CN105496986B - 一种登革热微针疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型登革热微针疫苗及其制备方法，经过病毒的培养、病毒浓缩、病毒灭活等制得灭活病毒疫苗，再通过制备反转模具、制备微针等制得新型登革热微针疫苗。本发明制得的是可溶性微针无痛疫苗，不会产生疼痛感，而且比皮下注射更安全。将灭活抗原通过注射器注射到肌肉内，微针注射将抗原投递到具有丰富免疫信号细胞的皮肤内，拥有更好的疫苗投递效果。固体形态的微针可包裹药物在室温下保存，无需冷藏，与液体注射药物相比，大大降低了运输和存储成本。

Description

一种登革热微针疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗，具体是一种新型登革热微针疫苗及其制备方法。

背景技术

登革热是登革热病毒(DengueVirus，DV)引起的一种急性传染病，通过蚊 子叮咬传播，登革病毒是黄病毒属、有包膜的单股正链RNA病毒，由于包膜 E蛋白的抗原性不同，又分为四种血清型，即DV1～4。登革病毒存在不同血清 型病毒感染后抗体增强效应，所以理想的疫苗应为四种血清型的合理组合。登革 疫苗的研究已经有数十年，迄今尚无成功疫苗上市。减毒活疫苗是最为传统的疫 苗，有望最早上市。目前研究较为成功的是巴斯德赛诺菲疫苗(Sanofi Pasteur,Swiftwater,PA,USA)，包含四种血清型，正在进行临床III试验。2011-2013年在亚洲开展的III期疗效研究，是一项随机、观察者双盲、安慰剂 对照、多中心临床研究，总计有10275名2-14岁儿童参与，这些儿童均来自亚 洲国家(印尼、马来西亚、菲律宾、泰国、越南等15个国家)的登革热流行地 区。研究中，志愿者随机(2:1)接受3剂登革热疫苗或安慰剂(每6个月注射 1剂)。主要终点通过由任何血清型引发的对症病毒学确诊的登革热病例数量来 衡量。研究结果表明可以有效降低60.8％的感染率，对各个血清型的保护率分别 为V150.3％，DV242.3％，DV374.0％和DV477.7％。2014年11月，赛诺菲巴斯 德公司CEOOlivierCharmeil宣布登革热疫苗治疗的有效性，并且希望能在2015 年下半年向市场推出该疫苗。临床试验结果提示：登革疫苗接种可以激发机体产 生保护性抗体，是有效遏制登革病毒感染的有力手段，但仍然存在不足。包括对 致病性最强的DENV2保护率仅为42.3％。同时，我们应该认识到，减毒活疫苗存 在病毒毒力回复、与流行病毒株发生重组、重配的风险。因此，能够避开减毒活 疫苗缺点且更高保护率的第二代登革疫苗有待研发。

亚单位疫苗和表位疫苗有着较好的安全性优势，但也存在免疫原性低的局限 性。此外，对于突变率高的病毒而言(尤其是RNA病毒如流感病毒、登革病毒等)， 难以获得成功。因此从疫苗实际需求的角度和研发风险成本的角度考虑，灭活病 毒疫苗是目前最应当考虑的登革热疫苗。灭活疫苗是利用灭活后的病毒或病毒的 裂解片段进行接种，从而达到免疫的目的，现已研发成功并投入使用的有百日咳 疫苗、流行性感冒疫苗、狂犬病疫苗、甲肝疫苗等，缺陷主要在于灭活疫苗免疫 效果较低，持续时间短，需要多次接种才可诱发稳定的保护性免疫。因此如果通 过能够解决灭活疫苗抗原性弱的问题，必会成为最理想的登革热疫苗。

登革热病毒感染的发病机理比较特殊，再次异型感染抗体依赖加强(AntibodyDependentEnhance,ADE)和细胞因子风暴(CytokineStorm)是困扰 该疫苗研制的主要障碍。从目前进入临床的登革疫苗研究结果分析，不同血清型 抗体产生免疫反应偏离的问题仍然没有解决。一个有效的策略是进行抗原组合的 合理调配，纠正免疫应答偏离，同时结合新型给药途径，如纳米技术，颗粒化技 术，模拟病毒形式等，提高疫苗效果。分析四种血清型的关键抗原分子E蛋白发 现，I、III、IV三种血清型的同源性较高，II型血清型较其他三种发生变异更多， 这就意味着如果四种血清型的抗原剂量相同时，产生I、III、IV三种血清型的抗 体相对于II型血清型的抗体要偏多。这可能是导致目前临床试验的II型血清型保 护率低的关键原因。

微针给药是近年来发展一起的一种新型给药系统。疫苗微针看起来就像一块 文身贴，表面分布着多列微针。微针直径250微米，高350-1000微米。微针由 可溶解的生物兼容材料制备而成，内嵌疫苗。把疫苗微针贴在皮肤上，微针刺入 皮肤大约0.5毫米，这一深度在皮肤表皮层，尚未触及神经末端和血管，因此不 会产生疼痛感，而且比皮下注射更安全。相比于肌肉，皮肤包含了更丰富的抗原 提呈细胞网络，这些抗原提呈细胞是启动免疫反应的必不可少的免疫信号细胞。 运用灭活的病毒进行微针皮肤免疫能增加局部细胞因子的增加，这些细胞因子对 中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞募集到免疫部位非常重要。所有上述这些细 胞在激活强大的先天性的抗病毒免疫反应中都发挥了作用。相对于传统疫苗投递 中，将灭活抗原通过注射器注射到肌肉内，微针注射将抗原投递到具有丰富免疫 信号细胞的皮肤内，拥有更好的疫苗投递效果。固体形态的微针可包裹药物在室 温下保存，无需冷藏，与液体注射药物相比，大大降低了运输和存储成本。

针对上述原因，我们对登革四种血清型灭活病毒进行合理调配组合，发现提 高II型登革病毒可以有效提高抗II登革病毒的抗体，证实了我们最初的设想。并 以脂质体、透明质酸包裹微针疫苗作为疫苗递送系统，可有效提高DC的疫苗递 呈能力10以上。进一步病毒中和实验显示，产生的血清型抗体可以有效中和四 种血清型病毒复制，显示出良好的疫苗预防效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全、无疼痛、投递效果号的新型登革热微针疫 苗及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型登革热微针疫苗的制备方法，由以下步骤组成：

一、灭活病毒疫苗的制备

首先进行病毒的培养，采用单层培养的Vero细胞，加入已作10倍-100倍 稀释的病毒液，将种毒瓶放入28℃培养箱培养lh，然后将其置入无菌间，在种 毒瓶中加入RPMI-1640维持培养液，再在28℃培养箱培养，当88-92％的Vero 细胞出现CPE后，进行收毒，收毒采用反复冻融的方法；将收毒后的病毒液进行 离心处理，取上清液；

病毒浓缩：将上述上清液进行过滤浓缩，浓缩液中再加入PB缓冲液回收病 毒液；

病毒灭活：取上述病毒液，加入灭活剂于4℃进行灭活，制得灭活病毒疫苗， 也称为DV病毒疫苗；

二、微针制备

制备反转模具：取微针针体的母模模具，取预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联 剂的混合物并覆盖在母模模具上，在温度为80℃下放置28-32分钟，得到反转 模具；分别将负载有台盼蓝和CpGOND的中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病毒 疫苗混匀，冻干；再加水水合且在45℃下搅拌，得到负载DV病毒疫苗的中空阳 离子脂质体纳米颗粒即Lip-DV；将Lip-DV加入到HA水溶液中，得到针体制作 液；

制备微针：将Cs、HA与水混合溶解得到作为背衬制作液，然后倒入上述反 转模具中静置；再置于密闭容器中，在2-4倍大气压下作用2-5分钟；然后将覆 盖有背衬制作液的反转模具自然晾干，即得新型登革热微针疫苗。

作为本发明进一步的方案：灭活剂采用质量浓度为0.0625％的甲醛或质量浓 度为0.1％的BeI。

作为本发明进一步的方案：BeI的灭活时间在24-36h。

作为本发明进一步的方案：甲醛的灭活时间在3-6h。

作为本发明进一步的方案：反复冻融的方法是将培养瓶在-20℃的条件下冻 住，然后融化，反复重复3-5次。

作为本发明进一步的方案：中空阳离子脂质体纳米颗粒的制备：将二棕榈酰 磷脂酰胆碱、二甲基三十六烷基铵和胆固醇按照摩尔比为2:1:1的比例搅拌混合 溶于酒精中，50℃下加热溶解；然后加水水合，并在50℃下搅拌均匀，再经过 均质机挤压得到中空阳离子脂质体纳米颗粒。

作为本发明进一步的方案：步骤一中，浓缩时采用0.01-0.02mo1/L的PBS 缓冲液。

作为本发明进一步的方案：步骤一中，PB缓冲液的浓度为0.2-0.3mo1/L。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病 毒疫苗的质量比为4-6:1。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病 毒疫苗的质量比为5:1。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，HA水溶液中HA的重量含量为4-6％。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，HA水溶液中HA的重量含量为5％。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，Lip-DV在针体制作液中所占的重量 含量为2.5-3.5％。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，Lip-DV在针体制作液中所占的重量 含量为3％。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联剂的 质量比为8-12:1。

作为本发明进一步的方案：步骤二中，预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联剂的 质量比为10:1。

作为本发明进一步的方案：背衬制作液中Cs:HA:水的重量比为1:1-2:3。

作为本发明进一步的方案：背衬制作液中Cs:HA:水的重量比为1:1:3。

根据上述制备方法制得新型登革热微针疫苗。

作为本发明进一步的方案：还包括基托部分，且基托部分不含有疫苗成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制得的是可溶性微针无痛疫苗。疫苗微针看起来就像一块文身贴，表 面分布着多列微针。微针直径250微米，高550微米。微针由可溶解的生物兼容 材料制备而成，内嵌疫苗。把疫苗微针贴在皮肤上，微针刺入皮肤大约0.5毫米， 这一深度在皮肤表皮层，尚未触及神经末端和血管，因此不会产生疼痛感，而且 比皮下注射更安全。相比于肌肉，皮肤包含了更丰富的抗原提呈细胞网络，这些 抗原提呈细胞是启动免疫反应的必不可少的免疫信号细胞。运用灭活的病毒进行 微针皮肤免疫能增加局部细胞因子的增加，这些细胞因子对中性粒细胞、单核细 胞和树突状细胞募集到免疫部位非常重要。所有上述这些细胞在激活强大的先天 性的抗病毒免疫反应中都发挥了作用。相对于传统疫苗投递中，将灭活抗原通过 注射器注射到肌肉内，微针注射将抗原投递到具有丰富免疫信号细胞的皮肤内，拥有更好的疫苗投递效果。固体形态的微针可包裹药物在室温下保存，无需冷藏， 与液体注射药物相比，大大降低了运输和存储成本。

附图说明

图1是不同试剂灭活登革病毒曲线图；

图2是本发明的可溶性微针疫苗贴片的整体示意图。

图3是可溶性微针疫苗贴片经皮给药后实施例和各比较例的IgG滴度，(a)是 针对DV1，(b)是针对DV2，(c)是针对DV3，(d)是针对DV4。

图4是本发明的结构示意图；图中，1-微针、2-基托部分。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地 描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例中，一种新型登革热微针疫苗的制备方法，具体包括以下步骤。

一、灭活病毒疫苗的制备

首先进行病毒的培养，细胞培养采用单层培养的Vero细胞，加入已作10 倍、100倍稀释的鼠脑病毒液0.6ml病毒加入后，盖上瓶塞，轻轻摇晃种毒瓶， 让病毒液在Vero细胞面上来回10次，对照瓶中加入相同的0.6ml维持液，将种 毒瓶和对照瓶一起放入28℃培养箱培养lh，其中每隔15min，将种毒瓶和对照 瓶拿出，轻轻摇晃种毒瓶和对照瓶，保证病毒液或维持液能在Vero细胞面上来 回20-30次，使病毒液或维持液能充分接触Vero细胞后，再晃动瓶子4次后， 重新进入无菌间，在培养瓶中加入2％RPMI-1640维持培养液，将加完2％RPMI-1640 维持培养液的培养瓶放回28℃培养箱培养，每天观察，直到有90％的Vero细胞出现CPE(cytopathiceffect，致细胞病变效应)后，进行收毒，收毒用反复 冻融的方法:即将培养瓶放入-20℃冰箱，冻住后，直接拿出来等其融化后，用力 摇晃培养瓶，使Vero细胞破裂释放出病毒颗粒，反复重复4次。收毒后的病毒 液用移液管吸入离心管，离心转速为1000-20O0rpm，离心10min，以此除去Vero 细胞碎片，将离心后的上清液转移，弃底部沉淀，该上清液可用于病毒的浓缩纯 化、滴度测定等。

病毒浓缩将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤，将无 菌试验和灭活试验合格的病毒液进行澄清过滤，即经10μm滤膜粗滤后，再经两次 0.45μm滤膜过滤，然后用分子量1000K的超滤膜进行超滤浓缩，用0.01M的PBS(磷 酸缓冲盐溶液,phosphatebuffersaline)作最后浓缩，浓缩液中再加入 0.25mo1/LPB(聚丁二烯，polybutadiene)回收病毒液。

病毒灭活取病毒液分别加入浓度分别为0.0625％和0.1％的甲醛和BeI于4℃ 进行灭活，于0.5h，1h，3h，6h，12h，24h，36h，48h取样透析后进行检测。将 不同时间段经过透析后的样品按10倍比稀释后分别接种96孔板vero细胞(非洲绿 猴肾细胞)。每组接种5个复孔，每个孔接种0.1ml。经33-37℃培养3d后，进行 病毒空斑实验，记录结果是否出现空斑，绘制出灭活效果曲线图。确定出两种灭 活剂各自的最佳灭活时间。取前甲醛和BeI灭活后的样品及先裂解后灭活和先灭 活后裂解完的不同浓度样品经透析，去除残余裂解剂与灭活剂后进行灭活验证实 验。试验结果显示采用两种灭活剂和不同裂解灭活顺序得到的病毒液均合格，可 以完全灭活病毒。甲醛灭活时，病毒在灭活最初半小时内保持较高感染性，1h 后迅速下降，至6h可完全灭活。BeI灭活时，病毒在灭活最初12h内感染性保持较 高水平，到24h迅速下降，至36h可完全灭活，证明BeI的最佳灭活时间在24-36h 间，甲醛的最佳灭活时间在3-6h间。(见图1)

二、微针制备

制备反转模具：依托表面有81个(9*9)(这里的依托面可以是矩形，也可 以是圆形(9*9+4*5)，高约300-1000微米，底端直径约250微米的四面体形微针 针体的母模模具，取预聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交联剂1克的混合物并覆盖 在母模模具上，在温度为80℃下放置28-32分钟，得到表面具有与模具上微针针 体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的反转模具；反转模具的表面含有81 个(9×9行)深度约300-1000微米微米，底端直径约250微米的正方形的针孔； 针孔的锥角的角度为35°。分别将负载有台盼蓝和CpGOND的中空阳离子脂质体 纳米颗粒(中空阳离子脂质体纳米颗粒的制备：将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二甲基三十六烷基铵(DDA)和胆固醇(cholesterol)按照摩尔比为2:1:1的比 例搅拌混合溶于6ml的酒精中，50℃水浴加热溶解，继续搅拌蒸馏掉酒精得到脂 质层；加10ml蒸馏水水合，50℃水浴搅拌均匀，得到中空的多层囊泡；将得到的 中空的多层囊泡用均质机挤压得粒径均一(约200纳米)的单层囊泡，即得到中 空阳离子脂质体纳米颗粒)；加入DV病毒疫苗混匀，冻干；再加1ml蒸馏水水合且 在45℃搅拌30分钟，可得到负载DV病毒疫苗的中空阳离子脂质体纳米颗粒 (Lip-DV)，其中，中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病毒疫苗的质量比为5:1。 将Lip-DV加入到重量百分含量为5％的HA(Haluronicacid，玻璃酸)水溶液中， 得到针体制作液，其中Lip-DV在针体制作液中所占的总重量百分含量为3％。

制备微针：将Cs:HA:水按重量比为1:1:3(w/w/w)混合溶解得到作为可溶 性微针疫苗贴片的背衬制作液，然后倒入上述所得到的覆盖有针体制作液并干燥 后得到的反转模具中，室温下放置5分钟；然后置于密闭容器中，增加气压至3 倍大气压，作用3分钟，使所述的81个正方形的针孔中残存的空气溢出；然后将 覆盖有背衬制作液的反转模具于4℃下自然晾干，将干燥后的可溶性微针疫苗贴 片小心取下即成。(图2与图4)

从图4中可以看到，新型登革热微针疫苗由微针1与基托部分2组成，且微针 1含有疫苗成分，基托部分2不含有疫苗成分。

三、体液免疫检测

按表1实验分组，每组5只体重约20±3g的年龄在6-8周左右的Balb/c雌性小 鼠为实验对象，免疫剂量为100μg抗原/只。将制备好的灭活登革病毒脂质体纳 米颗粒、天然登革病毒脂质体纳米颗粒及PBS，于0，14，28天进行皮下接种，微 针疫苗贴以皮肤贴片。提前24小时，小心把小鼠腹部一侧的毛除去。采用戊巴比 妥钠麻醉小鼠，然后将本实施例中得到的可溶性微针疫苗贴片按压在小鼠的无毛 区域，按压时可溶性微针疫苗贴片中的可溶性微针的针尖面向小鼠的无毛区域， 按压时间为3分钟，使可溶性微针针体中的HBsAg完全释放到小鼠皮肤中，完成经 皮给药。两周后重复一次上述给药。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并 获得血清，测定血清中针对HBsAg的特异性IgG抗体IgG的滴度(图3)。其中在0 天，14天，28天和42天免疫前尾静脉取血分离血清，以检测小鼠血清IgG抗体动 态变化。末次免疫两周后(即免疫第42天)将小鼠摘除眼球取血，分离血清备用。

1.ELISA检测免疫小鼠血清中登革病毒特异E蛋白IgG抗体应答

1)抗原包被:以原核表达纯化的E蛋白为抗原，按200ng/孔加入96孔板中， 4℃过夜包被，PBST洗板3次；

2)每孔加入200μl无菌PBS配制的5％脱脂奶，37℃封闭2h，PBST洗板3 次；

3)将0，14，28，42天收集的小鼠血清用5％脱脂奶从1:50开始进行2倍系 列稀释，按100μl/孔加入96孔板中，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

4)加入二抗:HRP标记的羊抗鼠IgG用5％脱脂奶按1:1000稀释，100μ1/孔， 37℃孵育1h，PBST洗板6次；

5)显色:加底物A液、B液每孔50μl，避光放置10min。终止液50μl终止反 应；

6)酶标仪检测A450，以PBS组各稀释度A450值为阴性对照，根据Cutoff 为P/N≥2.1的标准，选择符合该标准的最大稀释度作为每份血清的滴度并进行 对数转换。

以重组E蛋白为抗原包被ELISA板，检测免疫血清IgG抗体滴度及动态变化。 同时，以纯化的1-4型天然登革病毒作为阳性对照按同样方案免疫，PBS为阴性对 照。以阴性对照组OD值的平均数为N，按P/N≥2.1的标准选择符合该标准的最大 稀释度作为每份血清的IgG抗体滴度。结果表明，微针灭活登革疫苗、灭活登革 病毒及天然登革病毒均可刺激小鼠产生抗E蛋白的IgG抗体，抗体滴度随免疫时间 呈逐渐增高趋势，微针免疫组、灭活组及天然病毒免疫组的鼠血清各采血时间点 抗体滴度均高于阴性对照组(P<0.05)，说明各实验组免疫BALB/c小鼠后，均能产 生特异的抗登革E蛋白的IgG抗体。对于微针疫苗而言，其刺激小鼠产生的抗登革 1型、2型、3型E蛋白抗体滴度在各采血时间点均高于相应的天然病毒免疫组 (P<0.05)，4型E蛋白IgG抗体滴度与天然活病毒组免疫效果相当，无明显统计学 差异。而灭活病毒组四型抗体滴度均稍低于天然活病毒免疫组，有统计学差异。 结果如图3所示。

2.中和试验检测免疫小鼠血清中和活性

1)将BHK-21细胞传代至％孔板，待细胞长至单层；

2)将收集的小鼠免疫1fII一清于56℃灭活30min，0.45μm滤膜过滤；

3)将灭活血清用Eagle's维持液从1:5开始，作2倍倍比稀释，与100TCID50 的同型登革病毒按1:1混合，370C温育1h；

4)吸出96孔板中的培养液，用Eagle's维持液洗细胞表面1次；

5)按100μl/孔加入温育后血清，每个稀释度作4个复孔；

6)37℃，5％CO2条件培养，逐日观察病变，共观察7天；

7)以四个复孔均不出现可观察到的细胞病变的血清稀释度作为抗体中和效 价。

病毒中和效应检测显示，登革微针疫苗免疫BALB/c小鼠后，可刺激小鼠产生 针对同型登革病毒的中和抗体，中和效价最高可达1:50与作为阳性对照的天然病 毒免疫组小鼠血清抗体中和效价无明显统计学差异，但均高于PBS免疫组 (P<0.05)。具体见表2。

表格1灭活4价登革病毒微针疫苗及天然登革病毒免疫方案

表格2各种小鼠血清中和抗体效价检测结果

本发明对登革四种血清型灭活病毒进行合理组合，并以脂质体、透明质酸包 裹微针疫苗作为疫苗递送系统，可有效提高DC的疫苗递呈能力10以上。进一步 病毒攻毒实验显示，可以85％以上预防乳鼠颅内病毒挑战，显示出良好的疫苗预 防效果。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发 明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性 的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要 求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方 式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领 域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组 合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种登革热微针疫苗的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：

一、灭活病毒疫苗的制备

首先进行病毒的培养，采用单层培养的Vero细胞，加入已作10倍-100倍稀释的病毒液，将种毒瓶放入28℃培养箱培养lh，然后将其置入无菌间，在种毒瓶中加入RPMI-1640维持培养液，再在28℃培养箱培养，当88-92％的Vero 细胞出现CPE后，进行收毒，收毒采用反复冻融的方法；将收毒后的病毒液进行离心处理，取上清液；所述反复冻融的方法是将培养瓶在-20℃的条件下冻住，然后融化，反复重复3-5次；

病毒浓缩：将上述上清液进行过滤，然后用分子量1000K的超滤膜进行超滤浓缩，用0.01M的PBS作最后浓缩，浓缩液中再加入 0.25mo1/L PB回收病毒液；

病毒灭活：取上述病毒液，加入灭活剂于4℃进行灭活，制得灭活病毒疫苗，也称为DV病毒疫苗；灭活剂采用质量浓度为0.0625％的甲醛或质量浓度为0.1％的BeI；BeI的灭活时间在24-36h；甲醛的灭活时间在3-6h；

二、微针制备

制备反转模具：取微针针体的母模模具，取预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联剂的混合物并覆盖在母模模具上，在温度为80℃下放置28-32分钟，得到反转模具；分别将负载有台盼蓝和CpGOND的中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病毒疫苗混匀，冻干；再加水水合且在45℃下搅拌，得到负载DV病毒疫苗的中空阳离子脂质体纳米颗粒即Lip-DV；将Lip-DV加入到HA水溶液中，得到针体制作液；所述预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联剂的质量比为8-12:1；所述中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病毒疫苗的质量比为4-6:1；HA水溶液中HA的重量含量为4-6％；所述Lip-DV在针体制作液中所占的重量含量为2.5-3.5％；所述中空阳离子脂质体纳米颗粒的制备：将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二甲基三十六烷基铵和胆固醇按照摩尔比为2:1:1的比例搅拌混合溶于酒精中，50℃下加热溶解，继续搅拌蒸馏掉酒精得到脂质层；然后加水水合，并在50℃下搅拌均匀，再经过均质机挤压得到中空阳离子脂质体纳米颗粒；制备微针：将Cs、HA与水混合溶解得到作为背衬制作液，然后倒入上述反转模具中静置；再置于密闭容器中，在2-4倍大气压下作用2-5分钟；然后将覆盖有背衬制作液的反转模具自然晾干，即得新型登革热微针疫苗；背衬制作液中Cs:HA:水的重量比为1:1-2:3。

2.根据权利要求1所述的登革热微针疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，中空阳离子脂质体纳米颗粒与DV病毒疫苗的质量比为5:1。

3.根据权利要求1所述的登革热微针疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，HA水溶液中HA的重量含量为5％。

4.根据权利要求1所述的登革热微针疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，Lip-DV在针体制作液中所占的重量含量为3％。

5.根据权利要求1所述的登革热微针疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联剂的质量比为10:1。

6.根据权利要求1所述的登革热微针疫苗的制备方法，其特征在于，背衬制作液中Cs:HA:水的重量比为1:1:3。

7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法制得的登革热微针疫苗。