CN102942559A

CN102942559A - 一种柔性醚氧链嘧啶衍生物、其制备方法及其用途

Info

Publication number: CN102942559A
Application number: CN2012104206610A
Authority: CN
Inventors: 吴杰颖; 余道辉; 田玉鹏; 李胜利; 张琼
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2032-10-29
Also published as: CN102942559B

Abstract

本发明公开了一种柔性醚氧链嘧啶衍生物、其制备方法及其用途，其中柔性醚氧链嘧啶衍生物的结构式为：

Description

一种柔性醚氧链嘧啶衍生物、其制备方法及其用途

一、技术领域

本发明涉及一种柔性醚氧链嘧啶衍生物、其制备方法及其用途，本发明柔性醚氧链嘧啶衍生物为双光子荧光材料，具有生物相容性、低毒性，应用于活体细胞的双光子显微成像。

二、背景技术

过去，光化学创造了人类，而今天，光化学正在帮助我们缔造美好的新生活，其中以双光子吸收为特征的非线性光学近年来发展迅猛，成为现代光化学中具有旺盛生命力的新领域。当前双光子荧光材料已经初步应用于各个不同领域，其中双光子荧光成像是当前双光子吸收技术最实用化的领域之一，与单光子荧光成像相比具有明显的优势：用于双光子激发光的波长大都处在近红外(或红外)区域，这种低能量的光对生物组织损伤小，且穿透介质能力强，双光子诱导荧光只在焦点很小的体积内发生，使其成像具有极高的分辨率。以上优异的性能使双光子显微成像技术已广泛用于活体细胞、生物组织的长时间动态三维成像。

申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：

1、http://scholar.google.com网检索结果：（2012/9/14）

2、中国期刊网检索结果：

检索方式一：

篇名-柔性醚氧链嘧啶衍生物无相关文献。

篇名-双光子荧光生物显影材料无相关文献。

检索方式二：

全文-柔性醚氧链嘧啶衍生物无相关文献。

全文-双光子荧光生物显影材料无相关文献。

三、发明内容

本发明旨在提供一种柔性醚氧链嘧啶衍生物、其制备方法及其用途，所要解决的技术问题是遴选合适的化学结构使其具有双光子活性以及生物相容性，从而能够安全地用于活体细胞显微成像。

本发明柔性醚氧链嘧啶衍生物，简写为TM，其结构式为：

本发明柔性醚氧链嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于按以下步骤操作：

1、中间体Z1的制备：

向反应器中加入乙二醇单甲醚和二氯甲烷，搅拌溶解，加入NaOH溶液，再于搅拌下滴加对甲基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，在催化剂4-丁基溴化铵的作用下，常温搅拌反应20-24小时，反应结束后向反应液中加入水分液萃取，再经无水硫酸镁干燥、过滤以及浓缩后得到浅黄色油状物即为中间体Z1；对甲基苯磺酰氯、乙二醇单甲醚和氢氧化钠的物质的量之比为1：1-1.2：2.3-2.6，催化剂4-丁基溴化铵的添加量为乙二醇单甲醚质量的的3-5%；

2、中间体Z2的制备：

将氢化钠加入乙腈中，然后滴加N,N-二羟乙基苯胺的乙腈溶液，常温搅拌0.5-1h后滴加中间体Z1，滴加完成后升温，回流搅拌20-24小时，反应结束后过滤，滤液减压浓缩后柱层析分离得到黄色油状物即为中间体Z2；N,N-二羟乙基苯胺与Z1的物质的量比为1:2.5-3，氢化钠与Z1的物质的量之比为1：1-1.2。

3、中间体Z3的制备：

向反应器中加入DMF，在冰盐浴的条件下滴加三氯氧磷，形成白色冻盐，将中间体Z2溶解于氯仿中并通过恒压滴液漏斗滴加至反应器中，滴加完后升温，回流反应12-15小时，反应结束后除去溶剂，再将反应液倒入冰水中，调pH值7-8，依次通过二氯甲烷萃取、无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩以及柱层析分离后得到黄色油状物即为中间体Z3；Z2与三氯氧磷的物质的量比为1：6-6.5；

4、中间体Z4的制备：

将碘化亚铜和邻菲啰啉加入反应器中，加入DMF搅拌溶解，然后加入叔丁醇钾，通入氮气保护，常温搅拌下依次加入咪唑和2-碘-4，6-二甲基嘧啶，以18-冠-6为相转移催化剂，升温至120-150℃反应2-3小时，反应结束后向反应液中加入二氯甲烷，再加水萃取、无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩以及柱层析分离后得到白色晶体即为中间体Z4；2-碘-4，6-二甲基嘧啶与咪唑物质的量比为1：9-11，相转移催化剂18-冠-6的质量为2-碘-4，6-二甲基嘧啶质量的3-5%，碘化亚铜与2-碘-4，6-二甲基嘧啶的物质的量之比为1：1.8-2.2，邻菲啰啉与2-碘-4，6-二甲基嘧啶的物质的量之比为1：1.2-1.4，叔丁醇钾与2-碘-4，6-二甲基嘧啶的物质的量之比为4-6：1。

5、目标产物TM的制备：

称取叔丁醇钾置于研钵中，在加热条件下研成粉末，然后向研钵中加入中间体Z4和中间体Z3，在红外灯下研磨5-8分钟至丝状粘稠物后用CH₂Cl₂溶解，加水萃取、无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩以及柱层析分离后得到红色油状物即为目标产物柔性醚氧链嘧啶衍生物；Z4与Z3物质的量比为1：4-5，Z4与叔丁醇钾的物质的量之比为1：5-7。

本发明合成路线如下：

本发明柔性醚氧链嘧啶衍生物的用途，其特征在于：在活体细胞显影中作为荧光材料的应用。

本发明以生物相容性好、反应活性高的嘧啶环作为主体，修饰上具有生物活性的咪唑基团和带有共轭体系的多醚链，以提高其双光子活性和生物相容性，简洁高效地合成了一种D-π-A-π-D型的柔性醚氧链嘧啶类衍生物(TM)。

本发明柔性醚氧链嘧啶类衍生物在840nm左右具有较大的双光子吸收截面，较强的双光子激发荧光和良好的细胞亲和性，且能够安全地用于活体细胞显微成像，使之在生命科学研究领域具有广阔的应用前景。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明合成的目标分子是一类具有活体细胞显影功能的双光子荧光材料，在长波处具有较大的双光子吸收截面(图1)，同时具有激发能量低、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，且在不同溶剂中都具有较长的荧光寿命(图2)，具有明显的应用价值。

2、本发明产物具有很好的生物相容性和细胞通透性，双光子显微成像实验表明，该化合物能够穿过细胞膜，进入细胞，均匀着色细胞质(图3)。

3、本发明引入的多条柔性醚氧链既能提高分子的脂溶性，又能提高目标物的生物相容性，同时多醚链类似冠醚结构，能络合金属离子；咪唑环结构在生物分子中广泛存在，又具有不同的配位模式，被质子化或取代时可以形成带正电荷的咪唑盐，从而使目标分子在作为生物体内的DNA探针和识别金属离子的传感器方面具有潜在的应用价值。

4、本发明以低毒价廉的对甲基苯磺酰氯代替甲基磺酰氯，同时改进反应物配比，高产率合成了中间体Z2；先合成中间体Z4，再通过固相研磨的绿色合成方法与中间体Z3反应，避免了高温下多醚链的断裂。

四、附图说明

图1是TM在THF中的双光子吸收截面。从图中可以看出，当激发波长为840nm时，所对应的最大双光子吸收截面为3357GM。

图2是TM在不同溶剂中的荧光寿命衰减曲线和拟合结果。从图中可以看出，随着溶剂极性的增加，TM的荧光寿命呈现递增的趋势。

图3是TM着色的人体肝癌HepG2细胞的双光子激发荧光显微照片，其中(a)双光子作用图，(b)明场作用图，(c)叠加图。从图中可以看出，化合物TM可以穿过细胞膜，进入细胞，均匀地着色细胞质，而对细胞核不具有着色作用。

五、具体实施方式

1、中间体Z1的制备：

在500mL的圆底烧瓶中，先加入溶解于二氯甲烷中的12.30g（0.16mol）乙二醇单甲醚与0.369g 4-丁基溴化铵，在不断搅拌的条件下加入23wt%的氢氧化钠水溶液65.00g，再将对甲基苯磺酰氯28.60g（0.15mol）溶于二氯甲烷中，缓慢滴加到上述溶液中，常温搅拌下反应24小时，用TLC跟踪反应，反应结束后，将反应液用水萃取3遍，无水硫酸镁干燥，静置，抽滤，浓缩，得到浅黄色油状物即为中间体Z132.78g，产率95%。¹H-NMR:(400MHz,CD₃COCD₃),δ(ppm):3.203(s,3H),3.472~3.495(t,J=4.6Hz,2H),4.064~4.087(t,J=4.6Hz,2H),7.701~7.722(d,J=8.4Hz,2H),7.266~7.287(d,J=8.4Hz,2H),2.357(s,3H)。

2、中间体Z2的制备：

在250mL的圆底烧瓶中，先将1.20g（50mmol）的氢化钠加入乙腈中，然后将3.62g（20mmol）溶解在乙腈中的N,N-二羟乙基苯胺滴加到上述烧瓶中，常温下搅拌0.5小时，再逐滴滴加11.51g（50mmol）中间体Z1，滴加完毕后升温至85°C回流搅拌24h，TLC跟踪，反应完全后，将反应混合液抽滤，滤液减压浓缩，柱层析分离，展开剂选用体积比石油醚：乙酸乙酯=6：1，得到黄色油状物即为中间体Z24.80g，产率80%。¹H-NMR:(400MHz,CD₃COCD₃),δ(ppm):3.319(s,6H),3.575~3.601(t,J=5.2Hz,8H),3.491~3.514(t,J=4.6Hz,4H),3.629~3.659(t,J=6Hz,4H),6.741~6.762(d,J=8.4Hz,2H),7.163~7.202(t,J=8.0Hz,2H),6.613~6.649(t,J=7.2Hz,1H)。

3、中间体Z3的制备：

在100mL的圆底烧瓶中加入0.73g（10mmol）DMF，放在用氯化钠制作的冰盐浴中冷却到0℃以下，缓慢滴加1.84g（12mmol）三氯氧磷，形成白色冻盐后，把溶解在氯仿中的0.60g（2mmol）中间体Z2用恒压滴液漏斗滴加到上述做好的冻盐中，滴加完毕升温至65°C回流反应15小时，用TLC(体积比石油醚：乙酸乙酯=8：1)跟踪反应，反应完全后蒸出溶剂，将反应液倒入冰水中，调pH至8，再用二氯甲烷萃取4遍，合并有机相，用无水硫酸镁干燥过夜，静置，抽滤，浓缩，拌硅胶进行柱层析，展开剂选用体积比乙酸乙酯：石油醚=1：4，得到黄色油状物即为中间体Z30.55g，产率85%。IR(KBr,cm^-1)selected bands:3493(w),2876(s),2733(w),1669(s),1596(s),1556(s),1525(s),1454(s),1436(s),1401(s),1353(s),1316(s),1283(m),1239(s),1170(s),1112(s),1027(s),1001(m),818(s),730(m),711(w),608(w),512(m).¹H-NMR:(400MHz,CD₃COCD₃),δ(ppm):3.296(s,6H),3.698~3.716(t,J=3.6Hz,8H),3.478~3.502(q,J=3.8Hz,4H),3.579~3.603(q,J=3.8Hz,4H),6.871~6.894(d,J=9.2Hz,2H),7.693~7.715(d,J=8.4Hz,2H),9.724(s,1H)。

4、中间体Z4的制备：

先称取0.19g(1.00mmol)碘化亚铜和0.30g(1.50mmol)邻菲啰啉置于100mL三颈圆底烧瓶中，用5mL DMF溶解，再称取1.12g(10mmol)叔丁醇钾，快速加入到上述烧瓶中，并通入氮气保护，常温下搅拌10分钟，加入1.36g（20mmol）咪唑，搅拌，然后加入0.46g（2mmol）2-碘-4，6-二甲基嘧啶，最后快速加入2-碘-4，6-二甲基嘧啶质量3%的相转移催化剂18-冠-6，升温至150°C，通过TCL跟踪，反应完全，用二氯甲烷溶解反应物，并用水萃取3遍，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩溶剂进行柱层析，洗脱剂用体积比乙酸乙酯：石油醚=1：2，2h后得到白色晶体即为中间体Z40.20g，产率60%。¹H-NMR:(400MHz,CD₃COCD₃),δ(ppm):8.523(s,1H),7.185(s,1H),7.920(s,1H),7.088(s,1H),2.515(s,6H)。

5、目标分子TM的制备：

采取固相研磨的方法，称量0.67g(6mmol)叔丁醇钾放置于一个干燥的研钵中，在加热条件下研成粉末状，把0.17g(1mmol)中间体Z4和1.30g(4mmol)中间体Z3一起加入到上述盛有叔丁醇钾的研磨中，在红外灯下快速研磨，立刻变为红褐色，继续研磨5分钟，至呈丝状粘稠物质，用CH₂Cl₂溶解，用水萃取3遍，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩溶剂后进行柱层析，展开剂可以先选用乙酸乙酯，再加入体积比为3％的乙醇，得到红色油状物即为目标产物TM 0.51g，产率60%。IR(KBr,cm^-1)selected bands:3425(w),3074(m),3037(s),2922(s),2622(w),1602(s),1568(s),1519(s),1468(s),1424(s),1376(s),1322(s),1235(s),1183(s),1109(s),1023(s),978(s),889(s),836(s),810(s),750(m),724(w),685(m),655(m),565(w),521(s).¹H-NMR:(400MHz,CD₃COCD₃),δ(ppm):3.314(s,12H),3.510~3.520(d,J=4Hz,8H),3.598~3.608(d,J=4Hz,8H),3.692(s,16H),6.835~6.855(d,J=8Hz,4H),6.983~7.023(d,J=16Hz,2H),7.268(s,1H),7.583~7.603(d,J=8Hz,4H),8.041~8.081(d,J=16Hz,2H),7.117(s,1H),8.112(s,1H)，8.731(s,1H)。

¹³C-NMR(CD₃COCD₃,100MHz),δ(ppm):51.756,58.945,69.275,71.237,72.730,112.607,114.143,117.646,120.699，124.193,130.522，130.795,136.891,139.057，150.264,155.286,165.979。MS(ESI),m/z(%):789.45([M+H]⁺,46),811.43([M+Na]⁺,75)；MALDI-TOF,m/z(%):789.29([M+H]⁺，100)。

6、用于活体细胞显影的过程

首先，把肝癌HepG2细胞接种在激光共聚焦培养皿上，每个孔中接种1×10⁴个细胞，24小时后细胞达到30%－50%富集（confluence）。对肝癌细胞显影来说，使用化合物TM的溶液(先配制成1.0×10^-3mol/L的DMSO溶液，再稀释成20-40μM的溶液)进行培养，并置于含5%CO₂和95%氧气的培养箱中维持温度37°C进行细胞培养1小时。然后用PBS（PBS为磷酸缓冲液，pH=7.2,Gibco试剂公司生产）洗涤肝癌细胞6次(2×200μL)之后，向每个孔中注入1.5mL的PBS。最后，把着色的肝癌细胞置于100倍物镜的Zeiss 710生物成像系统中用于活细胞成像测试（双光子吸收激发波长840nm，发射波长为500～600nm，scal bar=50μm）。

Claims

1.一种柔性醚氧链嘧啶衍生物，其特征在于其结构式为：

2.一种权利要求1所述的柔性醚氧链嘧啶衍生物的制备方法，包括中间体的制备、目标产物的合成以及分离、洗涤、纯化和干燥各单元过程，其特征在于按以下步骤操作：

a、向反应器中加入乙二醇单甲醚，搅拌溶解于二氯甲烷中，加入NaOH溶液，再向反应器中滴加对甲基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，在催化剂4-丁基溴化铵的作用下常温反应20-24小时，得到中间体Z1，对甲基苯磺酰氯、乙二醇单甲醚和氢氧化钠的物质的量之比为1：1-1.2：2.3-2.6，催化剂4-丁基溴化铵的添加量为乙二醇单甲醚的质量的3-5%；

b、将氢化钠加入乙腈中，依次滴加N,N-羟乙基苯胺的乙腈溶液和中间体Z1，回流反应20-24小时，得到中间体Z2，N,N-二羟乙基苯胺与Z1的物质的量之比为1：2.5-3；

c、向反应器中加入DMF，在冰盐浴的条件下滴加三氯氧磷，将中间体Z2溶解于氯仿中并滴加至反应器中，回流反应12-15小时，得到中间体Z3；Z2与三氯氧磷的物质的量之比为1：6-6.5；

d、向反应器中加入碘化亚铜、邻菲啰啉和DMF，搅拌溶解后加入叔丁醇钾，通入氮气保护，常温搅拌下依次加入咪唑和2-碘-4，6-二甲基嘧啶，在相转移催化剂18-冠-6的存在下于120-150℃反应2-3小时，得到中间体Z4；2-碘-4，6-二甲基嘧啶与咪唑的物质的量之比为1：10-12，相转移催化剂18-冠-6的质量为2-碘-4，6-二甲基嘧啶质量的3-5%；

e、将叔丁醇钾置于研钵中研成粉末，加入中间体Z4和中间体Z3，在红外灯下研磨5-8分钟，得到目标产物柔性醚氧链嘧啶衍生物；Z4与Z3的物质的量之比为1：4-5。

3.一种权利要求1所述的柔性醚氧链嘧啶衍生物的用途，其特征在于：在活体细胞显影中作为荧光材料的应用。