IT201900013983A1 - Saggio per la determinazione dei profili di suscettibilità agli antibiotici in microrganismi produttori di biofilm. - Google Patents

Saggio per la determinazione dei profili di suscettibilità agli antibiotici in microrganismi produttori di biofilm. Download PDF

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Fabrizio Ensoli
Domenico Enea Gino Di
Luigi Toma
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St Fisioterapici Ospitalieri
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Description

SAGGIO PER LA DETERMINAZIONE DEI PROFILI DI SUSCETTIBILITÀ AGLI ANTIBIOTICI IN MICRORGANISMI PRODUTTORI DI BIOFILM
DESCRIZIONE
Campo dell’invenzione
La presente invenzione riguarda un saggio per la determinazione della suscettibilità agli antibiotici in microrganismi produttori di biofilm. Più in particolare, l’invenzione concerne un sistema diagnostico standardizzato su piastra per microbiologia che consente di misurare direttamente l’efficacia dei diversi antibiotici nella rimozione del biofilm microbico, da utilizzare per l’analisi clinica dei profili di suscettibilità/resistenza agli antimicrobici di microrganismi produttori di biofilm. La procedura analitica è stata denominata Biofilm Susceptibility Test (BST).
Antefatto dell’invenzione
I microrganismi possono esistere sotto forma di singole cellule fluttuanti o planctoniche, oppure in una forma aggregata o sessile, in cui le cellule sono vincolate e fermamente attaccate l’una all’altra crescendo in una matrice organica, nota come biofilm, principalmente composta da esopolisaccaridi (EPS), proteine e acidi nucleici. In natura i microrganismi tendono di regola ad aggregarsi in biofilm, una modalità di crescita che permette la formazione di comunità multicellulari organizzate e altamente specializzate. Grazie alla protezione offerta dalla matrice del biofilm ed alle complesse interazioni biologiche che si stabiliscono tra le cellule del consorzio, la formazione del biofilm permette la sopravvivenza delle singole cellule batteriche anche in condizioni ambientali ostili (Branda S.S. et al. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol.2005; 13:20–26.
Dal punto di vista medico, la modalità di crescita in biofilm rappresenta un importante fattore di virulenza e un serio problema per la salute pubblica. Infatti, i microrganismi patogeni che si sviluppano in biofilm mostrano una elevata tolleranza ai trattamenti antibiotici e sfuggono alla sorveglianza del sistema immunitario dell’ospite, acquisendo contestualmente una maggiore capacità di invasione e persistenza sia nell’ospite che nel l’ambiente esterno.
Si stima che oltre l’80% delle infezioni ospedaliere siano causate da ceppi microbici produttori di biofilm (Lebeaux D. et al., Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 2014; 78:510-43), e la presenza del biofilm rende difficile l’eradicazione dell’infezione soprattutto in pazienti immunocompromessi e portatori di dispositivi medici come impianti, protesi, cateteri e simili (Darouiche R.O. Device-associated infections: a macroproblem that starts with microadherence. Clin Infect Dis.2001, 33:1567–1572; O’Gara J.P. e Humphreys H. Staphylococcus epidermidis biofilms: importance and implications. J Med Microbiol.
2001, 50:582–587; Wilson M. Bacterial biofilms and human disease. Sci Prog. 2001, 84:235–254; Lyte M, et al. Stimulation of Staphylococcus epidermidis growth and biofilm formation by catecholamine inotropes. Lancet 2003, 361:130–5). In tutti questi casi, per poter attuare un intervento terapeutico efficace bisogna tener presente che i convenzionali test per la valutazione della suscettibilità agli agenti antimicrobici (antibiogramma) vengono eseguiti in vitro su cellule microbiche in crescita planctonica. Di conseguenza, l’antibiogramma convenzionale può non fornire informazioni complete sulle resistenze che gli stessi microrganismi sono in grado di sviluppare in vivo quando formano biofilm (Costerton et al., The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. J Clin Invest. 2003, 112:1466-1477).
In effetti, è stato ampiamente documentato che i comuni test in vitro possono spesso non essere rappresentativi di quanto accade in vivo poiché non tengono in conto i fattori farmacocinetici e farmacodinamici che limitano l’efficacia di un antibiotico contro microorganismi protetti dal biofilm (Coenye T. et al., Should standardized susceptibility testing for microbial biofilms be introduced in clinical practice? Clin Microbiol Infect.2018 Jan 11. pii: S1198-743X(18)30052-1). Ne deriva che in presenza di microorganismi produttori di biofilm, gli antibiogrammi convenzionali sono spesso inadeguati a determinare il reale spettro di suscettibilità ai farmaci antimicrobici, con il serio rischio di fallimenti terapeutici, una prolungata ospedalizzazione e l’emergenza di ulteriori meccanismi di resistenza ai farmaci. In questo quadro, lo sviluppo di nuove procedure di laboratorio per la valutazione della suscettibilità di microrganismi produttori di biofilm ai farmaci antimicrobici concorre a colmare una necessità diagnostica non ancora soddisfatta.
Diverse procedure sono state descritte in letteratura per la determinazione della suscettibilità agli antibiotici di microrganismi produttori di biofilm (Moskowitz S.M. et al., Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol.2004;42:1915–1922; Mah T.F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B) J. Vis. Exp.2014; Macia M.D.et al., Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria. Clin. Microbiol. Infect.
2014;20:981–990; Di Domenico E.G. et al., Inflammatory cytokines and biofilm production sustain Staphylococcus aureus outgrowth and persistence: a pivotal interplay in the pathogenesis of Atopic Dermatitis. Sci Rep.
2018;8:9573). In particolare, la procedura proposta da Pettit e coll. (Pettit R.K. et al., Microplate Alamar blue assay for Staphylococcus epidermidis biofilm susceptibility testing. Antimicrob Agents Chemother.2005; 49:2612-7) è basata sull’utilizzo di un indicatore di ossidoriduzione, la resazurina, anche nota commercialmente come Alamar blue (AB), che diventa fluorescente e cambia colore in risposta ad una riduzione chimica, per cui l’attività metabolica del biofilm si traduce in un cambiamento di colore tanto più marcato quanto più vitale è il biofilm. La procedura si avvaleva di piastre per microbiologia standard, su cui era fatto crescere il biofilm in un opportuno mezzo di coltura e a cui, dopo 24 ore di incubazione, venivano aggiunti, sempre in un opportuno mezzo, dosaggi prestabiliti dei vari agenti antimicrobici in prova. Dopo un’esposizione di 20 ore agli agenti antimicrobici si aggiungeva ai pozzetti il colorante (AB), e successivamente si procedeva alla lettura delle assorbanze (densità ottiche) a 570 nm e a 600 nm di lunghezza d’onda.
Nonostante l’abbondante letteratura scientifica sulla quantificazione della crescita batterica in biofilm e sulla valutazione dell’attività di agenti antibiotici e peptidi antimicrobici nell’eradicazione di infezioni batteriche caratterizzate da crescita in biofilm, non risulta ad oggi noto un saggio standardizzato in grado di determinare la suscettibilità agli agenti antimicrobici dei germi produttori di biofilm.
Nell’ambito degli studi connessi alla presente invenzione, si è considerato pertanto che sussiste ancora l’esigenza di poter disporre di una procedura di laboratorio standardizzata e facilmente riproducibile per la valutazione della suscettibilità agli antibiotici di microrganismi produttori di biofilm che sia economicamente conveniente e facile da attuare in qualsiasi comune laboratorio di analisi cliniche, oltre che applicabile, con la dovuta customizzazione, a settori collaterali, come lo screening di nuove molecole attive nell’industria farmaceutica, la sanificazione ambientale e dei prodotti alimentari.
Sommario dell’invenzione
Sulla base della letteratura corrente sintetizzata sopra, è stato ideato e sviluppato, secondo la presente invenzione, un sistema diagnostico per la valutazione della suscettibilità agli antibiotici dei principali batteri patogeni, che tiene in considerazione la loro capacità di formare biofilm. Tale metodo, di seguito anche indicato come Biofilm Susceptibility Test (BST) per praticità di riferimento, trae spunto dalla procedura sperimentale di Pettit et al. (già citata), sviluppandola in un nuovo formato destinato all’uso clinico che si basa sull’allestimento di piastre da batteriologia contenenti microdiluizioni standardizzate di antibiotici.
Secondo l’invenzione, viene allestita una sospensione batterica del campione clinico da sottoporre al test, con una torbidità pari a 0.5 ± 0.1 McFarland standards (McF), corrispondente a circa 1,0 x 10<8 >CFU/ml in 2 µL di soluzione salina. Successivamente, la sospensione contenente le cellule batteriche viene opportunamente diluita in un mezzo di coltura e utilizzata per inoculare i pozzetti della prima metà di una piastra per microbiologia da 96 pozzetti. Nella piastra possono essere analizzati contemporaneamente due ceppi batterici, quindi nei pozzetti della seconda metà di piastra sarà distribuita ina sospensione ottenuta allo stesso modo da un altro campione clinico. Per garantire l’accuratezza dei risultati sono stati introdotti diversi controlli standard, sia positivi che negativi, interni al sistema e atti a valutare i diversi parametri in grado di influenzare l’affidabilità del risultato. Infatti per ogni singolo test (48 pozzetti) sono compresi nella piastra due controlli positivi, realizzati con altrettanti pozzetti contenenti il ceppo analizzato in assenza di antibiotici, e quattro controlli negativi, realizzati con altrettanti pozzetti contenenti soltanto terreno di coltura senza batteri.
La piastra così allestita è incubata a 37°C per un tempo sufficiente a consentire la formazione di un biofilm maturo nei pozzetti in cui i batteri sono presenti. Al termine dell’incubazione, la piastra viene lavata con soluzione salina per rimuovere le cellule non adese al fondo dei pozzetti, e sul biofilm batterico così ottenuto vengono aggiunte concentrazioni prefissate di una serie di antibiotici prestabiliti in base al tipo di microrganismo che si sta analizzando (ad esempio, stafilococchi o enterobatteriacee). Dopo l’esposizione ai diversi antibiotici nelle diverse concentrazioni, il sovranatante viene rimosso e a ciascun pozzetto viene aggiunto terreno di coltura contenente una piccola quantità di resazurina. Come già notato, la resazurina (o Alamar blue) è un colorante blu debolmente fluorescente, che può essere ridotto dalle cellule batteriche metabolicamente attive in resofurina, un composto rosa altamente fluorescente. La conversione della resazurina a resofurina è quindi un indicatore della crescita cellulare e, in questo caso, del biofilm batterico (Pettit R.K. et al., già cit.)
Terminato il tempo di esposizione al colorante, si procede alla misurazione dell’assorbanza per ogni pozzetto mediante spettrofotometro a 550 nm (OD550) con un riferimento a 620 nm (OD620).
Secondo l’invenzione, sono stati fissati specifici criteri per poter considerare valido il test. In particolare, nei pozzetti dei controlli positivi, in presenza di batteri metabolicamente attivi, e in assenza concentrazioni sufficienti di antibiotici, la resazurina viene ridotta a resofurina, e la lettura tramite spettrofotometro determina dei valori di OD570/OD620 ≥ 0. Al contrario, nei pozzetti relativi ai controlli negativi, che contengono soltanto terreno di coltura e resazurina senza batteri, la lettura tramite spettrofotometro produce dei valori di OD570/OD620 ≤ -1.
Dalle misurazioni di assorbanza dei 96 pozzetti si ottengono quindi dei valori che vengono utilizzati per il calcolo della “biofilm minimal inhibitory concentration (BMIC)”, definita come la più bassa concentrazione di antibiotico alla quale non avviene la conversione della resazurina, corrispondente a valori OD570/OD620 ≤ -1, entro i tempi stabiliti dal protocollo.
L’interpretazione dei valori della BMIC conformemente ai criteri della European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) consente quindi di determinare la ‘suscettibilità’ o la ‘resistenza’ del microrganismo in esame verso le diverse concentrazioni dell’antibiotico.
L’allestimento secondo la presente invenzione consente di ottenere misure standardizzate dell’efficacia dei diversi antibiotici contro batteri produttori di biofilm, offrendo uno strumento innovativo utile non solo alla diagnostica clinica, ma anche ai controlli microbiologici ambientali, all’implementazione di procedure di sanificazione, allo sviluppo clinico di nuove molecole e/o formulazioni di farmaci antibiotici capaci di attaccare il biofilm microbico.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una procedura per la determinazione dei profili di suscettibilità agli antibiotici in microrganismi produttori di biofilm come enunciata nelle rivendicazioni allegate.
Secondo l’invenzione il test viene allestito, per ciascun ceppo batterico da analizzare, preparando una sospensione batterica con il campione clinico in esame, con una torbidità pari a 0,5 ± 0,1 McFarland standards (McF), corrispondente a circa 1,0 x 10<8 >± 0,5 x 10<8 >CFU/ml, in 2 mL di soluzione salina. La sospensione è successivamente diluita in un terreno di coltura per batteri fino al raggiungimento di una opportuna concentrazione cellulare, ad esempio 1,0 x 10<6 >± 0,5 x 10<6 >CFU/ml.
Successivamente, un’aliquota di questa sospensione batterica è utilizzata per inoculare quarantaquattro (44) dei quarantasei (46) pozzetti di una piastra per microbiologia, escludendo i due pozzetti dedicati al controllo negativo. La piastra è incubata 37°C per un intervallo di tempo sufficiente a consentire lo sviluppo di un biofilm maturo nei pozzetti contenenti la sospensione batterica. Tale tempo può essere compreso, ad esempio, tra 16 e 36 ore, più comunemente tra 20 e 24 ore.
Successivamente la piastra da 96 pozzetti viene lavata due volte con una soluzione salina per rimuovere le cellule non adese al fondo dei pozzetti, e nei pozzetti vengono aggiunti i diversi antibiotici, generalmente in due o più concentrazioni diverse, ad eccezione dei dodici pozzetti (sei per ogni singolo test) di controllo positivo e negativo, ai quali viene aggiunto soltanto terreno di coltura senza antibiotici.
La disposizione, la concentrazione ed il tipo di antibiotici inseriti nella piastra possono essere modificati rispetto quelli scelti per le forme di realizzazione preferite, e adattati a specifiche esigenze cliniche e/o a diverse specie di microrganismi. La piastra è incubata a 37°C per un tempo sufficiente a garantire la completa esposizione del biofilm batterico ai diversi antibiotici alle varie concentrazioni testate. Tale tempo può essere compreso, ad esempio, tra 16 e 36 ore, preferibilmente tra 20 e 24 ore.
Al termine del periodo di incubazione il terreno contenente gli antibiotici è rimosso e sostituito con un terreno di coltura contenente resazurina. La piastra è incubata staticamente a 37°C per garantire alle cellule batteriche metabolicamente attive all’interno del biofilm, di convertire il colorante da blu a rosa/giallo.
Secondo una forma di realizzazione specifica dell’invenzione, nella versione di micropiastra destinata a valutare i profili di suscettibilità agli stafilococchi, denominata “Staphylococcus spp.”, sono distribuiti tredici (13) antibiotici e un’associazione di due, specificamente: ciprofloxacina, clindamicina, daptomicina, dalbavancina, eritromicina, acido fusidico, gentamicina, levofloxacina, oxacillina, rifampicina, teicoplanina, tigeciclina, trimetoprim/sulfametossazolo e vancomicina, distribuiti su 42 pozzetti, in duplicato e a concentrazioni scalari prefissate, preferibilmente comprese tra 0,0625 e 4 μg/ml.
Forme di realizzazione preferite della distribuzione di antibiotici sulla piastra per gli stafilococchi sono specificate nelle ulteriori rivendicazioni dipendenti.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione specifica dell’invenzione, nella versione di micropiastra destinata a valutare i profili di suscettibilità alle pseudomonadacee e alle enterobatteriacee, denominata “Pseudomonas spp. e Enterobacteriaceae”, sono distribuiti dieci (10) antibiotici e tre associazioni di due, specificamente: amikacina, amoxicillina/acido clavulanico, cefepime, ceftazidima, ciprofloxacina, colistina, ertapenem, gentamicina, imipenem, meropenem, piperacillina/tazobactam, tobramicina e trimetoprim/sulfametossazolo, distribuiti su 42 pozzetti, in duplicato e a e a concentrazioni a concentrazioni scalari prefissate, preferibilmente comprese tra 0,0625 e 16 μg/mL.
Anche in questo caso, forme di realizzazione preferite della distribuzione di antibiotici sulla piastra per pseudomonadacee e enterobatteriacee sono specificate nelle ulteriori rivendicazioni dipendenti.
Come già notato, per ogni singolo test sono compresi due controlli positivi, realizzati con altrettanti pozzetti contenenti il ceppo analizzato in assenza di antibiotici, e quattro controlli negativi, realizzati con altrettanti pozzetti contenenti soltanto terreno di coltura senza batteri. Per poter considerare valido il test, i controlli positivi devono avere dei valori di OD570/OD620 ≥ 0, indicativi di batteri metabolicamente attivi all’interno del biofilm capaci di ridurre la resazurina a resofurina. Al contrario, i controlli negativi devono avere dei valori di OD570/OD620 ≤ -1, indicativo di una mancata riduzione della resazurina a resofurina. La BMIC è definita come la più bassa concentrazione di antibiotico alla quale non si vede la conversione di resazurina entro i tempi stabiliti dal protocollo, corrispondente a valori OD570/OD620 ≤ -1.
Nel metodo diagnostico dell’invenzione l’interpretazione dei criteri di suscettibilità o resistenza ai diversi antibiotici è ottenuta sulla base della misurazione della BMIC, applicando i criteri standard di misurazione dei “breakpoint” degli antibiotici nei confronti dei diversi microrganismi in accordo alla European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EU-CAST), che rappresenta il formato di riferimento ad uso clinico.
È da notare che il test diagnostico secondo l’invenzione è semplice, robusto, standardizzato ed altamente riproducibile, e richiede attrezzature comunemente presenti nei laboratori di microbiologia clinica. Esso può essere sviluppato anche per lo screening di combinazioni di antibiotici e/o altre molecole potenzialmente inibenti la formazione di biofilm.
Alcune forme di realizzazione specifiche del protocollo analitico secondo l’invenzione vengono descritte di seguito a titolo meramente esemplificativo ma non limitativo nel seguito, assieme ai risultati delle sperimentazioni cliniche effettuate.
ESEMPIO
Esecuzione di un saggio (BST) secondo l’invenzione
È stata preparata una sospensione batterica, con una torbidità pari a 0,5 ± 0,1 McF, corrispondente a circa 1,0 x 10<8 >CFU/ml, in 2 mL di soluzione salina 0,45% p/v (Air Life, Carefusion, CA, USA).
La sospensione è stata diluita 1:100 in Brain Heart Infusion broth, (BHI, anche noto come agar cuore-cervello) per raggiungere una concentrazione di 1 x 10<6 >CFU/ml, e 100 μl di sospensione batterica sono stati utilizzati per inoculare 96 pozzetti di una piastra per microbiologia (Costar 3624, Corning Inc., Corning, NY, USA). La piastra è stata incubata a 37°C per 22 ore per consentire lo sviluppo di un biofilm maturo.
Il giorno successivo la piastra è stata lavata due volte con 200 μl di soluzione salina 0.45% p/v per rimuovere le cellule non adese al fondo dei pozzetti. Successivamente, sul biofilm batterico preformato, sono stati aggiunti i diversi antibiotici in concentrazioni variabili, in un volume di 100 μl di BHI, e la piastra è incubata a 37°C per ulteriori 22 ore.
La disposizione e le concentrazioni degli antibiotici sulla piastra sono mostrate nella Tabella 1 che segue. Il pannello superiore della piastra era specifico per Staphylococcus spp., mentre il pannello inferiore era specifico per Pseudomonas spp. e Enterobacteriaceae.
Su ogni piastra possono essere analizzati contemporaneamente due ceppi batterici. Per ogni singolo test sono compresi 2 controlli positivi [CTR (+)] e 4 controlli negativi [CTR (-)]. L’interpretazione dei criteri di suscettibilità o resistenza ai diversi antibiotici è ottenuta applicando i criteri EUCAST.
Legenda antibiotici:
AMK - amikacina
AMC - amoxicillina/acido clavulanico
CEP - cefepime
CET - ceftazidima
CIP - ciprofloxacina
CLI - clindamicina
COL - colistina
DAP - daptomicina
DAL - dalbavancina
ERT - ertapenem
ERY - eritromycina
FUS - acido fusidico
GEN - gentamicina
IMI - imipenem
LEV - levofloxacina
MER - meropenem
OXA - oxacillina
PIT - piperacillina/tazobactam
RIF - rifampicina
TIG - tigeciclina
TOB - tobramicina
TPL - teicoplanina
T/S - trimetoprim/sulfametossazolo
VAN - vancomicina
CTR (+) Controllo positivo
CTR (-) Controllo negativo
Le concentrazioni dei diversi antibiotici sono espresse in μg/mL.
(segue tabella) TABELLA 1
Disposizione e concentrazioni (mg/mL) degli antibiotici su piastra a 96 pozzetti
Al termine dell’incubazione è stato aggiunto BHI contenente il colorante Alamar blue (resazurina) ad una concentrazione di 8 μg/mL (Trek Diagnostic Systems Inc., Cleveland, OH, USA) e la piastra è incubata staticamente per 180 minuti a 37 °C.
Le misurazioni sono state eseguite attraverso la rilevazione dell’assorbanza per ogni pozzetto mediante spettrofotometro a 550 nm (OD550), con un riferimento a 620 nm (OD620).
Studi di validazione del test
Isolati clinici, originati da diversi materiali biologici (cioè neurostimolatori, protesi ortopediche, lesioni cutanee ulcerative, cateteri endovenosi e delle vie urinarie, espettorato e campioni di broncolavaggio) sono stati preliminarmente analizzati per valutare la capacità di formare biofilm con il metodo del clinical Biofilm Ring Test (cBRT) (Di Domenico E.G. et al., Development of an in vitro Assay, Based on the BioFilm Ring Test<®>, for Rapid Profiling of Biofilm-Growing Bacteria. Front. Microbiol. 2016; 7:1429).
In base ai risultati, i ceppi sono stati suddivisi in deboli, moderati e forti produttori di biofilm. Il pannello di ceppi batterici utilizzati comprendeva isolati clinici caratterizzati da elevata resistenza agli antibiotici, documentata mediante analisi dell’antibiogramma eseguito con il sistema diagnostico VI-TEK2, comunemente in uso nei laboratori di microbiologia clinica, e successivamente confermato tramite microdiluizioni in brodo (Thermo Scientific, Massachusetts, USA) per la definizione della minima concentrazione inibente (Minimum Inhibitory Concentration - MIC).
Come mostrato nella Tabella 2 che segue, i ceppi batterici di riferimento comprendevano: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 47085; PAO1), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Pseudomonas aeruginosa (Pa14).
Tutti i ceppi microbici sono stati conservati a -70 °C in provette Cryobank (Copan Italia spa) e fatti crescere per 18 ore a 37 °C su specifiche piastre agar prima del loro impiego nel test sperimentale.
Gli isolati clinici usati nello studio avevano le seguenti caratteristiche: P. aeruginosa multiresistente (multidrug resistant – MDR);
batteri produttori di beta lattamasi a spettro esteso (extended spectrum beta-lactamase - ESBL);
K. pneumoniae produttore di carbapenemasi (KPC);
S. aureus meticillino-resistente;
Enterococchi vancomycina-resistenti (VRE).
Tra parentesi il numero di ceppi inclusi nello studio.
TABELLA 2
Caratteristiche degli isolati clinici
Analisi statistica
L'analisi statistica è stata effettuata mediante il test Chi square per l'andamento lineare e adeguato per comparazioni multiple, quando opportuno. Il calcolo dei dati è stato eseguito mediante one-way ANOVA. Solo valori di P pari a o minori di 0,05 sono stati considerati significativi. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite mediante software IBM SPSS v.21 (IBM, Chicago, IL, USA).
Risultati
La Tabella 3 seguente mostra una sintesi dei risultati ottenuti dalla misurazione comparativa dei profili di suscettibilità ai farmaci antimicrobici di tre diversi ceppi di S. aureus eseguiti mediante antibiogramma convenzionale e mediante la procedura della presente invenzione (BST). I tre ceppi di stafilococco analizzati nello studio avevano diverse capacità di formare biofilm: S. aureus-1 era una forte produttore di biofilm, S. aureus-2 era un moderato produttore di biofilm ed S. aureus-3 era un debole produttore di biofilm.
Nella tabella la Minimum Inhibitory Concentration (MIC) è stata misurata tramite microdiluizioni in brodo, e la Biofilm Minimal Inhibitory Concentration (BMIC) è stata misurata secondo il metodo dell’invenzione. L’elaborazione dei dati di suscettibilità (S) e resistenza (R) per la MIC e la BMIC è stata effettuata in base ai parametri EUCAST.
(segue tabella) TABELLA 3
Confronto tra i risultati della determinazione del profilo di suscettibilità agli antibiotici mediante antibiogramma e Biofilm Susceptibility Test (BST)
TMP/SMX = Trimetoprim/Sulfametossazolo
I dati riportati in Tabella 3 mostrano che le resistenze microbiche possono variare significativamente in relazione alla produzione di biofilm. In particolare, mentre nei ceppi batterici deboli produttori di biofilm i dati ricavati dall’analisi mediante antibiogramma sono sostanzialmente equivalenti a quelli ricavati con il test secondo l’invenzione (BST) (solo 8% di variazione dei profili di resistenza), molto diverso appare il quadro nel caso di batteri moderati o forti produttori di biofilm In questi casi si osservano marcate differenze tra i profili di suscettibilità ottenuti dall’antibiogramma e quelli documentati dal BST (67% e 83% di variazione per moderati e forti produttori, rispettivamente). Specificamente, i profili di suscettibilità ricavati dal BST indicano chiaramente uno spettro di efficacia dei diversi antibiotici significativamente ridotto rispetto a quanto indicato dall’antibiogramma, permettendo quindi di indirizzare le scelte terapeutiche sui farmaci che si rivelano attivi nei confronti del biofilm microbico e che appaiono in grado di assicurare un maggior livello di efficacia in vivo.
Quanto sopra esposto consente di concludere che il test microbiologico secondo l’invenzione rappresenta uno strumento innovativo per la diagnostica microbiologica clinica da utilizzarsi di concerto con i test convenzionali per la determinazione della sensibilità agli antibiotici (antibiogramma). La procedura qui proposta richiede una ridotta manualità ed attrezzature comunemente presenti nei laboratori di microbiologia clinica. L’inserimento di specifici controlli interni, positivi e negativi, insieme alla facile interpretazione dei risultati, identificano la procedura dell’invenzione come un test ideale per la routine clinica.
In aggiunta, la semplicità, la rapidità di implementazione e i costi contenuti ne rendono possibile l’uso anche al di fuori del campo clinico. Ulteriori campi applicativi della presente tecnologia includono l’industria farmaceutica, l’industria alimentare, l’industria dei prodotti per la sanificazione ambientale e dei servizi igienico-sanitari, l’odontoiatria e in generale in tutti quei settori in cui il biofilm microbico rappresenta un potenziale fattore di rischio.
La presente invenzione è stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma è da intendersi che variazioni o modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la determinazione dei profili di suscettibilità agli antibiotici in microrganismi produttori di biofilm, comprendente le seguenti operazioni: a) preparare con ciascun campione microbico da analizzare una sospensione microbica con una torbidità pari a 0,5 ± 0,1 McFarland standards (McF), corrispondente a circa 1,0 x 10<8 >± 0,5 x 10<8 >CFU/ml, in 2 mL di soluzione salina; b) diluire tale sospensione in terreno di coltura fino al raggiungimento di una concentrazione cellulare di 1,0 x 10<6; >± 0,5 x 10<8 >CFU/mL; c) inoculare con la sospensione batterica ottenuta dall’operazione b) quarantaquattro (44) dei quarantotto (48) pozzetti di una prima metà di una piastra per microbiologia da 96 pozzetti, i quattro pozzetti non inoculati essendo riservati al controllo negativo, ed eseguire la stessa operazione con gli altri quarantaquattro (44) dei quarantotto (48) pozzetti della seconda metà della piastra e con una sospensione microbica ottenuta dall’operazione b) relativa ad un secondo campione microbico da analizzare; d) incubare detta piastra a 37°C per un intervallo di tempo sufficiente a consentire lo sviluppo di un biofilm maturo nei pozzetti inoculati con la sospensione microbica; e) lavare almeno due volte detta piastra da 96 pozzetti con una soluzione salina; f) introdurre in quarantadue (42) dei quarantotto (48) pozzetti di ciascuna metà di piastra diversi antibiotici o associazioni di antibiotici in terreno di coltura, escludendo detti quattro pozzetti riservati al controllo negativo e due pozzetti riservati al controllo positivo; g) incubare detta piastra a 37°C per un intervallo di tempo sufficiente a garantire la completa esposizione del biofilm microbico ai diversi antibiotici; h) rimuovere dai pozzetti il terreno contenente gli antibiotici e sostituirlo con un terreno contenente resazurina e incubare staticamente la piastra a 37°C per un tempo di esposizione di almeno 30 minuti, e preferibilmente di almeno 3 ore; i) misurare l’assorbanza ottica per ogni pozzetto mediante spettrofotometro a 550 nm (OD550) con un riferimento a 620 nm (OD620), rilevando valori di OD570/OD620 ≤ -1 nei pozzetti dei controlli negativi, in cui non avviene una conversione della resazurina in resofurina, e valori di OD570/OD620 ≥ 0 nei pozzetti dei controlli positivi, nonché in quelli in cui sono presenti microrganismi metabolicamente attivi, e determinare dalla misura dei valori di BMIC (biofilm minimal inhibitory concentration), definita come la più bassa concentrazione di antibiotico alla quale non avviene la conversione della resazurina entro un tempo prestabilito, la ‘suscettibilità’ o la ‘resistenza’ del microrganismo in esame verso le diverse concentrazioni dell’antibiotico, applicando i criteri standard di misurazione dei “breakpoint” in accordo con l’European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) o con il Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detta piastra è specifica per la valutazione dei profili di suscettibilità agli stafilococchi, e in cui in detta operazione f) vengono introdotti in detti pozzetti i seguenti antibiotici, o associazioni di antibiotici: ciprofloxacina, clindamicina, daptomicina, dalbavancina, eritromicina, acido fusidico, gentamicina, levofloxacina, oxacillina, rifampicina, teicoplanina, tigeciclina, trimetoprim/sulfametossazolo e vancomicina, distribuendoli su 42 pozzetti, in duplicato.
  3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui detti antibiotici, o associazioni di antibiotici, vengono introdotti nei 42 pozzetti in concentrazioni scalari comprese tra 0,0625 e 128 μg/mL.
  4. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui nei 42 pozzetti vengono introdotti i seguenti antibiotici, alle seguenti concentrazioni, in μg/mL: dalbavancina: 0,0625 e 0,125; oxacillina: 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0; ciprofloxacina: 0,5, 1,0 e 2,0; clindamicina: 0,25, 0,5 e 1,0; daptomicina: 0,5, 1,0 e 2,0; eritromicina: 1,0, 2,0 e 4,0; acido fusidico: 0,25, 0,5 e 1,0; gentamicina: 0,5, 1,0 e 2,0; levofloxacina: 0,5, 1,0 e 2,0; rifampicina: 0,25, 0,5 e 1,0; teicoplanina: 1,0, 2,0 e 4,0; tigeciclina: 0,125, 0,25 e 0,5; trimetoprim/sulfametossazolo (1:5): 1,0, 2,0 e 4,0; vancomicina: 1,0, 2,0 e 4,0.
  5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detta piastra è specifica per la valutazione dei profili di suscettibilità alle pseudomonadacee e alle enterobatteriacee, e in cui in detta operazione f) vengono introdotti in detti pozzetti i seguenti antibiotici, o associazioni di antibiotici: amikacina, amoxicillina/acido clavulanico, cefepime, ceftazidima, ciprofloxacina, colistina, ertapenem, gentamicina, imipenem, meropenem, piperacillina/tazobactam, tigeciclina, tobramicina e trimetoprim/sulfametossazolo distribuendoli su 42 pozzetti, in duplicato.
  6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detti antibiotici, o associazioni di antibiotici, vengono introdotti nei 42 pozzetti in concentrazioni scalari comprese tra 0,0625 e 128 μg/mL.
  7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui nei 42 pozzetti vengono introdotti i seguenti antibiotici, alle seguenti concentrazioni, in μg/mL: amikacina: 4,0, 8,0 e 16,0; amoxicillina/acido clavulanico: 2,0/4,0, 2,0/8,0 e 2,0/16,0; cefepime: 1,0, 2,0, 4,0 e 8,0; ceftazidima: 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 e 8,0; ciprofloxacina: 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0; colistina: 2,0, 4,0 e 8,0; ertapenem: 1,0; gentamicina: 1,0, 2,0 e 4,0; imipenem: 1,0, 2,0 e 4,0; meropenem: 1,0, 2,0, 4,0 e 8,0; piperacillina/tazobactam (8:1): 8,0 e 16,0; tigeciclina: 1,0 e 2,0; tobramicina: 2,0 e 4,0; trimetoprim/sulfametossazolo (1:5): 2,0 e 4,0.
  8. 8. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui in detta operazione b) la sospensione microbica viene diluita 1:100 in Brain Heart Infusion broth (BHI).
  9. 9. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui in dette operazioni d) e g) la piastra viene incubata a 37°C per periodi di tempo compresi tra 16 e 36 ore, preferibilmente tra 20 e 24 ore.
  10. 10. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui in detta operazione h) in tutti i pozzetti viene aggiunta resazurina ad una concentrazione di 8 μg/mL in terreno di coltura, e la piastra è incubata staticamente per 180 minuti a 37 °C.
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