CN103127495A - 羊巴氏杆菌活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物医学领域，特别灭活疫苗的制备，羊巴氏杆菌灭活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗在制备二联灭活苗中的应用；按比例每毫升二联灭活苗中包括羊巴氏杆菌8-10亿个和0.025g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆；方法为：将羊巴氏杆菌的菌液计数并用甲醛溶液作灭活处理，得羊巴氏杆菌灭活苗；取被山羊丝状支原体感染的病变组织绞碎，与生理盐水、步骤A所述羊巴氏杆菌灭活苗混匀，制备匀浆，将所述匀浆用甲醛溶液作灭活处理，得二联灭活苗；将步骤B所得二联灭活苗加入配方量的所述芦荟多糖佐剂，混匀，得制剂；本发明中，所述羊巴氏杆菌活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗有协同增效作用；其制备方法简单；所述二联苗及其制剂效价高。

Description

羊巴氏杆菌活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗及其制备

技术领域

本发明属于动物医学领域，特别涉及灭活疫苗的制备。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎，俗称烂肺病，是由多种支原体引起的一种接触性传染病，以咳嗽、高热、胸膜炎、纤维素肺炎为主要特征。山羊支原体肺炎的病原主要有：山羊支原体山羊亚种(M.capricolum subsp.capricolum，Mcc)、丝状支原体簇的山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp)、丝状支原体丝状亚种LC型(M.mycoidessubsp.mycoides LC，MmmLC)、丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.Capri，Mmc)和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumoniae，MO)。该病流行于世界各地，也是对我国养羊业造成严重经济损失、阻碍我国养羊业发展的主要疾病之一。先后在甘肃、内蒙古、四川、山东、河北、湖北、云南、贵州、重庆等地均有报道，据初步统计，该病每年给我国造成的直接经济损失高达40亿美元。据调查，仅重庆山羊传染性胸膜肺炎的发病率约为70％，在各年龄阶段的山羊都有发生，断奶后山羊的病死率显著高于青年羊和成年羊。感染后未死亡的羊只大部分为带菌者，发病和死亡以春秋潮湿、寒冷的季节较为多见。由于本病的存在，使得山羊的生长速度减慢，饲料报酬较低，造成严重的经济损失，严重打击了养羊户的积极性。

羊巴氏杆菌病主要是由溶血性巴氏杆菌或多杀性巴氏杆菌所引起的畜禽共患的一种急性接触性传染病，此菌常存在于健康羊的呼吸道内，当遭遇刺激源(如气候骤变、天气寒冷、营养不良、长途运输或患有其它疾病)而羊的抵抗力减弱时，即呈现致病作用，引起发病。病原体主要经空气传播。飞沫传染是受时间和空间限制的，从病畜一次喷出的飞沫来说，其传播空间不过几米，维持的时间最多只有几个小时。过去，山羊多是一家一户的零星散养，每户一般养3～5只，多者养10多只，在饲养上多以放牧为主。山羊常年处于相对隔离、干燥和通风良好的环境中，因此，很少发生巴氏杆菌病。现在山羊饲养已发展为高密度、集约化的饲养，山羊之间接触频繁，一旦有羊发生巴氏杆菌病则很快就会在羊群中迅速传播，致使大批山羊发病、死亡。

山羊传染性胸膜肺炎与羊巴氏杆菌病均是山羊养殖生产过程中常见的地方性疫病，疫苗免疫接种仍是控制该类病的主要手段。但是由于病原复杂性与血清型的多样性，且不同地区的优势菌株存在差异，不同菌株之间的抗原交叉保护力较弱，所以长期缺乏有效的疫苗，免疫预防的效果始终不甚理想。随着养殖规模与数量的增大，同时全球性和区域性经济活动、家畜调动、运输的增多，山羊传染性胸膜肺炎与羊巴氏杆菌病的发病数量与疫区面积均有所增加，成为当前许多地区危害畜牧业的重要疫病。目前，还没有关于具有交叉保护作用的羊传染性胸膜肺炎与羊巴氏杆菌病二联苗的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供两种灭活苗的联合应用，其有协同作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

羊巴氏杆菌灭活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗在制备二联灭活苗中的应用。

进一步，所述羊丝状支原体肺炎灭活苗为山羊丝状支原体肺炎组织灭活苗。

进一步，每毫升二联灭活苗中包括羊巴氏杆菌8-10亿个和0.02g-0.03g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆。

本发明的目的之二在于提供二联灭活苗及其制剂，该二联灭活苗及其制剂用于预防山羊传染性胸膜肺炎和羊巴氏杆菌病效果明显。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

二联灭活苗，按比例计每毫升二联灭活苗中由羊巴氏杆菌8-10亿个和0.025g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆组成。

进一步，每毫升二联灭活苗中由羊巴氏杆菌9亿个和0.025g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆组成。

所述的二联灭活苗的制剂，所述二联灭活苗与芦荟多糖佐剂混合，所述芦荟多糖中的多糖占芦荟多糖重量的44％或更多。

进一步，所述制剂中所述多糖的质量百分比为5-10mg/mL。

本发明的目的之三在于提供所述制剂的制备方法，该方法操作简单，稳定，制备的产品生物利用度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

A羊巴氏杆菌灭活苗的制备

将羊巴氏杆菌的菌液用甲醛溶液作灭活处理并计数，为羊巴氏杆菌灭活苗；

B二联灭活苗的制备

取被山羊丝状支原体感染的病变组织绞碎，与生理盐水、步骤A所述羊巴氏杆菌灭活苗混匀，制备匀浆，将所述匀浆用甲醛溶液作灭活处理，得二联灭活苗；

C制剂的制备

将步骤B所得二联灭活苗加入配方量的所述芦荟多糖佐剂，混匀，得制剂。

进一步，步骤A和步骤B中，所述甲醛溶液的体积百分浓度为0.3％甲醛溶液，灭活处理时间为24小时，灭活温度为37℃。

进一步，步骤B中，所述生理盐水与所述羊巴氏杆菌灭活苗为等体积混合。

本发明的有益效果在于：本发明中，所述羊巴氏杆菌灭活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗有协同增效作用；其制备方法简单；所述二联苗及其制剂效价高。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例一

一羊巴氏杆菌菌液的制备

1培养基为添加了体积分数为0.2％裂解血球全血的马丁肉汤。

2种子液培养：将羊巴氏杆菌接种于所述马丁肉汤中，37℃培养20-24小时，经无菌检验合格后待用。

3菌液培养：将种子液按体积分数为5％的比例接种于制备好的营养液，于37℃振荡培养24小时。

4纯检及杀菌：菌液培养完成后，取样作纯粹检验，同时计算菌数。取样后，加入0.3％甲醛溶液，于37℃杀菌24小时。杀菌后取样作无菌检验，为羊巴氏杆菌灭活苗。

二二联疫苗的制备

1山羊接种：纯化培养的丝状支原体，生理盐水作1∶3(体积计算)稀释，气管注射易感山羊，接种剂量为5ml。

2观察山羊临床反应，接种7天后扑杀病羊，无菌采集病变组织(肺脏及胸腔积液)。

3经无菌检验合格后，将病变肺组织剪成小块，绞碎，加入生理盐水与羊巴氏杆菌灭活苗混匀(生理盐水和羊巴氏杆菌灭活苗)，同时将胸腔积液及渗出物等倾入，经磨碎机捣磨后，用40目/时铜纱漏斗过滤，即为组织乳剂。加入200U/ml双抗，于37℃培养24小时。

4杀菌及纯检：组织乳剂制作完成后，加入体积浓度为0.3％的甲醛溶液，于37℃杀菌24小时。杀菌后取样作无菌检验。

三制剂的制备

1芦荟多糖：多糖含量按重量百分比计相当与芦荟多糖重量的44％或更多。

2二联苗中两种成分的含量：每毫升灭活疫苗中含有羊巴氏杆菌9亿个；含丝状支原体感染的肺组织0.025g。二者无菌条件下混合均匀。

3无菌条件下，按比例加入灭菌处理后的芦荟多糖佐剂，制成两种制剂，分别含有含芦荟多糖(以多糖计)5mg/mL和10mg/mL作佐剂，振摇15分钟后分装备用，分别得制剂1(含多糖5mg/mL)和制剂2(含多糖10mg/mL)。

4无菌检验按常规灭活苗的方法检测，为合格。

实施例二灭活苗效果实验

一实验分组

羊巴氏杆菌灭活苗组：实施例1所述羊巴氏杆菌灭活苗；取12只非免疫30日龄山羊进行免疫，观察10天。

山羊丝状支原体肺炎灭活苗组：详见房晓文《山羊传染性胸膜炎氢氧化铝疫苗制造及免疫试验》制备山羊丝状支原体肺炎灭活苗免疫12只非免疫30日龄山羊，观察10天。

二联灭活苗组：羊巴氏杆菌灭活苗同实施例1所述制剂1的区别在于：以生理盐水替代芦荟多糖；取12只非免疫30日龄山羊进行免疫，观察10天。

制剂1组：用实施例1制备的制剂1，取12只非免疫30日龄山羊进行免疫；每组接种3个免疫剂量梯度，即2mL/只、3mL/只、4mL/只，每个梯度接种4只山羊，观察10天。

制剂2组：用实施例1制备的制剂2，取12只非免疫30日龄山羊进行免疫；每组接种3个免疫剂量梯度，即2mL/只、3mL/只、4mL/只，每个梯度接种4只山羊，观察10天。

空白组：取12只非免疫30日龄山羊用生理盐水进行免疫，观察10天。

二五种灭活菌苗免疫效果对比试验

免疫接种程序与剂量，按表1进行免疫接种。

表1菌苗免疫接种程序及剂量

备注：二免在第一次免疫后的第10天进行。

三待检血清的采取与制备

免疫后第7d，从每组12只山羊中随机选取5只，用一次性注射器按5mL/次采集颈静脉血液。以后每隔4天采血一次直至1个月。采集鲜血转入灭菌5mL离心管(有盖)，37℃温箱作用30min，后转入4℃冰箱沉析，取上清液即为待检血清，4℃冰箱保存备用。

抗体的检测采用ELISA抗体检测试剂盒检测两种灭活菌苗免疫后的抗体升长情况，比较其两种菌苗的免疫效果。

攻毒试验首免后第16天，选择空白对照组、甲醛灭活苗组和芦荟多糖菌苗(制剂1和制剂2)组试验山羊，以野毒菌株培养物(约6×10⁹CFU/ml)进行攻毒试验，观察其发病与死亡情况。

通过无菌检验和安全性检验表明，所述二联灭活疫苗与甲醛灭活苗均未受细菌污染；注射5mL/只山羊不表现毒副反应，表明安全性较好。

四各种灭活苗免疫后抗体效价的测定：结果见表2。

表2灭活菌苗免疫后抗体测定结果

备注：1.样本数是指随机采取血清样品的每组试验山羊数目；2.抗体滴度是所测5个样本的平均数；3、采血时间。

两种所述制剂组攻毒试验结果：首免后第16d，选择空白对照组、甲醛菌苗组和高含量芦荟多糖菌苗组试验山羊，进行攻毒试验，结果见表3。

表3菌苗免疫16d后攻毒试验结果

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.羊巴氏杆菌灭活苗与山羊丝状支原体肺炎灭活苗在制备二联灭活苗中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述山羊丝状支原体肺炎灭活苗为山羊丝状支原体肺炎组织灭活苗。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，按比例计，每毫升二联灭活苗中包括羊巴氏杆菌8-10亿个和0.02g-0.03g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆。

4.二联灭活苗，其特征在于，每毫升二联灭活苗中由羊巴氏杆菌8-10亿个和0.025g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆组成。

5.根据权利要求4所述的二联灭活苗，其特征在于，每毫升二联灭活苗中由羊巴氏杆菌9亿个和0.025g丝状支原体感染的灭活肺组织匀浆组成。

6.权利要求4或5所述的二联灭活苗的制剂，其特征在于，所述二联灭活苗与芦荟多糖佐剂混合，所述芦荟多糖中的多糖占芦荟多糖重量的44％或更多。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂中所述多糖的质量百分比为5-10mg/mL。

8.权利要求6所述的制剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A羊巴氏杆菌灭活苗的制备

对羊巴氏杆菌的菌液计数，并用甲醛溶液作灭活处理，得羊巴氏杆菌灭活苗；

B二联灭活苗的制备

取被山羊丝状支原体感染的病变组织绞碎，与生理盐水、步骤A所述羊巴氏杆菌灭活苗混匀，制备匀浆，将所述匀浆用甲醛溶液作灭活处理，得二联灭活苗；

C制剂的制备

将步骤B所得二联灭活苗加入配方量的所述芦荟多糖佐剂，混匀，得制剂。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤A和步骤B中，所述甲醛溶液的体积百分浓度为0.3％甲醛溶液，灭活处理时间为24小时，灭活温度为37℃。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述生理盐水与所述羊巴氏杆菌灭活苗为等体积混合。