CN1757396A - 一种海狗油注射乳剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海狗油注射乳剂及其制备方法，所述的海狗油注射乳剂包括21－50％的纯化海狗油、0.6－1.4％的乳化剂、1－5％的等渗调节剂、0.005－0.02％的抗氧化剂和注射用水，注射乳剂的油滴大小适当，粒度均匀，质量稳定，易于工业化生产，可满足特殊病理状态下的能量输入要求，如糖代谢有障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者，大大提高了海狗油的生物利用度。本发明同时还公开了其制备方法，本制备方法运用超声乳化等技术对纯化海狗油进行乳化，得到本发明的海狗油注射乳剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种海狗油注射乳剂及其制备方法。
背景技术
海狗系深海哺乳动物，生活在北极圈以内-50℃的高寒水域中，以名贵的鳕鱼为食，皮下有厚厚的脂肪层，体内富含ω-3多烯脂肪酸。以加拿大北部无污染海域海狗脂肪为原料提炼出的海狗油，其中不仅含有三种重要的ω-3多烯脂肪酸：EPA(Eic-osapen-taenoicAcid，二十碳五烯酸)、DPA(Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸)和DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)，而且总含量在20％以上。医学界经过多年的研究已经证实，这三种脂肪酸对人体有多种独特的生物学活性：EPA具有改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压和血糖以及抗炎作用；DHA和DPA具有营养大脑、促进胎儿和儿童大脑发育、保护视力、调节免疫和抗癌作用，其中DHA又被称作“脑黄金”。近期人们又发现它们对一些疾病具有治疗作用：EPA已被开发作为治疗动脉硬化和高血脂的药物；还发现海狗油对II型糖尿病、脂肪肝和前列腺炎具有治疗和预防作用。
人体自身不能合成ω-3多烯脂肪酸，只能从外界摄取，深海冷水鱼油中虽然也还有ω-3多烯脂肪酸，但其与海狗油相比除含量一般较低外，还有以下重大区别：
1.海狗与人类同为哺乳类动物，其体内甘油脂的化学结构与人类相似，ω-3多烯脂肪酸一般位于甘油三脂的1、3位，而鱼是低级冷血动物，ω-3多烯脂肪酸位于甘油三脂的2位，要经过人体肝脏代谢后才能利用。因此海狗油的ω-3多烯脂肪酸相比之下有更好的生物利用度，且不会增加肝脏负担。
2.海狗油中还含有2-3％的角鲨烯，这也是鱼油中没有的，这种物质有效抑制生物中不良胆固醇的吸收并加速其代谢，还具有防癌作用，另外对皮肤也有滋润作用。
3.海狗油中不仅富含EPA和DHA，并且富含DPA，而大多数鱼油中DPA含量很低。
4.海狗油中几乎不含胆固醇，而大多数鱼油总却含有较多胆固醇。
人体中的EPA、DHA、DPA主要有两个来源：一是从膳食中获得，这是最主要的来源；二是由α-亚麻酸(Linolenic Acid，LA，18：3-3)经去饱和酶(desaturating enzyme)和链延长酶(elongating enzyme)的作用代谢而来，即LA→EPA→DPA→DHA。但人体的这种合成能力极其有限，且必须以LA的大量存在为基础。
在体内代谢中-3脂肪酸和-6脂肪酸竞争去饱和凝血恶烷(TX2)及四不饱和白三烯(LT4)，统称双不饱和类二十烷酸(eicosanoids)，主要有血管收缩和促凝集作用，同时兼有血管舒张和抗凝集作用；而-3脂肪酸代谢生成三不饱和前列腺素(PG3)、三不饱和凝血恶烷(TX3)及五不饱和白三烯(LT5)，这些特质皆为局部激素，虽然其半衰期甚短(约1～2分钟)，但却具有多种生理活性，且作用极强，主要有血管舒张、抗凝集及拮抗双不饱和类二十烷酸的作用。同时-3脂肪酸抑制膜磷脂花生四烯酸的游离和生成PG2、TX2等炎症介质。因此在高-3脂肪酸饮食的人群中其血管动脉硬化疾病发生率明显偏低。
EPA、DHA、DPA的生理功能：
EPA，又称“血管清道夫”，不能通过血脑屏障进入大脑，主要作用于心血管系统，具有以下生理学效应：
改善血液循环人：促进血管壁内皮细胞生长，抑制血小板聚集，增加血细胞变形能力，降低血液粘度，对脑血心肌梗塞等有预防作用。
调整血脂：降低甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)，防止和治疗动肪硬化、高血脂。
降低血压：EPA可降低内源性血管活性物质对血管的反应，其代谢物PG13、PGD3也可直接作用于血管壁，PGD3还可影响去甲肾上腺素的释放和功能，从而使血压下降。
抗炎作用：EPA蓄积量增加可竞争性抑制花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的代谢，减少二烯PG和四烯LT的产生。已知PGE2和LTB4是重要的内源性炎症介质，减少他们含量可减轻局部炎症损伤。
降血糖：动物试验表明EPA可降低血糖浓度，其机制可能是通过影响胰岛素的释放、提高胰岛素水平起作用。
基于以上作用，EPA已被开发作为治疗动脉硬化和高血脂的药物。
DHA，又称“脑黄金”，很容易通过血脑屏障进入大脑，主要作于神经系统。EPA的作用它基本上都有，只是比EPA作用稍弱。另外它还眕以下生理学效应：
营养大脑：人脑细脂质中有10％是DHA，其对脑细胞的形成、生长发育及脑细胞突起的延伸、生长都起着重要作用，故其可改善学习能力，改善记忆力，防止早老性痴呆，还具有镇表催眼作用。
保护视力：DHA是视网膜和视神经的重要组成成分，其可改善视力，防止和治疗视力低下。
促进胎儿和儿童大脑发育：DHA可通过胎盘进入胎儿的肝脏和大脑，胎儿从怀孕后期到出生6个月，脑和视网膜发育最快，需要充足的DHA。如果DHA摄入偏低，婴儿出生体重可能偏低，并且容易早产。人母乳中DHA含量很高，约7-22mg/100ml。
调节免疫：DHA也可代谢生成PG、TX、LT等免疫活性物质，参与机体免疫调节，可抗特异性皮炎、支气管哮喘、花粉热，并可防止和治疗风温病。
抗癌作用：动物学试验数据和流行病学调查资料显示，大剂量DHA有抑制肿瘤作用，其可抑制癌细胞增殖，控制癌细胞转移，尤其对乳腺癌明显，对结肠癌和肺癌也有作用。
DPA，具有和DHA类似的作用，此外还有许多作用，目前尚未完全研究清楚，但引人注目的是，人乳分析中DPA含量也很高，且同样是人脑组织和神经细胞的重要组成成分。日本东京医院及其他一些大学的研究认为：EPA对血管壁内皮细胞的促生长作用，其实是代谢成DPA后的作用。
因此，海狗油相对于鱼油具有更高的应用价值，可帮助人们战胜糖尿病、脂肪肝、冠心病等长期困扰人类的“现代文明病”。
为了使海狗油剂型多样化，提高海狗油的生物利用度，同时满足特殊病理状态下的给药要求，可将纯化后的海狗油做成脂肪注射乳剂。但是，海狗油脂肪酸组成比较复杂，其初制品中大部分为单不饱和脂肪酸，约占60％，饱和脂肪酸约占13％，我们所关心的具有重要生物活性的三种ω-3多烯脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)-EPA、DHA、DPA总含量才21％左右，为提高PUFA含量，提高海狗油品质，我们必须对其初制品进行纯化，以满足注射要求。
制成注射乳剂后，不仅可提高海狗油的生物利用度，而且还可以满足特殊病理状态下的能量输入要求，如糖代谢有障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者。
脂肪乳剂是将脂肪油在高剪切力作用下以小液滴状态于水相中形成的水包油型亚微乳。亚微乳属于热力学不稳定体系，其油相被分散后表面积增大，势能增加，油滴有相互聚集并从水相析出的倾向，因此制备亚微乳的的关键就是稳定性问题。解决方法是制备中加入一定量的乳化剂和稳定剂，并且要控制乳剂油滴结构和粒径大小。目前乳剂颗粒是按照乳糜微粒的结构设计的，乳糜微粒中间是含甘油三酯、维生素E、K及胆固醇酯的核心，外周由磷脂及游离胆固醇构成，其直径在100-500nm之间，平均为200-350nm。
脂肪乳注射液的历史与现状，1920-1930年间，日本学者曾用蓖麻油为原料首先人工合成脂肪乳剂并试用于动物，但因严重毒性未能推广。1962年以大豆油为基础的脂肪乳剂Intralipid在美国诞生，但问世不久就因其毒素性及副作用被FDA宣布停用。1973年Solassol等首先介绍了三合-(All-in-AIL)溶液的概念，证明脂肪乳剂和其他营养液可混合于一个瓶内，在一定条件和时间内可保持稳定和营养支持效果。这一改进大大简化了肠外营养液的配制和输注，为脂肪乳剂的临床应用拓宽了道路。1975年美国制造了第二静脉脂肪乳Liposyn，此后20多年，Intralipid在世界各地得到了广泛应用，德、法、日等国相继发展了本国的脂肪乳剂，目前世界上至少已有20多种脂肪乳剂面市。
我国60年代也曾试制过静脉脂肪乳，但并无产品面市。80年代末我国与瑞典Kabi公司合资创立华瑞制药有限公司，生产Intralipid供临床应用。此后又有北京费森尤斯医药公司生产的低磷脂静脉脂肪乳Lipoven(力能)面市。另外广州侨光制药厂、广州绿十字药业有限公司也生产静脉脂肪乳。
二.脂肪乳注射液的用途
静脉脂肪乳剂的应用被认为是胃肠外营养(Parenteral Nutrition)支持治疗发展过程中的重要里程碑之一，它为严重创伤、感染、消化不良、恶性肿瘤及手术前后不能进食的患者提供了一个高热量营养物，并可防止和纠正机体必须脂肪酸的缺乏。严重和长期的疾病会使机体对必须脂肪酸和能量的需求增加，但同时机体对碳水化合物的利用率增加50％-250％。因此在严重疾病中应用脂肪乳作为胃肠外营养是非常合适的。胃肠外营养中应用脂肪乳剂具有以下好处。
★为机体提供生物膜和生物活性物质代谢所需的多不饱合脂肪酸(Polyunsaturated FattyAcids，PUFAs)。
★提供高能量：1.0g脂肪氧化产生37.7kJ热量，而且乳剂可制成与体液等渗，有利于在较少容量和等渗状态下输入足够能量，使经周围静脉完全肠外营养成为可能。
★改善静脉注射液成分：经中心静脉输入时，加入脂肪乳剂降低了葡萄糖的浓度，减少了静脉炎的发生危险，减少由于单纯高渗葡萄糖输注引起的高渗性利尿、脱水等代谢紊乱。
★保证特殊状态下能量输入：脂肪氧化不依赖于胰岛素，可用于糖代谢障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者。
★减轻呼吸系统负荷：脂肪氧化时呼吸商值下降，减少了CO2的产生，对呼吸衰竭及呼吸系统功能障碍病人有利。
三.传统脂肪乳注射液的不足之处
目前市场提供的传统脂肪乳在脂肪性质方面目前尚不令人满意，其多由大豆油(soybeanoil)或红花油(saffower oil)制得，而这两者中ω-3脂肪酸含量低。大豆油中ω-3脂肪酸占全部脂肪酸7％，红花油中约1％。
ω-3和ω-6脂肪酸都为人体必须，但需要量不同，且两系脂肪酸不能互相转变。代谢中两系脂肪酸竞争去饱合和延长酶，因此，在传统脂肪乳所提供的高亚油酸环境中，ω-3脂肪酸的去饱合会降到极低水平。因此，尽管在大豆油中ω-3脂肪酸可占全部脂肪酸7％，但其基本无生物活性。
体内ω-6脂肪酸代谢生成双不饱合前列腺素(PG2)、双不饱合凝血恶烷(和TX2)及四不饱合白三烯(LT4)统称双不饱合类二十烷酸(eicosanoids)，主要有血管收缩和促凝集作用，同时兼有血管舒张和抗凝集作用；而ω-3脂肪酸代谢生成三不饱合前列腺素(PG3)、三不饱合凝血恶烷(TX3)及五不饱和白三烯(LT5)，主要有血管舒张、抗凝集及拮抗双不饱和类二十烷酸的作用。因此在高ω-3脂肪酸饮食的人群中其血管动脉硬化疾病发生率明显偏低。
在正常状态下，双不饱和类二十烷酸间的相互拮抗作用有一个平衡。但在重病人(象手术后多发性创伤侵袭性代谢病人，败血症病人和进行人工呼吸的病人)增强因子(像组胺、缓激肽、补体因子)的影响下，平衡会向类二十烷酸潜在的不利方面移动(血管收缩、促凝集、促炎症反应)。这时如果再给予传统脂肪乳，这种不利作用就会被给予的较高亚油酸增强。
目前许多国家以将营养型输液脂肪乳成功的应用于临床，但这些乳剂在原料油性质方面尚不令人满意，其中不饱和脂肪酸绝大部分为ω-6型，而ω-3多不饱和脂肪酸含量很低。因此，现在迫切需要一可用于侵袭后代谢的新型脂肪乳剂，该乳剂应含较少的ω-6脂肪酸，代之以含较多ω-3脂肪酸，这样ω-6脂肪酸绝大部分进入细胞膜，其相应的类二十烷酸的作用减弱。纯化后的海狗油ω-3脂肪酸含量很高，可完全满足这一要求，而且还有其独特的药理作用。海狗油制成注射乳剂后，不仅可提高海狗油的生物利用度，而且还可以满足特殊病理状态下的能量输入要求，如糖代谢有障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者。
注射乳剂是将油相在高剪切力作用下以小液滴状态分散于水相中形成的水包油型亚微乳，其乳滴粒径平均在0.5μm左右，油相被分散后表面积增大，势能增加，油滴有相互聚集并从水相析出的倾向，因此注射乳剂在热力学和动力学上均属于不稳定系统。所以制备注射乳剂首先要解决乳剂的物理稳定性问题，这就要求选用高纯度原料和毒性低、乳化力强的乳化剂，采用合理的处方、严格的制备技术和必要的设备，以便制得油滴大小适当、粒度均匀、质量稳定的产品。
发明内容
本发明公开了一种海狗油注射乳剂，所述的注射乳剂可满足特殊病理状态下的能量输入要求，如糖代谢有障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者，大大提高了海狗油的生物利用度。
本发明同时还公开了其制备方法，运用超声乳化等技术对乳剂进行乳化，所制得的注射乳剂油滴大小适当，粒度均匀、质量稳定，易于工业化生产。
本发明的目的在于提供一种海狗油注射乳剂，包括如下主要成分：21-50％的纯化海狗油、0.6-1.4％的乳化剂、2-3％的等渗调节剂、0.005-0.02％的抗氧化剂和注射用水，其中的百分数指重量百分数，下同。
其中，纯化海狗油在选定范围内的浓度变化对乳剂稳定性影响很小，可任选21-50％的其中一种，优选为21-30％。
优选的，所述的纯化海狗油中三种ω-3多烯脂肪酸——EPA、DPA和DHA的总含量为40-80％。
优选的，所述的纯化海狗油中的三种ω-3多烯脂肪酸的含量分别为：EPA 10-20％，DHA25-30％，DPA 15-20％。
乳化剂在海狗油注射乳剂的形成以及保持乳剂的稳定性中起着非常重要的作用，乳化剂被吸附于乳滴的表面，能显著降低油水两相界面的表面张力，并能在乳滴周围形成牢固的乳化膜，从而使乳剂具备较好的物理稳定性。本发明选用0.2％的F68+1.2％的蛋黄卵磷脂、1.2％的蛋黄卵磷脂或0.6％的蛋黄卵磷脂中的任意一种作为乳化剂，优选为1.2％的蛋黄卵磷脂。
在注射乳剂中必须加入等渗调节剂以使静脉注射乳剂与人体血液渗透压保持一致，本发明的等渗调节剂可选甘油、山梨醇、葡萄糖或氯化钠中的任意一种，优选为2.5％的甘油。
当乳剂中的油脂核卵磷脂被以0.5μm左右的小油滴分散在水相中时，其比表面积极大，当贮存不当时极易氧化。油脂氧化后会产生过氧化物对人体不利，卵磷脂氧化也会产生能溶血的有毒物质，因此必须在注射乳剂中加入抗氧化剂。抗氧化剂可为维生素E、二叔丁基对甲苯酚或对羟基叔丁基茴香醚中的任意一种。常用的抗氧化剂为维生素E，就抗氧化作用而言，δ-维生素E作用最强，α-维生素E作用最弱。由于维生素E的少量加入对乳剂的稳定性基本无影响，所以本发明优选0.01％的δ-维生素E作抗氧化剂。
优选的，为使所形成的注射乳剂更稳定，在海狗油注射乳剂中还可以加入0.01-0.3％的稳定剂。一些具有长链结构同时有油水双亲性质的表面活性剂，其可以嵌入到油水界面的乳化膜中，增大分子间作用力和乳滴表面静电荷，提高膜稳定性。所述的稳定剂可为油酸钠、胆酸、脱氧胆酸、硬脂酸纳或醋酸胆固醇中的任意一种，最优选为0.3％的油酸钠。
优选的，海狗油注射乳剂包括如下成分：30％的纯化海狗油，1.2％的蛋黄卵磷脂，2.5％的甘油，0.01％的δ-维生素E、0.3％的油酸钠和注射用水。
本发明所得到的一种海狗油注射乳剂经测定，其中三种多烯脂肪酸的含量为：二十碳五烯酸(EPA)3-8％，二十二碳五烯酸(DHA)5-10％，二十二碳六烯酸(DPA)4-9％。
优选的，三种多烯脂肪酸的含量为：EPA 4-5％，DHA7-8％，DPA5-6％。
对乳剂进行理化性质的测定得，甘油含量为23-25mg/ml，乳剂pH值为7.0-9.0，碘值为80-120，过氧化值为0.1-0.5，游离脂肪酸值为0.1-0.5。
本发明的海狗注射乳剂经测定，乳粒细度：＞1μm乳粒数/＞0.5μm乳粒数的百分比为0.5-1.5％，乳粒的最大粒径平均值为2μm。其乳滴平均粒径均在0.5μm以下，无大于1μm乳滴，符合中国药典对注射乳剂的要求。
经过稳定性影响因素考察试验，所制得的海狗油注射乳剂在60℃高温和4500lx光照下不稳定，在40℃高温条件下基本稳定。加速试验表明该乳剂在30℃+2℃的条件下6个月内稳定；长期试验表明该乳剂在25℃+2℃的条件下12个月内稳定。
本发明所制得的海狗油注射乳剂的急性毒性试验如下：
选用体重为12公斤左右的狗6条，在动物正常清醒状态下，以0.2g脂肪/公斤体重的剂量，一次静脉滴注给药，一周后病理切片检查各组织细胞均无明显异常，结果表明本发明产品无毒性。
临床试验6例成年人经静脉输注本发明的海狗油注射乳剂后，结果表明，血甘油三酯水平，血总胆固醇浓度基本无变化并略有下降。
本发明的另一目的在于提供一种海狗油注射乳剂的制备方法，包括以下步骤：
1.取10％的注射用水，加热至40-70℃，按上述比例取各成分，加入乳化剂，破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用4-10倍于等渗调节剂的注射用水将等渗调节剂溶解，过滤后加入磷脂分散液中；
3.取纯化海狗油，将抗氧化剂溶解在油中，经过滤后加热到40-70℃，然后加入到磷脂分散液中，然后再加入注射用水使所制得的海狗油注射乳剂包括10-50％的纯化海狗油、0.6-1.4％的乳化剂、1-5％的等渗调节剂和0.005-0.02％的抗氧化剂和注射用水，然后超声乳化5-30分钟使成均匀初乳液；
4.初乳液用孔径为20-30μm的滤过器滤过，然后用高压匀质机连续乳化3-10次，均质压力为210-800bar；
5.调乳液pH值至7.0-9.0左右，再用孔径为4.5-9μm的滤过器滤过，灭菌即得乳剂产品。
其中，在步骤2中，还可以加入0.01-0.3％的稳定剂。
其中，所述的两相混合温度在40-70℃之间，优选为55℃。
步骤2、3中过滤可采用0.1-0.3μm膜过滤，优选为0.2μm膜。
所述的初乳超声时间为5-30分钟，但初乳超声时间10分钟和30分钟差别不大，说明超声到一定时间后再延长时间已无太大意义，故优选为15分钟。
所述的均质压力为210-800bar，优选为550bar。
初乳乳化时，所述的过滤器的孔径为20-30μm，以G1垂熔玻璃滤过器为好，最后过滤时，滤过器的孔径为4.5-9μm，以G3垂熔玻璃为好。
过高或过低的pH值会影响乳剂的稳定，同时在静脉输注时会引起患者的不适，此外乳剂在放置过程中会由于甘油三酯和磷脂的水解而引起pH值的缓慢降低，这种水解速率与最初的pH值有关，当乳剂偏碱性时可减缓水解，因此本发明调节乳剂pH值在7.0-9.0之间。乳剂pH值在选定的范围内对稳定性影响很小，考虑到乳剂的长期稳定性，优选为8.0。
优选的，海狗油注射乳剂的制备包括以下步骤：
1.取10％注射用水，加热到55℃，加入1.2％的注射用蛋黄卵磷脂作乳化剂，破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.取2.5％甘油为等渗调节剂，0.3％的注射用油酸钠为稳定剂，加10％注射用水溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取30％纯化海狗油，将0.01％的δ-维生素E溶解在油中，经0.2μm膜滤过后加热到55℃，然后加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油加完后再加入55.99％的注射用水，然后继续超声乳化15分钟成均匀初乳液；
4.初乳液用孔径为20-25μm的滤过器滤过，然后用高压匀质机在550bar压力下连续乳化10次；
5.用0.5mol/L NaOH调乳液Ph值至8.0，再用孔径为4.5～6μm的滤过器滤过，100℃灭菌45分钟，得乳剂样品。
本发明所述的乳剂制备方法的整个操作在洁净度为100级的无菌间进行，所有与乳剂原辅料接触的器具均高压灭菌，高压均质机和超声波破碎仪等不便高压的仪器均用足量无菌水冲洗。分装乳剂的安瓿经250℃35分钟除热源，使用前存放时间不应超过24h。乳剂从生产到灭菌必须在12h内完成。
为测定海狗油中脂肪酸的含量，本发明提供一种脂肪油中有效成分的测定方法，包括以下步骤：
1)脂肪油的衍生化处理：
取脂肪油80-120μl，置于10-200ml量瓶中，加入0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸终止反应，用含0.001％-0.005％抗氧化剂的醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液：
2)色谱进样分析
取衍生处理后的脂肪油，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，流速：
1.1-1.5ml/min，
柱温：15-45℃，
检测波长：202～230nm，
进样量：5～50μl：
3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。
其中，所述的脂肪油为鱼油、植物油或海狗油等含有三种多烯脂肪酸EPA、DPA和DHA的脂肪油，所测定脂肪油中的有效成分是指三种ω-3多烯脂肪酸：EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可测定这三种脂肪酸中的一种或多种，本方法尤其适合海狗油中这三种ω-3多烯脂肪酸的测定。
衍生化反应中所述的醇的碱金属盐可为甲醇钠、乙醇钠或甲醇钾等，优选为甲醇钠，甲醇钠在15天以内催化衍生化能力基本无变化。其浓度为0.2-1.0mol/L，优选为0.5-0.8mol/L。
所述的抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚、对羟基叔丁基茴香醚等，终止反应所用的酸为冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸等，定容所用的醇为甲醇、乙醇等。
优选的，本发明所述的衍生化处理在0-60℃下反应5-30分钟，为了便于操作，衍生化反应更优选在室温下进行，反应15分钟。
所述的衍生化处理方法优选为：取脂肪油100-120μl，置于10-200ml量瓶中，加入0.5-0.8mol/L的甲醇钠4-6ml，摇匀，室温反应15-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸终止反应，用含0.003％-0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
本发明色谱仪所用的色谱柱可为：Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；WatersSymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm和Lichrospher RP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。以RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号为好。如Waters高效液相色谱仪，Lichrospher高效液相色谱仪，Mightsil高效液相色谱仪。优选为，液相色谱仪为RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号。
在选择色谱仪的色谱条件时，发现检测波长在202～230nm之间均可，其中210nm处三种脂肪酸吸收较强且稳定，精密度也符合药典要求，故检测波长选用210nm。
本发明选择甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统三种系统中的任意一种作为流动相进行等梯度洗脱；经反复调试，改变比例，最终发现乙腈甲醇水系统最好，在其比例为7∶1∶2流速逐渐提高至1.1-1.5ml/min，最后发现在流速为1.2ml/min时各项指标达到最佳。所以流动相优选为乙腈甲醇水系统，三者比例为7∶1∶2，流速为1.2ml/min，同时柱温选择在15-45℃。
所述的衍生化处理方法最优选为：取脂肪油120μl，置于100ml容量瓶中，加入0.5mol/L甲醇钠4ml，摇匀，室温反应15～30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005％BHT的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
本发明同时提供一种海狗油中有效成分的测定方法，所述的测定方法包括以下步骤：
1)海狗油的衍生化处理：
取海狗油80-120μl，置于10-200ml量瓶中，加入0.2-1.0mol/L甲醇钠4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸终止反应，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液；
2)色谱进样分析
取衍生处理后的海狗油供试品溶液，注入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，流速：
1.1-1.5ml/min，
柱温：15-45℃，
检测波长：202-230nm，
进样量：5～50μl；
3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。
其中，所测定海狗油中的有效成分是指三种ω-3多烯脂肪酸：EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸中的一种或多种。
所述的衍生化处理方法优选为：取海狗油120μl，置于100ml容量瓶中，加入0.5mol/L甲醇钠4ml，摇匀，室温反应15～30分钟，再加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液。
另外，本发明还提供一种纯化海狗油，所述的纯化海狗油中三种ω-3多烯脂肪酸-二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的总含量显著提高，同时海狗油的特异腥味基本被脱除干净，物理性状大为改善。
本发明所提供的一种纯化海狗油中三种ω-3多烯脂肪酸的含量分别为：EPA 10-20％，DHA25-30％，DPA 15-20％。
优选的，纯化海狗油中三种ω-3多烯脂肪酸的含量分别为EPA14-16％，DHA 26-28％，DPA17-19％。
最优选的，纯化海狗油中三种ω-3多烯脂肪酸的含量分别为：EPA15-16％，DHA26-27％，DPA18-19％。
本发明所述的一种纯化海狗油的酸值为0.1-0.5，碘值为250-300，过氧化物含量为0.10-0.15。
本发明的同时提供一种纯化海狗油的制备方法，该方法先将天然海狗油酯化，然后应用多级分子蒸馏纯化技术对酯化后的海狗油进行纯化并得到了纯化海狗油。
本发明所提供的一种纯化海狗油的制备方法包括以下步骤：
1)海狗油的酯化处理
取原料海狗油，与含0.001％-0.005％抗氧化剂的等体积的0.5-1.0mol/L的醇的碱金属盐相混合，加入冰醋酸调pH值到6.5-7.5，海狗油中的多烯脂肪酸被酯化；
2)分子蒸馏纯化
a)脱气：将物料在50-70℃预热后进入分子蒸馏装置，进料速率650-750ml/h，蒸馏温度80℃，系统绝压0.04～0.06mbar，刮膜转子速度110-170rpm，多烯脂肪酸乙酯进入重组分；
b)第一步分离：取上步重组分进样蒸馏，60-110℃预热，进料速率90-1800ml/h，蒸馏温度60-110℃，系统绝压0.001～0.03mbar，刮膜转子速度100-500rpm；可重复蒸馏1-5次；
c)第二步分离：再取上步重组分进样，15-70℃预热，进料速率90～1800ml/h，100～120℃蒸馏，系统绝压0.001～0.03mbar，刮膜转子速度100-500rpm，收集轻组分即得纯化海狗油。
由于天然海狗油中的脂肪酸均以混甘油三酯的形式存在，其沸点很高不易汽化，而且海狗油成分复杂，甘油三酯的1位、2位和3位上可能分别是饱和度和碳链长度差异极大的不同脂肪酸。为了纯化其中的三种ω-3多烯脂肪酸，必须先将其从甘油三酯上解离下来。通过转酯化可达到这一目的，并生成沸点较低、易于汽化且较稳定的单酯形式。
优选的，纯化海狗油的制备包括以下步骤：
1)海狗油的酯化处理：
取原料海狗油，与含0.003％-0.005％抗氧化剂的等体积的0.5-0.8mol/L的醇的碱金属盐相混合，加入冰醋酸调pH值到6.8-7.2，海狗油中的多烯脂肪酸被酯化；
2)分子蒸馏纯化
a)脱气：将物料在55-65℃预热后进入分子蒸馏装置，进料速率680-720ml/h，蒸馏温度80℃，系统绝压0.04～0.05mbar，刮膜转子速度130-150rpm，多烯脂肪酸乙酯进入重组分；
b)第一步分离：取上步重组分进样蒸馏，60-70℃预热，进料速率200-300ml/h，蒸馏温度70-90℃，系统绝压0.001～0.01mbar，刮膜转子速度100-200rpm；可重复蒸馏1-3次；
c)第二步分离：再取上步重组分进样，50-70℃预热，进料速率100～200ml/h，110～120℃蒸馏，系统绝压0.001～0.02mbar，刮膜转子速度100-200rpm，收集轻组分即得纯化海狗油。
所述的抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚或对羟基叔丁基茴香醚，酯化所用的醇的碱金属盐为乙醇的钠盐或钾盐，优选为乙醇钠，其摩尔浓度最优选为0.5mol/L。酯化反应的pH值可控制在6.5-7.5之间，最优选为7.1。
更优选的，纯化海狗油的制备方法包括以下步骤：
1)海狗油的酯化处理：
取原料海狗油，与含0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的0.5mol/L的等体积的乙醇钠相混合，室温下充氮搅拌10分钟加入冰醋酸调节pH值到7.1，减压旋转蒸发除掉乙醇，除掉下部少量固体即得乙酯化海狗油；
2)分子蒸馏纯化
a)脱气：物料预热温度60℃，进料速率720ml/h，蒸馏温度80℃，系统绝压0.040mbar，刮膜转子速度140rpm，多烯脂肪酸乙酯进入重组分；
b)第一步分离：取上步重组分进样，60℃预热，进料速率210ml/h，80℃蒸馏，系统绝压0.005mbar，刮膜转子速度140rpm；取重组分再进样，蒸馏温度改为85℃，进料速率90ml/h，其他同上；
c)第二步分离：再取上步重组分进样，60℃预热，120℃蒸馏，系统绝压0.012mbar，刮膜转子速度140rpm，进料速率150ml/h，收集轻组分即得纯化海狗油。
本发明所述的一种海狗油注射乳剂及其制备方法是本发明技术人员多年对海狗油注射乳剂的制备方法摸索的结果，具有以下优点：
1.本发明所述的海狗油注射乳剂可大大提高海狗油的生物利用度，而且还可以满足特殊病理状态下的能量输入要求，如糖代谢有障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者。经过实验证明：可满足特殊病理状态下的能量输入要求，如糖代谢有障碍者以及创伤、感染等应急状态下胰岛素耐受的患者。可发挥三种脂肪酸对人体的生物学活性：可以改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压和血糖以及抗炎；和营养大脑、促进胎儿和儿童大脑发育、保护视力、调节免疫和抗癌，并可作为治疗动脉硬化和高血脂的药物；还可对II型糖尿病、脂肪肝和前列腺炎具有治疗和预防作用。
2.乳剂处方筛选和工艺优化过程中一个关键的问题是如何评价乳剂的优劣，不同文献报道的方法各不相同，有离心法、稳定指数法、浊度法、粘度法、DLVO计算法、测定乳剂粒径及其分步法等，本发明对各种可操作的方法进行了尝试，发现只有测定乳剂粒径及其分布法才是最合适的，其他方法有的只能评价不太稳定的乳剂，对注射乳剂这种总体稳定性较高的乳剂之间的细小差别难以区分；有的则是误差较大，使理论计算结果与实际不符。
3.本发明经过处方研究和乳化技术工艺优化，筛选出了合适的海狗注射乳剂处方，找到了最佳的乳化条件，并制得了质量稳定的海狗注射乳剂。
4.本发明所述的海狗油注射乳剂产品以卵磷脂为乳化剂用湿胶法乳化，制得了质量稳定的海狗油注射乳剂，解决了乳剂的物理稳定性问题，所制得的乳剂油滴大小适当，粒度均匀、质量稳定，易于工业化生产。
5.本发明首次建立了海狗油注射乳剂中三种脂肪酸含量的HPLC测定方法。还参照药典，建立了乳剂中甘油的含量测定方法。
6.本发明首次建立了海狗油注射乳剂理化性质的测定方法，增加了碘值等检测项目。目前市售的脂肪乳质量标准中没有碘值这一项，因为它们大多为饱和脂肪酸乳剂，故无需检测碘值。海狗油注射乳剂以不饱和脂肪酸为主要成分，因此检测乳剂的碘值便成为一种控制海狗油注射乳剂质量的重要手段，据此本发明增加了该项检测。
7.本发明在测定酸值时，先用适量硫酸将脂肪酸游离出来，再进行滴定。油脂变质的另一重要表现是发生酸败，产生游离脂肪酸，因此可用酸值来衡量油脂酸败程度。但在注射乳剂生产过程中通常要加入氢氧化钠将其pH值调至8.0左右，直接用氢氧化钠滴定样品来测定酸值并不能完全反映乳剂中油脂的酸败程度，而本发明参照卫生部药品标准中相关方法先用适量硫酸将脂肪酸游离出来再进行滴定，这样就能更全面反映油脂酸败程度。
附图说明
图1为乳剂样品显微镜下照片
具体实施方式
以下为本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
实施例1
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取100克的注射用水，加热到40℃，加入2克的F68和12克的蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用40克注射用水将10克甘油溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取210克纯化海狗油。将0.05克的维生素E溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到40℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加入注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化5分钟使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为20μm，然后用高压匀质机在210bar压力下连续乳化3次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/L NaOH调乳液Ph值至7.0，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为4.5μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)为：EPAE 3.012％，DHAE5.856％，DPAE4.635％。其理化性质的测定结果为：pH值7.0，碘值80，过氧化值0.1，游离脂肪酸值0.1，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实施例2
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取100克注射用水，加热到55℃，加入1.2％蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用200克注射用水将25克山梨醇、3克注射用油酸钠溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取300克纯化海狗油，将0.1克二叔丁基对甲苯酚溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到55℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化10分钟左右使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为25μm，然后用高压匀质机在550bar压力下连续乳化5次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/L NaOH调乳液Ph值至8.0左右，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为7μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)为：EPAE 4.488％，DHAE7.876％，DPAE5.486％。其理化性质的测定结果为：pH值7.85，碘值97，过氧化值0.27，游离脂肪酸值0.39，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实施例3
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取60克注射用水，加热到70℃，加入6克蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用100克注射用水将50克葡萄糖和0.1克胆酸溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取500克纯化海狗油，将0.2克对羟基叔丁基茴香醚溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到70℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化30分钟左右使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为30μm，然后用高压匀质机在800bar压力下连续乳化10次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/LNaOH调乳液Ph值至9.0左右，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为9μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)测定结果为：EPAE7.889％，DHAE9.891％，DPAE8.962％。其理化性质的测定结果为：pH值8.96，碘值117，过氧化值0.50，游离脂肪酸值0.50，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实施例4
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取60克注射用水，加热到70℃，加入6克蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用400克的注射用水将50克氯化钠和1克脱氧胆酸溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取500克纯化海狗油，将0.15克维生素E溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到70℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化30分钟左右使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为30μm，然后用高压匀质机在800bar压力下连续乳化10次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/LNaOH调乳液Ph值至9.0左右，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为9μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)测定结果为：EPAE 7.889％，DHAE9.891％，DPAE8.962％。其理化性质的测定结果为：pH值8.96，碘值117，过氧化值0.50，游离脂肪酸值0.50，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实施例5
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取180克注射用水，加热至50℃，加入6克蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用100克注射用水将20克甘油和1克脱氧胆酸溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取300克纯化海狗油，将0.1克维生素E溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到70℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化30分钟左右使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为30μm，然后用高压匀质机在800bar压力下连续乳化10次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/LNaOH调乳液Ph值至9.0左右，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为9μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)测定结果为：EPAE 7.889％，DHAE9.891％，DPAE8.962％。其理化性质的测定结果为：pH值8.96，碘值117，过氧化值0.50，游离脂肪酸值0.50，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实施例6
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取60克注射用水，加热到70℃，加入6克蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用100克注射用水将50克葡萄糖和0.1克硬脂酸钠溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取300克纯化海狗油，将0.2克对羟基叔丁基茴香醚溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到70℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化30分钟左右使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为30μm，然后用高压匀质机在800bar压力下连续乳化10次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/L NaOH调乳液Ph值至9.0左右，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为9μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)测定结果为：EPAE7.889％，DHAE9.891％，DPAE8.962％。其理化性质的测定结果为：pH值8.96，碘值117，过氧化值0.50，游离脂肪酸值0.50，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实施例7
制备1000克海狗油注射乳剂，包括以下步骤：
1.取60克注射用水，加热到70℃，加入6克蛋黄卵磷脂，用超声波破碎仪破碎至呈均匀磷脂分散液；
2.用100克注射用水将50克葡萄糖和0.1克醋酸胆固醇溶解，用0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3.取300克纯化海狗油，将0.2克对羟基叔丁基茴香醚溶解在油中，经0.2μm膜滤过后也加热到70℃，然后缓慢加入磷脂分散液中，边加边超声乳化，油的加入速度以水面无肉眼可见油滴出现为限，油加完后再加注射用水至1000克乳剂，然后继续超声乳化30分钟左右使成均匀初乳液；
4.初乳液用G1垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为30μm，然后用高压匀质机在800bar压力下连续乳化10次，每次尽量让乳液全部通过高压匀质机；
5.用0.5mol/LNaOH调乳液Ph值至9.0左右，再用G3垂熔玻璃滤过器滤过，该滤过器的孔径为9μm，取样显微镜检，当乳剂粒径合格后分装于10ml安瓿中，部分分装于1ml安瓿中，充高纯氮气，熔封；
6.1ml安瓿100℃灭菌30分钟；10ml安瓿100℃灭菌45分钟，所得乳剂样品4℃贮存，不可冰冻。
所制得的海狗注射乳剂乳剂中EPAE、DHAE、DPAE百分含量(w/w)测定结果为：EPAE7.889％，DHAE9.891％，DPAE8.962％。其理化性质的测定结果为：pH值8.96，碘值117，过氧化值0.50，游离脂肪酸值0.50，注射乳剂的乳滴平均粒径经检测均在0.5μm以下。
实验例1
本实验例在于海狗油静脉乳剂的初步稳定性考察。
按照《中华人民共和国药典》2000年版二部附录XIXC药物稳定性试验指导原则，对自制的乳剂样品进行了初步稳定性考察。
1考察内容
1.1影响因素试验
1.1.1高温试验
取自制乳剂样品，60℃下放置于台式干燥箱(天津市中环试验电炉有限公司DL-202RS型)中10天，分别于第5、10天取样，进行项目考察。若供试品有明显变化(如含量下降5％)，则在40℃条件下同法进行试验。
1.1.2强光照射试验
取自制乳剂样品，在照度为4500lx的条件下放置10天，分别于第5、10天取样，进行项目考察。
1.2加速试验
取模拟上市包装的自制乳剂样品，在温度30℃±2℃的条件下放置6个月，分别于第0、1、2、3、6个月末取样，进行项目考察。
1.3长期试验
取模拟上市包装的自制乳剂样品，在温度25℃±2℃的条件下放置12个月，分别于第0、3、6、9、12个月末取样，进行项目考察。
2考察项目及方法
2.1物理稳定性项目
2.1.1外观
直接目测
2.1.2乳粒细度
样品充分振摇，取一滴(约5μl)置载玻片上，覆以盖玻片，再加一滴香柏油于盖玻片上，用具有1μm分度目镜的高倍显微镜(1000倍)对每个样品检测5个视野(见图1)，计数大于1的乳粒数，估算大于0.5μm的乳粒数，乳剂评价以1μm以上乳粒占0.5μm以上乳粒的百分比为指标，该数值越小，表示大乳粒越少，乳粒分布越均匀，乳剂就越稳定。
乳粒细度是评价乳剂物理稳定性的一个重要指标，因为乳滴愈小、粒径分布愈均匀，乳剂就愈稳定。
2.2化学稳定性项目
2.2.1pH值
2.2.2碘值
参照《中华人民共和国药典》2000年版二部附录VIH方法测定；精密量取0.5ml样品，置250ml的干燥碘瓶中，加氯仿10ml，溶解后精密加入溴化碘溶液25ml，密塞，摇匀，在暗处放置30分钟。加入新制的碘化钾试液10ml与水100ml，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定剩余的碘，滴定时注意充分振摇，待混合液的棕色变为淡黄色，加淀粉指示液1ml继续滴定至蓝色消失；同时做空白实验。以样品消耗硫代硫酸钠滴定液的容积(ml)为A，空白试验消耗的容积(ml)为B，样品容积(ml)为V，照下式计算碘值：
样品碘值＝((B-A)/V)×1.269
目前市售的脂肪乳质量标准中没有碘值这一项，因为它们大多为饱和脂肪酸乳剂，故无需检测碘值。海狗油注射乳剂以不饱和脂肪酸为主要成分，因此检测乳剂的碘值便成为一种控制海狗油注射乳剂质量的重要手段，据此本发明增加了该项检测。
2.2.3过氧化值
参照《中华人民共和国药典》2000年版二部正文品种大豆油(供注射用)过氧化物测定方法测定：精密量取5ml样品，置250ml碘瓶中，立即加冰醋酸-氯仿(6∶4)混合液60ml，振摇使溶解，精密加入饱和碘化钾溶液0.5ml，密塞，振摇1分钟，加水100ml，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时加淀粉指示液0.5ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白实验校正。以样品消耗硫代硫酸钠滴定液的容积(ml)为A，空白试验消耗的容积(ml)为B，样品容积(ml)为V，照下式计算过氧化值：
样品过氧化值＝((A-B)/V)×0.01×1000
乳剂若贮存不当会发生氧化产生过氧化物，对人体具有致癌性，因此必须对乳剂的过氧化值进行检测。油脂变质的另一重要表现是发生酸败，产生游离脂肪酸，因此可用酸值来衡量油脂酸败程度。但在注射乳剂生产过程中通常要加入氢氧化钠将其pH值调至8.0左右，因此直接用氢氧化钠滴定样品来测定酸值并不能完全反映乳剂中油脂的酸败程度，所以我们参照卫生部药品标准中相关方法先用适量硫酸将脂肪酸游离出来，再进行滴定，更全面反映油脂酸败程度。
2.2.4游离脂肪酸值
参照《中华人民共和国药典》2000年版二部附录VIIH及卫生部药品标准(98版)二部第六分册脂肪乳注射液(C14-24)质量标准游离脂肪酸测定方法：精密量取10ml样品，置250ml具塞锥形瓶中，加异丙醇-正庚烷-0.5mol/L硫酸溶液(39∶10∶1)的混合液50ml。振摇2分钟，放置30分钟。精密加入正庚烷和水各30ml，密塞，上下翻转10次，静置至少30分钟，使分层，精密量取上层液20ml，加尼罗蓝指示液1ml，在通氮条件下，用0.01mol/L氢氧化钠滴定液滴定至溶液显淡紫色。以消耗0.01mol/L氢氧化钠滴定液的容积(ml)为A，样品容积(ml)为V，照下式计算酸值：
样品酸值＝(A×0.01×56.1×2)/V
*尼罗蓝指示液的制备：取尼罗蓝0.04g，加水200ml使溶解，加正庚烷100ml振摇，静置分层后弃去上层正庚烷；反复操作4次。取下层水溶液20ml，加无水乙醇180ml混匀即得。本液置棕色瓶中，室温可存放一个月。
2.2.5主成分EPAE、DHAE、DPAE的含量
采用本发明所提供的测定方法。
3结果与讨论
3.1影响因素试验
3.1.1强光照射试验
表14500lx光照稳定性试验结果
| 放置天数 | 外观 | 乳粒细度 | pH值 | 碘值 | 过氧化值 | 游离脂肪酸值 | 主成分含量％(w/w) | ||
| EPAE | DHAE | DPAE | |||||||
| 0 | 乳白色 | 1.38％ | 7.85 | 97 | 0.27 | 0.39 | 4.488 | 7.876 | 5.486 |
| 5 | 乳白色 | 1.42％ | 7.72 | 97 | 0.28 | 0.37 | 4.386 | 7.863 | 5.426 |
| 10 | 极微黄色 | 1.68％ | 7.65 | 94 | 0.34 | 0.46 | 4.126 | 7.652 | 5.167 |
试验结果表明，海狗油注射乳剂在强光照射下很多指标发生变化，尽管变化幅度较小，但主成分含量下降超过5％，可见对光不稳定，因此乳剂应避光保存。
3.2加速试验
表2加速稳定性试验结果
| 放置月数 | 外观 | 乳粒细度 | pH值 | 碘值 | 过氧化值 | 游离脂肪酸值 | 主成分含量％(w/w) | ||
| EPAE | DHAE | DPAE | |||||||
| 0 | 乳白色 | 1.38％ | 7.85 | 97 | 0.27 | 0.39 | 4.488 | 7.876 | 5.486 |
| 1 | 乳白色 | 1.42％ | 7.84 | 96 | 0.28 | 0.38 | 4.424 | 7.874 | 5.467 |
| 2 | 乳白色 | 1.35％ | 7.85 | 98 | 0.27 | 0.41 | 4.312 | 7.863 | 5.382 |
| 3 | 乳白色 | 1.38％ | 7.82 | 97 | 0.29 | 0.41 | 4.326 | 7.836 | 5.217 |
| 6 | 乳白色 | 1.46％ | 7.76 | 95 | 0.31 | 0.43 | 4.295 | 7.829 | 5.156 |
试验结果表明，海狗油注射乳剂在加速条件下放置6个月，各项指标与0个月结果无明显变化，主成分含量仅下降3.2％，可以认为本品在此条件下稳定。
3.3长期试验
表3长期稳定性试验结果
| 放置月数 | 外观 | 乳粒细度 | pH值 | 碘值 | 过氧化值 | 游离脂肪酸值 | 主成分含量％(w/w) | ||
| EPAE | DHAE | DPAE | |||||||
| 0 | 乳白色 | 1.38％ | 7.85 | 97 | 0.27 | 0.39 | 4.488 | 7.876 | 5.486 |
| 1 | 乳白色 | 1.46％ | 7.82 | 97 | 0.28 | 0.40 | 4.396 | 7.852 | 5.391 |
| 2 | 乳白色 | 1.52％ | 7.80 | 95 | 0.31 | 0.42 | 4.3908 | 7.841 | 5.247 |
| 3 | 乳白色 | 1.48％ | 7.74 | 93 | 0.31 | 0.42 | 4.297 | 7.816 | 5.126 |
| 6 | 乳白色 | 1.63％ | 7.62 | 92 | 0.34 | 0.45 | 4.264 | 7.808 | 5.035 |
试验结果表明，海狗油注射乳剂在25℃±2℃的条件下放置12个月，各项指标与0个月无明显变化，主成分含量仅下降4.2％，可以认为本品在此条件下稳定。
4.对比试验
4.1比较对象
本发明海狗油注射乳剂
现有技术的海狗油注射乳剂
4.2测定指标
乳粒细度、碘值、过氧化值和游离脂肪酸值。
4.3测定结果
表4海狗油注射乳剂稳定性测定结果
| 项目 | 本发明海狗油注射乳剂 | 现有技术的海狗油注射乳剂 | 本发明乳剂放置6月后 | 现有技术乳剂放置6月后 | |
| pH值 | 7.85 | 7.74 | 7.80 | 6.90 | |
| 乳粒细度 | ＞1μm..乳粒数/＞0.5μm乳粒数 | 1.38％ | 1.45％ | 1.40％ | 2.82％ |
| 最大粒径 | 2μm | 2μm | 2μm | 5μm | |
| 碘值 | 97 | 82 | 96 | 65 | |
| 过氧化值 | 0.27 | 0.28 | 0.31 | 1.21 | |
| 游离脂肪酸值 | 0.39 | 0.42 | 0.41 | 0.95 | |
5.稳定性试验初步结论
结果表明：海狗油注射乳剂在60℃高温和4500lx光照下不稳定，在40℃高温条件下基本稳定，所以应避光避热保存。加速试验表明该乳剂在30℃+2℃的条件下6个月内稳定；长期试验表明该乳剂在25℃+2℃的条件下12个月内稳定。
同时，通过对本发明和现有技术的注射乳剂稳定性比较，说明本发明的海狗油注射乳剂长期放置稳定，长期放置后，其碘值、过氧化值和游离脂肪酸值均低于现有技术的乳剂。
证明本发明的海狗油注射乳剂长期放置稳定。
Claims (10)
1.一种海狗油注射乳剂，包括如下主要成分：21-50％的纯化海狗油、0.6-1.4％的乳化剂、2-3％的等渗调节剂、0.005-0.02％的抗氧化剂和注射用水，其中的百分数指重量百分数。
2.根据权利要求1所述的一种海狗油注射乳剂，其特征在于，所述的纯化海狗油中的三种ω-3多烯脂肪酸——EPA、DPA和DHA总含量为40-80％。
3.根据权利要求2所述的一种海狗油注射乳剂，其特征在于，所述的纯化海狗油中的三种ω-3多烯脂肪酸的含量分别为：EPA 10-20％，DHA 25-30％，DPA 15-20％。
4.根据权利要求1所述的一种海狗油注射乳剂，其特征在于，所述的注射乳剂中包括21-30％的纯化海狗油，所述的乳化剂为0.2％的F68+1.2％的蛋黄卵磷脂、1.2％的蛋黄卵磷脂或0.6％的蛋黄卵磷脂中的任意一种，所述的等渗调节剂为甘油、山梨醇、葡萄糖或氯化钠中的任意一种，所述的抗氧化剂为维生素E、二叔丁基对甲苯酚或对羟基叔丁基茴香醚中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种海狗油注射乳剂，其特征在于，所述的注射乳剂中还包括0.03-0.3％的稳定剂。
6.根据权利要求5所述的一种海狗油注射乳剂，其特征在于，所述的稳定剂为注射用油酸钠、胆酸、脱氧胆酸、硬脂酸纳或醋酸胆固醇中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的一种海狗油注射乳剂，其特征在于，注射乳剂中包括30％的纯化海狗油，1.2％的蛋黄卵磷脂，2.5％的甘油，0.01％的δ-维生素E、0.3％的注射用油酸钠和注射用水。
8.制备根据权利要求1所述的一种海狗油注射乳剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取10％的注射用水，加热至40-70℃，按上述比例取各成分，加入乳化剂，破碎至呈均匀磷脂分散液；
2)用4-10倍等渗调节剂的注射用水将等渗调节剂溶解，过滤后加入磷脂分散液中；
3)取纯化海狗油，将抗氧化剂溶解在海狗油中，过滤后加热到40-70℃，加入到磷脂分散液中，再加入注射用水使所制得的海狗油注射乳剂包括10-50％的纯化海狗油、0.6-1.4％的乳化剂、2-3％的等渗调节剂和0.005-0.02％的抗氧化剂和注射用水，然后超声乳化5-30分钟使成均匀初乳液；
4)初乳液用孔径为20-30μm的滤过器滤过，然后用高压匀质机连续乳化3-10次，均质压力210-800bar；
5)调乳液Ph值至7.0-9.0左右，再用孔径为4.5～9μm的滤过器滤过，灭菌即得乳剂产品。
9.根据权利要求8所述的一种海狗油注射乳剂的制备方法，其特征在于，在步骤2)中还可以加入0.01-0.3％的稳定剂。
10.根据权利要求8所述的一种海狗油注射乳剂的制备方法，其特征在于，所述的注射乳剂的制备方法包括以下步骤：
1)将10％的注射用水加热到55℃后，取1.2％的注射用蛋黄卵磷脂，将卵磷脂加入注射用水中，破碎至呈均匀磷脂分散液；
2)取2.5％的甘油，0.3％的注射用油酸钠，加10％的注射用水溶解，经0.2μm膜滤过后加入磷脂分散液中；
3)取30％的纯化海狗油，将0.01％的δ-维生素E溶解在海狗油中，经0.2μm膜滤过后加热到55℃，然后加入到磷脂分散液中，边加边超声乳化，油加完后再加入注射用水使所制得的海狗油注射乳剂包括30％的纯化海狗油、1.2％的乳化剂、2.5％的等渗调节剂、0.3％的稳定剂、0.01％的抗氧化剂和注射用水，然后继续超声乳化15分钟成均匀初乳液；
4)初乳液用孔径为20-25μm的滤过器滤过，然后用高压匀质机在550bar压力下连续乳化10次；
5)用0.5mol/L NaOH调乳液pH值至8.0，再用孔径为4.5～6μm的滤过器滤过，100℃灭菌45分钟，得乳剂样品。
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