와 상이한 부위에서의 종양의 발생일 수 있다. 종양의 재발 또는 반복은 또한 원래의 종양의 부위에서뿐만 아니라 원래의 종양의 부위와 상이한 위치에서 종양이 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 원래의 종양은 원발성 종양이고, 원래의 종양의 위치와 상이한 부위에서의 종양은 2 차 또는 전이성 종양이다.
"면역 요법"이라는 용어는 면역 응답을 유도, 향상, 또는 억제함으로써 질병 또는 질환을 치료하는 것과 관련된다. 면역 응답을 유도하거나 증폭시키기 위해 고안된 면역 요법은 활성화 면역 요법으로 분류되는 한편, 면역 응답을 감소시키거나 억제하는 면역 요법은 억제 면역 요법으로 분류된다. "면역 요법"이라는 용어는 항원 면역화 또는 항원 백신 접종, 또는 종양 면역화 또는 종양 백신 접종을 포함한다. 또한 "면역 요법"이라는 용어는, 부적절한 면역 응답이 류마티스성 관절염, 알레르기, 당뇨병 또는 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환과 관련하여 더욱 적절한 것으로 조절되도록 하는, 면역 응답의 조작과 관련된다.
용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은, 예를 들어 치료적 또는 예방적 이유로, 면역 응답을 유도할 목적으로 항원을 개체에게 투여하는 과정을 말한다.
"치료"란 본원에 기술된 바와 같은 면역 요법제 또는 면역 요법제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써, 대상체 내의 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것을 포함하는 질병을 예방 또는 제거하고/하거나; 대상체의 질병을 저지하거나 늦추고/거나; 대상체에서 새로운 질병의 발생을 저해하거나 늦추고/거나; 현재 질병에 걸려 있거나 이전에 질병에 걸린 적이 있는 대상체에서 증상의 빈도 또는 중증도 및/또는 반복을 감소시키고/거나; 대상체의 수명을 연장, 즉, 증가시키는 것을 의미한다. 특히, "질병의 치료"라는 용어는 질병 또는 그의 증상의 치유, 지속 기간의 단축, 개선, 예방, 진행 또는 악화의 감속 또는 저해, 또는 발생의 예방 또는 지연을 포함한다.
"위험이 있는"이란 일반적인 집단과 비교하여 질병, 특히 암을 발병할 확률이 보통보다 높은 것으로 확인된 대상체, 즉, 환자를 의미한다. 또한, 질병, 특히 암에 걸린 적이 있거나 현재 걸려 있는 대상체는 질병을 발병할 증가된 위험을 갖는 대상체인데, 이는 그러한 대상체는 계속 질병을 발병할 수 있기 때문이다. 현재 암에 걸려 있거나 암에 걸린 적이 있는 대상체는 또한 암 전이에 대해 증가된 위험을 갖는다.
면역 요법의 예방적 적용, 예를 들어, 면역 요법제 또는 면역 요법제를 포함하는 조성물의 예방적 투여는 바람직하게는 수령자를 질병의 발생으로부터 보호한다. 면역 요법의 치료적 적용, 예를 들어, 면역 요법제의 치료적 투여는 질병의 진행/성장의 저해를 가져올 수 있다. 이는 질병의 진행/성장의 감속, 특히, 바람직하게는 질병의 제거를 가져오는 질병의 진행의 붕괴를 포함한다.
면역 요법은 다양한 기법 중 임의의 것을 이용하여 수행될 수 있으며, 여기서 본원에서 제공되는 작용제는 환자로부터 질병 세포를 제거하는 기능을 한다. 그러한 제거는 환자에서 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 면역 응답을 향상시키거나 유도한 결과로서 일어날 수 있다.
면역 요법제 및 조성물은 단독으로 사용되거나 수술, 방사선 조사, 화학 요법 및/또는 (자가, 동계, 동종이계 또는 비관련) 골수 이식과 같은 통상적인 치료 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
"생체내"라는 용어는 대상자 내의 상황과 관련된다.
"대상체", "개체", "유기체" 또는 "환자"라는 용어는 척추 동물, 특히 포유 동물과 관련되고, 본원에 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, 본 발명과 관련하여 포유 동물은 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등과 같은 가축 포유 동물, 마우스, 토끼, 기니피그 등과 같은 실험 동물뿐만 아니라 동물원의 동물과 같은 포획된 동물이다. 이 용어는 또한 조류(특히, 닭, 오리, 거위, 칠면조와 같은 가축화된 조류) 및 어류(특히, 연어 또는 메기와 같은 양식 어류)와 같은 포유류가 아닌 척추 동물과 관련된다. 본원에 사용된 바와 같은 "동물"이라는 용어는 인간을 또한 포함한다.
"자가"라는 용어는 동일한 대상체로부터 유래되는 임의의 것을 기술하는데 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 대상체로부터 유래되는 조직 또는 기관의 이식을 지칭한다. 그러한 절차는 그렇지 않으면 거부 반응을 초래하는 면역학적 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.
"이종"이라는 용어는 다수의 상이한 요소들로 이루어진 것을 기술하는데 사용된다. 예로서, 한 개체의 골수를 다른 개체 내로 전달하는 것은 이종 이식을 구성한다. 이종 유전자는 대상체 이외의 원천으로부터 유래된 유전자이다.
면역화 또는 백신 접종을 위한 조성물의 일부로서, 바람직하게는 하나 이상의 면역 요법제는 면역 응답을 유도하거나 면역 응답을 증가시키기 위해 하나 이상의 애주번트와 함께 투여된다. "애주번트"라는 용어는 면역 응답을 연장시키거나 향상시키거나 가속시키는 화합물과 관련된다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 애주번트의 첨가없이 그 효과를 발휘한다. 그럼에도 불구하고, 본 출원의 조성물은 임의의 공지된 애주번트를 함유할 수 있다. 애주번트는 오일 에멀젼(예를 들어, 프로인트 애주번트), 무기 화합물(예를 들어, 명반), 세균 생성물(예를 들어, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 독소), 리포솜, 및 면역 자극 복합체와 같은 이질적인 화합물 군을 포함한다. 애주번트의 예는 모노포스포릴-리피드-A(MPL SmithKline Beecham)이다. 사포닌, 예컨대 QS2(SmithKline Beecham), DQS21(QS21, SmithKline Beecham; WO 96/33739호), QS7, QS17, QS18, 및 QS-L1(문헌[So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186]), 불완전 프로인트 애주번트, 완전 프로인트 애주번트, 비타민 E, 몬타니드(montanid), 명반, CpG 올리고뉴클레오타이드(문헌[Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549]), 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생물학적으로 분해 가능한 오일로부터 제조되는 다양한 유중수 에멀젼.
환자의 면역 응답을 자극하는 다른 물질이 또한 투여될 수 있다. 예를 들어, 림프구에 대한 조절 특성으로 인해 백신 접종시 사이토카인을 사용하는 것이 가능하다. 그러한 사이토카인은, 예를 들어, 백신의 보호 작용을 증가시키는 것으로 밝혀진 인터루킨-12(IL-12)(문헌[Hall, 1995, IL-12 at the crossroads, Science 268:1432-1434] 참조), GM-CSF 및 IL-18을 포함한다.
면역 응답을 향상시키는 많은 화합물이 존재하고, 이에 따라 이러한 화합물은 백신 접종에 사용될 수 있다. 상기 화합물은 B7-1 및 B7-2(각각 CD80 및 CD86)와 같은 단백질 또는 핵산의 형태로 제공되는 공동 자극 분자를 포함한다.
본 발명에 따르면, "종양 표본"은 샘플, 예컨대 순환성 종양 세포(CTC)와 같은 종양 또는 암 세포, 특히 체액 및/또는 세포 샘플을 포함하는 조직 샘플을 함유하는 신체 샘플이다. 본 발명에 따르면, "비종양 표본"은 샘플, 예컨대 순환성 종양 세포(CTC)와 같은 종양 또는 암 세포, 특히 체액 및/또는 세포 샘플을 포함하는 조직 샘플을 함유하지 않는 신체 샘플이다. 그러한 신체 샘플은 펀치 생검을 포함한 조직 생검, 및 혈액, 기관지 흡인물, 객담, 소변, 대변 또는 다른 체액을 채취하는 것과 같은 통상적인 방식으로 얻어질 수 있다. 본 발명에 따르면, "샘플"이라는 용어는 처리된 샘플, 예컨대 생물학적 샘플의 분획 또는 분리물, 예를 들어 핵산 또는 세포 분리물을 또한 포함한다.
본원에 기재된 면역 요법제 및 그의 조성물은 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하는 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 경피로 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 투여는 림프절 내로의 주사에 의한 것과 같이 결절내로 수행된다. 다른 투여 형태는 본원에 기재된 핵산에 의한 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포의 시험관내 형질감염에 이은 항원 제시 세포의 투여를 고려한다.
"약제학적으로 허용되는"이란 용어는 약제학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 담체 및 선택적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
"부형제"라는 용어는 결합제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 향료, 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 약제학적 조성물 내의 모든 물질을 나타내고자 한다.
"희석제"라는 용어는 희석시키고/거나 묽게 만드는 작용제와 관련된다. 더욱이, "희석제"라는 용어는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매질 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
"담체"라는 용어는 인간에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제와 관련된다. "담체"라는 용어는 활성 성분의 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분과 관련된다. 바람직하게는, 담체 성분은, 광유, 동물, 또는 식물, 예컨대 땅콩유, 대두유, 참깨유, 해바라기유 등으로부터 유래되는 것들을 포함하는, 물 또는 오일과 같은 멸균 액체이다. 염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세린 용액이 또한 수성 담체 화합물로서 사용될 수 있다.
치료적 용도를 위한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약제학 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예로는 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 설탕, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다.
약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실무와 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)로서 또는 이에 더하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 및/또는 가용화제(들)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예로는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 자유 유동 락토스, 베타-락토오스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예로는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등이 포함된다. 방부제, 안정화제, 염료 및 심지어 향료가 약제학적 조성물에 제공될 수 있다. 방부제의 예로는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시 벤조산의 에스테르가 포함된다. 산화방지제 및 현탁제가 또한 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 선택적으로 용질, 예를 들어 염을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 조성물은 동결 건조 조성물의 형태이다. 동결 건조 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결 건조시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명은 상세히 설명되고, 도면과 실시예에 의해 예시되는데, 이는 단지 예시 목적으로 사용되고 제한하고자 하는 것이 아니다. 설명 및 실시예로 인해, 본 발명에 마찬가지로 포함되는 추가의 구체예가 당업자에게 접근 가능하다.
실시예 1
승인된 중재적 제1 상 임상 시험(NCT02410733) 내에서, 악성 흑색종을 가진 15 명의 환자를 1 일(V2), 8 일(V3), 15 일(V4), 22 일(V5), 29 일(V6), 36 일(V7), 50 일(V8) 및 64 일(V9)째에(환자 1, 환자 2 및 환자 3은 단지 1 일, 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 43 일째에만) 정맥내 투여에 의해 증가량의 나노입자 리포솜 제형화(liposome formulated) RNA 기반 면역 요법약으로 처리하였다. 면역 요법약은 4 개의 개별 RNA-리포플렉스(lipoplex)(RNA(LIP)) 생성물을 포함하였고, 각각은 하나의 흑색종 관련 항원을 코딩하는데, 이 항원은 정맥내 투여 후에 효율적인 TLR7 촉발 I 형 인터페론 유도 면역 활성화 및 T 세포 자극을 가져온다. 환자를 증가하는 용량 수준으로 처리하였는데, 제1 백신 접종 주기 동안 7.2 μg의 총 RNA로 시작하여, 제2 백신 접종 주기 동안 14.4 μg의 총 RNA로, 그리고 나머지 백신 접종 주기 동안 각각 최대 29 μg, 50 μg, 75 μg 또는 100 μg의 총 RNA로 처리하였다.
활력 징후 및 유해 사건/심각한 유해 사건(부작용)을 각 백신 접종 주기 전후로 평가하고 보고하였다. 개별 백신 접종 주기에서(0(백신 접종 전), RNA(LIP) 투여 후 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간(h)째에) 혈액학적 분석 및 전신 사이토카인 측정을 위해 혈액 샘플을 얻었다. 림프구 수(도 1a), 혈소판 수(도 1b), 및 혈청 사이토카인 발현 수준(도 1c 내지 도 1f)을 각 환자에 대해 결정하였다.
첫 번째 환자(1982 년생 여성)는 면역 요법약의 투여 후 수 시간 내에 두통, 피로, 떨림, 및 발열과 같은 전형적으로 면역계 활성화와 관련된 증상을 경험하였다. 이 증상들은 용량 의존적이었고, 14.4 μg의 용량(제2 백신 접종 주기)에서 관찰되었다. 29 μg의 RNA(제3 백신 접종 주기)로 처리한 후, 중등도의 발열 관련 빈맥과 저혈압이 추가로 관찰되었다. 관찰된 증상은 파라세타몰의 투여에 의해 용이하게 관리될 수 있었지만, 그럼에도 불구하고 이는 이 환자를 위한 나머지 백신 접종 주기 동안 14.4 μg의 총 RNA 로의 용량 감소를 가져왔다. 관찰된 혈액학적 변화는 전신 림프구와 혈소판의 가역적인 용량 의존성 감소뿐만 아니라 전신 IFN-α, IL-6, IFN-γ의 경미한 일시적 증가 및 IP-10의 강한 분비를 포함하였다. 이러한 관찰은 RNA(LIP) 면역 요법에 대한 신뢰받는 작용 방식과 일치하고, 광범위한 전임상 연구로부터 관찰된 결과를 확인해준다.
두 번째 환자(1947 년생 여성)는 면역 요법약과 관련하여 관찰된 유해 사건없이 모든 3 회 용량 수준에서 면역 요법약의 투여(백신 접종)을 매우 잘 견뎌냈다. 더욱이, IFN-γ 및 IL-6의 약간의 일시적 증가뿐만 아니라 용량 의존적 방식으로의 상당한 IP-10 분비에 더하여 단지 경미한 혈액학적 변화가 검출되었다. 그러나, 분비된 총 사이토카인 양은 도 1c 내지 도 1f에 도시된 바와 같이 첫 번째 환자와 비교하여 유의하게 적었다.
세 번째 환자(1950 년생 남성)는 조사자의 재량에 따라 투여 전후에 주어진 파라세타몰의 동시 투여와 함께 모든 3 회 용량 수준에서 면역 요법약의 투여를 매우 잘 견뎌냈다. 이 환자의 경우, 24 시간 내에 해소된 제3 백신 접종 주기(29 μg) 후의 경미한 발열이 관찰된 유일한 임상 증상이었다. 첫 번째 환자에서와 같이, 적은 정도이긴 하지만 전신 림프구의 용량 의존성 일시적 감소, 및 IFN-α, IFN-γ 및 IP-10의 용량 의존성 일시적 증가가 관찰된 반면, 전신 IL-6의 양은 첫 번째 환자 및 두 번째 환자에서보다 유의하게 높았지만 또한 24 시간 이내에 완전히 역전되었다.
네 번째 환자(1971 년생 여성)는 각각 7.2 μg 또는 14.4 μg의 총 RNA의 투여 후 수 시간 내에 두통, 피로, 및 오한과 같은 전형적으로 면역계 활성화와 관련된 증상을 경험하였다. 두 투여량 모두에서, 순환성 림프구의 약간의 일시적 감소가 검출되고 첫 번째 환자에 필적하는 IFN-γ, IP-10, 및 IFN-α의 중등도의 일시적 용량 의존성 사이토카인 유도가 관찰된 반면, 14.4 μg의 투여 후 IL-6는 약간 더 증가하여 오히려 세 번째 환자의 사이토카인 수준에 필적하였다.
다섯 번째 환자(1980 년생 남성)는 제2 백신 접종 주기(14.4 μg) 후 약간 증가된 체온과 제3 백신 접종 주기(14.4 μg) 후 경미한 관절 통증을 나타내며 면역 요법약의 투여를 매우 잘 견뎌냈다. 혈소판 수는 유의하게 영향받지 않았지만, 14.4 μg을 사용한 제2 백신 접종 주기 후에 중등도이지만 완전히 일시적인 림프구감소증이 관찰되었다. 제2 백신 접종 주기 후 다른 5 명의 환자와 비교하여 최저인 IP-10 분비의 미미하고 완전히 가역적인 증가를 제외하고는 전신 사이토카인의 증가는 거의 관찰되지 않았다.
여섯 번째 환자(1974 년생 여성)는 면역 요법약의 투여를 매우 잘 견뎌냈다. 이 환자의 경우, 오한, 두통, 및 사지의 통증(모두 경미함)이 14.4 μg의 투여(제2 백신 접종 주기)시에 보고된 유일한 임상 관찰된 유해 사건이었다. 또한, 혈소판 및 림프구의 완전히 가역적인 약간의 용량 의존성 감소가 관찰되었다. 또한, 제2 백신 접종 주기(14.4 μg) 후 전신 IFN-α와 IFN-γ의 경미한 용량 의존성 증가가 검출되었는데, 후자는 세기가 첫 번째 환자 및 네 번째 환자에 필적하였다.
마찬가지로, 환자 7, 환자 8, 환자 9, 환자 10, 환자 11, 환자 12, 환자 14, 환자 15, 및 환자 16(27 세 내지 75 세의 연령 범위)의 경우 RNA(LIP) 처리에 대한 개체간 감도가 관찰되었다. 이는 특히 29 μg 이상의 총 RNA 용량에서의 혈액학적 변화의 상이한 세기 및 전신 사이토카인 수준의 다양한 일시적 유도, 및 반복적인 RNA(LIP) 투약과 관련된 발산성 유해 사건 프로파일이 반영된 것이다. 대다수의 환자가 최대 75 μg 및 100 μg의 총 RNA 용량에서 또한 반복적인 RNA(LIP)를 매우 잘 견디는 반면, 선택된 환자는 100 μg의 RNA(LIP)(환자 16)로의 처리 후 심각한 발열을 경험하거나 7.2 μg(환자 11), 14.4 μg(환자 10), 및 75 μg 또는 100 μg(환자 16)의 총 RNA(LIP)로의 처리 후 고혈압의 악화를 경험하였다.
15 명의 환자 중 각 용량에서 경험한 관찰된 유해 사건들 사이의 차이뿐만 아니라 면역 요법약의 투여 후 여러 시점에서의 혈액학적 변화 및 혈청 사이토카인 발현 수준의 개체간 차이에 기초하여, 데이터는 상이한 개체에서 동일한 용량으로 동일한 면역 요법제의 투여시 유도되는 면역학적 반응의 세기가 달라짐을 명백히 나타낸다.
실시예 2
하기 연구의 목적은 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 전혈 중의 세포의 시험관내 활성화에 관한 정보를 얻는 것이었고, 이는 세포를 리포솜과 복합체를 형성한 RNA 분자와 접촉시킨 후 특정 사이토카인의 발현을 측정함으로써 이루어지며, 이 RNA 분자는 특정 종양 항원(RNALIP)을 코딩한다. 코딩된 항원은 매우 다양한 종양에서 발현되는 암 항원인 NY-ESO1(RBL001.1), 타이로시나제(RBL002.2), MAGE-A3, 흑색종 관련 항원(RBL003.1) 및 티로신-단백질 포스파타제인 TPTE(RBL004.1) 이었다.
본 연구의 첫 번째 부분에서, 건강한 공여자로부터 얻은 인간 헤파린처리 전혈 및 PBMC(헤파린처리 전혈로부터 분리된 것)의 샘플을 리포솜 제형화 RBL001.1, RBL002.2, RBL003.1 및 RBL004.1의 동일한 부분의 혼합물과 접촉시켰다. 전혈에서의 사이토카인 분비와 관련된 수지상 세포(DC)의 역할에 관한 정보를 얻기 위해, 연구의 두 번째 부분에서, 헤파린처리 전혈에 플라스마사이토이드 DC(pDC) 또는 단핵구 유래 미성숙 DC(iDC)을 농축시키고, 후속하여 리포솜 제형화 RNA 분자(RNA-LIP)와 함께 인큐베이션하였다.
본 연구의 두 부분에서의 1차 종점으로서, 이러한 세포의 활성화를 배양 상등액에서의 사이토카인 발현의 분석에 의해 접촉 후 6 시간 및 24 시간째에 결정하였다. 연구의 첫 번째 부분의 경우, 다음과 같은 사이토카인 분석되었다: IP-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12 및 IFN-α2. 연구의 두 번째 부분에서는 단지 IP-10, IL-6 및 IFN-α2가 분석되었다.
4 가지 상이한 RNA-LIP 조성물과 접촉한 배양된 PBMC에서, 모든 검출 가능한 사이토카인의 용량 의존성 유도가 관찰되었다(도 2a 내지 도 2h). 도 3a 내지 도 3h에 나타난 바와 같이, 발현이 검출될 수 있었던 전혈에서, 사이토카인 IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2, 및 IL-12의 수준에서 변화가 없었다. 또한, IFN-α2는 희석제 대조군에 비해 전혈에서 임의의 용량에서 유의하게 증가하지 않았다. 그러나, 케모카인 IP-10(CXCL10)은 전혈에서 용량 의존성 방식으로 상향 조절되는 것으로 관찰되었다. 전혈에서의 IL-6의 증가된 유도는 4 명의 공여자 중 단지 1 명으로부터 얻은 세포에서 단지 낮은 수준으로 관찰되었다.
수지상 세포 농축 전혈을 사용한 연구에서, IP-10, IFN-α2 및 IL-6의 용량 의존성 유도가 또한 관찰되었다.
분리된 PBMC로부터 관찰된 결과는 전혈에 비해 약간의 차이를 나타내었고, 이는 분리된 PBMC를 사용한 시험 시스템의 더 높은 감도를 암시한다. 분리된 PBMC의 경우, 증가된 사이토카인 수준이 시험된 사이토카인에 대해 관찰된 반면, 전혈 중의 PBMC의 경우, 사이토카인 검출은 IFN-α2, IP-10 및 IL-6로 제한되었다. 연구의 두 번째 부분에서, 전혈에서의 사이토카인 분비는 상이한 유형의 DC의 농축에 의해 증가하였고, 이는 DC가 RNA-리포솜 복합체의 흡수를 위한 주요 세포 유형임을 암시한다. 이 데이터에 기초하여, 새로운 pDC의 농축이 증가된 IFN-α2 분비를 가져오므로 pDC가 전혈에서의 리포솜 제형화 RNA 흡수를 위한 주요 세포 유형이라고 추정될 수 있다.
더욱이, 이러한 결과는 면역 요법제(RNA-LIP)를 개체의 면역 반응성 물질(PBMC, 전혈 및 DC가 농축된 전혈)과 동일한 용량으로 접촉시키는 것에 응답하는 다양한 면역학적 반응에서의 유의한 개체의 차이를 명백히 나타낸다.
재료:
연구에 사용된 재료 및 그 개별 공급원은 다음과 같다: 모두 Bio-Rad Laboratories GmbH로부터 구입되는, 커스터머 7-플렉스(Customer 7-plex)(Cat.: L5002JFHHC), IFN-α2 단일 플렉스(single Plex)(Cat.: 171-B6010M), IP-10 단일 플렉스(Cat.: 171-B5020M), IL-6 단일 플렉스(Cat.: 171-B5006M), 사이토카인 스탠다즈 그룹(Cytokine Standards Group) II(Cat.: 171-D60001), 사이토카인 스탠다즈 그룹 I(Cat.: 171-D50001), 바이오-플렉스 프로 리에이전트 키트(Bio-Plex Pro Reagent Kit)(Cat.: 171-304070M); 모두 Invitrogen, GIBCO®로부터 구입되는, 피루브산나트륨(Cat.: 11360-039), 비필수 아미노산(Cat.: 11140-035), 페니실린-스트렙토마이신(Cat.: 15140-122), HEPES(Cat.: 15360-056), RPMI-1640 + GlutamaxTM(Cat.: 61870-010); LONZA로부터 구입되는 인간 혈청형(Human Serum Type) AB; 모두 Miltenyi Biotech GmbH로부터 구입되는, IL-4(Cat. No.: 130-093-924), CD14-비즈(Beads)(Cat.: 130-050-201), CD304-비즈(Cat.: 130-090-532); Novartis로부터 구입되는, 류코맥스(Leucomax), 몰그래모스팀(Molgramostim)(rHuman GM-CSF); 및 GE Healthcare로부터 구입되는, 피콜-팩 플러스(Ficoll-Paque PLUS)(Cat.: 17-1440-03).
방법:
전혈을 건강한 지원자로부터 무균 주사기로 채취하였다. 헤파린을 항응고제로 사용하였다. 헤파린처리 전혈을 사용하여 피콜-팩 상에서의 밀도 원심 분리에 의해 PBMC를 생성시켰다. iDC는 전혈로부터 분리된 새로 준비된 PBMC를 사용하여 분리하였고, CD14+ 단핵구의 분리는 자성 비드 기반 분리에 의해 수행하였다. pDC는 전혈로부터 분리된 새로 준비된 PBMC를 사용하여 분리하였고, pDC의 분리는 자성 비드 기반 분리에 의해 수행하였다.
본 연구의 첫 번째 부분의 경우, 건강한 공여자(n = 4)로부터 헤파린처리 전혈을 채취하였다. 전혈의 한 부분은 PBMC를 생성하는데 사용하였다. 후속하여, PBMC를 배지에 재현탁하고 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 상세하게는, 용량 그룹당 5 × 105 개의 PBMC를 웰당 180 μL로 시딩하였다. 이어서, 200 μL의 최종 부피(각 용액의 1:10 희석물) 및 2.5 × 106 개 PBMC/mL의 최종 세포 밀도에 도달하도록 리포솜-복합체형성 RNA(RNA-리포솜 혼합물)를 함유하는 20 μL의 용액을 첨가하였다. 시험된 모든 용량에 대해, 데이터는 삼중시료로부터 생성되었다. 동일한 공여자로부터 얻은 나머지 전혈을 96-웰 플레이트의 웰 내로 직접 피펫팅하였다. 상세하게는, 180μL의 전혈을 모든 투여 그룹에 대해 삼중시료로 시딩하고, 200μL의 최종 부피 및 스파이크액(spike solution)의 1:10 희석물에 도달하도록 리포솜-복합체형성 RNA를 함유하는 20μL의 용액을 첨가하였다. 아래의 표 1과 표 2는 개별 시험 샘플을 요약한 것이다.
표 1: 연구의 첫 번째 부분을 위한 용량 그룹(분리된 PBMC)
표 2: 연구의 첫 번째 부분을 위한 용량 그룹(전혈)
연구의 두 번째 부분의 경우, 헤파린처리 전혈을 동일한 공여자(n = 2)로부터 2 회 채취하였다. 첫 번째에서는, 헤파린처리 전혈을 사용하여 PBMC를 생성시키고, 후속하여 CD14+ 단핵구를 분리하였다. 분리된 단핵구를 5 일 동안 배양하여 iDC를 생성시켰다. 사이토카인 IL-4 및 GM-CSF(각각 1,000 U/ml)를 배양 배지에 첨가하여 iDC의 생성을 자극하였다. 3 일 후, 세포에 사이토카인을 포함하는 새로운 배지를 공급하였다. 이어서, 동일한 공여자로부터의 헤파린처리 전혈을 두 번째로 채취하였다. 이 혈액의 한 부분을 사용하여 PBMC를 생성시키고, 후속하여 pDC를 분리하였다. 그 후, 혈액의 나머지를 전술한 바와 같이 웰 내로 시딩하였다: 96-웰 플레이트에서 웰당 180 μL. 최고 용량 그룹의 경우, 100 μL의 전혈을 피펫팅하였다. 자가 pDC 또는 iDC의 첨가는 다음과 같았다: 10,000 개의 DC를 표 3에 나타낸 바와 같이 전혈 샘플에 첨가하였다. DC의 첨가 후, 200 μL의 최종 부피 및 용액의 1:10의 희석물에 도달하도록 리포솜 제형화 RNA를 함유하는 20 μL의 용액을 첨가하였다.
표 3: 연구의 두 번째 부분을 위한 용량 그룹
실험 일정
연구의 첫 번째 부분:
제1 일 : 헤파린처리 전혈(n = 4)의 채취
각 공여자의 PBMC의 준비
PBMC 및 전혈의 시딩
RNA-LIP의 용액 첨가 및 인큐베이션
6 시간 시점에서의 상등액/혈장의 수거 및 -65℃ 내지 -85℃에서의 동결
2 일째: 24 시간 시점에서의 상등액/혈장의 수거 및 -65℃ 내지 -85℃에서의 동결
이후 임의의 날에 동결 상등액의 분석 수행
연구의 두 번째 부분:
1 일째: 전혈(n = 2)의 채취
각 공여자로부터의 PBMC의 준비
PBMC로부터의 CD14+ 단핵구의 분리
IDC를 생성시키기 위한 분리된 CD14+ 단핵구의 배양
4 일째: iDC의 공급
6 일째: iDC의 수거
전혈(n = 2; 동일한 공여자)의 채취
각 공여자의 PBMC의 준비
PBMC부터의 pDC의 분리
전혈의 시딩
iDC 또는 pDC 각각의 첨가
RNA-LIP를 함유하는 용액의 첨가
6 시간 시점에서의 상등액/혈장의 수거 및 -65℃ 내지 -85℃에서의 동결
7 일째: 24 시간 시점에서의 상등액/혈장의 수거 및 -65℃ 내지 85℃에서의 동결
이후 임의의 날에 상등액/혈장의 분석 수행
결과:
PBMC를 RNA-LIP 혼합물과 함께 24 시간 동안 배양한 후, 모든 사이토카인의 용량 의존성 분비가 검출되었다. 그러나, 사이토카인의 농도 수준(20 pg/ml 내지 60,000 pg/ml)에서의 큰 차이가 관찰되었다. 사이토카인 응답은 8 개의 선택된 사이토카인 중 5 개, 즉, IP-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 가 두드러졌다(표 4 참조). 부가적으로, 분비 시점에서의 차이가 또한 관찰되었다: IL-1β, IL-6 및 TNF-α는 (높은 RNA 농도에서의) 6 시간 인큐베이션 후 이미 검출되었고, 수준은 24 시간 후에 현저하게 증가하지 않았는데, 이는 RNA-LIP 조성물의 첨가에 응답하는 상이한 공여자로부터의 세포의 능력 차이를 나타낸다.
표 4: 분리된 PBMC로부터의 결과의 요약
분리된 PBMC를 사용한 연구에 더하여, 전혈에서의 유사한 실험을 수행하였다. 이들 연구에서, 다음과 같은 사이토카인에 대한, RNA-LIP 조성물과 함께 인큐베이션한 후에 현저한 농도로의 상승된 사이토카인 분비는 검출 가능하지 않았다: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2 및 IL-12(표 5 및 도 3a 내지 도 3h). 일부 데이터 지점에서, 3 개 복제물 중 1 개에서만 관찰된 상승된 수준은 이상치(outlier)로 간주되었음이 주목된다. IFN-α2에 관해서는, 희석제 대조군을 포함하는 4 명의 공여자 중 3 명의 일부 샘플에서 저수준의 기준선 분비가 검출 가능하였다. IP-10의 상승된 분비는 24 시간 후 그리고 시험된 최고 용량에서 모든 공여자에 대해 검출되었다. 4 명의 공여자 중 2 명에서, 용량 # 3(0.37 μg/mL)에서 검출 가능한 상승된 수준이 여전히 존재하였다. 매우 낮은 수준이지만, IL-6는 24 시간 후 그리고 시험된 최고 용량에서 RNA-LIP의 첨가 후에 4 명의 공여자 중 2 명에서 상승하였다.
표 5: 전혈에 대한 결과의 요약
전혈에서 활성화 및 사이토카인 분비에 대한 DC의 역할을 시험하기 위해, 연구의 두 번째 부분을 수행하였다. 이때, 자가 iDC 또는 pDC가 농축된 헤파린처리 전혈을 0.016 μg/m 내지 50 μg/mL의 용량 범위에서 RNA-LIP 조성물과 함께 인큐베이션하였다. 도 4a 내지 도 4c 및 도 5a 내지 도 5c에 제시된 결과는 IFN-α2, IP-10 및 IL-6의 명확한 용량 의존성 유도를 나타낸다. IFN-α2와 관련하여, 시험된 두 개의 최고 용량(10 μg/mL 및 50 μg/mL)에서만 전혈에서 RNA-LIP 조성물과 함께 24 시간 인큐베이션한 후 상승된 분비가 관찰되었다. 용량 3(2 μg/mL)의 경우, 증가된 분비가 검출 가능하지 않았다. 그러나, 헤파린처리 전혈로의 pDC의 첨가는 2 μg/mL의 용량에서 IFN-α2의 분비를 증가시켰다. 대조적으로, iDC의 첨가는 전혈 단독에 비해 이 사이토카인의 증가된 분비를 가져오지 않았다. 놀랍게도, IP-10의 상승된 수준은 0.4 μg/mL 내지 50 μg/mL의 RNA-LIP와 함께 24 시간 인큐베이션한 후에 검출되었으며(0.08 μg/mL의 경우에는 약간), 이는 연구의 첫 번째 부분으로부터의 결과를 확인해주었다. 어느 한 유형의 DC의 첨가는 무첨가에 비해 검출된 사이토카인의 심지어 더 많은 분비를 가져왔지만, 최고 수준은 iDC가 농축된 전혈에서 검출되었다. IL-6에 관하여, 연구의 첫 번째 부분으로부터의 결과가 확인되었는데, 즉, 2 μg/mL보다 높은 용량으로 증가된 발현 수준이 검출되었다. 이때, 전혈로의 iDC의 첨가는 전혈 단독에 비해 증가된 수준의 발현을 또한 가져왔다.
논의 및 결론
연구의 첫 번째 부분에 관하여, 분리된 인간 PBMC 및 전혈의 두 시험 시스템 모두에서, RNA-LIP 조성물과 함께 인큐베이션한 후에 여러 사이토카인이 분비되었다. 그러나, 시험 시스템 사이의 차이는 PBMC가 시험 시스템으로서 더 높은 감도를 갖는다는 것을 암시한다. 한편, 8 개의 시험된 사이토카인 모두에 대한 분리된 PBMC에서의 증가된 사이토카인 수준이 검출될 수 있었다. 전혈을 시험 시스템으로 사용하면, 사이토카인 검출은 IFN-α2, IP-10, 및 IL-6로 제한되었다. 상이한 결과는 상이한 배양 조건으로 인한 것일 수 있는데, 분리된 PBMC는 혈청(FCS) 및 항생제가 보충된 배양 배지로 배양된 반면, 전혈에서의 배양은 PBMC가 인간 혈장 및 적혈구와 함께 배양되었음을 의미하기 때문이다.
연구의 두 번째 부분에서는, 전혈에서의 IFN-α2 분비가 pDC의 첨가로 증가될 수 있다는 것이 밝혀졌다. pDC는 TLR-7 활성화시에 IFN-α를 분비하는 것으로 알려져 있다(문헌[Kwissa et al., 2012, Distinct TLR adjuvants differentially stimulate systemic and local innate immune responses in nonhuman primates, Blood 119:2044-2055]; 문헌[Schiller et al., 2006, Immune response modifiers--mode of action, Exp. Dermatol. 15:331-341], 문헌[Hornung et al., 2005, Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7, Nat. Med. 11(3):263-270]). TLR-7은 엔도솜 내에서 RNA에 의해 활성화되기 때문에, 이는 pDC가 RNA의 흡수를 위한 주요 세포 유형이라는 것을 나타낸다.
이들 실험으로부터의 결과는 동일 농도(동일 용량)에서 동일한 면역 요법제와 접촉한 상이한 개체로부터 분리된 동일한 면역 반응성 물질이 유의하게 상이한 면역학적 반응을 가져옴을 또한 나타내며, 이에 따라 동일 용량의 면역 요법제가 상이한 개체에서 상이한 효과를 가지는 바, 모든 개체에서 치료학적으로 유효하고/하거나 용인되는 단일 용량은 존재하지 않는다는 결론을 추가로 뒷받침한다.
실시예 3
하기 연구의 목적은, 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 새로운 전혈 중의 세포의 시험관내 활성화에 관한 정보를, 세포를 다양한 농도의 작은 TLR-7 효능제 화합물, 즉, N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(본원에서 SM1이라고 명명됨) 및 N-{4-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]부틸}-N-(1,1-다이옥소티에탄-3-일)아세트아미드(본원에서 SM2라고 명명됨)와 함께 인큐베이션한 후에 특정 사이토카인의 분비 및 일반적인 활성화 마커(CD69)의 유도를 측정함으로써 얻는 것이었다. 하기에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 건강한 공여자로부터 얻은 인간 헤파린처리 전혈 및 (백혈구 연층으로부터 분리된) PBMC를 등몰량의 효능제 화합물 SM1 또는 SM2와 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
실험에 사용된 PBMC는 피콜-팩 상에서의 밀도 원심 분리에 의해 백혈구 연층으로부터 분리하였다. 후속하여, PBMC를 세포 배양 배지에 재현탁하고 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 상세하게는, 용량 그룹당 5 × 105 개의 PBMC를 웰당 190 μL로 시딩하였다. 이어서, 200 μL의 최종 부피(각 용액의 1:20 희석물) 및 2.5 × 106 개 PBMC/mL의 최종 세포 밀도에 도달하도록 명시된 농도의 10 μL의 효능제를 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 후속하여, 상등액을 수거하고, 즉시 분석하거나 동결시키고 분석할 때까지 -80℃로 유지하였다. 시험된 효능제의 모든 용량에 대해, 각각 생물학적 이중시료로 (두 연구 부분 모두를 위한) 10 명의 개체로부터 데이터를 생성하였다.
전혈을 건강한 지원자로부터 무균 주사기로 채취하였다. 헤파린을 항응고제로 사용하였다. 새로운 헤파린처리 전혈을 96-웰 플레이트 내로 직접 피펫팅하였다. 상세하게는, 상이한 개체(CBA의 경우 n = 10 명의 공여자; 유세포 분석의 경우 n = 8)로부터의 190μL의 전혈을 모든 용량 그룹에 대해 이중시료로 시딩하고, 200μL의 최종 부피 및 스파이크액의 1:20 희석물에 도달하도록 10μL의 시험 항목 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 후속하여, 상등액을 수거하고, 즉시 분석하거나 동결시키고 분석할 때까지 -80℃로 유지하였다.
CD69 발현에 의한 세포 활성화를 측정하기 위해, 세포 펠릿을 수거하고, 유세포 분석 염색 및 측정을 즉시 수행하였다.
각각의 효능제는 DMSO(다이메틸 설폭사이드) 희석제를 사용한 연속 희석으로 준비하였다: 8 단계로 5 배. PBMC 또는 전혈과 함께 인큐베이션된 효능제 화합물 농도는 10 μM, 2 μM, 0.4 μM, 0.08 μM, 0.016 μM, 0.0032 μM, 0.0006 μM, 및 0.0001 μM이었다.
연구의 첫 번째 부분의 1차 종점으로서, 세포의 활성화는 세포계측 비드 검정(cytometric bead assay, CBA)을 통한 세포 배양 상등액(PBMC) 및 혈장(전혈)에서의 사이토카인 분비 유도의 분석에 의해 결정하였다. 다음과 같은 사이토카인/케모카인을 분석하였다(IFN-α, IP-10, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 및 IL-2). 연구의 두 번째 부분의 경우, 세포 활성화는 유세포 분석을 통해 여러 유형의 면역 세포에서 일반적인 활성화 마커인 CD69의 발현 분석에 의해 결정하였다. 다음과 같은 면역 세포 유형을 조사하였다: 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC), 골수계 수지상 세포(mDC), 단핵구, B 세포 및 NK 세포.
특히, 사이토카인 농도의 결정을 위해, 10 개의 모든 사이토카인/케모카인(IFN-α, IP-10, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 및 IL-2)을 포함하는 세포계측 비드 검정(멀티플렉스-키트(Multiplex-Kit), (ProcartaPlex; eBioscience)을 이용하였다. 분석은 Luminex® 시스템으로 수행하였다.
유세포 분석의 경우, 표면 마커인 CD16, CD19, CD14, BDCA2 및 BDCA3, 및 활성화 마커인 CD69를 조합한 항체 혼합물로 세포 펠렛을 염색하였다. 이 유동 패널을 사용하여, B 세포, NK 세포, 단핵구, 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC) 및 골수계 수지상 세포(mDC)의 활성화를 분석하는 것이 가능하였다. 측정은 BD FACSCanto IITM로 수행하였다.
TLR7-효능제와 함께 인큐베이션된 배양된 PBMC에서, 10 개의 측정된 사이토카인 중 8 개의 일관되고 용량 의존적인 유도가 관찰되었다(도 6a 내지 도 6h). IL-12p70과 IL-2만이 일관되게 유도되지 않았고, 몇몇 경우에 IL-12p70과 IL-2는 일부 공여자의 PBMC에서 단지 낮은 수준으로 발현되었다(도 6i 내지 도 6j). 상이한 효능제 농도에서의 상이한 공여자의 사이토카인 수준을 비교하면 두 효능제 화합물에 대해 높은 가변성이 나타나는데, 이는 시험관내 설정에서 예시적인 TLR7 효능제를 면역 세포와 함께 인큐베이션시킴에 의해 예시되는 바와 같이 외부 자극에 대한 면역계의 높은 개체간 응답성에 기인한다.
전혈을 각 효능제 화합물과 함께 인큐베이션한 후(도 7a 내지 도 7j), 검출된 사이토카인에 대한 용량-응답 곡선은 PBMC를 사용하여 이루어진 관찰에 거의 필적한다. 그러나, PBMC와 대조적으로, 각 효능제 화합물과 함께 배양한 후 IL-12p70 분비의 일관되고 용량 의존적인 유도가 또한 존재한다(도 7j). PBMC에서 관찰되는 바와 같이, 사이토카인 분비에 대한 용량-응답 곡선은 고도로 개별적이고, 혈액 공여자의 면역계의 각각의 응답성에 좌우된다.
PBMC 및 전혈을 TLR7-효능제와 함께 인큐베이션한 후의 세포 활성화를 또한 유세포 분석(CD69의 발현)을 통해 분석하였다. 사이토카인 분비를 이용하여 이루어진 관찰에 필적하게, PBMC(도 8a 내지 8e) 및 전혈(도 9a 내지 9e)에 대해, 두 효능제 화합물 모두에 대해 분석된 모든 면역 세포 집단(pDC, mDC, 단핵구, B 세포 및 NK 세포)의 일관된 농도 의존성 활성화가 존재한다. 또한, 사이토카인과 관련하여 나타난 바와 같이, 면역 세포 활성화의 세기는 상이한 공여자로부터의 혈액 샘플 사이에 고도로 가변적이다.
전술한 결과는 상이한 개체에서 면역 요법제, 본 경우에서는 TLR7-효능제에 응답하여 유도된 세포성 면역학적 반응의 세기가 유의하게 달라짐을 명백히 나타낸다.
실시예 4
하기 연구의 목적은, 사이노몰거스 원숭이 모델에서 혈액 내 다양한 사이토카인의 발현에 대한, 상이한 양의 TLR-7의 소분자 효능제인 N-(4-(4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세트아미드(SM1) 및 N-(4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸)-N-(1,1-다이옥사이도티에탄-3-일)아세트아미드(SM3)의 생체내 투여의 효과를 관찰하는 것이었다. 발현이 결정되는 다양한 사이토카인은 인터페론 알파, 인터루킨 1 수용체 길항제, 인터루킨 4, 인터루킨 6, 인터루킨 8, 인터루킨 10, 인터루킨 12, 인터루킨 15, 인터루킨 18, 단핵구 화학유인 물질 1, 과립구 콜로니 자극 인자, 대식세포 염증 단백질 1 베타, 종양 괴사 인자 알파, 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다.
효능제 화합물 중 하나의 규정된 단일 용량을 30 분 주입으로 사이노몰거스 원숭이에게 정맥내 투여하였다. 투여 개시 후 몇몇 시점에서, 전완 요측피 정맥(vena cephalica antebrachii) 또는 복재정맥(vena saphena) 혈관을 통해 원숭이로부터 K3EDTA 튜브 내로 혈액 샘플(약 0.25 mL 혈장에 대해 0.5 mL)을 채취하였다. 혈액 샘플은 원심 분리 전에 분쇄된 얼음 상에 보관하였다. 혈장은 4℃ 및 약 1,800 g에서 10 분 동안의 원심 분리에 의해 얻었고, 이를 라벨링된 마이크로 튜브 내로 분취하여 70℃ 이하에서 냉동 보관하였다. 사이토카인 결정 전에, 동결된 혈장 샘플을 해동하고, 희석시켰다.
사이토카인 수준은 인터페론 알파 엘리사(Elisa) 키트(예를 들어, VeriKineTM 사이노몰거스/레서스(Cynomolgus/Rhesus) IFNα ELISA Kit) 및 Luminex® 비인간 영장류 사이토카인/케모카인 키트(예를 들어, 밀리플렉스 비인간 영장류 사이토카인/케모카인 자기 프리믹스드 23 플렉스 패널(Milliplex Non-Human Primate Cytokine/Chemokine Magnetic Premixed 23 Plex Panel))을 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 결정하였다. 먼저, 저용량의 효능제 화합물(30 μg/kg[SM1을 투여한 동물에게만], 100 μg/kg[SM1을 투여한 동물에게만] 또는 300 μg/kg)을 원숭이에게 투여하였다. 이후, 14 일째에, 제2의 더 높은 용량의 동일한 효능제 화합물(1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg)을 동일한 원숭이에게 투여하였다. 결과는 도 10a 내지 도 10kk(SM1) 및 도 11a 내지 도 11m(SM3)에 도시되어 있고, TLR-7 효능제의 생체내 투여가 고도로 개별적인 방식으로의 다양한 사이토카인의 생성을 가져온다는 것을 나타낸다.
도10(SM1):
효능제 화합물 SM1은 30 μg/kg, 100 mg/kg, 300 μg/kg 및 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 10 mg/kg의 용량으로 개체 P0101(수컷), P0102(수컷), P0501(암컷), P0502(암컷), P0201(수컷), P0202(수컷), P0601(암컷), P0602(암컷), P0301(수컷), P0302(암컷), P0701(암컷), P0702(암컷)로 표시된 사이노몰거스 원숭이에게 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 혈액 내로의 사이토카인 분비는 투여 후 168 시간까지 다양한 시점에서 측정하였다. 다양한 사이토카인에 대한 혈장 농도는 주입 시작 후 최대 12 시간 또는 24 시간째에 수치로 나타난다.
각 원숭이에게 동일한 효능제를 2회 투여하였다. 첫 번째 투여는 낮은 용량인 30 μg/kg, 100 μg/kg 또는 300 μg/kg 중 하나 였고, 두 번째 투여는 더 높은 용량인 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg 중 하나였다. 첫 번째 용량으로 30 μg/kg을 투여받은 원숭이에게는 1 mg/kg의 두 번째 용량을 투여하였다. 첫 번째 용량으로 100 μg/kg을 투여받은 원숭이에게는 3 mg/kg의 두 번째 용량을 투여하였다. 첫 번째 용량으로 300 μg/kg을 투여받은 원숭이에게는 10 mg/kg의 두 번째 용량을 투여하였다.
도 10a: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터페론 알파 분비
도 10b: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터페론 알파 분비
도 10c: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터페론 알파 분비
도 10d: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터루킨 1 수용체 효능제 분비
도 10e: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0302, P0501, P0502 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 1 수용체 효능제 분비
도 10f: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 1 수용체 효능제 분비
도 10g: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터루킨 8 분비
도 10h: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 8 분비
도 10i: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 8 분비
도 10j: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터루킨 10 분비
도 10k: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 10 분비
도 10l: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 10 분비
도 10m: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 단핵구 화학유인 단백질 1 분비
도 10n: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 단핵구 화학유인 단백질 1 분비
도 10o: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 단핵구 화학유인 단백질 1 분비
도 10p: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 과립구 콜로니 자극 인자 분비
도 10q: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 과립구 콜로니 자극 인자 분비
도 10r: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 과립구 콜로니 자극 인자 분비
도 10s: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터루킨 4 분비
도 10t: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 4 분비
도 10u: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 4 분비
도 10v: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터루킨 6 분비
도 10w: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 6 분비
도 10x: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 6 분비
도 10y: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 인터루킨 18 분비
도 10z: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 18 분비
도 10aa: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 18 분비
도 10bb: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 대식세포 염증 단백질 1 베타 분비
도 10cc: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 대식세포 염증 단백질 1 베타 분비
도 10dd: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 대식세포 염증 단백질 1 베타 분비
도 10ee: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 종양 괴사 인자 알파 분비
도 10ff: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 종양 괴사 인자 알파 분비
도 10gg: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 종양 괴사 인자 알파 분비
도 10hh: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 30 μg/kg의 용량 및 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ii)의 경우 100 μg/kg의 용량에서의 혈관 내피 성장 인자 분비
도 10ii: 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (ii)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 혈관 내피 성장 인자 분비
도 10jj: 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (ii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 혈관 내피 성장 인자 분비
도 10kk: 동물 P0101, P0102, P0501, P0502 (i)의 경우 1 mg/kg의 용량, 동물 P0201, P0202, P0601, P0602 (ⅱ)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 P0301, P0302, P0701, P0702 (iii)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 12 분비
도 11(SM3):
효능제 화합물 SM3는 30 μg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 10 mg/kg의 용량으로 개체 16962, 17477, 17479, 17607, 16988, 30018, 16669, 17613, 14030, 16216으로 표시된 수컷 사이노몰거스 원숭이에게 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 혈액 내로의 사이토카인 분비는 투여 후 168 시간까지 다양한 시점에서 측정하였다. 다양한 사이토카인에 대한 혈장 농도는 주입 시작 후 최대 12 시간 또는 24 시간째에 수치로 나타난다.
도 11a: 동물 16962, 17477, 17479, 17607 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 16962, 16988, 17479, 30018 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터페론 알파 분비
도 11b: 동물 16669, 17607, 17613 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 14030, 16216, 17477 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터페론 알파 분비
도 11c: 동물 14030, 16216, 17477의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 과립구 콜로니 자극 인자 분비
도 11d: 동물 16962, 16988, 17479, 30018 (i)의 경우 1 mg/kg의 용량 및 동물 14030, 16216, 17477 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 10 분비
도 11e: 동물 16962, 17477, 17479, 17607 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 16962, 16982, 17479, 30018 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 15 분비
도 11f: 동물 16669, 17607, 17613 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 14030, 16216, 17477 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 15 분비
도 11g: 동물 16962, 17477, 17479, 17607 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 16962, 16988, 17479, 30018 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 1 수용체 효능제 분비
도 11h: 동물 16669, 17607, 17613 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 14030, 16216, 17477 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 1 수용체 효능제 분비
도 11i: 동물 14030, 16216, 17477의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 인터루킨 10 분비
도 11j: 동물 16962, 17477, 17479, 17607 (i)의 경우 300 μg/kg의 용량 및 동물 16962, 16988, 17479, 30018 (ⅱ)의 경우 1 mg/kg의 용량에서의 단핵구 화학유인 단백질 1 분비
도 11k: 동물 16669, 17607, 17613 (i)의 경우 3 mg/kg의 용량 및 동물 14030, 16216, 17477 (ⅱ)의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 단핵구 화학유인 단백질 1 분비
도 11l: 동물 14030, 16216, 17477의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 종양 괴사 인자 알파 분비
도 11m: 동물 14030, 16216, 17477의 경우 10 mg/kg의 용량에서의 대식세포 염증 단백질 1 베타 분비
실시예 5
하기 연구의 목적은 인간 PBMC에 의한 시험관내 사이토카인 분비에 대한 TLR8의 두 소분자 효능제인 2-에틸-1-(4-((2-메틸테트라하이드로푸란-3-일)아미노)부틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(SM4) 및 1-(4-(사이클로헥실아미노)부틸)-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(SM5)의 효과를 관찰하는 것이었다. 발현이 결정되는 다양한 사이토카인에는 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 1 베타, 인터루킨 6, 인터루킨 8, 인터루킨 10 및 인터루킨 12p70, 인터페론 감마, 인터루킨 10, 및 인터페론 감마 유도성 단백질 10이 포함된다.
PBMC는 4 명의 인간 혈액 공여 지원자로부터 회수된 새로운 혈액 샘플로부터 분리되었다. PBMC를 표준 프로토콜에 따라 분리하고, 2 × 106/mL의 세포 수로 10% 소 태아 혈청을 함유하는 세포 배양 배지에 재현탁하고, 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트 내로 시딩하고, 후속하여 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 효능제 화합물을 DMSO에 용해시키고 후속하여 DMSO로 하나 또는 수 개의 단계로 최종 시험 농도의 1,000 배의 농도로 희석함으로써 각각의 효능제 화합물의 적절한 저장 용액을 생성시켰다. 효능제의 적절한 사전 희석물은 배지를 사용하여 제조하였는데, 제1 단계에서는 효능제를 1:100으로 희석하였고, 제 2 단계에서는 25μL의 사전 희석물과 125μL의 배지를 웰 내의 100μL의 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 상등액을 수거하고, 제조업체의 지침서에 따라 특정 인간 사이토카인에 특이적인 Luminex® 비드 검정 또는 ELISA 검정으로 분석하였다.
도 12 및 도 13에 도시된 결과는 TLR8 효능제로의 인간 PBMC의 노출이 고도로 개별화된 방식으로 측정된 사이토카인의 분비를 가져온다는 것을 나타낸다.
도 12(SM4):
효능제 화합물 SM4를 다양한 농도, 즉, 0.1 μM, 0.3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 및 30 μM 농도로 개체 130325, 100621, 110126, 110125로 표시된 4 명의 혈액 공여자로부터 새로 준비된 인간 PBMC에 시험관내 검정에서 첨가하였다. 효능제 화합물의 첨가 후 24 시간째에, 상등액 내로의 사이토카인 분비를 전술한 바와 같이 측정하였다. 상이한 양의 효능제와 함께 24 시간 인큐베이션 한 후의 상등액 중의 다양한 사이토카인의 농도를 나타낸다.
도 12a: 24 시간 후 개체 130325, 100621, 110126, 110125의 PBMC로부터의 종양 괴사 인자 알파 분비
도 12b: 24 시간 후 개체 130325, 100621, 110126, 110125의 PBMC로부터의 인터루킨 1 베타 분비
도 12c: 24 시간 후 개체 130325, 100621, 110126, 110125의 PBMC로부터의 인터루킨 6 분비
도 12d: 24 시간 후 개체 130325, 100621, 110126, 110125의 PBMC로부터의 인터페론 감마 분비
도 12e: 24 시간 후 개체 130325, 100621, 110126, 1101252의 PBMC로부터의 인터루킨 10 분비
도 12f: 24 시간 후 개체 130325, 110126, 110125의 PBMC로부터의 인터페론 감마 유도성 단백질 10 분비
도 13(SM5):
효능제 화합물 SM5를 0.1 μM, 0.3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 및 30 μM의 다양한 농도로 개체 131105, 130618, 130325, 131120으로 표시된 4 명의 혈액 공여자로부터 새로 준비된 인간 PBMC에 시험관내 검정에서 첨가하였다. 효능제 화합물의 첨가 후 24 시간째에, 상등액 내로의 사이토카인 분비를 전술한 바와 같이 측정하였다. 상이한 양의 효능제와 함께 24 시간 인큐베이션 한 후의 상등액 중의 다양한 사이토카인의 농도를 나타낸다.
도 13a: 24 시간 후 개체 131105, 130618, 130325, 131120의 PBMC로부터의 종양 괴사 인자 알파 분비
도 13b: 24 시간 후 개체 131105, 130618, 130325, 131120의 PBMC로부터의 인터루킨 1 베타 분비
도 13c: 24 시간 후 개체 131105, 130618, 130325, 131120의 PBMC로부터의 인터류킨 6 분비
도 13d: 24 시간 후 개체 131105, 131120의 PBMC로부터의 인터루킨 8 분비
도 13e: 24 시간 후 개체 131105, 130618, 130325, 131120의 PBMC로부터의 인터페론 감마 분비
도 13f: 24 시간 후 개체 131105, 130618, 130325, 131120의 PBMC로부터의 인터루킨 10 분비
도 13g: 24 시간 후 131105, 130618, 130325, 131120의 PBMC로부터의 인터페론 감마 유도성 단백질 10 분비
도 13h: 24 시간 후 개체 131105, 131120의 PBMC로부터의 인터루킨 12p70 분비
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(3)
<223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently
a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or
more, 3 or more, 4 or more or 5 or more
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(6)
<223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently
a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20
<220>
<221> REPEAT
<222> (7)..(9)
<223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently
a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20
<220>
<221> REPEAT
<222> (10)..(12)
<223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently
a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20
<220>
<221> REPEAT
<222> (13)..(15)
<223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently
a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20
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Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
Claims (46)
- 개체에게 투여하기 위한 면역 요법제의 적합한 용량을 결정하는 방법으로서,
(a) 다수의 상이한 용량의 상기 면역 요법제를 상기 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 다수의 상이한 용량의 상기 면역 요법제에 의해 유발되는 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (b)는 적어도 하나의 면역학적 반응을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하는 것, 바람직하게는 적어도 하나의 면역학적 반응을 정량적으로 측정하는 것인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역 요법제의 상기 다수의 상이한 용량은 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 또는 10 개 초과의 상이한 용량인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 요법제의 상기 다수의 상이한 용량은 용량 상승, 바람직하게는 선형 또는 대수 용량 상승을 나타내는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 요법제는 Toll 유사 수용체(TLR) 효능제, 바람직하게는 TLR-7 또는 TLR-8 효능제인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 요법제는 적어도 하나의 면역 반응성 펩타이드 또는 단백질, 또는 적어도 하나의 면역 반응성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 핵산은 RNA를 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 면역 요법제는 RNA 및 적어도 하나의 지질을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 면역 요법제는 RNA 리포플렉스(lipoplex) 제형을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 상이한 용량은 상기 면역 요법제에 대한 표준 용량 범위 미만인 적어도 하나의 용량을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 상이한 용량은 상기 면역 요법제에 대한 표준 용량 범위 내에 있는 적어도 하나의 용량을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)는 순차적으로 수행되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 2 시간 내지 48 시간째에, 바람직하게는 단계 (a) 후 4 시간 내지 24 시간째에 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역학적 반응은 적어도 하나의 사이토카인의 생성을 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인은 인터루킨 6(IL-6), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터페론-α(IFN-α), 인터페론-γ(IFN-γ), 인터페론 감마 유도 단백질 10(IP-10), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-12p70(IL-12p70)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인은 인터페론-α(IFN-α)인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 방법인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 개체의 면역 반응성 물질은 상기 개체로부터 분리된 혈액 세포를 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 면역 반응성 물질은 상기 개체로부터 분리된 전혈을 포함하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 전혈은 상기 개체로부터의 자가 수지상 세포, 바람직하게는 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 수지상 세포(pDC) 및/또는 단핵구 유래 미성숙 수지상 세포(iDC)가 농축된 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 개체의 면역 반응성 물질은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로 필수적으로 이루어지거나 이를 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역학적 반응이 상기 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은, 상기 개체로의 상기 면역 요법제의 투여를 위한 적합한 용량을 반영하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 생체내에서 수행되고, 개별적인 투여 단계들로 다수의 상이한 용량의 상기 면역 요법제를 상기 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 것이며, 각각의 투여 단계는 하나의 용량의 상기 면역 요법제를 상기 개체에 투여하는 것인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 개별적인 투여 단계들은 순차적으로 수행되고, 서로 2 일 내지 30 일, 예컨대 7 일 내지 28 일, 바람직하게는 7 일, 14 일, 21 일 또는 28 일, 더욱 바람직하게는 7 일 또는 14 일의 시간 간격만큼 떨어져 있는, 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 단계는 각각의 개별적인 투여 단계 후에 개별적으로 수행되는, 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개별적인 투여 단계들 중 첫 번째 단계는 상기 면역 요법제에 대한 상기 표준 용량 범위 미만인 상기 면역 요법제의 용량의 투여이고, 상기 개별적인 투여 단계들 중 후속 단계에서 투여되는 용량은 상기 개별적인 투여 단계들 중 첫 번째 단계에서 투여되는 용량보다 선택적으로 높은, 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 적어도 하나의 부작용의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 적어도 하나의 부작용은 용인 가능하지 않은 부작용인, 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 단계 (c)는 각각의 개별적인 투여 단계 후에 수행되는, 방법.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 모든 후속 용량은 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되지 않는 상기 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 후속 투여될 상기 면역 요법제의 다음 용량은 이전 투여 단계에서 투여된 용량과 동일하거나 그 미만인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 이전 투여 단계에 바로 이어지는 상기 후속 투여 단계에, 단계별로 용량 상승 계획을 선택적으로 나타내는 하나 이상의 추가의 투여 단계가 추가로 뒤따르는, 방법.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 상기 다수의 상이한 용량 중 하나의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 후속 투여될 상기 면역 요법제의 다음 용량은 이전 투여 단계에서 투여된 용량 미만인, 방법.
- 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항독성제는 해열제, 바람직하게는 파라세타몰(아세트아미노펜)을 포함하는, 방법.
- 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부작용은 감각이상, 피로, 두통, 근육통, 흉부 압박감 또는 흉부 통증, 떨림, 고열 또는 발열, 이명, 관절 통증, 현기증, 발한, 근긴장저하(hypotonia) 및 빈맥 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
- 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 부작용이 검출되지 않는 경우, 상기 적어도 하나의 면역학적 반응이 상기 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은, 상기 개체로의 상기 면역 요법제의 투여를 위한 적합한 용량을 반영하는, 방법.
- 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되고 상기 적어도 하나의 면역학적 반응이 상기 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는, 후속 투여 단계에서의 용량은 상기 개체로의 상기 면역 요법제의 투여를 위한 적합한 용량을 반영하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 상기 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 부작용이 검출되지 않는 경우, 상기 적어도 하나의 면역학적 반응이 허용 가능한 치료 효과의 가장 강한 표시를 제공하는 용량은 상기 개체로의 상기 면역 요법제의 투여를 위한 적합한 용량인, 방법.
- 제37항에 있어서, 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여된 상기 다수의 상이한 용량 중 임의의 것의 투여 후에 적어도 하나의 부작용이 검출되는 경우, 상기 부작용이 검출되지 않거나 가장 덜 심각하거나 그렇지 않으면 질병의 중증도를 고려하여 허용 가능한 것으로 간주되는 최고 용량은 상기 개체로의 상기 면역 요법제의 투여를 위한 적합한 용량인, 방법.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 적합한 용량은 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여하기 위한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 사람 대상체인, 방법.
- 개체를 적합한 용량의 면역 요법제로 치료하는 방법으로서,
(a) 다수의 상이한 용량의 상기 면역 요법제를 상기 개체의 면역 반응성 물질과 개별적으로 접촉시키는 단계,
(b) 상기 면역 요법제의 상기 다수의 상이한 용량에 의해 유발되는 적어도 하나의 면역학적 반응을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 면역학적 반응이 상기 면역 요법제에 대한 허용 가능한 치료 효과를 나타내는 용량은 상기 개체에게 투여하기 위한 적합한 용량을 반영하는, 단계, 및
(c) 상기 면역 요법제를 상기 적합한 용량으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 개체를 적합한 용량의 면역 요법제로 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 적합한 것으로 결정된 상기 면역 요법제의 용량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 적합한 용량의 상기 면역 요법제는 적어도 하나의 항독성제와 함께 투여되는, 방법.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 요법제는 하나 이상의 네오에피토프(neoepitope)를 코딩하는 핵산인, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥 RNA인, 방법.
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