CN115737800A - 一种复合脂质体佐剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种包含中性脂质、阳离子脂质、TLR3和TLR4激动剂的稳定且免疫效果突出的复合脂质体佐剂。中性脂质和阳离子脂质在合适的配比下所形成的复合脂质体佐剂更易于进入细胞内,同时激活不同的信号通路,发挥协同作用,从而促使机体获得更加稳定长效的免疫应答。
Description
技术领域
本申请属于生物医药工程领域,特别涉及一种复合脂质体佐剂及其制备方法。
背景技术
铝佐剂作为唯一注册佐剂在世界范围广泛应用,其主要介导体液免疫,对于以细胞免疫为主的疾病却效果不佳。
″脂质体″是封闭的小囊泡结构,由一个或多个脂质双层体围绕着水性核心而构成。每个脂质双层体由两个脂质单层体组成,其中每个单层体有一个疏水的“尾部”区域和一个亲水的“头部”区域。在双层体中,脂质单层体的疏水“尾部”指向双层体内部,亲水“头部”朝向双层体外部。脂质体可具有多种物理化学性质,例如大小、脂质组成、表面电荷、流动性、双分子膜的数量。根据脂质双层体的数量,脂质体可归类为单层小囊泡(UV)或者多层小囊泡(MLV),单层小囊泡是由单一脂质双层体构成,多层小囊泡是由两个或多个同心的双层体构成且双层体彼此被水层间隔分离。水溶性化合物被捕获入脂质体的水相/核,相反的,亲脂性化合物被捕获入脂质双层膜的核心。
阳离子脂质体作为疫苗佐剂被发现已经超过40年,不仅具有抗原提呈、保护抗原防止其在体内降解的作用,而且能诱导树突状细胞成熟,增强免疫反应。其表面正电荷是延长疫苗在注射部位停留、增加抗原提呈、延长刺激体内细胞免疫时间的重要因素。但如果细胞摄入大量的阳离子脂质,将对细胞产生较大的毒性作用,引起细胞凋亡或坏死,其是否会在细胞内积累,目前尚不十分明确需要更深入的研究[生命的化学,2016,36(1):50-56]。
PolyI:C是合成的双链RNA,能诱导产生抗原特异性的CD8+T细胞,可被内含体的TLR3受体识别。本申请人在前期实验中,将DDA和PolyI:C联合应用作为结核亚单位疫苗佐剂使用,在加强BCG免疫后,能有效诱导小鼠特异性的细胞免疫应答,且能有效的减轻结核分枝杆菌感染造成的病理损伤(专利号:201110199072X)。然而,该佐剂稳定性较差,易于发生絮凝现象,不利于最终投入生产和实际应用。为此,我们在前期脂质体佐剂和PolyI:C的基础上,研究更加稳定和有效的新型免疫佐剂,以增强疫苗的保护效果,适于后期的研发和生产。
本发明公开一种稳定的、免疫效果突出的复合脂质体佐剂,不仅包括中性脂质还包括阳离子脂质。虽然其毒性高于中性脂质,但是发明人发现在合适的配比下所形成的复合脂质体佐剂由于细胞膜负电而更易于进入细胞内,同时激活不同的信号通路,从而发挥协同作用,高质量的免疫组合物不仅有强大的免疫刺激性同时具有更高的稳定性。
发明内容
本发明第一方面提供一种复合脂质体佐剂,其主要成分包括:
A)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物;
B)胆固醇;和
C)3D-MPL与PolyI:C,
其中DOPC与DOTAP的重量比为2:1-6:1,脂质混合物与胆固醇的重量比是4:1,固醇与3D-MPL的重量比是5:1,3D-MPL与PolyI:C的重量比是1:2-1:20。
在一个优选的实施例中,DOPC与DOTAP的重量比为6:1或4:1比例关系的脂质混合物。
在一个优选的实施例中,3D-MPL与PolyI:C的重量比为1:2、1:5或1:10。
本发明第二方面提供复合脂质体佐剂的制备方法,包括如下步骤:
步骤1)制备有机相:将包含DOPC/DOTAP的脂质混合物、胆固醇和3D-MPL按质量比90-100:20-30:4-5的比例溶解于有机溶剂中,得到有机相备用;
步骤2)制备水相:使用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液,制得水相备用;
步骤3)制备脂质体溶液:用微流控装置混合有机相和水相,去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液;
步骤4)制备佐剂原液:用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到复合脂质体佐剂。
在一些实施例中,步骤3)可以用如下步骤替代:
制备脂质体溶液:将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜;在脂质薄膜中加入水相溶液进行水化,再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
在一些实施例中,所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、正丙醇、异丙醇、氯仿或其中两者的混合物,例如乙醇/异丙醇混合溶剂。
在一个优选的实施例中,步骤3)制备脂质体溶液可以经过1-2次过滤得到最终的脂质体佐剂。通过透析除去溶剂,稀释提供终浓度的脂质体佐剂。
在一些实施例中,步骤3)中微流控过程在20-25℃温度下以总流速4-6ml/min和有机相:水相=1:3-1:6的流速比运行。例如在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相=1:4的流速比运行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相=1:5的流速比运行等。
本发明第三方面提供疫苗组合物,包括本发明制备的复合脂质体佐剂和抗原类成分。
在一些实施例中,抗原类成分来源于人乳头瘤病毒(HPV)、引发手足口病的肠道病毒、结核分枝杆菌、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肝炎病毒和狂犬病毒中的至少一种。
本发明第四方面提供包含复合脂质体佐剂的疫苗组合物的制备方法,步骤包括:
步骤1)制备有机相:将包含DOPC/DOTAP的脂质混合物、胆固醇和3D-MPL按质量比90-100:20-30:4-5的比例溶解于有机溶剂中,得到有机相备用;
步骤2)制备水相:使用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解抗原类成分,制得水相备用;
步骤3)制备脂质体溶液:用微流控装置混合有机相和水相,去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液。
步骤4)制备疫苗组合物:用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到疫苗组合物溶液。
在一些实施例中,步骤3)可以用如下步骤替代:
制备脂质体:将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜;在脂质薄膜中加入水相进行水化,再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
在一些实施例中,所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、正丙醇、异丙醇或其中两者的混合物,例如乙醇/异丙醇混合溶剂。
在一个优选的实施例中,步骤3)制备脂质体溶液可以经过1-2次过滤得到最终的脂质体佐剂。通过透析除去溶剂,稀释提供终浓度的脂质体佐剂。
在一些实施例中,步骤3)中微流控过程在20-25℃温度下以总流速4-6ml/min和有机相:水相=1:3-1:6的流速比运行。例如在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相=1:4的流速比运行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相=1:5的流速比运行等。
在一些实施方式中,所述抗原类成分来源于人乳头瘤病毒(HPV)、引发手足口病的肠道病毒、结核分枝杆菌、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肝炎病毒和狂犬病毒中的至少一种,所述的抗原类物质在一些实施例中优选重组蛋白类形式的抗原。
在一个优选的实施例中,本发明的复合脂质体佐剂中选用的阳离子脂质为DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)。DOTAP与中性脂质(例如DOPC)的组合稳定性上优于DOPC与DDA的脂质组合。主要优点是DOTAP与中性脂质例如DOPC的组合更稳定,制成的脂质体混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月,相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3-5倍。另外,DOPC与DDA的脂质组合获得的脂质体粒径大于200nm,对工艺后期的过滤除菌等会有不利影响,而本发明的复合脂质体佐剂可以获得粒径在100-200nm之间的脂质体颗粒,有利于后期工艺及免疫增效。
本发明的复合脂质体佐剂中含有两种免疫刺激剂,分别为TLR3激动剂PolyI:C和TLR4激动剂3D-MPL。PolyI:C吸附在脂质的外层,免疫效果更突出,粒径大小和均一度更优,与3D-MPL联合使用可以同时激活两种TLR信号通路,更高效地激活先天免疫系统。另一方面,存在于脂质层的MPL,与吸附在脂质外层的PolyI:C,两层存在位置差,以特定比例组合的3D-MPL和PolyI:C能够在不同信号通路中更好地发挥联合作用,使得免疫效果更持久。
本发明的抗原类成分溶于复合脂质体佐剂的内水相中,免疫效果优于脂质体溶液复溶后加入抗原、或者直接将脂质体溶液与抗原溶液混合。
附图说明
以下附图仅旨在对本发明做示意性说明和解释,并不限定本发明的范围。其中:
图1为复合脂质体佐剂的结构示意图;
图2为疫苗组合物,包括本发明制备的复合脂质体佐剂和抗原类成分。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图1和附图2,对本发明作进一步的详细说明。
在本发明中DOPC和DOTAP做为脂质的骨架结构成分,而胆固醇作为助脂质嵌入脂质双分子层之间,调节膜的结构和性质。免疫刺激剂3D-MPL与PolyI:C在脂质体中存在的位置不同,3D-MPL嵌在脂质双分子层上,而PolyI:C存在于外水相。在本发明的说明书中,提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而,在本发明的说明书中,若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中,若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语,也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解,在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
TLR激动剂
本发明中的TLR3激动剂为聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C)或其衍生物。Poly I:C是一种双链RNA类似物,由一条ploy(I)链和一条ploy(C)链组成,能够模拟病毒感染后所形成的dsRNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应,具有良好的抗病毒作用。研究发现,将Poly I:C直接作为药物应用于临床时,会对身体产生一定的毒性。为了降低其对机体的毒性,并提高Poly I:C刺激机体产生干扰素的能力,研究人员对其进行了改造,创造出多种Poly I:C衍生物。
将poly I:C与聚左旋赖氨酸混合后溶于羧甲基纤维素形成的复合物称为Poly-ICLC。研究表明,相对于poly I:C,Poly-ICLC在小鼠体内可以将诱发的IFN最高浓度提高5-8倍。但是,Poly-ICLC同样对机体有一定的毒性。使用脂质体包被Poly-ICLC后,能够显著降低其副作用。
Poly I:C12U是一种错配的双链RNA,能够上调或下调2,5-腺苷酸合成酶/RNaseL(2,5-A synthetase/RNaseL)系统和P68蛋白激酶系统,且这种作用不依赖于干扰素。
在一些实施方式中,所述TLR3激动剂选自Poly I:C、Poly ICLC和Poly I:C12U中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中,所述TLR3激动剂是Poly I:C,其分子量介于66,000至1200,000道尔顿之间,例如,75,000至1100,000道尔顿之间、96,000至950,000道尔顿之间、150,000至550,000道尔顿之间,特别是66,000至660,000道尔顿之间。
本发明中的TLR4激动剂为MPL或3D-MPL。来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)及其衍生物或其片段包括MPL或3D-MPL是TLR-4(Toll样受体4)配体。单磷酰脂质A(MPL)是革兰氏阴性细菌例如明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595的脂多糖(LPS)的无毒衍生物。它保持LPS的佐剂特性同时显示出降低的毒性(Johnson等1987 Rev. Infect.Dis.9Suppl:S512-S516)。3D-MPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A(或3脱- O -酰化单磷酰脂质A)。化学上它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在一个实施例中,本发明的免疫原性组合物包含3- O -脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。
疫苗组合物
在一些实施方式中,所述抗原类成分来源于人乳头瘤病毒(HPV)、引发手足口病的肠道病毒、结核分枝杆菌、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肝炎病毒和狂犬病毒中的至少一种。
在一些实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原为各型别HPV的L1蛋白和/或L2蛋白。在一些实施方式中,HPV可以为低危型HPV(例如HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、89),中等风险型HPV(例如HPV26、53、66、73、82),或者高危型HPV(例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
在一些优选的实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原包含由HPV6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型及58型中的一种或多种的L1蛋白和/或L2蛋白组装而成的HPV病毒样颗粒。
在一个优选的实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原包含由HPV 6型和11型的L1蛋白和/或L2蛋白组装而成的HPV病毒样颗粒。
在一个优选的实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原包含由HPV16型和18型的L1蛋白和/或L2蛋白组装而成的HPV病毒样颗粒。
在一个优选的实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原包含由HPV 6型、11型、16型和18型的L1蛋白和/或L2蛋白组装而成的HPV病毒样颗粒。
在优选的实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原包含由HPV6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型及58型的L1蛋白和/或L2蛋白组装而成的HPV病毒样颗粒。
在优选的实施方式中,来源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原包含由HPV6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型及59型的L1蛋白和/或L2蛋白组装而成的HPV病毒样颗粒。
引发手足口病的肠道病毒主要包含柯萨奇A组4型、5型、6型、7型、9型、10型16型等,B组的2型、5型和13型,以及肠道病毒71型(EV71)等。在一些实施方式中,来源于这些肠道病毒的抗原可以来自上述型别中的一种或任意组合,所述抗原优选为由VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白以及VP4蛋白组成的病毒样颗粒(VLP)。VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白以及VP4蛋白由前体蛋白P1在3CD蛋白酶的作用下分解后产生。
在一些实施方式中,来源于这些肠道病毒的抗原包含EV71、柯萨奇A组6型、10型和16型病毒颗粒中的一种或多种。在优选的实施方式中,来源于这些肠道病毒的抗原包含EV71、柯萨奇A组6型、10型和16型病毒颗粒。
结核分枝杆菌免疫原性较强的蛋白家族主要包含Esx家族蛋白、PE/PPE家族蛋白和DosR家族蛋白。Esx家族蛋白优选包含ESAT-6、CFP-10、TB9.8、TB10.3、TB10.4、TB11.0、TB12.9等。PE/PPE家族蛋白优选包含PPE17、PPE18、PPE34、PPE42、、PPE57PE-PGRS33、PE35-PPE68、PE-PGRS62、PE-PGRS17、PE-PGRS11、PE25-PPE41等。DosR家族蛋白优选包含Rv2029c、Rv2031c、Rv2627c、Rv3133c等。
在一些实施方式中,来源于结核分枝杆菌的抗原包含至少一个Esx家族蛋白、至少一个PE/PPE家族蛋白和至少一个DosR家族蛋白。在一个优选的实施方式中,源于结核分枝杆菌的抗原包含CFP-10蛋白、PE35蛋白、PPE68蛋白和Rv2627c蛋白。在一个优选的实施方式中,来源于结核分枝杆菌的抗原包含由CFP-10蛋白、PE35蛋白、PPE68蛋白和Rv2627c蛋白形成的融合蛋白。
来源于单纯疱疹病毒(HSV)的抗原可以为来自HSV-1和/或HSV-2的gB、gC、gD、gH、gL、gI、ICP0、ICP4等。在一些实施方式中,来源于单纯疱疹病毒(HSV)的抗原包含HSV gB蛋白或其功能性片段。在一个优选的实施方式中,来源于单纯疱疹病毒(HSV)的抗原包含gB蛋白的胞外结构域或其功能片段。在一个实施方式中,gB蛋白的胞外结构域的功能片段包含gB蛋白的融合环(fusion-loop)结构域。在一个实施方式中,gB蛋白的胞外结构域包含至少一个氨基酸突变,优选的,所述氨基酸突变为脯氨酸取代。在一个实施方式中,HSV-1的gB蛋白的胞外结构域包含406位的脯氨酸取代。在一个实施方式中,HSV-2的gB蛋白的胞外结构域包含408位的脯氨酸取代。在一个实施方式中,来源于单纯疱疹病毒(HSV)的抗原包含HSV-1 gB蛋白的融合环结构域与HSV-2 gB蛋白的融合环结构域形成的融合蛋白。
来源于水痘带状疱疹病毒(VZV)的抗原包含VZV病毒的糖蛋白gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL等。在一个优选的实施方式中,来源于水痘带状疱疹病毒(VZV)的抗原包含截短的gE蛋白,其缺少gE蛋白的羧基端疏水锚区。
来源于流感病毒的抗原包含灭活的流感病毒、流感病毒的血凝素(HA蛋白)或神经氨酸酶(NA蛋白)。在一个优选的实施方式中,来源于流感病毒的抗原包含流感病毒的血凝素(HA蛋白)。在一个优选的实施方式中,来源于流感病毒的抗原包含灭活的流感病毒。
来源于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)、刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段。在一些实施方式中,来源于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抗原为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段与N端结构域(NTD)或其功能活性片段形成的融合蛋白。在一个优选的实施方式中,所述融合蛋白进一步包含foldon结构域、人免疫球蛋白的Fc结构域或其功能活性片段。在一个更优选的实施方式中,来源于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抗原包含来自不同毒株的融合蛋白,每个融合蛋白为受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段、N端结构域(NTD)和foldon结构域或其功能活性片段形成的融合蛋白。在一些实施方式中,来源于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抗原包含源自免疫优势毒株的融合蛋白和源自流行优势毒株的融合蛋白,其中,所述免疫优势毒株包含原型株和Beta株中的至少一种,所述流行优势毒株包含Delta株和Omicron株中的至少一种。
在一些实施方式中,来源于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抗原包含源自免疫优势毒株的S蛋白受体结合区或其功能活性片段与源自流行优势毒株的S蛋白受体结合区或其功能活性片段形成的融合蛋白,其中,所述免疫优势毒株包含原型株和Beta株中的至少一种,所述流行优势毒株包含Delta株和Omicron株中的至少一种。所述Omicron株包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、BF.7、BQ.1和XBB变异株。
人类肝炎病毒包含甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和庚型肝炎病毒。在一些实施方式中,来源于肝炎病毒的抗原包含源自乙肝的乙肝表面抗原(HBsAg)。
来源于狂犬病毒的抗原包括灭活的狂犬病毒或源自狂犬病毒的重组蛋白。重组蛋白源自狂犬病毒G蛋白、N蛋白、M蛋白、P蛋白及L蛋白中的至少一种。
实施例1:脂质组成对佐剂免疫效果影响的研究
为了研究不同脂质组成对脂质体产生的影响,以不同阳离子脂质与中性脂质比率制备脂质体溶液。
制备有机相:将40g以不同比例DOPC/DOTAP配制的脂质混合物、10g胆固醇和2g3D-MPL溶于200mL的异丙醇中,在50℃水浴中进行溶解。
制备水相:磷酸盐水溶液作为水相备用。
制备脂质体溶液:将有机相在50℃水浴中通过梯度减压、旋蒸干燥2-5小时获得脂质薄膜。在脂质薄膜中加入水相进行水化,再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
制备佐剂原液:PolyI:C取4g(厂家是Sigma,货号:P1530,CAS号:42424-50-0),溶解于磷酸盐水溶液(50mM PB,包含100mM 的NaCl),与脂质体溶液混合,得到终浓度的复合脂质体佐剂制剂。
抗原的加入:含缓冲液的VZV gE蛋白与佐剂原液直接混合,得到终浓度的疫苗制剂。
表1 不同DOPC/DOTAP比例的脂质体佐剂比较
组别 | 佐剂成分 |
Gr1 | DOPC/DOTAP(1:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr2 | DOPC/DOTAP(2:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr3 | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr4 | DOPC/DOTAP(6:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr5-1 | DOPC/DDA(1:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr5-2 | DOPC/DDA(2:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr5-3 | DOPC/DDA(4:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
Gr5-4 | DOPC/DDA(6:1),3D-MPL 5μg,PolyI:C 100μg |
不同DOPC/DOTAP比例对脂质体大小的影响结果如表2所示。
表2 不同DOPC/DOTAP比例对脂质体大小的影响
组别 | DOPC/DOTAP的比率 | 脂质体大小(nm) |
Gr1 | 1:1 | >200 |
Gr2 | 2:1 | >200 |
Gr3 | 4:1 | 100-200 |
Gr4 | 6:1 | 100-200 |
Gr5-1 | 1:1的DOPC/DDA | >200 |
Gr5-2 | 2:1的DOPC/DDA | >200 |
Gr5-3 | 4:1的DOPC/DDA | >200 |
Gr5-4 | 6:1的DOPC/DDA | >200 |
本实施例的疫苗组合物的抗原类成分使用的是水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白,为考察复合脂质体佐剂中不同DOPC/DOTAP比例组成对免疫效果的影响,以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究。每组6只,采用0天初免,两针间隔14天的免疫程序,于0天进行水痘苗接种,35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d),取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞,以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物,通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2 的水平。
表3 关于不同比例DOPC/DOTAP对细胞免疫的影响
组别 | IL-2+ | IL-2+IFN-γ+ | IFN-γ+ | 合计 |
Gr1 | 0.251 | 0.251 | 0.421 | 0.923 |
Gr2 | 0.287 | 0.425 | 0.474 | 1.186 |
Gr3 | 0.369 | 0.139 | 0.240 | 0.748 |
Gr4 | 0.341 | 0.203 | 0.462 | 1.006 |
使用异丙醇溶解不同比例的DOPC/DOTAP制备复合脂质体佐剂,从免疫原性考虑,不同重量比的DOPC/DOTAP制备的复合脂质体佐剂都可以获得细胞免疫的保护效果。综合对脂质体大小(nm)的考量,根据所需要的佐剂剂量,100-200nm的脂质体大小合适,优选6:1和4:1比例关系的DOPC/DOTAP脂质混合物。
实施例2:PolyI:C浓度对佐剂免疫效果影响的研究
为了研究不同PolyI:C浓度组成的佐剂的免疫原性效果,制备含不同比率PolyI:C的复合脂质体佐剂。同时比较两种佐剂形式,一种是脂质体形式,另一种是铝佐剂的吸附形式。
脂质体形式佐剂制备
制备有机相:将40g以不同比例DOPC/DOTAP配制的脂质混合物、10g胆固醇和2g3D-MPL溶于200mL的异丙醇中。制备水相:磷酸盐水溶液作为水相备用。制备脂质体溶液:在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行微流控装置,获得脂质体溶液。制备佐剂原液:PolyI:C取4g(厂家是Sigma,货号:P1530,CAS号:42424-50-0),溶解于磷酸盐水溶液(50mM PB,包含100mM 的NaCl),与脂质体溶液混合,得到终浓度的复合脂质体佐剂原液。
抗原的加入:含缓冲液的VZV gE抗原与佐剂原液直接混合,得到终浓度的疫苗制剂。
铝佐剂制备
MPL溶于200mL的异丙醇溶液中,polyI:C(厂家是Sigma,货号:P1530,CAS号:42424-50-0)溶解于磷酸盐水溶液(50mM PB,包含100mM的NaCl),铝佐剂(ALHYDROGEL,CAS:21645-51-2,厂家:CRODA,货号:AJV3012,批号:0001678865)4mg/ml分别吸附polyI:C和3D-MPL,再混合至合适的浓度备用。含缓冲液的VZV gE抗原与佐剂原液混合,得到终浓度的疫苗制剂。
表4 不同PolyI:C浓度的脂质体佐剂比较
组别 | 剂型 | 成分 | 小鼠用量(1/10 HD) |
Gr1-1 | 脂质体 | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL,polyI:C(0.2mg/ml) | 3D-MPL 5μg,polyI:C 10μg |
Gr1-2 | 脂质体 | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL,polyI:C(0.5mg/ml) | 3D-MPL 5μg,polyI:C 50μg |
Gr1-3 | 脂质体 | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL,polyI:C(1mg/ml) | 3D-MPL 5μg,polyI:C 50μg |
Gr2 | 氢氧化铝佐剂 | 氢氧化铝,3D-MPL,polyI:C(0.5mg/ml) | Al 50μg,3D-MPL 5μg,polyI:C 25μg |
Gr3 | 氢氧化铝佐剂 | 氢氧化铝,3D-MPL,polyI:C(1mg/ml) | Al 50μg,3D-MPL 5μg,polyI:C 50μg |
Gr4 | 脂质体 | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL,polyI:C(2mg/ml) | 3D-MPL 5μg,polyI:C 100μg |
结果
本实施例的疫苗组合物的抗原类成分使用的是水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白,为考察复合脂质体佐剂中不同PolyI:C浓度对免疫效果的影响,以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究。每组6只,采用0天初免,两针间隔14天的免疫程序,于0天进行水痘苗接种,35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d),取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞,以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物,通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2 的水平。
表5 不同PolyI:C浓度的脂质体佐剂免疫效果比较
组别 | IL-2+ | IL-2+IFN-γ+ | IFN-γ+ | 合计 |
Gr1-1 | 0.475 | 0.468 | 0.594 | 1.537 |
Gr1-2 | 0.421 | 0.258 | 0.527 | 1.206 |
Gr1-3 | 0.413 | 0.215 | 0.512 | 1.140 |
Gr2 | 0.406 | 0.231 | 0.469 | 1.106 |
Gr3 | 0.314 | 0.178 | 0.585 | 1.077 |
Gr4 | 0.453 | 0.205 | 0.499 | 1.157 |
结论
每只小鼠接种人用剂量十分之一,研究发现,整体上,复合脂质体佐剂组Gr1-1、Gr1-2、Gr1-3和Gr4优于铝佐剂组Gr2和Gr3,其中Gr1-1组中3D-MPL 5μg,polyI:C 10μg时细胞免疫的效果是最优的。3D-MPL与PolyI:C的重量比范围可以是1:2-1:20之间,优选的比例是3D-MPL与PolyI:C的重量比1:2、1:5和1:10,最优的比例是1:2。
实施例3:疫苗组合物的制备方法研究
制备有机相:将总计40g以4:1比例的DOPC/DOTAP配制的脂质混合物(32g的DOPC、8g的DOTAP),10g胆固醇和2g 3D-MPL溶于200mL的异丙醇中。
制备水相:磷酸盐水溶液作为水相备用。
制备脂质体溶液:在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行微流控装置,获得脂质体溶液。
制备佐剂原液:PolyI:C取4g(厂家是Sigma,货号:P1530,CAS号:42424-50-0)溶解于磷酸盐水溶液(50mM PB,包含100mM 的NaCl),与脂质体溶液混合,得到终浓度的佐剂原液。
抗原的加入:包括两种不同方式,分别为将VZV gE蛋白加入内水相磷酸盐水溶液中、或者使用佐剂原液复溶抗原溶液。
表6 不同制备方法的免疫效果比较
组别 | 剂型 | 成分 | 小鼠用量(1/10 HD) | 方法 |
Gr1 | 脂质体 | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL,polyI:C(2mg/ml) | 3D-MPL 5μg,polyI:C100μg | 1×,复溶抗原 |
Gr2 | 脂质体(含抗原) | DOPC/DOTAP(4:1),3D-MPL,polyI:C(2mg/ml) | 3D-MPL 5μg,polyI:C100μg,抗原5μg | 加入内水相 |
结果
本实施例的疫苗组合物的抗原类成分使用的是水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白,为考察加入抗原的不同方式对免疫效果的影响,。以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究。每组6只,采用0天初免,两针间隔14天的免疫程序,于0天进行水痘苗接种,35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d),取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞,以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物,通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。
表7 不同抗原加入方式的免疫效果比较
组号 | IL-2+ | IL-2+IFN-γ+ | IFN-γ+ | 合计 |
Gr1 | 0.369 | 0.139 | 0.240 | 0.748 |
Gr2 | 0.492 | 0.240 | 0.485 | 1.217 |
结论
微流体产生的与TLR4激动剂和TLR3激动剂结合的脂质体制剂,研究发现,抗原VZVgE重组蛋白以加入内水相的方式形成的疫苗组合物能够产生更高水平的细胞免疫应答。
实施例4:HPV疫苗组合物的制备
制备有机相:将总计40g以4:1比例的DOPC/DOTAP配制的脂质混合物(32g的DOPC、8g的DOTAP),10g胆固醇和2g 3D-MPL溶于200mL的乙醇溶液中。
制备水相:生理盐水溶解HPV16的 L1蛋白原液(一人份用剂为40μg)作为水相备用。
制备脂质体溶液:在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行微流控装置,获得脂质体溶液。
制备疫苗组合物:用注射用水溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到疫苗组合物。
实施例5:RSV疫苗组合物的制备
制备有机相:将总计42g以6:1比例的DOPC/DOTAP配制的脂质混合物(36g的DOPC、6g的DOTAP),10.5g胆固醇和2.1g 3D-MPL溶于200mL的异丙醇/丙醇(1:1)溶液中。
制备水相:生理盐水溶解重组RSV的F蛋白蛋白原液(参考CN202211033268.6说明书中实施例1,一人份用剂量为40μg)作为水相备用。
制备脂质体溶液:在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行微流控装置,获得脂质体溶液。
制备疫苗组合物:用注射用水溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到疫苗组合物。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合脂质体佐剂,其主要成分包括:
A)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物;
B)胆固醇;和
C)3D-MPL与PolyI:C,
其中DOPC与DOTAP的重量比为2:1-6:1,脂质混合物与胆固醇的重量比是4:1,固醇与3D-MPL的重量比是5:1,3D-MPL与PolyI:C的重量比是1:2-1:20。
2.如权利要求1所述的复合脂质体佐剂,其特征在于,所述DOPC与DOTAP的重量比为6:1或4:1。
3.如权利要求1所述的复合脂质体佐剂,其特征在于,所述3D-MPL与PolyI:C的重量比为1:2、1:5或1:10。
4.如权利要求1-3中任一项所述的复合脂质体佐剂的制备方法,包括如下步骤:
步骤1)制备有机相:将包含DOPC/DOTAP的脂质混合物、胆固醇和3D-MPL按质量比90-100:20-30:4-5的比例溶解于有机溶剂中,得到有机相备用;
步骤2)制备水相:使用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液,制得水相备用;
步骤3)制备脂质体溶液:用微流控装置混合有机相和水相,去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液;
步骤4)制备佐剂原液:用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到复合脂质体佐剂原液。
5.如权利要求4所述的复合脂质体佐剂的制备方法,其特征在于,所述步骤3)可以用如下步骤替代:
制备脂质体溶液:将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜;在脂质薄膜中加入水相进行水化、再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
6.如权利要求4或5所述的复合脂质体佐剂的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、乙醇、正丙醇、异丙醇、氯仿或其中两者的混合物。
7.一种疫苗组合物,包括权利要求1-3中任一项所述的复合脂质体佐剂和抗原类成分。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物的制备方法,包括如下步骤:
步骤1)制备有机相:将包含DOPC/DOTAP的脂质混合物、胆固醇和3D-MPL按质量比90-100:20-30:4-5的比例溶解于有机溶剂中,得到有机相备用;
步骤2)制备水相:使用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解抗原类成分,制得水相备用;
步骤3)制备脂质体溶液:用微流控装置混合有机相和水相,去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液;
步骤4)制备疫苗组合物:用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到疫苗组合物。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物的制备方法,其特征在于,所述步骤3)可以用如下步骤替代:
制备脂质体溶液:将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜;在脂质薄膜中加入水相进行水化,再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
10.如权利要求8或9所述的疫苗组合物的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、乙醇、正丙醇、异丙醇、氯仿或其中两者的混合物。
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