CN102093885B

CN102093885B - 吲哚类钙离子荧光探针及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102093885B
Application number: CN201110051293.2A
Authority: CN
Inventors: 雷磊; 第五振军; 成昭; 李剑利; 史真
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-03-04
Also published as: CN102093885A

Abstract

本发明公开了结构式（I）所示吲哚素类钙离子指示剂，其中 R为H或甲基；R1至R7独立地选自H、卤素或甲基。本发明在发色团结构中增加了双键，共轭效应增大，激发波长红移，处于或接近可见光区，使用过程中减少了紫外光对细胞的损害，有利于观察和检测。

Description

吲哚类钙离子荧光探针及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于钙离子荧光指示剂的合成技术领域，特别涉及具有高量子产率及荧光信号的钙离子荧光指示剂的合成与应用。

背景技术

钙是生命体内重要的金属元素之一，调节生命体一系列重要的生理活动，如细胞的胞吞、胞饮、神经递质释放、DNA合成、细胞分裂、乃至细胞死亡等细胞的代谢与功能的调节作用，细胞钙几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程。钙离子作为细胞内的第二信使还参与生物信号的跨膜传递，介导细胞对外界刺激的应答反应等。

细胞内钙离子的分布是极不均匀的，细胞内外之间以及胞内各个细胞器与胞质之间存在着较大的浓度梯度，在胞质与胞内钙库、胞质与胞外Ca²⁺之间均存在有大的浓度梯度，相差约3~4个数量级，正是由于其分布的不均一性及其时空变化构成了细胞钙离子信号的基础。因此，实时、准确地测定静息态和激发态细胞内Ca²⁺的浓度、时空分布，研究其与细胞功能的关系具有十分重要的意义。

理想的胞内Ca²⁺测定方法须能够在亚细胞水平无损伤地、直接、迅速、实时地提供细胞内任意部位的Ca²⁺的动态变化信息。细胞内游离钙Ca²⁺浓度测定在技术上有着如下的要求：(1)对活细胞无损伤或生理条件下研究细胞钙，不干扰细胞内正常的生理、生化过程；(2)灵敏度高，检出限应达10^-7mol/L；(3)选择性好，由于细胞内其它一些无机离子如Mg²⁺、Na⁺、K⁺和Cl^-等的浓度均在10^-3 mol/L水平，故要求测定方法特异性强；(4)响应速度快，为了测定钙浓度的变化，要求测定方法对Ca²⁺浓度变化的响应快于细胞内Ca²⁺信号引起的相关生理和生化反应；(5)时空分辨率高，能实时、原位地提供胞内各细胞区域钙信号聚散涨落的彼此独立又相互关联的信息。人们常常要根据各种方法的特点，按照所进行实验的具体要求而选择不同的测定方法，如生物发光蛋白法、有机显色剂法、离子传感器法、微电极法、核磁共振法，荧光探针法等。荧光探针法是目前应用最为广泛且非常有效的一种途径，此技术的核心是高效选择性分子探针与细胞内钙离子螯合，并在激发光下发出荧光，来显示钙离子浓度。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型吲哚素类钙离子探针的甲酯形式作为细胞钙识别的探针，该探针对钙离子具有较强的选择识别性，且激发波长红移至可见光区，减少对于细胞的损伤，便于活细胞检测。

本发明提供的吲哚素类钙离子指示剂甲酯形式具有以下结构：

其合成路线如下：

Figure 2011100512932100002DEST_PATH_IMAGE002

Figure 2011100512932100002DEST_PATH_IMAGE003

本发明吲哚类钙离子荧光指示剂可很好的应用于胞内游离钙离子浓度测定，其综合性能优异，其优点与积极效果为：（1）当吲哚环和类BAPTA醛之间由双键连接时，对于BAPTA结构的几何构型几乎没有影响，但由于不饱和度增加，改变了整个体系的电子云密度，进一步调节了指示剂与Ca²⁺的亲和能力。（2）经典的吲哚类钙离子荧光探针如：Indo-1，其化学命名为1-[2-氨基-5-(6’’-羧基吲哚-2’’-)苯氧基]-2-(2’-氨基-5’-甲苯氧基) -乙烷- N, N, N’, N’-四乙酸五钾盐。该化合物为黄色结晶，溶于水呈带有粉色荧光的黄色溶液，与钙离子络合形成强荧光络合物，是第二代荧光探针，激发波长在300~400 nm 之间，荧光发射波长在510 nm 左右。将indo-1溶于甲醇中，配制成浓度为1×10^-6的溶液，其紫外吸收在344nm处。本发明的钙离子探针，对钙离子的螯合部分未做大量修改，同样具有对钙离子的螯合能力；发色团部分的结构中由于增加了双键，共轭效应增大，激发波长红移，处于可见光区，为390 nm，减少了紫外光对细胞的损害，有利于观察和检测。

附图说明

图1为本发明合成得到的Ca²⁺荧光指示剂Indo-Ole-M甲酯的液质联用谱图。

具体实施方式

（1）化合物1-(2-氯乙氧基)4-甲基-2-硝基苯(中间产物 b)的合成，合成步骤如下：

在装有回流冷凝管，干燥管的100mL三口烧瓶中加入7.65g（50mmol）4-甲基-2-硝基苯酚，40mL N, N-二甲基甲酰胺，待溶解完全后，搅拌下加入12.4mL (0.15mol) 1-溴-2-氯乙烷，室温搅拌5分钟，加入10.35g (0.1mol) K₂CO₃，升温至120℃反应2h，冷却至室温，加入70mL乙酸乙酯稀释，用水（50mL×3）洗涤，收集有机相，真空蒸除溶剂，抽滤，干燥。粗品用乙醇重结晶，产率96%。m.p. 33～34 oC

核磁¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm)： 7.657 (s, 1H), 7.339 (d, 1H), 6.993 (d, 1H), 4.388-4.332 (t, 2H), 3.848- 3.665 (t, 2H), 2.360 (s, 3H);

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 3420.9, 2930.3, 1626.9, 1530.3, 1357.4, 1258.1, 1157.8, 1030.6, 810.7。

（2）化合物4-甲基-2-(2-(4-甲基-2-硝基苯氧基)乙氧基)-1-硝基苯(中间产物c)的合成，合成步骤如下：

在装有机械搅拌器、回流冷凝管和温度计的三颈瓶中加入21.5g (0.1mol) 中间产物2，18.4g (0.12mol) 4-氯-5-甲基-2-硝基苯酚，100mL N, N-二甲基甲酰胺，搅拌使之溶解。向上述反应液中加入27.6g (0.2mol) K₂CO₃。升温，使温度维持在140~160℃间，搅拌5~6h。待反应结束后，冷至室温，真空浓缩，将残渣分散于水中，抽滤收集形成的固体。粗品经乙醇-水重结晶提纯。产率93.8%。m.p. 148～150 oC

核磁¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm)： 7.785 (d, 1H), 7.640 (s, 1H), 7.370-7.145 (d, 2H), 7.027 (s, 1H), 6.871 (d, 1H), 4.497 (s, 4H), 2.443 (s, 3H), 2.355 (s, 3H);

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 3427.7, 2930.9, 1602.9, 1521.1, 1349.1, 1253.5, 1172.9, 1057.9, 814.6。

（3）化合物2-(2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基-5-甲基苯胺(中间产物d)的合成，合成步骤如下：

Figure 2011100512932100002DEST_PATH_IMAGE006

在装有回流冷凝管和搅拌器的250mL三颈瓶中，加入17g (0.3mol) 还原铁粉和20mL无水乙醇，搅拌下慢慢加入由1.04mL (0.012mol) 浓盐酸和5mL无水乙醇配成的溶液，小火加热煮沸约20min。搅拌下，分批加入16.6g (0.05mol)中间产物c，之后加热回流2-4h。待反应完全后向热混合物中加入氢氧化钾溶液，趁热除去铁粉，并用热无水乙醇洗涤反应瓶和滤饼。合并滤液、洗液，加入6mol/L硫酸，析出硫酸盐，冷却，过滤。固体经空气干燥。将上述制得的硫酸盐溶于60℃热水中，但完全溶解后，冷至40℃，加入饱和氢氧化钠溶液使呈碱性，冷却，抽滤析出的固体。产率92.0%。m.p. 118～120 oC

核磁¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm)： 6.790-6.750 (d, 2H), 6.714 (s, 1H), 6.687 (s, 1H), 6.660-6.640 (d, 2H), 4.351 (s, 4H), 2.355 (s, 3H), 2.255 (s, 3H);

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 3440.9, 2926.2, 1624.7, 1517.9, 1227.2, 1157.3, 801.1, 574.6。

（4）化合物4-甲基-4-甲基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N’, N’-四乙酸甲酯(中间产物e)的合成，合成步骤如下：

Figure 2011100512932100002DEST_PATH_IMAGE007

在装有回流冷凝管的250mL三颈瓶中，加入50mL热乙腈，搅拌下，加入13.20g (0.05mol) 中间产物d，待完全溶解后，加入43.0mL (0.25mol) (iPr)₂NEt，23.5mL (0.25mol)溴乙酸甲酯，将反应液回流24h后，再按1:2补加0.7mL溴乙酸甲酯和2.2mL(iPr)₂NEt。待反应完成后，将反应液冷至40-60℃，倾入50mL乙酸乙酯中，抽滤、洗涤，合并滤液、洗液，真空除去溶剂，加入30mL甲醇，室温搅拌4-6h，抽滤析出的固体。产率77.8%。m.p. 93～95 oC

核磁¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm)：8.024 (s, 1H), 6.803 (d, 1H), 6.763 (s, 1H), 6.732-6.626 (s, 4H), 4.381-4.352 (s, 4H), 4.144 (s, 4H), 4.044 (s, 4H), 3.572-3.562 (s, 12H), 2.331 (s, 3H), 2.265 (s, 3H);

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 2953.9, 1753.3, 1518.19, 1418.2, 1255.1, 1170.7, 1004.5, 795.8, 710.9。

（5）类BAPTA化合物 BAPTA-CH₃-CHO(中间产物f)的合成，合成步骤如下：

Figure 2011100512932100002DEST_PATH_IMAGE008

在装有回流冷凝管、温度计的250mL三颈瓶中，加入50mL DMF，将此反应液冷至5~10℃，于40~45min内滴加9.6mL三氯氧磷，滴加完后，室温搅拌1~2h。反应液再冷至5~10℃，在小烧杯中称取11.2g (0.02mol) 中间产物5，并加入50mL新蒸的DMF，搅拌使其全部溶解，于40~45min内滴加至上述反应液中，滴加完毕后，将反应混合物加热至40~45℃搅拌过夜。待反应完成后，冷至室温，倒入200g冰/水浴中，抽滤收集生成的固体，用水洗涤至pH=4~5。粗品重结晶得BAPTA-CH₃-CHO。产率72.5%。m.p. 108～110 oC

核磁¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm): 10.135 (s, 1H), 7.315 (s, 1H), 6.790 (d, 1H), 6.699 (s, 1H) 6.673 (d, 1H), 6.445 (s, 1H), 4.303-4.290 (m, 4H), 4.256-4.229 (m, 4H), 4.146 (s, 4H), 3.616 (s, 12H), 2.558 (s, 3H), 2.272(s, 3H);

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 3471.6, 2952.2, 2923.2, 1749.4, 1681.5, 1520.5, 1257.9, 1201.5, 1167.6, 1010.5, 711.4。

（6）类BAPTA化合物 BAPTA-Ole-CH₃-CHO(中间产物g)的合成，合成步骤如下：

在装有回流冷凝管和搅拌器的100mL三颈瓶中，加入化合物f（11.5g，0.02mol）与溴化乙醛缩乙二醇三苯基磷（9.5g，0.022mol），并溶于50mL DMF中。搅拌下向上述混合液中分批加入1.2g，0.05molNaH，保持温度90oC回流大约7h，降至室温，将反应液倾倒在100mL冰水中，搅拌至冰块完全溶化后用乙醚萃取混合物，合并有机层，再用饱和食盐水（50mL×3）萃取洗涤有机层至中性。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出乙醚。

向所剩油状物中加入50mLTHF和50mL10%HCl，室温下搅拌两小时后倾倒在100mL冰水中，搅拌至冰块完全溶化后用乙醚萃取混合物，合并有机层，再用饱和食盐水（50mL×3）萃取有机层至中性。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出乙醚。所得油状物用色谱柱分离，洗脱剂为正己烷:乙酸乙酯/65:35。得到淡黄色粉末2.76g，产率20%。

核磁¹HNMR (CDCl₃) δ(ppm):9.667 (s,1H), 7.667 (s,1H), 7.091 (s,1H), 6.841 (s,1H), 6.758 (d,1H), 6.719 (s,1H), 6.575 (s,1H), 6.534 (d,1H), 4.336~4.325 (m,4H), 4.241~4.203 (m,4H), 4.159~4.123 (s,4H), 3.640 (s,12H), 2.551 (s,3H), 2.374 (s,3H).

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 3525.46, 2996.03, 2920.51, 2736.25, 2081.78 1749.91, 1677.83, 1598.45 1554.88, 1416.18, 1259.23, 1200.23, 1167.71, 1010.51, 873.74, 708.76。

（7）Indo-Ole-M荧光指示剂甲酯(产物i)的合成，合成步骤如下：

将化合物g(5 g, 9.3mmol), Witting试剂(4.24 g, 7.4mmol)和碳酸钾(15 g, 0.108 mol)在 DMF (25mL)中混合，加热到90-95 °C。冷至室温搅拌过夜后倾入冰水(100mL)中搅拌至冰块融化。抽滤析出固体，并用乙酸乙酯、水萃取，合并有机相，蒸去溶剂，柱层析(甲苯:乙酸乙酯/3:1)分离得到红色固体4.63 g，产率68%。MS-TOF: 752.08(M+1)。

在氮气保护下将上步所得固体(3 g, 4mmol)与2mL亚磷酸三乙酯(20mL, d 0.969, 1.16 mol)混合，反应升温至120-130 °C搅拌至反应结束(2-3 hr)，减压蒸去亚磷酸三乙酯，真空干燥残余物，柱层析(正己烷:乙酸乙酯/65:35梯度洗脱至65:50)分离得淡黄色粉末2.1g，产率73%

核磁¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm): 10.132 (s, 1H), 8.937 (s, 1H), 8.647 (s, 1H), 8.314-7.626 (d, 3H), 6.847-6.586 (s, 5H), 6.496 (s, 1H) 4.328-4.077 (d, 8H), 3.940-3.881 (d, 6H), 3.738 (s, 3H), 3.617 (s, 12H), 2.344 (s, 3H), 2.171(s, 3H);

红外FT-IR (KBr),υ/cm^-1: 3432.6, 2953.6, 2923.2, 1735.9, 1617.5, 1516.2, 1435.5,1384.5,1256.8, 1207.5, 1169.6, 1010.7, 742.8。

实施例2：

与实施例1类似，不同的是使用邻硝基苯酚代替4-甲基邻硝基苯酚和2-硝基-5-甲基苯酚制备得到如下结构的荧光指示剂。

实施例3：

与实施例1类似，不同的是使用邻硝基苯酚代替4-甲基邻硝基苯酚，2-硝基-5-氟苯酚代替2-硝基-5-甲基苯酚制备得到如下结构的荧光指示剂。

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Claims

1.一种吲哚素类钙离子指示剂的制备方法，其特征在于采取以下步骤：

（1）化合物1-(2-氯乙氧基)-4-甲基-2-硝基苯的合成，合成步骤如下：

Figure 2011100512932100001DEST_PATH_IMAGE001

在装有回流冷凝管，干燥管的100mL三口烧瓶中加入7.65g 4-甲基-2-硝基苯酚，40mL N, N-二甲基甲酰胺，待溶解完全后，搅拌下加入12.4mL 1-溴-2-氯乙烷，室温搅拌5分钟，加入10.35g K₂CO₃，升温至120℃反应2h，冷却至室温，加入70mL乙酸乙酯稀释，用3×50mL水洗涤，收集有机相，真空蒸除溶剂，抽滤，干燥；粗品用乙醇重结晶，产率96%，m.p. 33～34 oC ；

（2）化合物4-甲基-2-(2-(4-甲基-2-硝基苯氧基)乙氧基)-1-硝基苯的合成，合成步骤如下：

Figure 2011100512932100001DEST_PATH_IMAGE002

在装有机械搅拌器、回流冷凝管和温度计的三颈瓶中加入21.5g 1-(2-氯乙氧基)-4-甲基-2-硝基苯，18.4g 4-氯-5-甲基-2-硝基苯酚，100mL N, N-二甲基甲酰胺，搅拌使之溶解；向上述反应液中加入27.6g K₂CO₃；升温，使温度维持在140~160℃间，搅拌5~6h；待反应结束后，冷至室温，真空浓缩，将残渣分散于水中，抽滤收集形成的固体；粗品经乙醇-水重结晶提纯，产率93.8%，m.p. 148～150 oC；

（3）化合物2-(2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基-5-甲基苯胺的合成，合成步骤如下：

在装有回流冷凝管和搅拌器的250mL三颈瓶中，加入17g还原铁粉和20mL无水乙醇，搅拌下慢慢加入由1.04mL浓盐酸和5mL无水乙醇配成的溶液，小火加热煮沸20min；搅拌下，分批加入16.6g 4-甲基-2-(2-(4-甲基-2-硝基苯氧基)乙氧基)-1-硝基苯，之后加热回流2-4h；待反应完全后向热混合物中加入氢氧化钾溶液，趁热除去铁粉，并用热无水乙醇洗涤反应瓶和滤饼；合并滤液、洗液，加入6mol/L硫酸，析出硫酸盐，冷却，过滤，固体经空气干燥；将上述制得的硫酸盐溶于60℃热水中，但完全溶解后，冷至40℃，加入饱和氢氧化钠溶液使呈碱性，冷却，抽滤析出的固体；产率92.0%，m.p. 118～120 oC；

（4）化合物4-甲基-4-甲基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N’, N’-四乙酸甲酯的合成，合成步骤如下：

在装有回流冷凝管的250mL三颈瓶中，加入50mL热乙腈，搅拌下，加入13.20g 2-(2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基-5-甲基苯胺，待完全溶解后，加入43.0mL (iPr)₂NEt，23.5mL溴乙酸甲酯，将反应液回流24h后，再按1:2补加0.7mL溴乙酸甲酯和2.2mL(iPr)₂Net；待反应完成后，将反应液冷至40-60℃，倾入50mL乙酸乙酯中，抽滤、洗涤，合并滤液、洗液，真空除去溶剂，加入30mL甲醇，室温搅拌4-6h，抽滤析出的固体，产率77.8%，m.p. 93～95 oC；

（5）类BAPTA化合物 BAPTA-CH₃-CHO的合成，合成步骤如下：

在装有回流冷凝管、温度计的250mL三颈瓶中，加入50mL DMF，将此反应液冷至5~10℃，于40~45min内滴加9.6mL三氯氧磷，滴加完后，室温搅拌1~2h，反应液再冷至5~10℃，在小烧杯中称取11.2g 4-甲基-4-甲基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N’, N’-四乙酸甲酯，并加入50mL新蒸的DMF，搅拌使其全部溶解，于40~45min内滴加至上述反应液中，滴加完毕后，将反应混合物加热至40~45℃搅拌过夜；待反应完成后，冷至室温，倒入200g冰/水浴中，抽滤收集生成的固体，用水洗涤至pH=4~5，粗品重结晶得BAPTA-CH₃-CHO；产率72.5%，m.p. 108～110 oC；

（6）类BAPTA化合物 BAPTA-Ole-CH₃-CHO的合成，合成步骤如下：

Figure 2011100512932100001DEST_PATH_IMAGE006

在装有回流冷凝管和搅拌器的100mL三颈瓶中，加入11.5g类BAPTA化合物 BAPTA-CH₃-CHO与9.5g溴化乙醛缩乙二醇三苯基磷，并溶于50mL DMF中，搅拌下向上述混合液中分批加入1.2g，0.05mol NaH，保持温度90oC回流7h，降至室温，将反应液倾倒在100mL冰水中，搅拌至冰块完全溶化后用乙醚萃取混合物，合并有机层，再用50mL×3饱和食盐水萃取洗涤有机层至中性，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出乙醚；

向所剩油状物中加入50mLTHF和50mL10%HCl，室温下搅拌两小时后倾倒在100mL冰水中，搅拌至冰块完全溶化后用乙醚萃取混合物，合并有机层，再用50mL×3饱和食盐水萃取有机层至中性；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出乙醚；所得油状物用色谱柱分离，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯为65:35；得到淡黄色粉末2.76g，产率20%；

（7）Indo-Ole-M荧光指示剂甲酯的合成，合成步骤如下：

将5 g类BAPTA化合物 BAPTA-Ole-CH₃-CHO, 4.24 g Witting试剂和15 g碳酸钾在 25mL DMF中混合，加热到90-95 °C；冷至室温搅拌过夜后倾入100mL冰水中搅拌至冰块融化；抽滤析出固体，并用乙酸乙酯、水萃取，合并有机相，蒸去溶剂，柱层析分离得到红色固体4.63 g，柱层析中甲苯:乙酸乙酯为3:1，产率68%；

在氮气保护下将3 g上步所得固体与20mL 2mL亚磷酸三乙酯混合，反应升温至120-130 °C搅拌2-3 hr至反应结束，减压蒸去亚磷酸三乙酯，真空干燥残余物，柱层析分离得淡黄色粉末2.1g，柱层析中正己烷：乙酸乙酯为65:35梯度洗脱至65:50，产率73%。

2.根据权利要求1所述的吲哚素类钙离子指示剂的制备方法，其特征在于：采取权利要求1所述的吲哚素类钙离子指示剂的制备方法，不同的是使用邻硝基苯酚代替4-甲基邻硝基苯酚和2-硝基-5-甲基苯酚制备得到如下结构的荧光指示剂，

Figure 2011100512932100001DEST_PATH_IMAGE008

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3.根据权利要求1所述的吲哚素类钙离子指示剂的制备方法，其特征在于：采取权利要求1所述的吲哚素类钙离子指示剂的制备方法，不同的是使用邻硝基苯酚代替4-甲基邻硝基苯酚，2-硝基-5-氟苯酚代替2-硝基-5-甲基苯酚制备得到如下结构的荧光指示剂，

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