JP6638876B2 - ミトコンドリア膜電位応答性蛍光性化合物 - Google Patents

ミトコンドリア膜電位応答性蛍光性化合物 Download PDF

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Description

本発明は、新規な蛍光性化合物に関し、さらに詳しくは、ミトコンドリア膜電位に応答して局在場所を変化させる蛍光性化合物に関する。また、該化合物を含有する蛍光色素組成物に関する。さらに、上記蛍光色素組成物を用いた、ミトコンドリア膜電位の変化の検出方法や細胞の生死の判別方法に関する。
ミトコンドリアは、細胞のエネルギーを生産する一方でアポトーシスの制御にも関わり、細胞の生死に関わる細胞小器官である。また、ミトコンドリアの機能障害に起因して、糖尿病、脳梗塞、心筋梗塞等の代謝疾患、アルツハイマーやパーキンソン病等の神経変性疾患、癌が発病することが指摘されている。そのため、これら疾患のメカニズム解明や、治療方法の開発のためにも、ミトコンドリアの変化を観察することは重要である。
エネルギー生産に伴って生じるミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリアの内側と外側で電位差を意味し、ミトコンドリア自体の活力を表す。すなわち、膜電位があるときはエネルギーが生産され、ミトコンドリアの活力が高い状態にある。他方、膜電位が消失しているときは、エネルギー生産がされず、活力が低い状態にある。また、ミトコンドリア膜電位は、細胞の健康状態を表し、膜電位があるときは正常細胞で、膜電位がないときは異常細胞とされる。
ミトコンドリア膜電位の変化を検出したり、該変化による細胞の健康状態を判別したりするためには、膜電位に応じて発光挙動を変化させる色素によりミトコンドリアを染色し、その発光挙動の変化を観測する方法がある。従来のミトコンドリア膜電位に応答する色素には、２種類のタイプがある。一つは、ミトコンドリア膜電位に応じて発光強度が変化する型の色素、もう一つは、発光色が変化する型の色素である。しかし、発光強度が変化する型の色素は、ミトコンドリア膜電位による発光強度の変化と、色素自体の光退色による発光強度の変化が同時に起こるため、蛍光強度の変化が膜電位の変化によるものか、色素の光退色によるものかを区別することが難しく、膜電位の変化の検出には適するとはいえない。
また、もう一方の発光色が変化する型の色素においても、膜電位の変化に伴う色素の発光色の変化を観測するために、励起光源及び蛍光検出器は発光色に応じてそれぞれ少なくても２系統用意する必要があり、且つリアルタイムで上記励起光源及び蛍光検出器を調整する必要もあり、装置が高コスト化するとともに、実験操作が極めて煩雑となる。さらに、どちらの型の色素も、溶解度の低さから細胞を染色するには、細胞に対して有害な有機溶媒を用いなければならないという問題もある。
本出願人は、ミトコンドリア膜電位に応じて、局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有している以下の化合物ＢＰを見いだし、細胞の染色に利用できることを既に報告している（非特許文献１）。
ミトコンドリア膜電位に応じて、化合物ＢＰが局在場所をミトコンドリアから核に移す性質は、蛍光強度が変化する訳ではないので、化合物ＢＰ自身の光退色の影響を受けずに膜電位の変化を検出することを可能にする。また、蛍光色の変化もないため、特別な励起光源及び蛍光検出装置を必要とせず、一般的な蛍光顕微鏡による膜電位の変化の検出を可能にした。また、化合物ＢＰは水溶性が高く、細胞にとって有害な有機溶媒を用いなくても細胞の染色を可能にした。そのため、有機溶媒による細胞死が起こらず、２４時間以上にわたる生きた細胞の観察を可能にした。
しかし、化合物ＢＰにおける、吸収（励起）によって化合物に吸収された光子数と蛍光によって放出された光子数との比である量子収率（φ）が０．１４と低く、発光の効率がよいものではなく、高感度で蛍光を検出するためにも発光の効率がよい化合物が必要とされていた。
H. Moritomo, K. Yamada, Y. Kojima, Y. Suzuki, H. Kinoshita, A. Sasaki, S. Mikuni, M. Kinjo, J. Kawamata, Cell Struct. Funct. 39 (2014) 125.
細胞を染色できる色素であって、水溶性を備え、発光の効率が良く、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質がある化合物を提供することを課題とする。
前記課題解決のために鋭意研究の結果、分子の電子雲等がもつ電荷分布の相対的な偏り、すなわち、分極率が低いことを特徴とする特定の化合物が、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有していることを見いだし、本発明を完成するに至った。また、当該化合物は水溶性を示し、発光効率がよいため、細胞の染色のための蛍光色素として有用である。
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
（１）式（１）で表される化合物。
［式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、Ｘは、
（式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。ただし、ナフチレン基（ｉ）は、電子供与性基を有していてもよい。）で表される縮合多環基のいずれかを表す。］
（２）Ｘが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする上記（１）に記載の化合物。
（式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。ただし、ナフチレン基（ｉ）は、電子供与性基を有していてもよい。）
（３）Ｘが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする上記（１）に記載の化合物。
（式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。ただし、ナフチレン基（ｉ−１）は、電子供与性基を有していてもよい。）
（４）カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、スルホネートであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光色素組成物。
（６）上記（１）〜（４）に記載の化合物及び以下の式（２）で表される化合物；
（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、ナフチレン基は電子供与性基を有していてもよい。）
からなる群より選ばれる少なくとも一つを用いることを特徴とする、ミトコンドリア膜電位の変化の検出方法。
（７）化合物（２）が以下の化合物（２−１）
であることを特徴とする、上記（６）に記載のミトコンドリア膜電位の変化の検出方法。
（８）上記（１）〜（４）に記載の化合物及び以下の式（２）で表される化合物；
（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、ナフチレン基は電子供与性基を有していてもよい。）
からなる群より選ばれる少なくとも一つを用いることを特徴とする、細胞の生死を判別する方法。
（９）化合物（２）が以下の化合物（２−１）
であることを特徴とする、上記（８）に記載の細胞の生死を判別する方法。
本発明の化合物は、蛍光性があり、また、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有していることから、ミトコンドリアの膜電位の変化、すなわち、ミトコンドリアの活力の有無を上記化合物の局在場所から判別することができる。また、本発明の化合物は水溶性を示し、細胞に毒性のある有機溶媒を使用する必要がないため、生きた細胞の観察が可能である。また、本発明の化合物は、細胞観察中に蛍光の発光色の変化がないため、単一波長の励起光の照射によって発光する単一波長の蛍光波長を検出すればよく、一般的な蛍光顕微鏡によって簡単に細胞の観察ができる。
ナフタレン誘導体（Ｉ）の１ＨＮＭＲチャート アントラセン誘導体（II）の１ＨＮＭＲチャート ピレン誘導体（III）の１ＨＮＭＲチャート 式（２−１）の化合物の１ＨＮＭＲチャート 紫外−可視吸収スペクトル（実線）、蛍光スペクトル（点線）を表す図である。 ナフタレン誘導体（Ｉ）により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。 アントラセン誘導体（II）により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。 ピレン誘導体（III）により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。 式（２−１）の化合物により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。 比較例２の化合物により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。 比較例３の化合物により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。 比較例４の化合物により染色された膜電位低下前と膜電位低下後のＨｅｋ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像を表す図である。
（化合物）
本発明の化合物は、式（１）で表される化合物である。
式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、Ｘは、
（式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。ただし、ナフチレン基（ｉ）は、電子供与性基を有していてもよい。）で表される縮合多環基のいずれかを表す。
上記Ｘの縮合多環基の中でも、好ましくは、
（式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。ただし、ナフチレン基（ｉ）は、電子供与性基を有していてもよい。）で表される縮合多環基であり、さらに好ましくは、
（式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。ただし、ナフチレン基（ｉ−１）は、電子供与性基を有していてもよい。）で表される縮合多環基である。
式（１）における炭素数１〜１０のアルキル基とは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の直鎖状または分岐状のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等が挙げられる。
上記「置換基を有していてもよい」の置換基としては、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリール基等が挙げられる。
ナフチレン基が有していてもよい電子供与性基としては、芳香環に結合して電子を供与する性質を有する基であれば特に制限はなく、例えば、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨ２、−ＮＲ２ ２（Ｒ２は、Ｒ１と同じ定義である）、アミド、−ＯＣＯＲ３（Ｒ３は、Ｒ１と同じ定義である）、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチルオ基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基）、フェニル基および共役アルケニルが挙げられるが、これらに限定されない。
式（１）で表される化合物は、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
本発明の式（１）で表される化合物は、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所を変化させる化合物であって、且つ、励起光を照射すると発光する蛍光性化合物である。上記局在場所に関して、具体的には、ミトコンドリアがエネルギー生産をして膜電位を有するとき、本発明の式（１）で表される化合物はミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアがエネルギー生産を停止して膜電位を消失したとき、本発明の式（１）で表される化合物は核に局在する。
（化合物の合成）
本発明の式（１）で表される化合物は、特に制限されるものではないが、例えば、以下に示すように、縮合多環を有するハロゲン化合物（２）とピリジン環を有する有機ホウ素化合物（３）とをパラジウム触媒及び塩基の存在下反応させる、鈴木−宮浦カップリング反応（工程Ｉ）によって連結し、Ｎ−アルキル化剤（Ｒ１Ｚ）により化合物（４）のピリジンの窒素をアルキル化すること（工程II）により式（１）の化合物を合成することができる。
（式中、Ｘ、Ｚ、Ｒ１は、前記式（１）におけるＸ、Ｚ、Ｒ１と同じ定義である。Ｙ１、Ｙ２は、同一でも異なっていてもよく、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子から選択されるいずれかのハロゲン原子を表す。Ｐ１、Ｐ２は、同一でも異なっていてもよく、水酸基、アルキル基、アルコキシ基等を表す。）
上記ハロゲン化物（２）は、市販のハロゲン化物を用いることができる。例えば、上記市販のハロゲン化物としては、１，３−ジブロモナフタレン、１，５−ジブロモナフタレン、２，７−ジブロモナフタレン、２，６−ジブロモナフタレン、２，３−ジブロモナフタレン、２，６−ジブロモアントラセン、１，５−ジブロモアントラセン、１，８−ジブロモアントラセン、９，１０−ジブロモアントラセン、１，６−ジブロモピレン、２，７−ジブロモピレン等を挙げることができる。
また、上記ハロゲン化物（２）は、有機合成手法により合成することができる。例えば、市販のナフタレン、アントラセン、ピレン、テトラセン、フェナントレン、ベンゾ［ａ］フェナントレンに塩素（Ｃｌ２）、臭素（Ｂｒ２）、ヨウ素（Ｉ２）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）等を作用させて、ハロゲン化物（２）を合成することができる。
上記ハロゲン化物（２）の、Ｘがナフチレン基である場合、該ナフチレン基は１つ又は２つ以上の電子供与性基を有していてもよいが、電子供与性基の導入は公知の合成方法によって行うことができる。また、ナフチレン部分に電子供与性基及び／又は電子吸引性基を有する市販のハロゲン化物を用いてもよい。
上記有機ホウ素化合物（３）は、市販の有機ホウ素化合物を用いることができる。例えば、上記市販の有機ホウ素化合物としては、４−ピリジルボロン酸、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン等を挙げることができる。
前記パラジウム触媒は、鈴木−宮浦カップリング反応に用いられるパラジウム触媒であれば特に限定されず、例えば酢酸パラジウム（II）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）またはトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II)ジクロリド、１，１′−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（II）ジクロリド−ジクロロメタン錯体、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（０）等の公知のパラジウム錯体が挙げられ、好ましくは、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II)ジクロリドである。効率よく反応が進行するために、例えばトリフェニルホスフィン、トリ−ｏ−トリルホスフィン、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン、トリス（ｏ−メトキフェニル）ホスフィン、ジブチルブチルホスホネート等リン配位子、トリフェニルヒ素等のヒ素配位子等を適宜添加してもよい。
前記塩基は、鈴木−宮浦カップリング反応に用いられる塩基であれば特に限定されず、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ピリジン等のアミン類；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等の無機塩基類が挙げられる。
前記アルキル化剤は、通常窒素のアルキル化に用いられるＮ−アルキル化剤であれば特に限定されず、例えば、ヨードメタン、ヨードエタン、１−ヨードプロパン、１−ヨードブタン、１−ヨード−３−メチルプロパン、２−ヨードブタン、２−ヨード−２−メチルプロパン、１−ヨードペンタン、１−ヨード−３−メチルブタン、１−ヨードへキサン、１−ヨードヘプタン、１−ヨードオクタン、１−ヨードノナン、１−ヨードデカン、ジメチル硫酸、トリフルオロメタンスルホン酸メチル等が挙げられる。これらのＮ−アルキル化剤は市販品を用いることができる。
工程Ｉ、IIの反応は、それぞれ溶媒中で行うことができるが、溶媒は反応温度や反応物等によって適宜選択される。また、工程Ｉ、IIの反応の反応温度は、用いる溶媒の沸点等の条件によって適宜選択される。工程Ｉ、IIの反応で溶媒を用いる場合、得られた反応溶液を必要に応じて濃縮した後、残渣をそのまま次の反応に使用してもよく、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出処理及び／又は晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製が挙げられる。
（蛍光色素組成物）
式（１）で表される化合物は、蛍光性を示すため、蛍光色素として用いることができる。式（１）で表される化合物は、蛍光色素としてそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して蛍光色素組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤等の添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤等適宜の形態の組成物として提供される。
本発明の蛍光色素組成物は、上記組成物に含まれる式（１）の化合物のミトコンドリア膜電位に応じて局在場所を変化させる性質を利用して、細胞のミトコンドリア膜電位の有無、すなわち、ミトコンドリアの活力の有無を判別できる。ここで、ミトコンドリアが活力を有するとは、ミトコンドリアが好気呼吸によってエネルギー生産している状態を指し、活力が無いとは、ミトコンドリアの外膜が破壊されること等によってエネルギー生産が停止している状態を指す。ミトコンドリアの活力の有無は、以下の機構で判別される。
膜電位を有するミトコンドリアが存在する細胞、すなわち、エネルギー生産されている細胞に本発明の蛍光色素組成物を添加すると、ミトコンドリア膜電位に応答して、ミトコンドリアと蛍光色素組成物に含まれる式（１）の化合物とが相互作用して、ミトコンドリアに式（１）の化合物が局在する。細胞に所定の波長の励起光が照射されると、ミトコンドリアに存在する式（１）で表される化合物より所定の波長の蛍光が発せられる。以上のように、ミトコンドリアから蛍光が検出されることによって、ミトコンドリアは活力を有していると判断される。
他方、膜電位が脱分極したミトコンドリアが存在する細胞、すなわち、エネルギー生産が停止した細胞に本発明の蛍光色素組成物を添加すると、ミトコンドリア膜電位は脱分極しているためミトコンドリアに式（１）の化合物は局在せず、上記（１）の化合物は細胞の核に局在するようになる。細胞に所定の波長の励起光を照射すると、核に存在する式（１）で表される化合物より所定の波長の蛍光が発せられる。以上のように、核から蛍光が検出されることによって、ミトコンドリアは活力が無いと判断される。
このように、本発明の蛍光色素組成物に含まれる式（１）で表される化合物はミトコンドリア膜電位の変化に応答して細胞中で局在場所を変化させ、該化合物の蛍光が検出される場所を確認することによってミトコンドリアの活力の有無を判別できる。本発明におけるミトコンドリア膜電位の変化の検出とは、ミトコンドリアの活力の有無を判別することである。
ミトコンドリア膜電位の変化から、ミトコンドリアの活力の有無、すなわち、細胞のエネルギー生産がされているか否かがわかる。したがって、本発明の蛍光色素組成物による細胞の観察によって、正常な細胞か、アポトーシスや代謝ストレス等により脱分極したミトコンドリアを有する細胞かの判別、すなわち、細胞の生死の判別ができる。
上記励起光としては、式（１）で表される化合物が吸収できる波長であれば特に制限は無く、紫外領域、可視領域、赤外領域の光である。また、式（１）で表される化合物の局在場所の検出は、該化合物の発光状態を蛍光顕微鏡によって行うことができる。さらに、励起光は式（１）で表される化合物に二光子吸収を起こさせるものであってもよく、レンズで集光した光を照射してもよい。
さらに、本発明のミトコンドリア膜電位の変化の検出方法や、細胞の生死の判別する方法には、式（１）で表される化合物に加え、以下の式（２）で表される化合物も使用することができる。
（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンで表される縮合多環基のいずれかを表し、ナフチレン基は電子供与性基を有していてもよい。）
上記Ｒ１は、式（１）におけるＲ１と同じ定義である。
式（２）で表される化合物の中でも、好ましくは以下の式（２−１）で表される化合物である。
式（２）で表される化合物は、ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／００４９４８等を参考に、公知の合成方法によって合成できる。
以下に、実施例において本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術範囲は、これらに限定されるものではない。
実施例１．ナフタレン誘導体（Ｉ）の合成
［工程１］
２，６−ジブロモナフタレン（０．２９ｇ，１ｍｍｏｌ）、４−ピリジルボロン酸（０．２７ｇ，２．２ ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（０．８１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１２ｍＬ）溶液にパラジウム触媒（５．８mｇ，０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。１１０℃で４０時間撹拌した後、混合溶液をジエチルエーテルで抽出し、有機層を水で洗浄、有機層に硫酸マグネシウム（無水）を加えて乾燥し、濃縮した。粗結晶をメタノールで再結晶し、化合物１を得た。
［工程２］
化合物１（０．２ｇ，１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２５ｍＬに溶解し、ヨードメタン（ＣＨ３Ｉ，２ｍＬ）を加え室温で２４時間撹拌した。析出した固体をジクロロメタンで洗浄し、ナフタレン誘導体（Ｉ）を黄色固体として得た。以下に、１ＨＮＭＲデータを示す。また、得られたナフタレン誘導体（Ｉ）の１ＨＮＭＲチャートを図１に示す。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d (ppm): 9.11 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 8.88 (s, 2H), 8.68 (d, J =7.2 Hz, 4H), 8.35 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.30 (dd, J = 1.6, 8.8 Hz, 2H), 4.37 (s, 6H)．
実施例２．アントラセン誘導体（II）の合成
［工程１］
２，６−ジブロモアントラセン（０．３４ｇ，１ｍｍｏｌ）、４−ピリジルボロン酸（０．２７ｇ，２．２ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（０．８１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１２ｍＬ）溶液にパラジウム触媒（５．７８mｇ，０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。１１０℃で７０時間撹拌した後、混合溶液をジエチルエーテルで抽出し、有機層を水で洗浄、有機層に硫酸マグネシウム（無水）を加えて乾燥し、濃縮した。粗結晶をメタノールで再結晶し、化合物２を得た。
［工程２］
化合物２（０．１８ｇ，０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２５ｍＬに溶解し、ヨードメタン（ＣＨ３Ｉ，２ｍＬ）を加え室温で２４時間撹拌した。析出した固体をジクロロメタンで洗浄し、アントラセン誘導体（II）を黄色固体として得た。以下に、１ＨＮＭＲデータを示す。また、得られたアントラセン誘導体（II）の１ＨＮＭＲチャートを図２に示す。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d (ppm): 9.10 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 9.03 (s, 2H), 8.90 (s, 2H), 8.72 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 8.46 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.21 (dd, J = 1.6, 7.2, 2 Hz, 2H), 4.37 (s, 6H)．
実施例３．ピレン誘導体（III）の合成
［工程１］
１，６−ジブロモピレン（０．３６ｇ，１ｍｍｏｌ）、４−ピリジルボロン酸（０．２７ｇ，２．２ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（０．８１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１２ｍＬ）溶液にパラジウム触媒（５．７８mｇ，０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。１２０℃で５０時間撹拌した後、混合溶液をジエチルエーテルで抽出し、有機層を水で洗浄、有機層に硫酸マグネシウム（無水）を加えて乾燥し、濃縮した。粗結晶をメタノールで再結晶し、化合物３を得た。
［工程２］
化合物３（０．１５ｇ，０．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１５ｍＬに溶解し、ヨードメタン（ＣＨ３Ｉ，２ｍＬ）を加え室温で２４時間撹拌した。析出した固体をジクロロメタンで洗浄し、ピレン誘導体（III）を黄色固体として得た。以下に、１ＨＮＭＲデータを示す。また、得られたピレン誘導体（III）の１ＨＮＭＲチャートを図３に示す。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.18 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 8.62 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.49 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 8.46 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.26 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 4.47 (s, 6H)．
実施例４．式（２−１）で表される化合物の合成
フレイムドライし、アルゴン置換したシュレンク管に、２，６−ジブロモナフタレン（０．２９ｇ，１ｍｍｏｌ）とジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）（Pd(PPh3)2Cl2，０．０７７ｇ，０．１１ｍｍｏｌ）、４−ビニルピリジン（０．２６ｇ，２．５６ｍｍｏｌ）、ベンゼン１ｍＬ、トリエチルアミン１ｍＬを加え、２４時間、１００℃で加熱・撹拌した。エバポレーターで有機溶媒を除き、得られた固体をジクロロメタンに溶解させ、水と分液した。有機相に無水硫酸マグネシウムを加え、乾燥した後、濃縮し、粗結晶を得た。その後、粗結晶をジエチルエーテルで洗い、アセトンによる再結晶でパールイエローの固体を得た。
得られた上記固体（０．０４５ｇ，０．１３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶かし、ヨウ化メチル２ｍＬを加えた。一晩、常温で撹拌し、析出した黄色の固体をろ過により得た。以下に、１ＨＮＭＲデータを示す。また、得られた式（２−１）で表される化合物の１ＨＮＭＲチャートを図４に示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8.91 (d, J = 6.5 Hz, 4H), 8.29 (d, J = 6.5 Hz, 4H), 8.25 (s, 4H), 8.21 (d, J = 16.5 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.12 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 16.5 Hz, 2H), 4.25 (s, 6H)．
実施例５．紫外−可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定
実施例１〜３により合成された化合物及び比較例１の紫外−可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを以下の条件にしたがって測定した。比較例１の化合物は、以下の構造である。
紫外−可視吸収スペクトルは、V-670-UV-VIS-NIR spectrophotometer（Jasco Co.）を用いて測定した。蛍光スペクトルは、C9920-03G（Hamamatsu Photonics. K. K.）を用いて測定した。蛍光量子収率は積分球を用いた絶対測定により決定した。濃度が１０−６ｍｏｌ／Ｌとなるように調整した試料を用いて測定した。測定結果を、表１と図１に示す。なお、図１における実線は紫外−可視吸収スペクトルを表し、点線は蛍光スペクトルを表す。
上記表１に示すように、比較例１の化合物の発光量子収率（φ）、化合物に吸収された光子数と蛍光によって放出された光子数との比を表し、数値が大きいほど発光の効率がよいことを意味する）が０．１４であったのに対し、ナフタレン誘導体（Ｉ）、アントラセン誘導体（II）、ピレン誘導体（III）の発光量子収率（φ）は、それぞれ、０．９２、０．５８、０．４３であった。すなわち、本発明の化合物は発光の効率が良く、強い蛍光を検出できるため、蛍光色素としての使用に適する。
実施例６．細胞の蛍光化実験と観察
細胞の培養
染色のモデル細胞としてヒト胎児腎細胞であるＨｅｋ２９３細胞を使用した。Ｈｅｋ２９３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）のトリプシン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
細胞の蛍光化
顕微鏡観察を行う準備のために、Ｈｅｋ２９３細胞を３５ｍｍガラスベースディッシュに細胞密度１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように継代した。継代して２４時間後、細胞がディッシュへ付着していることを顕微鏡観察により確認した。ディッシュより培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回細胞を洗浄した。ナフタレン誘導体（I）、アントラセン誘導体（II）、ピレン誘導体（III）、式（２−１）で表される化合物、比較例２〜４の化合物の１×１０−３ｍｏｌ ｄｍ−３のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液２μＬを添加したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬ（ＰＹ最終濃度１μｍｏｌ ｄｍ−３、最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））をディッシュに入れ、１２時間インキュベートすることにより染色を行った。顕微鏡観察の直前に、色素を含む培地をディッシュから取り除き、ＰＢＳを用いて２回細胞を洗浄し、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬをディッシュに加えた。なお、比較例２〜４の化合物は以下の構造であり、公知の合成方法により得た。
蛍光顕微鏡観察
蛍光顕微鏡は、オプティカルブロック（Hamamatsu Photonics K. K.）を用いて作成した。光源にはフェムト秒チタンサファイヤレーザー（Mira900、Coherent）を用いた。蛍光の検出には光電子増倍管（R928、Hamamatsu Photonics K. K.）を用い、印加電圧１０００Ｖでプリアンプ（５ＭＨｚ）付きソケットを経てＤＣ検出した。サンプルステージにはKZG0620-Gを用い、対物レンズは倍率４０倍、ＮＡ＝１．１５の無限遠補正対物レンズを用いた。観察により得られた画像を図２〜７に示す。
なお、膜電位の調整、すなわち、膜電位の低下への誘導は、脱共役剤であるカルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）を用いた。ＣＣＣＰは、ミトコンドリアのプロトン透過性を増加させてミトコンドリア膜電位を崩壊させる化合物である。ＣＣＣＰをＤＭＳＯに溶解させ、１０ｍｍｏｌ ｄｍ−３の溶液を調製した。調製したＣＣＣＰのＤＭＳＯ溶液を、培地に対して０．１％（ｖ／ｖ）となるよう添加した（最終ＣＣＣＰ濃度 １０（ｍｏｌ ｄｍ−３）。添加して５分後、蛍光顕微鏡により観察した。
図１０〜１２に示されるように、膜電位低下の前と後で、比較例２〜４の化合物は蛍光の強度や場所は変化していない。一方、図６〜９に示されるように、ナフタレン誘導体（Ｉ）、アントラセン誘導体（II）、ピレン誘導体（III）及び式（２−１）で表される化合物は、膜電位の低下前はミトコンドリアで蛍光が検出され、核では蛍光が検出されなかったが、膜電位の低下後は核での蛍光が検出されるようになり、蛍光が検出される場所が変化した。したがって、本発明の化合物は、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所が変化する化合物である。
本発明の化合物は、蛍光性があり、また、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有していることから、ミトコンドリアの膜電位の変化を検出することができる。また、本発明の化合物を蛍光色素として用いることにより、生きた細胞の観察が可能で一般的な蛍光顕微鏡によって、簡単に細胞の観察ができる。さらに、蛍光顕微鏡によって、蛍光の発せられる場所の情報を得ることができ、簡単に細胞の生死を判別することができる。本発明の蛍光色素組成物は、ミトコンドリアの機能障害に起因する疾患の予防研究や疾患の発生メカニズム解明の研究、例えば、治療候補薬の投与による薬剤の効果、ミトコンドリア活力や細胞の生死への影響等を試験するときに使用できる。

Claims (5)

  1. 式（１）で表される化合物。
    ［式中、Ｒ１は置換基を有しないＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、Ｘは、
    （式中、波線は隣接するピリジン環への結合部位を表す。）で表される縮合多環基のいずれかを表す。］
  2. カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、スルホネートであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
  3. 請求項１又は２に記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光色素組成物。
  4. 請求項１及び２に記載の化合物及び以下の式（２−１）で表される化合物；
    からなる群より選ばれる少なくとも一つを用いることを特徴とする、ミトコンドリア膜電位の変化の検出方法。
  5. 請求項１及び２に記載の化合物及び以下の式（２−１）で表される化合物；
    からなる群より選ばれる少なくとも一つを用いることを特徴とする、ミトコンドリア膜電位の変化の検出を利用して細胞の生死を判別する方法。
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