CN102936338A - 一种阳离子类脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种式I所示的阳离子类脂质体：其中，R为式II、III、IV、V所示的取代基：R'为C6~C40的烷基、C6~C40的取代烷基，胆固醇基或胆酸基。本发明提供了一类新型的以PAMAM作为亲水头部，两条疏水链段作为疏水尾部的生物相容性良好的可降解的阳离子类脂质体。该类脂质体同时具备了PAMAM及类脂质体的优异性质。同时提供了一种式（I）所示的阳离子类脂质体的制备方法。该方法通用性强，可通过此方法得到多种类似结构的化合物。也为研究此类化合物结构性能关系提供了一个方法学平台。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物制备领域，具体涉及一种阳离子类脂质体及其制备方法。
背景技术
脂质体又称为囊泡，是类脂分子在水相中的自组装体。它含有一个或多个类脂双层膜，在每个双层膜结构中，类脂分子中的疏水部分通过疏水相互作用结合在一起，极性亲水部分指向环境中的水相。
用于制备脂质体的类脂分子包括天然类脂及合成类脂。它们的分子结构大都具备一个共同的特点，即都是由两条疏水尾链与一个亲水的极性头部构成。脂质体由于其结构的特殊性，在医疗领域具有广泛的应用。它可以包封血红蛋白做人血的代用品，可以作疫苗佐剂，可以作为药物控释的载体，合成类脂分子还可以作为基因治疗的载体。
经过近三十年的发展，脂质体作为一种药物载体已经实现了商业化。美国食品及药品管理局已批准多种脂质体和以脂质体为基础的药物产品，还有很多项目处于临床实验阶段。这使得脂质体的研究更具吸引力。
树枝状聚合物PAMAM是第一种被合成和应用的树枝状聚合物。以一种烷基二胺为核，通过反复的丙烯酸甲酯迈克尔加成和乙二胺胺解可制备出各种不同代数的PAMAM树枝状聚合物。聚酰胺-胺树枝状大分子是第一种被合成和商品化的树枝状聚合物。随着生命科学的发展，PAMAM受到越来越广泛的关注。其分子内部的空腔可以用来包裹药物分子，多个表面官能团可以用来进行各种修饰，如连接靶向分子，荧光分子，键和药物等。其分子的高正电荷密度可以用来结合DNA，作为基因载体。目前，PAMAM树枝状聚合物已被广泛应用于生物医药领域，如药物载体，基因载体，磁共振成像对比剂等。
Bioconjugate Chem.2005,16,1160-1165公开了一种方法制备以树枝状聚（酰胺-胺）大分子（PAMAM）为阳离子亲水头部的类脂分子并应用于基因转染领域。然而该方法是以含有一个仲胺的疏水小分子引发制备PAMAM,因此在疏水段的选择上受到了限制，并且该分子不可降解。
Angew.Chem.Int.Ed.(2011,50,1-6)公开了一种方法，利用点击化学制备出阳离子类酯分子，并用于结合肝素作为解毒剂，也取得了很好的效果。但是由于方法限制，疏水部分选择也十分有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种具有含有树枝状聚合物PAMAM的阳离子类脂质体的及其制备方法，该方法可制备多种含不同代数PAMAM的阳离子类脂质体。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种式（I）所示的阳离子类脂质体：
其中，R为式II、III、IV、V所示的取代基：
R'为C6~C40的烷基、C6~C40的取代烷基，胆固醇基或胆酸基。优选的，所述取代烷基选自氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽和叶酸中的一种或多种取代的烷基。
优选的，所述R'分别为豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸或油酸失去氢离子得到的取代基。
本发明还提供了一种所述的阳离子类脂质体的制备方法，其特征在于，包括：
a）提供异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酸酐，并将其与丙炔醇在有机溶剂中混合，在催化剂作用下发生缩合反应，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯；
b）将步骤a）得到的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯与小分子疏水化合物混合在有机溶剂中，在催化剂和缩合剂的作用下，发生缩合反应，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物；所述小分子疏水化合物选自C6~C40范围可扩大的羧酸、C6~C40的取代羧酸，羧基化胆固醇或胆酸；
c）提供叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM，与步骤b）提供的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物混合在有机溶剂中，在五水硫酸铜和抗坏血酸钠的作用下发生点击化学反应，在三氟乙酸中脱去保护得到式I所示的阳离子类脂质体。
优选的，所述丙炔醇与所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐按摩尔比为1:1.1~2；所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯与所述小分子疏水化合物按摩尔比为1：2~2.5；所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰疏水分子与所述叠氮化PAMAM按摩尔比为1:1~2。
优选的，所述步骤a）中的提供异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酸酐具体为：
将2,2-二羟甲基丙酸与2,2-二甲氧基丙烷混合在有机溶剂中，在4-甲苯磺酸的作用下发生反应，得到异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸；
将所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸与缩合剂二环己基碳二亚胺混合在有机溶剂中，发生缩合反应，得到异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐。
优选的，所述步骤c）中的叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM通过以下方法制备，包括步骤：
将NaN3,溴丙胺溴化氢盐溶于水，在碱性条件下发生迈克尔加成反应，并经过提纯干燥工序，得到G0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和G0代PAMAM溶解于有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G0.5代PAMAM；将乙二胺与所述G0.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G1.0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和所述G 1.0代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G 1.5代PAMAM；将乙二胺与所述G1.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G2.0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和所述G2.0代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G2.5代PAMAM；将乙二胺与所述G2.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G3.0代PAMAM；
将G1.0代，G2.0代与G3.0代的PAMAM与二碳酸二叔丁酯反应经过提纯后，得到叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM。
优选的，所述疏水性小分子化合物可以为各种脂肪酸或胆酸，脱氧胆酸等。
优选的，所述叠氮化PAMAM选自G0代、第G1.0代，G2.0代或G3.0代树枝状聚合物PAMAM。
优选的，所述有机溶剂分别选自丙酮、甲醇、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺中的一种。
本发明建立了一种新方法制备PAMAM阳离子类脂质体，通过点击化学的方法制备出一种新型阳离子类脂质体。使脂质体同时具备树枝状聚合物PAMAM的优点。此外，建立阳离子类脂质体的结构性能关系至关重要，而本文建立的方法，有很大的可变性，可根据需要改变阳离子及疏水链段的组成，也为研究阳离子脂质体的结构性能关系提供了一个很好的平台。
附图说明：
图1为本发明实施例7提供的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的油酸以CDCl3为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例10第2代树枝状聚合物PAMAM提供的以CDCl3为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例11第3代树枝状聚合物PAMAM提供的以CDCl3为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图4为本发明实施例22提供的红外光谱图；
图5为本发明实施例22提供的以DMSO为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图6为本发明实施例26提供的以DMSO为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图7为本发明实施例26提供的利用动态光散射法测定的脂质体粒径及分布；
图8为本发明实施例22与实施例26提供的细胞毒性测试；
图9为本发明实施例22产物DYY-G2.0提供的绿色荧光蛋白质粒DNA对HEK细胞的转染测试图；
图10为本发明实施例26产物DYY-G3.0提供的绿色荧光蛋白质粒DNA的转染测试电镜图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
现有技术中以PAMAM这一性质优异的树枝状阳离子聚合物作为类脂质体亲水头部的合成方法十分有限，相应分子种类较少并且往往不可降解。针对这一问题，本文通过点击化学及酯键键合的方法，同时将两分子疏水链段及不同代数的PAMAM引入新型阳离子类脂质体的制备中，得到了多种性质优异的新型阳离子类脂质体化合物。
本发明提供了一种阳离子类脂质体，具有式I所示的结构，
其中R为式II、III、IV、V所示的取代基：
R'为C6~C40的烷基、C6~C40的取代烷基，胆固醇基或胆酸基。
按照上述技术方案，本发明提供的是一种阳离子类脂质体，C6~C40的烷基、C6~C40的取代烷基，胆固醇基或胆酸基作为疏水链段；式II、III、IV所示的取代基为阳离子亲水基团。由于本发明提供的类脂质体具有两条疏水嵌段，所以具有良好的疏水性能，又由于本发明提供的阳离子类脂质体具有式II、III、IV所示的取代基形成的亲水段，所以能够按照对亲水性不同的要求增加不同的取代基，使阳离子类脂质体具有不同的亲水性，能够适用于更多的环境中。而式II、III、IV所示的取代基均为不同分子量的树枝状大分子PAMAM，具有PAMAM的性能。当所述阳离子类脂质体在水中时，类脂质体分子之间通过疏水段结合，亲水段指向水相。
按照本发明，所述取代烷基是疏水链段，由小分子化合物形成，取代烷基选自氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽和叶酸中的一种或多种取代的烷基。
更优选的，所述R'为豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸或油酸失去羟基得到的取代基。
为了得到所述阳离子类脂质体，本发明还提供了一种所述式I所示化合物的制备方法，包括：
a）提供异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐，并将其与丙炔醇在有机溶剂中混合，在催化剂作用下发生缩合反应，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯；
b）将步骤a）得到的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯与小分子疏水化合物混合在有机溶剂中，在催化剂和缩合剂的作用下，发生缩合反应，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物；所述小分子疏水化合物选自C6~C40的羧酸、C6~C40的取代羧酸，羧基化胆固醇或胆酸。
c）提供叠氮化PAMAMG1~G3，与步骤b）提供的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物混合在有机溶剂中，在五水硫酸铜和抗坏血酸钠的作用下发生点击化学反应，得到式I所示的阳离子类脂质体。
上述制备方法中，首先提供异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐，所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐可以通过本申请人自行制备，制备的方法具体为
将2,2-二羟甲基丙酸与2,2-二甲氧基丙烷混合在有机溶剂中，在4-甲苯磺酸的作用下发生反应，得到异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸；
将所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸与缩合剂二环己基碳二亚胺混合在有机溶剂中，发生缩合反应，得到异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐。
更具体的所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐的制备方法为：将2,2-二羟甲基丙酸,4-甲苯磺酸一水合物,2,2-二甲氧基丙烷,其中2,2-二羟甲基丙酸和2,2-二甲氧基丙烷按摩尔比优选为1:1.5~2，4-甲苯磺酸一水合物的物质的量优选为为2,2-二甲氧基丙烷摩尔数的2倍。依次加入反应瓶中后，向反应瓶中加入丙酮作为反应溶剂。室温下搅拌2小时。然后向反应瓶中加入氨水/乙醇（50:50）的混合溶液。溶剂在室温下旋干。然后利用二氯甲烷溶解，分两次利用一次水萃取。得到的有机相利用无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤后旋干，油泵抽真空8h后得白色晶体异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸。
将所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸,溶解于二氯甲烷中，然后加入二环己基碳二亚胺（DCC）,室温搅拌反应24小时，其中异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸与DCC摩尔比例优选为1:1.1~1.5。停止反应后，利用G4砂芯漏斗将不溶物过滤除去，旋转蒸发后，利用油泵抽真空8h,得黄色油状产物异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐。。
以下为所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸的制备过程反应方程式：
制备了所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐后，将其与丙炔醇混合反应，在所述2,2-二甲氧基丙酸上引入炔基，并使所述酸酐水解，形成2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯。
所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯的制备过程具体为：
利用吡啶将丙炔醇和4-二甲氨基吡啶（DMAP）溶解得到混合溶液，加入反应瓶中后，再向所述反应瓶中加入二氯甲烷，磁子搅拌下缓慢加入异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐，室温搅拌12~24h，其中丙炔醇,异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐,优选摩尔比例为1:1.1~2，更优选为1:1.5~1.8。DMAP优选为异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐的1.1倍摩尔量。利用碳谱监测反应是否完全（取决于过量的酸酐约在169ppm处的峰是否消失）反应利用少量一次水在剧烈搅拌下停止，利用二氯甲烷稀释，再利用10%NaHSO4水溶液洗三次。再利用10%的Na2CO3水溶液洗三次，最后利用饱和NaCl水溶液冲洗一次。将有机相利用无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤后，旋干浓缩，粗产物利用200-300目硅胶柱分离。将产物溶液收集在一起后旋干，抽真空，得无色油状物。将油状物利用甲醇溶解后加入反应瓶，再加入离子交换树脂DOWEX 50w-X2-200resin，40℃搅拌反应，利用碳谱监测反应是否完全，待反应完全后过滤除去树脂，滤出液浓缩后，真空干燥，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯。
由于2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯分子上还具有两个羟基，所以可以通过与酸性疏水小分子化合物反应通过酯化反应，使2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯能够修饰所述疏水小分子化合物。按照本发明，所述疏水小分子化合物优选选自C6~C40的羧酸、C12~40的取代羧酸，胆固醇和胆酸一种或多种。更优选为月桂酸，豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山萮酸，木蜡酸，蜡酸，褐煤酸，棕榈油酸，油酸，鳕油酸，神经酸，亚油酸，亚麻酸，EPA,DHA,蓖麻油酸，胆酸，脱氧胆酸中的一种或多种。
按照本发明，所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物的制备方法具体为：
将DMAP,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）加入反应瓶中，再加入利用二氯甲烷溶解的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯，疏水小分子,室温反应72h后停止反应,其中2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯与疏水小分子摩尔比例优选为1:2~2.5，更优选为1:2.2~2.5，DMAP摩尔量优选为疏水小分子的1.1倍摩尔比，EDC优选为疏水小分子的2倍摩尔比，利用饱和氯化钠水溶液洗5次，加入无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤，旋转蒸发仪旋干溶剂，将得到的混合物利用200-300目硅胶柱分离，然后旋干，抽真空，得产物2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物。
至此，已经制备了具有疏水基团的分子，然后通过2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯上的炔基在铜催化剂的作用下与叠氮化合物发生点击化学反应，在所述疏水基团的分子上引入阳离子亲水基团，得到阳离子类脂质体。按照本发明，所述叠氮化合物优选为叠氮化PAMAM。更优选为树枝状的PAMAM，由于具有不同分子量的PAMAM，是通过反应的进行程度不同划分为G0代PAMAM、G1.0代PAMAM、G2.0代PAMAM、G3.0代PAMAM、G4.0代PAMAM、G5.0代PAMAM，代数也高说明分子量越大。本发明优选使用G0代PAMAM、G 1.0代PAMAM、G2.0代PAMAM、G3.0代PAMAM，因为分子量过大的PAMAM会使分子的阳离子基团太重，而导致疏水链段无法结合。
按照本发明，所述叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM的制备方法具体为：
将NaN3,溴丙胺溴化氢盐溶于水，在碱性条件下发生迈克尔加成反应，并经过提纯干燥工序，得到G0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和G0代PAMAM溶解于有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G0.5代PAMAM；将乙二胺与所述G0.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G1.0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和所述G 1.0代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G 1.5代PAMAM；将乙二胺与所述G1.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G2.0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和所述G2.0代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G2.5代PAMAM；将乙二胺与所述G2.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G3.0代PAMAM。
将第G1.0代，G2.0代与G3.0代的PAMAM分别与二碳酸二叔丁酯反应，经过提纯后，得到叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM
更优选的，所述叠氮化PAMAM的制备方法为：
将NaN3,溴丙胺溴化氢盐溶解于一次水中，然后加入到反应瓶中，90℃反应24h,其中溴丙胺溴化氢盐与NaN3的摩尔比优选为1:1.1~1.5。静置至室温后，向反应瓶中加入KOH调节pH至碱性,分两次用无水乙醚萃取，将有机相利用无水硫酸镁干燥4h，然后将固体过滤掉，旋干得无色透明液体，即为产物第0代的叠氮化PAMAM，简称为G0。
取丙烯酸甲酯溶解于甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再将G0利用甲醇溶解，缓慢滴加到反应瓶中，约半小时滴完，其中G0和丙烯酸甲酯的摩尔比优选为1:5~10。将反应瓶密封后移至30℃油浴中搅拌反应48h，所得产物利用硅胶柱1:1正己烷：乙酸乙酯为展开剂分离，将产物溶液收集在一起，抽真空8h后，得无色油状透明液体，即为产物。第0.5代的叠氮化PAMAM简称为G0.5。
将乙二胺溶解于甲醇后加入反应瓶，冰浴搅拌。再将G1.0利用甲醇溶解后滴加到反应瓶中，约半小时滴加完毕,其中G0.5与乙二胺的摩尔比例优选为1:15~25。将反应瓶密封后移至35℃油浴中搅拌反应三天，红外跟踪发现酯键消失后，停止反应，将反应瓶抽真空2h。向反应瓶中加入甲苯将粘稠物溶解，真空抽干，反复三次，加入甲醇将粘稠物溶解，真空抽干，反复三次后得黄色粘稠物即为产物，第1代的叠氮化PAMAM简称为G1.0。
反复进行胺解反应及迈克尔加成反应，可得G1.5，G2.0，G2.5，G3.0。
将第G1.0代，G2.0代与G3.0代的PAMAM分别与二碳酸二叔丁酯反应，得到叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM。
将所述叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM与所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的疏水小分子进行点击化学反应。反应过程具体为：
称取五水硫酸铜和抗坏血酸钠加入反应瓶。称取利用2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰疏水小分子，溶解于DMF中，加入反应瓶。称取各代叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM，溶解于DMF中，其中，2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰疏水小分子和叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM按摩尔比优选为1~2：1，更优选为1.1~1.5:1。五水硫酸铜优选为PAMAM摩尔量的5%，抗坏血酸钠摩尔量为五水硫酸铜的5倍，反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，旋干溶剂，利用硅胶柱分离纯化所得产物。
得到产物后，利用20mL三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合溶剂搅拌4h,反应结束后旋干溶剂得式Ⅰ所示的阳离子类脂质体。
按照本发明，上述各部反应中所述有机溶剂分别选自丙酮、甲醇、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺中的一种。
以下为2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯的反应方程式：
以下为修饰小分子疏水化合物的化学反应方程式：
以下为阳离子类脂质体的反应方程式：
其中R”为叔丁氧羰基保护的各代PAMAM聚合物
为了更好的证明本发明提供的技术方案能够解决结束问题，以下将通过具体实施例阐述本发明的方案，其中主要原料的来源为丙炔醇，2,2-二羟甲基丙酸，2,2-二甲氧基丙烷购于百灵威试剂公司，油酸，棕榈酸，豆蔻酸，硬脂酸，乙二胺，丙烯酸甲酯购于西格玛试剂公司，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）,二环己基碳二亚胺(DCC)，4-二甲氨基吡啶（DMAP）购于上海吉尔试剂公司。其余各种药品均购于北京化工厂。
实施例1：
异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸的合成：
称取2,2-二羟甲基丙酸50.000g,4-甲苯磺酸一水合物3.550g,量取2,2-二甲氧基丙烷69.0mL,依次加入反应瓶中后，向反应瓶中加入250.0mL丙酮。室温下搅拌2小时。然后向反应瓶中加入约5mL氨水/乙醇（50:50）的混合溶液。溶剂在室温下旋干。然后利用250.0mL二氯甲烷溶解，分两次利用20mL一次水萃取。得到的有机相利用无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤后旋干，油泵抽真空8h后得白色晶体异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸。产率为95%。
实施例2：
异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐的合成：
称取异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸30.000g,溶解于150.0mL二氯甲烷中，然后加入DCC 17.800g,室温搅拌反应24小时。停止反应后，利用G4砂芯漏斗将不溶物过滤除去，旋转蒸发后，利用油泵抽真空8h,得黄色油状产物异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐。产率为91%。
实施例3：
2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯的合成：
称取2.000g丙炔醇和0.652克DMAP，利用8.360g吡啶将丙炔醇和DMAP溶解，加入反应瓶中后，再加入20mL二氯甲烷，磁子搅拌下缓慢加入15.28g异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐，室温搅拌过夜。利用碳谱监测反应是否完全（取决于过量的酸酐约在169ppm处的峰是否消失）反应利用5ml一次水在剧烈搅拌下停止，利用500mL二氯甲烷稀释，再利用10%NaHSO4水溶液洗三次，每次200mL。再利用10%的Na2CO3水溶液洗三次，每次200mL，最后利用100mL饱和NaCl水溶液冲洗一次。将有机相利用无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤后，旋干浓缩，粗产物利用200-300目硅胶柱分离，流动相依次为正己烷，乙酸乙酯：正己烷（10:90）混合溶剂，乙酸乙酯：正己烷（15:85）混合溶剂。将产物溶液收集在一起后旋干，抽真空，得无色油状物。将油状物利用50mL甲醇溶解后加入反应瓶，再加入5g DOWEX50w-X2-200resin，40℃搅拌反应，利用碳谱监测反应是否完全，待反应完全后过滤除去树脂，滤出液浓缩后，真空干燥，得到炔二醇。产率为：57.3%。
实施例4：
利用2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰豆蔻酸的合成：
先称取DMAP 0.224g,EDC 0.438g,加入50mL反应瓶中，再加入利用20mL二氯甲烷溶解的二元醇0.396g，1.133g,室温反应72h后停止反应，利用饱和氯化钠水溶液洗5次，加入无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤，旋转蒸发仪旋干溶剂，将得到的混合物利用200-300目硅胶柱，正己烷：乙酸乙酯=1:1的展开剂洗脱，然后旋干，抽真空，得产物为无色油状液体。产率为：86.3%。
实施例5：
利用2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰棕榈酸的合成：
先称取DMAP 0.224g,EDC 0.438g,加入50mL反应瓶中，再加入利用20mL二氯甲烷溶解的二元醇0.396g，1.271g,室温反应72h后停止反应，利用饱和氯化钠水溶液洗5次，加入无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤，旋转蒸发仪旋干溶剂，将得到的混合物利用200-300目硅胶柱，正己烷：乙酸乙酯=1:1的展开剂洗脱，然后旋干，抽真空，得产物为无色油状液体。产率为：87.2%。
实施例6：
利用2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰硬脂酸的合成：
先称取DMAP 0.224g,EDC 0.438g,加入50mL反应瓶中，再加入利用20mL二氯甲烷溶解的二元醇0.396g，1.400g,室温反应72h后停止反应，利用饱和氯化钠水溶液洗5次，加入无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤，旋转蒸发仪旋干溶剂，将得到的混合物利用200-300目硅胶柱，正己烷：乙酸乙酯=1:1的展开剂洗脱，然后旋干，抽真空，得产物为无色油状液体。产率为：85.4%。
实施例7：
利用2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰油酸的合成：
先称取DMAP 0.224g,EDC 0.4375g,加入50mL反应瓶中，再加入利用20mL二氯甲烷溶解的二元醇0.396g，1.400g,室温反应72h后停止反应，利用饱和氯化钠水溶液洗5次，加入无水MgSO4干燥，G4砂芯漏斗过滤，旋转蒸发仪旋干溶剂，将得到的混合物利用200-300目硅胶柱，正己烷：乙酸乙酯=1:1的展开剂洗脱，然后旋干，抽真空，得产物为无色油状液体。产率为：86.7%。
通过核磁检测，各峰归属如图1所示。证明了2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰油酸的合成。
实施例8：
叔丁氧羰基保护的G0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM的合成：
称取NaN310.0g,溴丙胺溴化氢盐10.0g，分别溶解于30mL一次水中，然后加入到反应瓶中，90℃反应24h,静置至室温后，向反应瓶中加入10gKOH,分两次用90mL无水乙醚萃取，将有机相利用无水硫酸镁干燥4h，然后将固体过滤掉，旋干得无色透明液体，即为产物。第0代的叠氮化PAMAM简称为G0。产率为:58.5%。
称取G0代PAMAM 1.0克，二碳酸二叔丁酯3.0克，溶解于20mL一次水中，然后加入到反应瓶中，室温搅拌过夜，静止至室温后，利用二氯甲烷每次10mL，分三次进行萃取，有机相利用无水硫酸镁干燥后，浓缩，然后过硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4的混合溶剂为展开剂，将产物点收集旋干后得叔丁氧羰基保护的G0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM。
实施例9：
叔丁氧羰基保护的G1.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM的合成：
取2.0g丙烯酸甲酯溶解于20mL甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再称取1.0gG0，利用10mL甲醇溶解，缓慢滴加到反应瓶中，约半小时滴完。将反应瓶密封后移至30℃油浴中搅拌反应48h，所得产物利用硅胶柱1:1正己烷：乙酸乙酯为展开剂分离，将产物溶液收集在一起，抽真空8h后，得无色油状透明液体，即为产物。第0.5代的叠氮化PAMAM简称为G0.5。产率:为：85.2%。
取10.0mL乙二胺溶解于20mL甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再称取1.8gG1.0，利用10mL甲醇溶解后，滴加到反应瓶中，约半小时滴加完毕。将反应瓶密封后移至35℃油浴中搅拌反应三天，红外跟踪发现酯键消失后，停止反应，将反应瓶抽真空2h。向反应瓶中加入10mL甲苯，真空抽干，反复三次，加入10mL甲醇，真空抽干，反复三次后得黄色粘稠物即为产物，第1代的叠氮化PAMAM简称为G1.0。产率为：99.0%。
称取G 1.0代PAMAM 1.0克，二碳酸二叔丁酯2.0克，溶解于20mL一次水中，然后加入到反应瓶中，室温搅拌过夜，静止至室温后，利用二氯甲烷每次10mL，分三次进行萃取，有机相利用无水硫酸镁干燥后，浓缩，然后过硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4的混合溶剂为展开剂，将产物点收集旋干后得叔丁氧羰基保护的G1.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM。
实施例10：
叔丁氧羰基保护的G2.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM的合成：
取5.0g丙烯酸甲酯溶解于20mL甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再称取2.0gG 1.0，利用10mL甲醇溶解，缓慢滴加到反应瓶中，约半小时滴完。将反应瓶密封后移至30℃油浴中搅拌反应48h，所得产物利用硅胶柱10:1正己烷：乙酸乙酯为展开剂分离，将产物溶液收集在一起，抽真空8h后，得淡黄色粘稠物，即为产物。第1.5代的叠氮化PAMAM简称为G1.5。产率为：89.5%。
取15.0ml乙二胺溶解于20mL甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再称取2.0gG1.5，利用10mL甲醇溶解后，滴加到反应瓶中，约半小时滴加完毕。将反应瓶密封后移至35℃油浴中搅拌反应三天，红外跟踪发现酯键消失后，停止反应，将反应瓶抽真空2h。向反应瓶中加入10mL甲苯，真空抽干，反复三次，加入10mL甲醇，真空抽干，反复三次后得深黄色粘稠物即为产物，第2代的叠氮化PAMAM简称为G2.0。产率为99.2%。
将G2.0代PAMAM进行核磁检测，各峰归属如图2所示。证明了第2代叠氮化树枝状聚合物PAMAM的合成。
称取G2.0代PAMAM 1.0克，二碳酸二叔丁酯2.0克，溶解于20mL一次水中，然后加入到反应瓶中，室温搅拌过夜，静止至室温后，利用二氯甲烷每次10mL，分三次进行萃取，有机相利用无水硫酸镁干燥后，浓缩，然后过硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4的混合溶剂为展开剂，将产物点收集旋干后得叔丁氧羰基保护的G2.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM。
实施例11：
叔丁氧羰基保护的G3.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM的合成：
取5.0g丙烯酸甲酯溶解于20mL甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再称取2.0gG2.0，利用10mL甲醇溶解，缓慢滴加到反应瓶中，约半小时滴完。将反应瓶密封后移至30℃油浴中搅拌反应48h，所得产物利用硅胶柱分离，先用10:1正己烷：乙酸乙酯冲柱，将杂质洗脱后，改用甲醇冲柱，得到产物。将产物溶液收集在一起，抽真空8h后，得黄色粘稠物，即为产物。第2.5代的叠氮化PAMAM简称为G2.5。产率为：72.2%。
取15.0mL乙二胺溶解于20mL甲醇中，加入反应瓶中，冰浴搅拌。再称取2.0gG2.5，利用10mL甲醇溶解后，滴加到反应瓶中，约半小时滴加完毕。将反应瓶密封后移至35℃油浴中搅拌反应三天，红外跟踪发现酯键消失后，停止反应，将反应瓶抽真空2h。向反应瓶中加入10mL甲苯，真空抽干，反复三次，加入10mL甲醇，真空抽干，反复三次后得深黄色粘稠物即为产物，第3代的叠氮化PAMAM简称为G3.0。产率为：99.3%。
将本实施例制备的产物进行核磁检测，各峰归属如图3所示。证明了G3.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM的合成。
称取G3.0代PAMAM 1.0克，二碳酸二叔丁酯2.0克，溶解于20mL一次水中，然后加入到反应瓶中，室温搅拌过夜，静止至室温后，利用二氯甲烷每次10mL，分三次进行萃取，有机相利用无水硫酸镁干燥后，浓缩，然后过硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4的混合溶剂为展开剂，将产物点收集旋干后得叔丁氧羰基保护的G3.0代叠氮化树枝状聚合物PAMAM。
实施例12：
基于G0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰豆蔻酸1.5g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶，反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体化合物。取出1mg样品后，加入10mL一次水，超声振荡20分钟后得类脂质体。
实施例13：
基于G0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰棕榈酸1.5g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体化合物。取出1mg样品后，加入10mL一次水，超声振荡20分钟后得类脂质体。
实施例14：
基于第G0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰硬脂酸1.5g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体化合物。取出1mg样品后，加入10mL一次水，超声振荡20分钟后得类脂质体。
实施例15：
基于G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰豆蔻酸1.0g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第1.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G 1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例16：
基于G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰棕榈酸1.0g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第1.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G 1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例17：
基于G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰硬脂酸1.0g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第1.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G 1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例18：
基于G1.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰油酸0.80g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第2.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例19：
基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰豆蔻酸0.80g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第2.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例20：
基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰棕榈酸0.80g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第2.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例21：
基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰硬脂酸0.80g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第2.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例22：
基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰油酸0.80g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第2.0代叠氮化PAMAM0.067g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G2.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
图4为本发明制备过程的红外光谱图，波数为2098处的迭氮基团红外吸收峰消失，证明了点击化学的成功进行。
图5为本实施例制备的类脂质体的核磁谱图，各峰归属如图所示。化学位移为8.0ppm处的吸收峰属于click反应形成1,2,3-三氮唑环上的氢。化学位移为5.1ppm处的吸收峰属于与1,2,3-三氮唑环上的碳原子相邻的亚甲基上的氢。化学位移为4.3ppm处的吸收峰属于与1,2,3-三氮唑环上的氮原子相邻的亚甲基上的氢。证明了click反应的成功进行。
实施例23：
基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰豆蔻酸0.50g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取第叔丁氧羰基保护的第3代叠氮化PAMAM0.050g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。实施例24：基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备。
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰棕榈酸0.50g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第3代叠氮化PAMAM0.050g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用1000透析袋透析三天。冻干后得产物为浅棕色固体。产率为60.3%。取出冻干后样品1mg，加入一次水10mL，超声振荡20分钟后得类脂质体。
实施例25：
基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰硬脂酸0.50g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第3代叠氮化PAMAM0.050g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
实施例26：
基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体的合成及制备：
称取五水硫酸铜15mg，抗坏血酸钠63mg，加入反应瓶。称取2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰油酸0.50g，溶解于2mLDMF中，加入反应瓶。称取叔丁氧羰基保护的第3代叠氮化PAMAM0.050g，溶解于2mLDMF中加入反应瓶。反复冻融三次除去反应瓶中及溶液中的氧气，充入氮气后在60℃油浴中反应三天。待反应结束后，利用硅胶柱除杂，以甲醇：乙酸乙酯=1:4为展开剂，将产物点收集并旋干，再在20mL三氟乙酸与二氯甲烷等体积的混合溶剂中搅拌4h,真空抽干后得基于G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。取出1mg样品，加入一次水10mL,超声振荡20分钟后得G3.0代树枝状聚合物PAMAM类脂质体。
图6为本实施例制备的产物的核磁谱图，各峰归属如图所示。化学位移为8.0ppm处的吸收峰属于click反应形成1,2,3-三氮唑环上的氢。化学位移为5.1ppm处的吸收峰属于与1,2,3-三氮唑环上的碳原子相邻的亚甲基上的氢。化学位移为4.3ppm处的吸收峰属于与1,2,3-三氮唑环上的氮原子相邻的亚甲基上的氢。证明了click反应的成功进行。
实施例27：
细胞抑制实验：
为了考察本发明所述的类脂质体生物相容性。以HEK293细胞为模型，采用细胞毒性试验，检测材料作用于细胞后细胞的存活率情况。
具体操作步骤如下：
1）、收集对数期HEK293细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内（每孔104个，100μl）；
2）、用培养基稀释类脂质体浓度，制成一系列，共5~8个浓度梯度的溶液样，每孔加入100μL，每种浓度6个复孔；
3）、37°C，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24小时；
4）、24h后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时；
5）、终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，低速振荡10分钟，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值。
如附图8所示，以聚乙烯亚胺（25K）为阳性对照，单纯的材料具有良好的生物相容性。
实施例28：
绿色荧光蛋白质粒DNA转染实验：
为了考察本发明所述的类脂质体转染DNA的能力，以HEK293细胞为模型，检测绿色荧光蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下：
1）、收集对数期HEK293细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内（每孔104个，100μl）；
2）、用培养基稀释类脂质体浓度并与绿色荧光蛋白质粒DNA复合，制成一系列，共5~8个浓度梯度的溶液样，室温复合半小时后，每孔加入100μL，每种浓度6个复孔；
3）、37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48小时；
4）、终止培养，在倒置显微镜下利用475nm蓝光激发观察转染情况并拍照。
如附图9和图10所示，该类脂质体表现出较好的基因转染能力。
图7为本实施例制备的产品的分子粒径及其分布图，可见形成的脂质体大小在150nm左右，分布较窄。
图8为本发明实施例22产物DYY-G2.0与实施例26产物DYY-G3.0对HEK293细胞的毒性考察结果图，以PEI25K为阳性对照；
图9为本发明实施例22产物DYY-G2.0与实施例26产物DYY-G3.0提供的绿色荧光蛋白质粒DNA对HEK细胞的转染测试。图片为材料与质粒DNA质量比为50:1的情况。
图10为本发明实施例28提供的DYY-G3.0进行绿色荧光蛋白质粒DNA对HEK293细胞的转染测试电镜图。
以上对本发明提供的一种阳离子类脂质体及其制备方法进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种式（I）所示的阳离子类脂质体：
其中，R为式II、III、IV、V所示的取代基：
R'为C6~C40的烷基、C6~C40的取代烷基，胆固醇基或胆酸基。
2.根据权利要求1所述的阳离子类脂质体，其特征在于，所述取代烷基选自氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽和叶酸中的一种或多种取代的烷基。
3.根据权利要去1所述的阳离子类脂质体，其特征在于，所述R'为豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸或油酸失去氢离子得到的取代基。
4.一种权利要求1所述的阳离子类脂质体的制备方法，其特征在于，包括：
a）提供异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐，并将其与丙炔醇在有机溶剂中混合，在催化剂作用下发生缩合反应，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯；
b）将步骤a）得到的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯与小分子疏水化合物混合在有机溶剂中，在催化剂和缩合剂的作用下，发生缩合反应，得到2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物；所述小分子疏水化合物选自C6~C40的羧酸、C6~C40的取代羧酸，羧基化胆固醇或胆酸；
c）提供叠氮化叔丁氧羰基保护PAMAM，与步骤b）提供的2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰的小分子疏水化合物混合在有机溶剂中，在五水硫酸铜和抗坏血酸钠的作用下发生点击化学反应，在三氟乙酸中脱去保护，得到式I所示的阳离子类脂质体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述丙炔醇与所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐按摩尔比为1:1.1~2；所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯与所述小分子疏水化合物按摩尔比为1：2~2.5；所述2,2-二羟甲基丙酸丙炔醇酯修饰疏水分子与所述叠氮化PAMAM按摩尔比为1:1~2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a）中的提供异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐具体为：
将2,2-二羟甲基丙酸与2,2-二甲氧基丙烷混合在有机溶剂中，在4-甲苯磺酸的作用下发生反应，得到异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸；
将所述异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸与缩合剂二环己基碳二亚胺混合在有机溶剂中，发生缩合反应，得到异亚丙基-2,2-二甲氧基丙酸酐。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c）中的叠氮化PAMAM通过以下方法制备，包括步骤：
将NaN3,溴丙胺溴化氢盐溶于水，在碱性条件下发生迈克尔加成反应，并经过提纯干燥工序，得到G0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和G0代PAMAM溶解于有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G0.5代PAMAM；将乙二胺与所述G0.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G1.0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和所述G 1.0代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G 1.5代PAMAM；将乙二胺与所述G1.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G2.0代PAMAM；
或将丙烯酸甲酯和所述G2.0代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行迈克尔加成反应，反应产物经过提纯后得到G2.5代PAMAM；将乙二胺与所述G2.5代PAMAM溶解在有机溶剂中，进行胺解反应，反应产物经过提纯、得到G3.0代PAMAM；
将得到的G1.0代，G2.0代与G3.0代的PAMAM分别与二碳酸二叔丁酯进行反应，经过提纯后，得到叔丁氧羰基保护的PAMAM。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性小分子化合物可以为各种脂肪酸或胆酸，脱氧胆酸等。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述叔丁氧羰基保护的叠氮化PAMAM选自G0代、第G1.0代，G2.0代或G3.0代树枝状聚合物PAMAM。
10.根据权利要求3、5或6中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂分别选自丙酮、甲醇、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺中的一种。
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