CN1810947A - 大蒜油的精制方法及其乳剂和固体脂质纳米粒的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大蒜油原料精制方法及制剂，主要技术方案是将适量吸附剂装入层析柱，再另取吸附剂与大蒜油原料拌匀后，减压装入层析柱，用适量的有机溶剂洗脱，收集流出液，减压回收有机溶剂后即得。纯化后的大蒜油原料为微黄色澄明液体，具蒜臭，折光率20℃时为1.5720以上，GC检查，大蒜素含量大于37.0％，GC测定其指纹图谱大蒜油共有指纹峰15个。所得精制大蒜油可以进一步制备各种制剂，包括乳剂、脂质纳米粒等。利用本发明精制后的大蒜油制得的乳剂和固体脂质纳米粒剂可直接静脉给药，各项指标经实验后均合格，其具有抗深部真菌和细菌感染，防治急慢性菌痢和肠炎、百日咳、肺部和消化道的真菌感染、白色念珠菌菌血症、隐球菌性脑膜炎、肺结核等。

Description

大蒜油的精制方法及其乳剂和固体脂质纳米粒的制备工艺

一、技术领域：本发明涉及一种将普通的大蒜油原料纯化处理后得到精制大蒜油，并利用纯化的大蒜油制备乳剂和固体脂质纳米粒及其方法。

二、背景技术：深部真菌感染是临床各科严重并发症之一。近年来由于临床上广谱抗生素、化疗药物和免疫抑制剂等大量应用；深部静脉高营养方法与静脉、气管插管、器官移植的广泛开展，加之糖尿病、恶性肿瘤、艾滋病等慢性消耗性疾病所造成的免疫抑制或免疫缺陷患者的增加，真菌病尤其是深部真菌病发病率大幅上升。据美国疾病控制和预防中心的国家院内感染检测系统资料证实，从1980年至1990年，院内真菌感染率显著上升，外科患者增长了124％，内科患者增长了73％。而念珠菌成为第六位最常见的院内致病菌。侵袭性真菌病大多发生在有严重基础疾病的患者，病死率高。

目前治疗深部真菌病的高效低毒药物不多，仍选用延用了近40年的二性霉素B，但其毒性较大，应用受限。5-氟胞嘧啶(5-FC)抗菌谱窄，易产生耐药，一般不单独使用。60年代末合成克霉唑和咪康唑。80年代后，酮康唑、氟康唑等新的抗真菌药相继问世，其中氟康唑是目前临床应用最广，效果最好的抗真菌药物。然而这些药物多数仅具有抑菌作用而使得疗程较长，通常需数周至数月。由于真菌与人类细胞同为真核细胞，长期用药后往往对宿主具有相当毒性。因此临床上迫切需要开发出高效、低毒、广谱的新型抗真菌药物。中药副作用小、来源广、价格低廉、很少出现耐药、适合于长期及预防性应用的这些特点，使研究开发抗真菌中药具有良好的前景。

应用于抗真菌的中药主要是一些挥发油类，如从大蒜中提取的大蒜油、从肉桂中提取的桂皮油、从茴香中提取的茴香醛等。其中大蒜油的抗真菌作用首屈一指。大蒜油是粉碎后的大蒜泥经水蒸馏或有机溶剂萃取而得的挥发油。天然大蒜油成分复杂，种类很多，其主要成分是含烯丙基、丙基和甲基等多种基团组成的硫醚类化合物。现代医学证实大蒜油药理作用广泛，抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫力、降低血小板的聚集作用，在抗病原微生物方面，对多种致病菌如葡萄球菌、脑膜炎、肺炎双球菌、链球菌、白喉、痢疾、伤寒、大肠杆菌、结核杆菌、霍乱弧菌等都有抑制或杀灭作用，享有“天然广谱抗生素”的美称。

目前，国内有十余家企业生产大蒜油，主要有河南奥林特制药厂、河南许昌元化生物科技有限公司、山东金贵集团金乡食用油有限公司等。天然大蒜油主要用于食品与饲料添加剂、保健品等，至今尚未有药用规格的精制大蒜油，也未见报道天然大蒜油原料的纯化(精制)方法，相对应的高质量原料制备的制剂也未能开发。目前我国市售的大蒜类药品仅有大蒜肠溶片、大蒜素肠溶胶丸、大蒜素注射液等。为了取得稳定而快速的疗效，临床上常常希望直接静脉给药。市售大蒜素注射液为大蒜素合成品，但大蒜素注射液为单成分制剂，抗菌谱明显窄，且对心脏的毒性较大，曾有报道大蒜素注射液有致心脏停搏的毒性作用且血管刺激性强。现在尚无市售的大蒜油类制剂，这项空白亟待填补。

三、发明内容：

1、发明目的：本发明提供了一种大蒜油的精制方法及其乳剂和固体脂质纳米粒的制备工艺，其目的在于解决至今尚未有药用规格的精制大蒜油的制备方法，及相对应的高质量大蒜油原料制备的制剂也未能开发等方面存在的问题。

2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：

1、一种精制的大蒜油，其特征在于：该大蒜油具有如下特征：1、性状：它为淡黄色或黄色澄清液体，具蒜臭；2、折光率：它的折光率20℃时为1.5720以上；3、大蒜素含量测定及含量限度：采用GC法，四氢呋喃为内标测定大蒜油中大蒜素含量，大蒜素含量大于37.0％；4、指纹图谱为：色谱条件：6890NGC(美国Agilent公司)，色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)，进样口温度250℃，柱温60～220℃，程序升温，升温速率：8℃/min，N₂作载气，流速1.0ml·min^-1，FID检测器，检测室温度300℃，四氢呋喃为内标；大蒜油GC指纹图谱共有指纹峰保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00。

2、一种如权利要求1所述的大蒜油的精制方法，其特征在于：该方法按下述步骤进行：

a、按如下重量比取各原料：大蒜油1∶吸附剂I 0.25～1.25∶吸附剂II 1～5；

b、将上述大蒜油与吸附剂II混匀；

c、在减压下将吸附剂I装入层析柱，再将步骤b所得混合物减压装入其上；

d、取溶媒减压洗脱，收集流出液；

e、减压回收溶媒即得精制大蒜油。

3、根据权利要求1中所述的大蒜油原料的精制方法，其特征在于：所述的吸附剂I、吸附剂II选自硅胶、氧化铝、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、大孔吸附树脂；洗脱剂选自C₁～C₅醇类、C₃～C₈有机酸酯类、C₁～C₄有机酸类、C₃～C₈酮类、醚类。

4、一种用权利要求1所述的精制大蒜油制备的乳剂，其特征在于：该乳剂主要含有精制大蒜油及药用辅料，大蒜油与药用辅料的质量比为1∶1～1∶300；药用辅料主要为油、乳化剂、等渗调节剂、pH调节剂、抗氧剂组成，其药用辅料的各成分用量为：油1～30％(w/v)；乳化剂0.05％～5％(w/v)；等渗调节剂0.5～5％(w/v)；抗氧剂0.1～5.0％(w/v)；其它成分为注射用水；PH最佳范围是4～9。

5、根据权利要求3所述的精制大蒜油静脉注射乳剂，其特征在于：所述的油选自C₆～C₂₈的植物油或动物油，它包括经过结构改造和水解后的植物油、甘油三酯、椰子油、橄榄油、大豆油、红花油、海豹油、辛葵酸甘油酯；及脂肪酸的衍生物，它包括油酸乙酯、亚油酸甘油酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、亚油酸乙酯、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯、椰子油C₈～C₁₀甘油单酯或双酯、椰子油C₈～C₁₀丙二醇双酯、椰子油C₈～C₁₀甘油三酯、纯化乙酰化的单甘油酯、纯化向日葵油单甘油酯中的一种或几种混合物，用量为1～30％(w/v)；所述的乳化剂包括磷脂0.5％～5％(w/v)、聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯(polyethylene glycol 660 hydroxystearate，HS15)，用量为0.1％～5％(w/v)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯0.1％～5％(w/v)、泊洛沙姆188的用量为0.05％～5％(w/v)、吐温类0.1％～5％(w/v)、司盘类0.1％～5％(w/v)中的一种或几种混合物；所述的等渗调节剂选自甘油、葡萄糖、甘露醇、木糖醇中的一种0.5～5％(w/v)；pH调节剂选自盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸、磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠等中的一种，pH值范围是4～9；抗氧剂选自惰性气体、乙二胺四乙酸及其盐类、α-生育酚、α-醋酸生育酚、α-硫辛酸、维生素C及其衍生物，维生素C棕榈酸酯中的一种或几种混合物0.1～5.0％(w/v)。

6、根据权利要求4中所述的精制大蒜油静脉注射乳剂，其特征在于：乳剂为口服剂型时以明胶、阿拉伯胶、西黄嗜胶、人血清白蛋白作为乳化剂0.05％～5％(w/v)；静脉注射乳剂或口服乳剂根据需要加入助乳化剂或防腐剂，助乳化剂选自油酸、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、胆酸中的一种0～5％(w/v)；防腐剂选自尼泊金酯类、苯甲酸类0～5％(w/v)。

7、一种如权利要求4所述的精制大蒜油静脉注射乳剂的制备工艺，其特征在于：按下述步骤进行：

a、按权利要求4所述乳剂的处方比例取各原料；

b、在配制罐中制备油相：在配制罐中，将油、抗氧剂，或油、助乳化剂加热至50～90℃，强烈搅拌混匀，加入精制大蒜油，强烈搅拌混匀；

c、在配制罐中制备水相：将水和等渗调节剂在50～90℃下搅拌混匀，加入乳化剂，高速搅拌使其完全混溶；

d、在50～90℃时，将油相加入水相或水相加入油相，强烈搅拌混匀，形成初乳；

e、加入pH调节剂调节pH值到4～9；

f、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至40～200MPa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，充惰性气体，封装，灭菌(按无菌操作法制备时，可不灭菌)即得。

8、一种用权利要求1所述的精制大蒜油制备的固体脂质纳米粒剂，其特征在于：主要含有精制大蒜油及药用辅料，药用辅料主要为固体脂质、乳化剂、助乳化剂组成，大蒜油与药用辅料的质量比为：5∶1～1∶50；其药用辅料的各成分用量为：固体脂质1％～10％(w/v)、乳化剂1％～10％(w/v)、助乳化剂0.05～5％(w/v)；其它成分为水。

9、根据权利要求8中所述的精制大蒜油固体脂质纳米粒剂，其特征在于：所述的固体脂质主要包括有甘油脂、脂肪酸、类固醇和蜡类；甘油脂选自豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯中的一种，其中三硬脂酸甘油酯包括中、长链脂肪酸的甘油酯、甘油二十二烷酸酯(Compritol888 ATO)，部分甘油如Imwitor、单硬脂酸甘油酯，含有单、二、三甘油酯中的一种或几种混合物；脂肪酸选自硬脂酸、棕榈酸、癸酸、二十二酸中的一种；类固醇选自胆固醇；蜡类选自鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡、鲸醋蜡中的一种；所述的乳化剂选自磷脂类用量为0.5～5％(w/v)、HS15，用量为0.1～5％(w/v)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯，用量为0.1～5％(w/v)、泊洛沙姆188，用量为0.05～5％(w/v)、胆酸盐类，用量为0.1％～5％(w/v)、吐温类，用量为0.1％～5％(w/v)、短链醇类，用量为0.05～5％(w/v)；所述磷脂类选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、卵磷脂；HS15选自聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯660；胆酸盐类选自胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠，去氧牛磺胆酸钠；短链醇类选自丁醇、丁酸；所述的助乳化剂选自油酸、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、胆酸中的一种。

10、一种如权利要求8所述的精制大蒜油固体脂质纳米粒剂的制备工艺，其特征在于：该工艺按下述步骤进行：

a、按权利要求8所述精制大蒜油固体脂质纳米粒剂的处方取各原料；

b、在配制罐中将水、乳化剂和助乳化剂在50～90℃下搅拌分散均匀制成水相；

c、在配制罐中，在相同温度下将固体脂质相熔化，再加入大蒜油，搅拌均匀，形成脂质相；

d、将水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌3分钟，搅拌转数6000～28000rpm，制成初乳；

e、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至40～120MPa，将溶液反复匀化，或将初乳在功率400W下进行探头超声5分钟，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得。

3、优点及效果：通过本发明技术方案的实施，能够很好地解决至今尚未有药用规格的精制大蒜油，也未见报道天然大蒜油原料的精制方法，相对应的高质量大蒜油原料制备的制剂也未能开发等方面存在的问题。本发明对现有天然大蒜油进行精制，建立符合工业化生产精制纯化大蒜油的方法，制定药用、注射用规格大蒜油质量标准，并采用所纯化的高质量大蒜油原料研究相对应的各种高质量制剂。本发明精制方法纯化后的大蒜油由原来的棕黄色变为淡黄色；用所建立的GC方法测定大蒜素含量大于37.0％，指纹图谱共有指纹峰15个；用精制大蒜油制备的静脉注射乳剂具有体外抗深部真菌作用，且安全性提高，为临床应用提供可靠的依据。

利用本发明精制后的大蒜油制得的乳剂和固体脂质纳米粒剂可直接静脉给药，各项指标经检测后均合格，粒径范围是10nm～5μm；指纹图谱共有指纹峰17个。本发明制剂具有抗深部真菌和细菌感染，防治急慢性菌痢和肠炎、百日咳、肺部和消化道的真菌感染、白色念珠菌菌血症、隐球菌性脑膜炎、肺结核等。

四、附图说明：

附图1为本发明精制大蒜油稳定性影响因素试验结果曲线图；

附图2为本发明精制大蒜油不同贮存条件下的稳定性试验结果曲线图；

附图3为本发明精制大蒜油GC指纹图谱；

附图4为本发明大蒜油静脉注射乳剂指纹图谱；

附图5为本发明大蒜油静脉注射乳剂标准指纹图谱；

附图6为本发明大蒜油固体脂质纳米粒指纹谱图；

附图7为本发明给予葡萄糖注射液后的兔耳缘静脉病理切片照片；

附图8为本发明给予大蒜油静脉注射乳剂后72h的兔耳缘静脉病理切片照片；

附图9为本发明给予大蒜油静脉注射乳剂后14天的兔耳缘静脉病理切片照片。

五、具体实施方式：

本发明大蒜油原料精制方法，按如下重量比取各原料：大蒜油1∶吸附剂I 0.25～1.25∶吸附剂II 1～5；根据需要可在该范围内任意选取其比例关系，具体操作为：1、大蒜油与吸附剂II混匀；2、在减压下将吸附剂I装入层析柱，再将步骤1所得混合物减压装入其上；3、取溶媒减压洗脱，收集流出液；4、减压回收溶媒即得精制大蒜油。吸附剂I和II为硅胶、氧化铝、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、大孔吸附树脂中的一种或几种；洗脱剂为C₁～C₅醇类，如乙醇、甲醇；C₃～C₈有机酸酯类、C₁～C₄有机酸类、C₃～C₈酮类、醚类。所得的精制大蒜油，其质量标准如下：1、性状：本品为淡黄色或黄色澄清液体，具蒜臭；2、折光率：本品折光率20℃时为1.5720以上；3、大蒜素含量测定及含量限度：采用GC法，四氢呋喃为内标测定大蒜油中大蒜素含量，大蒜素含量应大于37.0％；4、指纹图谱为：色谱条件：6890N GC，它为美国Agilent公司出品，色谱柱：HP-5，其规格为30m×320μm×0.25μm，进样口温度250℃，柱温60～220℃，程序升温，升温速率：8℃/min，N₂作载气，流速1.0ml·min^-1，FID检测器，检测室温度300℃，四氢呋喃为内标；大蒜油GC指纹图谱共有指纹峰保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00。

将上述制备的大蒜油制成静脉注射乳剂，其含有效剂量的纯化后的大蒜油作为药物，并含有药用辅料，大蒜油与药用辅料的质量比为1∶1～1∶300；药用辅料主要为油、乳化剂、等渗调节剂、pH调节剂、抗氧剂组成，其药用辅料的各成分用量为：油1～30％(w/v)；乳化剂0.05％～5％(w/v)；等渗调节剂0.5～5％(w/v)；抗氧剂0.1～5.0％(w/v)；其它成分为水；PH最佳范围是4～9。

所述的油选自C₆～C₂₈的植物油或动物油，它包括经过结构改造和水解后的植物油、甘油三酯、椰子油、橄榄油、大豆油、红花油、海豹油、辛葵酸甘油酯；及脂肪酸的衍生物，它包括油酸乙酯、亚油酸甘油酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、亚油酸乙酯、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯、椰子油C₈～C₁₀甘油单酯或双酯、椰子油C₈～C₁₀丙二醇双酯、椰子油C₈～C₁₀甘油三酯、纯化乙酰化的单甘油酯、纯化向日葵油单甘油酯中的一种或几种混合物，用量为1～30％(w/v)；所述的乳化剂包括磷脂0.5％～5％(w/v)、聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯(polyethylene glycol 660 hydroxystearate，HS15)，用量为0.1％～5％(w/v)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯0.1％～5％(w/v)、泊洛沙姆188的用量为0.05％～5％(w/v)、吐温类0.1％～5％(w/v)、司盘类0.1％～5％(w/v)中的一种或几种混合物；口服乳剂还可以采用明胶、阿拉伯胶、西黄嗜胶、人血清白蛋白作为乳化剂0.05％～5％(w/v)；根据需要加入助乳化剂或防腐剂，助乳化剂选自油酸、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、胆酸中的一种0～5％(w/v)；防腐剂选自尼泊金酯类、苯甲酸类0～5％(w/v)。所述的等渗调节剂选自是甘油、葡萄糖、甘露醇、木糖醇中的一种(0.5～5％)(w/v)；pH调节剂选自盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸、磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠等中的一种，pH值范围是4～9；抗氧剂是惰性气体、乙二胺四乙酸及其盐类、α-生育酚、α-醋酸生育酚、α-硫辛酸、维生素C及其衍生物，维生素C棕榈酸酯中的一种或几种混合物(0.1～5.0％)(w/v)。

所得的大蒜油静脉注射乳剂，GC指纹图谱为：色谱条件：6890N GC(美国Agilent公司)，色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)，进样口温度250℃，柱温60～220℃，程序升温，升温速率：8℃/min，N₂作载气，流速1.0ml·min^-1，FID检测器，检测室温度300℃，四氢呋喃为内标；GC指纹图谱共有指纹峰保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00、20.0～21.0、23.0～25。

用本发明所得的精制大蒜油制备的固体脂质纳米粒，含有效剂量的大蒜油作为药物，并含有药用辅料，药用辅料包括油、固体脂质、乳化剂、助乳化剂，大蒜油与药用辅料的质量比为：5∶1～1∶50；其药用辅料的各成分用量为：固体脂质1％～10％(w/v)、乳化剂1％～10％(w/v)、助乳化剂0.05～5％(w/v)；其它成分为水。其固体脂质主要包括有甘油脂、脂肪酸、类固醇和蜡类；甘油脂选自豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯中的一种，其中三硬脂酸甘油酯包括中、长链脂肪酸的甘油酯、甘油二十二烷酸酯(Compritol888ATO)，部分甘油如Imwitor、单硬脂酸甘油酯，含有单、二、三甘油酯中的一种或几种混合物；脂肪酸选自硬脂酸、棕榈酸、癸酸、二十二酸中的一种；类固醇选自胆固醇；蜡类选自鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡、鲸醋蜡中的一种；所述的乳化剂选自磷脂类用量为0.5～5％(w/v)、HS15，用量为0.1～5％(w/v)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)，用量为0.1～5％(w/v)、泊洛沙姆188，用量为0.05～5％(w/v)、胆酸盐类，用量为0.1％～5％(w/v)、吐温类，用量为0.1％～5％(w/v)、短链醇类，用量为0.05～5％(w/v)；所述磷脂类选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、卵磷脂；HS15选自聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯660；胆酸盐类选自胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠；短链醇类选自丁醇、丁酸；所述的助乳化剂选自油酸、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、胆酸中的一种。

所得的固体脂质纳米粒剂，GC指纹图谱为：色谱条件：6890N GC(美国Agilent公司)，色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)，进样口温度250℃，柱温60～220℃，程序升温，升温速率：8℃/min，N₂作载气，流速1.0ml·min^-1，FID检测器，检测室温度300℃，四氢呋喃为内标；大蒜油固体脂质纳米粒GC指纹图谱共有指纹峰保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00、20.0～21.0、23.0～25。

用纯化后的大蒜油原料还可以制备片剂、硬、软胶囊(包括自乳化)、颗粒剂、混悬剂。精制大蒜油可用于抗深部真菌感染，预防与治疗血栓形成、高血脂症、动脉粥样硬化防治。

实施例1：

本发明精制大蒜油的方法，取大蒜油40g，先按大蒜油与硅胶重量比1∶2的比例与80g硅胶混匀；另按大蒜油与硅胶重量比1∶0.25的比例取硅胶10g，在减压下装入层析柱；再将上述大蒜油与硅胶混合物减压装入其上；用石油醚减压洗脱，收集流出液；减压回收石油醚，得到精制大蒜油。收率87％，外观为微黄色澄明液体，折光率为1.5820，大蒜素含量37.83％。

实施例2：

本发明精制大蒜油的方法，取大蒜油60g，先按大蒜油与氧化铝重量比1∶1的比例与60g氧化铝混匀；另按大蒜油与硅胶重量比1∶0.5的比例取硅胶30g，在减压下装入层析柱；再将上述大蒜油与氧化铝混合物减压装入其上；用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)减压洗脱，收集流出液；减压回收溶剂，得到精制大蒜油，收率86％，外观为微黄色澄明液体，折光率为1.5730，大蒜素含量37.79％。

实施例3：

本发明精制大蒜油的方法，取大蒜油80g，先按大蒜油与硅酸镁重量比1∶3的比例与240g硅酸镁混匀；另按大蒜油与硅酸镁重量比1∶0.75的比例取硅酸镁60g，在减压下装入层析柱；再将上述大蒜油与硅酸镁混合物减压装入其上；用氯仿减压洗脱，收集流出液；减压回收氯仿，得到精制大蒜油。收率94％，外观为微黄色澄明液体，折光率为1.5750，大蒜素含量38.71％。

实施例4：

本发明精制大蒜油的方法，取大蒜油20g，按大蒜油与硅藻土重量比1∶4的比例与80g硅藻土混匀，另按大蒜油与硅胶重量比1∶1的比例取硅胶20g，在减压下装入层析柱；再将上述大蒜油与硅藻土混合物减压装入其上；用甲醇减压洗脱，收集流出液；减压回收溶剂，得到精制大蒜油。收率87％，外观为微黄色澄明液体，折光率为1.5810，大蒜素含量38.83％。

实施例5：

本发明精制大蒜油的方法，取大蒜油40g，按大蒜油与聚酰胺重量比1∶5的比例先与200g聚酰胺混匀；另按大蒜油与聚酰胺重量比1∶1.25的比例取聚酰胺200g，在减压下装入层析柱；再将上述大蒜油与聚酰胺混合物减压装入其上；用石油醚减压洗脱，收集流出液；减压回收石油醚，得到精制大蒜油。收率85％，外观为微黄色澄明液体，折光率为1.5760，大蒜素含量37.23％。

实施例6：

本发明精制大蒜油的方法，取大蒜油100g，按大蒜油与大孔吸附树脂重量比1∶4的比例与大孔吸附树脂400g混匀；另按大蒜油与大孔吸附树脂重量比1∶0.5的比例取大孔吸附树脂50g，在减压下装入层析柱；用石油醚减压洗脱，收集流出液；减压回收石油醚，得到精制大蒜油。收率80％，外观为微黄色澄明液体，折光率为1.5790，大蒜素含量38.01％。

对上述制得的精制大蒜油稳定性影响因素试验：

取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5，实施例6制得的精制大蒜油，分别在40℃、60℃和光照(4500Lx±500Lx)条件下放置10天，分别在第5、10天取样，测定大蒜素含量，并与0天结果比较。以实施例1为例，结果见图1，图1中y轴表示大蒜素百分含量，x轴表示时间，单位为天，其中三角形、菱形、四方形分别表示40℃、光照、60℃条件下结果曲线。结果表明，本发明大蒜油对光、热均敏感，温度越高，稳定性越差。

对上述制得的精制大蒜油不同贮存条件下的稳定性试验：

取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6制得的精制大蒜油，分别于室温、冷藏、冷冻条件下密闭遮光存放，分别于0、0.5、1、3、6、9、12个月取样，测定大蒜素含量，以实施例1为例，结果见图2，图2中y轴表示大蒜素百分含量，x轴表示时间，单位为分钟，其中三角形、菱形、四方形分别表示冷冻、室温、冷藏条件下结果曲线。结果表明，本发明大蒜油在冷冻条件下贮存一个月，含量趋于稳定，而室温避光和冷藏条件下贮存含量均下降。

对上述制得的大蒜油GC指纹图谱测定：

色谱条件：6890N GC(美国Agilent公司)，色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)，进样口温度250℃，柱温60～220℃，程序升温，升温速率：8℃/min，N₂作载气，流速1.0ml·min^-1，FID检测器，检测室温度300℃，四氢呋喃为内标。

在上述色谱条件下，大蒜素在0.005～2.4mg·ml^-1范围内，线性关系良好(r＝0.9998)，平均回收率102.52％(RSD＝0.41％)。日内日间RSD＜2％，重复性RSD＜2％，样品溶液室温放置48h稳定性良好。如图3所示，本发明大蒜油指纹图谱共有峰15个，保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00。

指纹图谱的精密度、稳定性、重复性符合规定。

实施例7：

本发明所得精制大蒜油制备的乳剂，其成分为有效剂量的精制大蒜油3.0g，豆油3.0g，磷脂0.8g，α-生育酚0.53g，甘油1.6g，油酸0.13g，氢氧化钠适量，其余为注射用水，共100ml。

乳剂的制造方法(无菌操作法)：

a、在配制罐中制备油相：在配制罐中，将豆油、油酸、α-生育酚加热至60℃，强烈搅拌混匀，加入药物，强烈搅拌混匀；

b、在配制罐中制备水相：将水和甘油在60℃下搅拌5分钟，加入磷脂，高速搅拌使其完全混溶；

c、在60℃时，将油相加入水相，强烈搅拌混匀，形成初乳；

d、用适量氢氧化钠溶液，调节pH值至7.5；

e、按无菌操作法过均质仪，调节匀化压力至70Mpa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，封装，即得本品。乳剂的平均粒径为180nm，不含大于5μm的乳粒。所得乳剂可以静脉注射也可以口服。

实施例8：

本发明所得精制大蒜油制备的乳剂，成分为有效剂量的大蒜油3g，红花油5g，聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯(HS15)2g，α-生育酚1.0g，甘露醇2.0g，磷酸钠适量，其余为注射用水，共100ml。

乳剂的制造方法：

a、在配制罐中制备油相：在配制罐中，将红花油、α-生育酚加热至70℃，强烈搅拌混匀，加入药物，强烈搅拌混匀；

b、在配制罐中制备水相：将水、甘露醇在60℃下搅拌5min，加入HS15、泊洛沙姆188，高速搅拌使其完全混溶；

c、按无菌操作法在70℃时，将油相加入水相，强烈搅拌混匀，形成初乳；

d、用适量磷酸钠溶液，调节pH值至7

e、过微射流仪，第一步调节匀化压力至40Mpa，第二步再调节至100Mpa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，充氮，封装，灭菌，即得成品乳剂。乳剂的平均粒径为183nm，不含大于5μm的乳粒。

实施例9：

本发明所得精制大蒜油制备的乳剂，其成分为有效剂量的大蒜油3.3g，辛葵酸甘油酯与大豆油(1∶1)5g，磷脂2.0g，泊洛沙姆188 0.5g，硬脂酸1.0g，维生素C棕榈酸酯1.2g，葡萄糖1.6g，醋酸钠适量，其余为注射用水，共100ml。

乳剂的制造方法：

a、在配制罐中制备油相：在配制罐中，将辛葵酸甘油酯与大豆油混合液、硬脂酸、维生素C棕榈酸酯加热至80℃，强烈搅拌混匀，加入药物，强烈搅拌混匀；

b、在配制罐中制备水相：将水和葡萄糖在80℃下搅拌5min，加入磷脂和泊洛沙姆188，高速搅拌使其完全混溶；

c、在80℃时，将油相加入水相，强烈搅拌混匀，形成初乳；

d、用适量醋酸钠溶液，调节pH值至6；

e、过均质仪，调节匀化压力至80Mpa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，封装，灭菌，即得本品。乳剂的平均粒径为170nm，不含大于5μm的乳粒。所得乳剂可以静脉注射也可以口服。

实施例10：

本发明所得精制大蒜油制备的乳剂，其成分为有效剂量的精制大蒜油3.3g，海豹油10g，磷脂1.5g，月桂酸0.05g，乙二胺四乙酸二钠0.2g，α-生育酚0.5g，木糖醇1.6g，柠檬酸钠适量，其余为注射用水，共100ml。

乳剂的制备方法如下：

a、在配制罐中制备油相：在配制罐中，将海豹油、月桂酸、α-生育酚加热至50℃，强烈搅拌混匀，加入大蒜油，强烈搅拌混匀；

b、在配制罐中制备水相：将水、乙二胺四乙酸二钠、木糖醇在50℃下搅拌5分钟，加入磷脂，高速搅拌使其完全混溶；

c、在50℃时，将油相加入水相，强烈搅拌混匀，形成初乳；

d、用适量柠檬酸钠溶液，调节pH值至8；

e、过均质仪，调节匀化压力至90Mpa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，封装，灭菌，即得成品乳剂。乳剂平均粒径为166nm，不含大于5μm的乳粒，所得乳剂可以静脉注射也可以口服。

实施例11：

本发明所得精制大蒜油制备的乳剂，成分为有效剂量的大蒜油3.3g，亚油酸甘油酯与豆油(1∶1)5.0g，2.5g，甘油1.0g，α-醋酸生育酚0.5g，盐酸适量，其余为注射用水，共100ml。

乳剂的制造方法：

a、按无菌操作法在配制罐中制备油相：在配制罐中，将亚油酸甘油酯与豆油混合液、α-醋酸生育酚加热至90℃，强烈搅拌混匀，加入药物，强烈搅拌混匀；

b、按无菌操作法在配制罐中制备水相：将水和甘油在90℃下搅拌5min，加入α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，高速搅拌使其完全混溶；

c、按无菌操作法在90℃时，将油相加入水相，强烈搅拌混匀，形成初乳。

d、用适量盐酸溶液，调节pH值至6；

e、按无菌操作法过均质仪，调节匀化压力至90Mpa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，充氮，封装，即得本品。乳剂平均粒径为150nm，不含大于5μm的乳粒。所得乳剂可以静脉注射也可以口服。上述制得的乳剂各参数如下：

外观：外观为乳白色乳状液体，无油滴，未分层，流动性良好；

pH值：7.0～7.5；

粒径：平均粒径为140～180nm；

大蒜素含量：气相色谱条件色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)；载气：N₂，流速为1.0ml·min-1；进样口温度：250℃；柱温60～220℃，程序升温，升温速率为8℃/min；检测器：FID，检测室温度：300℃，四氢呋喃为内标。在此色谱条件下，大蒜素分离完全，峰形良好，在0.005～2.4mg·ml-1范围内，线性关系良好(r＝0.9998)，平均回收率102.52％(RSD＝0.41％)。日内日间RSD＜2％，重复性RSD＜2％，样品溶液室温放置48h稳定性良好。大蒜素保留时间为11.7min，制剂辅料对测定无干扰。取实施例7、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11，按本法测定大蒜素含量，结果见表1。

表1样品含量测定结果(n＝3)

样品	大蒜素浓度/mg·ml-1
		实施例7	11.54

实施例8实施例9实施例10实施例11

12.2810.6012.9013.97

上述实施例制得的大蒜油静脉注射乳剂GC指纹图谱测定：

气相色谱条件：色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)；载气：N₂，流速为1.0ml·min-1；进样口温度：250℃；柱温60～220℃，程序升温，升温速率8℃/min；检测器：FID，检测室温度：300℃，四氢呋喃为内标。在此条件下，指纹图谱测定的精密度、稳定性、重复性符合规定。取本发明乳剂10批，测定其指纹图谱，结果见图4。

经中药指纹图谱相似度评价系统处理，建立大蒜油静脉注射乳剂GC指纹图谱共有模式，如图5所示，即标准指纹图谱，其中S表示内标；11表示大蒜素。在标准指纹图谱中，确定共有指纹峰17个，保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00、20.0～21.0、23.0～25.0。

其中3，5，6，7，8，11，15号峰构成了指纹的主要特征，其它共有峰虽然对指纹图谱贡献相对较小，但在不同样品间均稳定存在，构成了指纹的次要特征。

按照夹角余弦法对本发明制得的10批样品指纹图谱进行批间及与标准指纹图谱的相似度评价，结果表明，指纹图谱的相关系数在0.9593～0.9999之间，相互间吻合程度较高且非共有峰面积占总峰面积5％以下，符合规定。

对本发明制得的大蒜油静脉注射乳剂质量评价：

(1)、大蒜油静脉注射乳剂灭菌前后指纹图谱的比较：灭菌前后指纹图谱吻合程度较高，相关系数见表2，表明整体图貌未发生变化

        表2灭菌前后样品指纹图谱相似度评价(n＝5)

	相关系数
							实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11
灭菌前	0.9984	0.9987	0.9985	0.9981	0.9983
						灭菌后	0.9986	0.9984	0.9988	0.9985	0.9991

(2)、大蒜油静脉注射乳剂不同储存期指纹图谱的比较：取本发明大蒜油静脉注射乳剂，室温避光储存，每隔半月测定指纹图谱，并进行相似度评价，结果见表3。相关系数在0.9997～0.9999，表明大蒜油静脉注射乳剂储存2个月后其总体质量未发生明显变化。

         表3不同储存期样品指纹图谱相似度评价(n＝3)

月份	相关系数
						实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11
	0	0.9998	0.9998	0.9998	0.9997						0.9999
0.5						0.9997	0.9997	0.9997	0.9996	0.9996
	1.0	0.9998	0.9997	0.9999	0.9996						0.9996
1.5						0.9998	0.9997	0.9999	0.9999	0.9998
	2.0	0.9998	0.9997	0.9999	0.9999						0.9997

(3)、大蒜油静脉注射乳剂不同储存条件指纹图谱比较：取本发明大蒜油静脉注射乳剂，分别在室温避光和冷藏条件下储存2个月，并进行指纹图谱测定和相似度评价，结果见表4。相关系数在0.9992～0.9998，表明大蒜油静脉注射乳剂在两种储存条件下其指纹图谱整体图貌未发生明显变化。

        表4不同储存条件样品指纹图谱相似度评价(n＝5)

储存条件	相关系数
							实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11
室温避光	0.9992	0.9994	0.9997	0.9996	0.9998
						冷藏	0.9994	0.9995	0.9998	0.9996	0.9997

对本发明制得的大蒜油静脉注射乳剂稀释试验如下：

取本发明大蒜油静脉注射乳剂分别以灭菌注射用水、5％葡萄糖注射液、0.9％氯化钠注射液、Intralipid脂肪乳注射液(C_14～24)稀释至250ml，按表5考察大蒜油静脉注射乳剂稀释前后的变化，为临床用药提供依据。

结果显示，各种稀释剂在10小时内对乳剂的各项检查指标无显著性影响。乳剂被水、葡萄糖、氯化钠稀释后，依然能闻到大蒜油特有的臭味，但被脂肪乳稀释后可完全掩盖其臭味，且脂肪乳与大蒜油乳剂组成相近，两者混合后未见外观改变及粒径的改变，说明大蒜油乳剂可均匀分散于脂肪乳中，不改变其稳定性。用脂肪乳稀释后的粒径较大，是由于脂肪乳本身粒径较大所致。

用氯化钠稀释后，粒径可见稍微增大，虽然也呈白色乳状液，但颜色较深，且随着时间的推移有加强之趋势，曾将其置于冰箱冷藏过夜，颜色浑浊，但亦无破乳之现象。故糖尿病患者可用氯化钠稀释给药，但为确保安全应于12小时内用药完毕。

                  表5.大蒜油静脉注射乳剂稀释试验结果

稀释液	时间(h)	外观	pH	平均粒径(nm)	含量(％)
						灭菌注射用水5％葡萄糖注射液0.9％氯化钠注射液脂肪乳注射液	0510051005100510	++++++++++++	6.266.296.324.954.995.075.725.865.98.038.018.00	150.3±36.5159.6±50.4165.5±63.6168.3±34.3163.7±57.1163.6±57.2162.8±56.3171.1±55.3183.3±60.4321.2±34.3327.9±83.6329.2±60.6	101.5100.198.7103.1101.599.4100.698.497.3102.4102.1102.8

+：白色乳状液，均匀，未见油滴，无相分离

对制得的大蒜油静脉注射乳剂稳定性试验如下：

(1)、影响因素试验

参照2005年药典(二部)对制剂稳定性考察的新指导原则和有关文献，进行了高温、光照、冷冻因素的考察。实验表明，本发明大蒜油静脉注射乳剂在各种条件下放置10天，外观仍呈白色乳剂，未见分层、出油等，流动性良好，未发生明显改变；光照及40℃条件下，含量下降，粒径无明显变化，光照试验对pH影响最大，可能是由于光照能促进磷脂的氧化分解所致；冷冻条件下，含量无变化，而粒径显著增大。因此，本品对热、光都敏感，应于适宜温度下避光贮存，不得冷冻。

按照以上试验方法对比考察了大蒜油注射液在光照、高温、冷冻条件下的稳定性，结果表明，大蒜油注射液在光照、高温条件下pH值略微下降，但含量下降明显，与大蒜油静脉注射乳剂比较，同等条件下，大蒜素在注射液中的下降率几乎是在乳剂中的两倍，说明乳剂将大蒜油包裹入内相，确能提高其稳定性。

(2)、与市售维生素脂肪乳的冷冻试验比较：

影响因素试验结果表明冷冻条件下，乳剂的含药量没有变化，但粒径明显增大，将市售维他利匹特脂溶性维生素注射液同样做冷冻加速试验，将二者粒径进行比较。

实际上，Nicomp-380激光粒径仪测出的大蒜油静脉注射乳剂冷冻前后，都推荐使用高斯分布，而维生素注射液在冷冻10天后，粒径发生明显变化，已经不能用高斯分布来表示，但为比较方便，将二者的尼康分布进行比较。与自身相比，二者的粒径都增大，但冷冻后维生素注射液的粒径横跨100～500nm，而大蒜油静脉注射乳剂的粒径在100～250nm，说明其稳定性较市售同类产品优异。

(3)、加速试验

从影响因素试验结果可以看出，将大蒜油静脉注射乳剂置于40℃条件下，大蒜素含量明显下降，根据药典对药物稳定性试验指导原则，加速试验在25℃±2℃下进行，时间为6个月。将大蒜油静脉注射乳剂在25℃±2℃下避光放置六个月，于第1、2、3、6月取样，按考察项目下要求进行检查，与0天结果比较，结果表明，大蒜油静脉注射乳剂在加速试验6个月后，各项检查指标基本无变化，稳定性良好。

(4)、长期留样试验：

从影响因素试验结果可以看出，将大蒜油静脉注射乳剂置于40℃条件下，大蒜素含量明显下降，根据药典对药物稳定性试验指导原则，长期试验在6℃±2℃下进行。将大蒜油静脉注射乳剂于6℃±2℃条件下避光放置6个月，于第3、6月取样，按考察项目下要求进行检查，与0天结果比较。结果表明，大蒜油静脉注射乳剂在长期留样试验6个月后，各项检查指标基本无变化，稳定性良好。

实施例12：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的精制的大蒜油4g，单硬脂酸甘油酯2.0g，牛磺胆酸钠0.2g，泊洛沙姆1880.6g，其余为注射用水，共100ml。

制备方法：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在75℃下搅拌30min，分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，在6000rpm的转速下高速搅拌3min，制成初乳；

d、过均质仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为106nm，不含大于5μm的乳粒，所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例13：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，单硬脂酸甘油酯2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

制备方法：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在60℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm)3min，制成初乳；

d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为136nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例14：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，单硬脂酸甘油酯2.0g，牛磺胆酸钠0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在80℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速6000rpm时搅拌3分钟，制成初乳；

d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为146nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例15：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，单硬脂酸甘油酯2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在75℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm)3min，制成初乳；

将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为146nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例16：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，Compritol888 ATO 2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在90℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm)3min，制成初乳；

d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为276nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例17：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4.0g，Compritol888 ATO 2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在85℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm)3min，制成初乳；d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为321nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例18：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，三棕榈酸甘油酯2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在80℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(12000rpm)3min，制成初乳；

d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为244nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例19：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，三棕榈酸甘油酯2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在80℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(28000rpm)3min，制成初乳；

d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为351nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例20：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，单硬脂酸甘油酯2.0g，聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯0.2g，泊洛沙姆1880.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在60℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(10000rpm)3min，制成初乳；

d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为321nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例21：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油6g，单硬脂酸甘油酯4g，卵磷脂0.6g，泊洛沙姆188 3.0g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在80℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm)3min，制成初乳；

d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为176nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例22：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油2g，豆蔻酸甘油酯2.0g，卵磷脂0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在80℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(28000rpm)3min，制成初乳；

d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为196nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

实施例23：

本发明精制大蒜油固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量的大蒜油4g，单硬脂酸甘油酯2.0g，甘胆酸钠0.2g，泊洛沙姆188 0.6g，其余为注射用水，共100ml。

上述的固体脂质纳米粒制备方法如下：

a、在配制罐中，将处方量乳化剂、助乳化剂和水在80℃下搅拌分散均匀制成水相；

b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量大蒜油加入，搅拌均匀，形成脂质相；

c、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm)3min，制成初乳；

d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至100MPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为126nm，不含大于5μm的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以注射也可以口服。

对本发明制得的大蒜油静脉注射固体脂质纳米粒GC指纹图谱如下：

气相色谱条件，色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)；载气：N₂，流速为1.0ml·min-1；进样口温度：250℃；柱温60～220℃，程序升温，升温速率8℃/min；检测器：FID，检测室温度：300℃，四氢呋喃为内标。在此条件下，指纹图谱测定的精密度、稳定性、重复性符合规定。取本发明制得样品10批，测定其指纹图谱，结果见图6。

经中药指纹图谱相似度评价系统处理，建立GC指纹图谱共有模式，如图7所示，即标准指纹图谱，其中S表示内标；11表示大蒜素。在标准指纹图谱中，确定共有指纹峰17个，保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00、20.0～21.0、23.0～25.0

其中3，5，6，7，8，11，15号峰构成了指纹的主要特征，其它共有峰虽然对指纹图谱贡献相对较小，但在不同样品间均稳定存在，构成了指纹的次要特征。

按照夹角余弦法对本发明制得的10批样品指纹图谱进行批间及与标准指纹图谱的相似度评价，结果表明，指纹图谱的相关系数在0.9593～0.9999之间，相互间吻合程度较高且非共有峰面积占总峰面积5％以下，符合规定。

对本发明制得的药品的体外抗真菌作用测试如下：

①、菌种

白色念珠菌2株(辽宁省药检所提供)；热带念珠菌1株、新型隐球菌1株、烟曲菌1株(南京医学科学院皮肤病医院)。

②、药物

氟康唑注射液(3059102，美国辉瑞公司)；大蒜油静脉注射乳剂(031118，自制)；5％葡萄糖注射液、氯化钠注射液(沈阳军区总医院药剂科)。

③、沙式琼脂培养基法测定MIC

用沙式琼脂培养基以倍比稀释法将大蒜油静脉注射乳剂、氟康唑注射液分别配成100μg/mL至0.8μg/mL的6个浓度的药物梯度，移入平皿，分别接种10⁵cfu/mL的菌悬液。另做不含药物的培养基接种菌悬液，作为空白对照；含空白乳剂的培养基接种菌悬液，为空白辅料对照。样品与28℃培养，放置不同时间观察真菌生长情况，以连续倍量稀释的最高稀释倍数未出现白色沉淀或浑浊作为MIC，结果见表6。

表6大蒜油静脉注射乳剂和氟康唑注射液MICs(μg/mL)试验结果

菌种	MICs(μg/mL)
			大蒜油静脉注射乳剂	氟康唑注射液
	白色念珠菌热带念珠菌新型隐球菌烟曲菌	50255025			12.56.2550/

结果表明，本发明大蒜油静脉注射乳剂对白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌及烟曲菌具有不同的抑制作用，对烟曲菌的抑杀作用最为显著，实验观察了一星期，只有抗烟曲菌的第一个、第二个浓度，依然无菌生长，说明大蒜油类制剂能杀灭烟曲菌，而氟康唑对其无效。阴性对照实验显示空白培养基及加入空白乳的培养基都无抗菌作用。

对本发明制得的药物的安全性试验：

考察用本发明大蒜油制备的亚微乳剂的安全性，如：急性毒性、溶血性、血管刺激性、热原及致敏试验等。

①、急性毒性试验

选取健康小鼠40只，体重18～22g，随机分为4组，雌雄各半，每组10只，考察大蒜油静脉注射乳剂的毒性。结果大蒜油静脉注射乳剂的LD₅₀为184mg/kg，LD₅₀的95％置信区间为：163.8～207.0mg/kg

②、溶血性实验

大蒜油刺激性较强，长期在某一部位静滴易导致静脉炎，高浓度可引起红细胞溶解。磷脂分子中所具有的不饱和键易与氧结合生成二烯键的结构而氧化，导致溶血毒性。因此本实验观察了大蒜油静脉注射乳剂对家兔红细胞有无溶血和凝聚作用。

取供试家兔，从耳动脉采血9mL，玻璃棒轻轻搅动除去纤维蛋白，使成脱纤血液，加10倍量的氯化钠注射液，摇匀、离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用氯化钠注射液如法洗涤3次至上清液不显红色，将所得红细胞用氯化钠注射液配成2％的混悬液，供实验用。

取试管7只，依次加入2％红细胞混悬液和氯化钠注射液，混匀后，于37℃水浴中放置10min，将大蒜油静脉注射乳剂于1～5号管分别加入此稀释药液0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL，6号管加入氯化钠注射液2.5mL，7号管加入无菌水2.5mL，使各管最终体积均为5mL，轻轻混匀后，置37℃水浴中，分别于不同时间观察溶血情况。如溶液呈透明红色，即表示溶血，如溶液中有棕红色絮状沉淀，表示有红细胞凝聚作用。如有红细胞凝聚现象，应震荡试管或在显微镜下观察，判定是真凝聚还是假凝聚。

在规定时间内观察，发现大蒜油静脉注射乳剂的1～6号管上层液体无色透明，红细胞逐渐沉于管底，第7号管上层液体呈红色透明，上述各管均无红棕色絮状沉淀，也未见红细胞凝聚作用，表明大蒜油静脉注射乳剂无溶血作用。

③、血管刺激性试验

用5％葡萄糖注射液稀释大蒜油静脉注射乳剂，给药浓度相当于临床真菌感染的最大给药量。取体重2.0～2.5kg健康家兔4只，雌雄兼用，随即分为两组。将家兔置于固定器内。家兔左耳缘静脉滴注大蒜油静脉注射乳剂20mL/kg，右耳缘静脉滴注5％葡萄糖注射液20mL/kg，滴注速度为20滴(1mL)/min，每天上午滴注一次，连续3天，观察兔左耳缘静脉反应，并于末次给药后72h、14天将家兔处死，取注射部位或远离注射部位5cm处耳缘静脉，进行组织切片检查。

每次滴注期间及给药后观察，肉眼观察见左耳缘静脉进针处无血管发红、肿、热等局部刺激反应，组织病理学检查对照组与用药组皮肤、皮下组织形态正常，耳缘静脉血管内皮细胞排列正常，未见层次增多，排列紊乱的改变，官腔内无附壁血栓，无炎细胞浸润，管壁无增厚，管壁周围未见明显变性、坏死及炎症等形态学改变。结果表明大蒜油静脉注射乳剂无明显血管刺激性。病理切片照片见图8、图9、图10。

④、热原检查

依据《中国药典》2005年版热原检查法，观察家兔体温升高情况，判断本发明大蒜油静脉注射乳剂热原限度是否合格。

取合格家兔3只，在测定其正常体温后15min，自耳缘静脉缓缓注入预热至37℃的大蒜油静脉注射乳剂稀释液10mL·kg^-1(相当大蒜油1.5mg·kg^-1)，每隔30min测家兔肛温1次，共测6次。结果表明每只家兔体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃，说明本发明大蒜油静脉注射乳剂热原限度符合要求，可以安全使用。

⑤、致敏试验

动物：雄性豚鼠，250～350g；药物：大蒜油静脉注射乳剂，牛血清白蛋白；方法：取白色健康雄性豚鼠24只，体重250～350g，随机分为4组，每组6只，分别为本发明大蒜油静脉注射乳剂低剂量组、本发明大蒜油静脉注射乳剂高剂量组、阳性组(牛血清白蛋白)、阴性组(空白乳)。按无菌操作，连续隔日每组分别腹腔注射供试品0.5ml/只，共3次。致敏期间，每日观察每只动物的症状。初次，最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重。然后于末次注射后第10天，各组取3只豚鼠，分别静脉注射供试品1ml/只进行激发，给药后立即按全身过敏性反应评级标准详细观察注射后每只动物，症状的出现及消失时间，观察3h，判定豚鼠过敏反应级数。再于首次注射后第21天，各组取另3只豚鼠同法进行激发，进行观察。结果药物组豚鼠的过敏反应呈阴性，表明大蒜油静脉注射亚微乳过敏试验合格，粒度测定：本发明中应用PSS.NICOMPTM380作为测定粒径的仪器。

综上所述，本发明建立了一种大蒜油的精制方法，所获得的精制大蒜油由原来的棕黄色变为淡黄色；用所建立的GC方法测定大蒜素含量大于37.0％，共有指纹峰15个；用本发明大蒜油制备的静脉注射乳剂和固定脂质纳米粒具有体外抗深部真菌作用，且安全性提高，为临床应用提供可靠的依据。

Claims (10)

1、一种精制的大蒜油，其特征在于：该大蒜油具有如下特征：1、性状：它为淡黄色或黄色澄清液体，具蒜臭；2、折光率：它的折光率20℃时为1.5720以上；3、大蒜素含量测定及含量限度：采用GC法，四氢呋喃为内标测定大蒜油中大蒜素含量，大蒜素含量大于37.0％；4、指纹图谱为：色谱条件：6890NGC(美国Agilent公司)，色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)，进样口温度250℃，柱温60～220℃，程序升温，升温速率：8℃/min，N₂作载气，流速1.0ml·min^-1，FID检测器，检测室温度300℃，四氢呋喃为内标；大蒜油GC指纹图谱共有指纹峰保留时间(min)为：4.50～4.68、4.70～4.80、5.40～5.58、6.00～6.20、7.90～8.10、8.20～8.34、8.35～8.45、9.00～9.20、10.00～10.29、10.30～10.45、11.70～11.90、11.91～12.10、12.12～12.30、12.80～13.10、14.90～15.20(内标峰)、15.00～16.00。

2、一种如权利要求1所述的大蒜油的精制方法，其特征在于：该方法按下述步骤进行：

a、按如下重量比取各原料：大蒜油1∶吸附剂I 0.25～1.25∶吸附剂II 1～5；

b、将上述大蒜油与吸附剂II混匀；

c、在减压下将吸附剂I装入层析柱，再将步骤b所得混合物减压装入其上；

d、取溶媒减压洗脱，收集流出液；

e、减压回收溶媒即得精制大蒜油。

3、根据权利要求1中所述的大蒜油原料的精制方法，其特征在于：所述的吸附剂I、吸附剂II选自硅胶、氧化铝、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、大孔吸附树脂；洗脱剂选自C₁～C₅醇类、C₃～C₈有机酸酯类、C₁～C₄有机酸类、C₃～C₈酮类、醚类。

4、一种用权利要求1所述的精制大蒜油制备的乳剂，其特征在于：该乳剂主要含有精制大蒜油及药用辅料，大蒜油与药用辅料的质量比为1∶1～1∶300；药用辅料主要为油、乳化剂、等渗调节剂、pH调节剂、抗氧剂组成，其药用辅料的各成分用量为：油1～30％(w/v)；乳化剂0.05％～5％(w/v)；等渗调节剂0.5～5％(w/v)；抗氧剂0.1～5.0％(w/v)；其它成分为注射用水；PH最佳范围是4～9。

5、根据权利要求3所述的精制大蒜油静脉注射乳剂，其特征在于：所述的油选自C₆～C₂₈的植物油或动物油，它包括经过结构改造和水解后的植物油、甘油三酯、椰子油、橄榄油、大豆油、红花油、海豹油、辛葵酸甘油酯；及脂肪酸的衍生物，它包括油酸乙酯、亚油酸甘油酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、亚油酸乙酯、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯、椰子油C₈～C₁₀甘油单酯或双酯、椰子油C₈～C₁₀丙二醇双酯、椰子油C₈～C₁₀甘油三酯、纯化乙酰化的单甘油酯、纯化向日葵油单甘油酯中的一种或几种混合物，用量为1～30％(w/v)；所述的乳化剂包括磷脂0.5％～5％(w/v)、聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯，用量为0.1％～5％(w/v)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯0.1％～5％(w/v)、泊洛沙姆188的用量为0.05％～5％(w/v)、吐温类0.1％～5％(w/v)、司盘类0.1％～5％(w/v)中的一种或几种混合物；所述的等渗调节剂选自甘油、葡萄糖、甘露醇、木糖醇中的一种0.5～5％(w/v)；pH调节剂选自盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸、磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠等中的一种，pH值范围是4～9；抗氧剂选自惰性气体、乙二胺四乙酸及其盐类、α-生育酚、α-醋酸生育酚、α-硫辛酸、维生素C及其衍生物，维生素C棕榈酸酯中的一种或几种混合物0.1～5.0％(w/v)。

6、根据权利要求4中所述的精制大蒜油静脉注射乳剂，其特征在于：乳剂为口服剂型时以明胶、阿拉伯胶、西黄嗜胶、人血清白蛋白作为乳化剂0.05％～5％(w/v)；静脉注射乳剂或口服乳剂根据需要加入助乳化剂或防腐剂，助乳化剂选自油酸、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、胆酸中的一种0～5％(w/v)；防腐剂选自尼泊金酯类、苯甲酸类0～5％(w/v)。

7、一种如权利要求4所述的精制大蒜油静脉注射乳剂的制备工艺，其特征在于：按下述步骤进行：

a、按权利要求4所述乳剂的处方比例取各原料；

b、在配制罐中制备油相：在配制罐中，将油、抗氧剂，或油、助乳化剂加热至50～90℃，强烈搅拌混匀，加入精制大蒜油，强烈搅拌混匀；

c、在配制罐中制备水相：将水和等渗调节剂在50～90℃下搅拌混匀，加入乳化剂，高速搅拌使其完全混溶；

d、在50～90℃时，将油相加入水相或水相加入油相，强烈搅拌混匀，形成初乳；

e、加入pH调节剂调节pH值到4～9；

f、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至40～200MPa，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，充惰性气体，封装，即得。

8、一种用权利要求1所述的精制大蒜油制备的固体脂质纳米粒剂，其特征在于：主要含有精制大蒜油及药用辅料，药用辅料主要为固体脂质、乳化剂、助乳化剂组成，大蒜油与药用辅料的质量比为：5∶1～1∶50；其药用辅料的各成分用量为：固体脂质1％～10％(w/v)、乳化剂1％～10％(w/v)、助乳化剂0.05～5％(w/v)；其它成分为水。

9、根据权利要求8中所述的精制大蒜油固体脂质纳米粒剂，其特征在于：所述的固体脂质主要包括有甘油脂、脂肪酸、类固醇和蜡类；甘油脂选自豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯中的一种，其中三硬脂酸甘油酯包括中、长链脂肪酸的甘油酯、甘油二十二烷酸酯，部分甘油如Imwitor、单硬脂酸甘油酯，含有单、二、三甘油酯中的一种或几种混合物；脂肪酸选自硬脂酸、棕榈酸、癸酸、二十二酸中的一种；类固醇选自胆固醇；蜡类选自鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡、鲸醋蜡中的一种；所述的乳化剂选自磷脂类用量为0.5～5％(w/v)、HS15，用量为0.1～5％(w/v)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯，用量为0.1～5％(w/v)、泊洛沙姆188，用量为0.05～5％(w/v)、胆酸盐类，用量为0.1％～5％(w/v)、吐温类，用量为0.1％～5％(w/v)、短链醇类，用量为0.05～5％(w/v)；所述磷脂类选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、卵磷脂；HS15选自聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯660；胆酸盐类选自胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠，去氧牛磺胆酸钠；短链醇类选自丁醇、丁酸；所述的助乳化剂选自油酸、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、胆酸中的一种。

10、一种如权利要求8所述的精制大蒜油固体脂质纳米粒剂的制备工艺，其特征在于：该工艺按下述步骤进行：

a、按权利要求8所述精制大蒜油固体脂质纳米粒剂的处方取各原料；

b、在配制罐中将水、乳化剂和助乳化剂在50～90℃下搅拌分散均匀制成水相；

c、在配制罐中，在相同温度下将固体脂质相熔化，再加入大蒜油，搅拌均匀，形成脂质相；

d、将水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌3分钟，搅拌转数6000～28000rpm，制成初乳；

e、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至40～120MPa，将溶液反复匀化，或将初乳在功率400W下进行探头超声5分钟，保持70℃，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得。

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