ITPD20060128A1 - Uso di fluorofori per la localizzazione selettiva di mitocondri - Google Patents
Uso di fluorofori per la localizzazione selettiva di mitocondri Download PDFInfo
- Publication number
- ITPD20060128A1 ITPD20060128A1 ITPD20060128A ITPD20060128A1 IT PD20060128 A1 ITPD20060128 A1 IT PD20060128A1 IT PD20060128 A ITPD20060128 A IT PD20060128A IT PD20060128 A1 ITPD20060128 A1 IT PD20060128A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- compound
- mitochondria
- marker
- pepep
- cells
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 20
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 5
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 5
- 125000004183 alkoxy alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000278 alkyl amino alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000004985 dialkyl amino alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 5
- BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N Carbonyl Cyanide para-Trifluoromethoxyphenylhydrazone Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(NN=C(C#N)C#N)C=C1 BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 150000002390 heteroarenes Chemical class 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=CC(N)=C2)C2=[O+]C2=C1C=CC(N)=C2 TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- VAXNMTMRMVMKLU-UHFFFAOYSA-N 1-nonylacridine Chemical compound C1=CC=C2C=C3C(CCCCCCCCC)=CC=CC3=NC2=C1 VAXNMTMRMVMKLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMAXNNVXIBDEMV-UHFFFAOYSA-M 2-(4-dimethylaminostyryl)-1-ethylpyridinium iodide Chemical compound [I-].CC[N+]1=CC=CC=C1C=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 AMAXNNVXIBDEMV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052641 Mitochondrial DNA mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JAVRNIFMYIJXIE-UHFFFAOYSA-N methyl 2-chlorobenzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1Cl JAVRNIFMYIJXIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001048 orange dye Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 description 1
- XUDZMIGAJMGETI-UHFFFAOYSA-N tetramethylchloromethylrosamine Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(CCl)C=C1 XUDZMIGAJMGETI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
- G01N33/5079—Mitochondria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Insulated Conductors (AREA)
Description
DESCRIZIONE
Ambito tecnico
La presente invenzione riguarda un metodo per la localizzazione selettiva, nonché un metodo per la visualizzazione, di mitocondri in colture cellulari mediante microscopia confocale, impiegando quali marcatori una famiglia di composti eteroaromatici in sé nota.
Stato dell'arte
Nel campo delle scienze mediche e biologiche è nota l'esigenza di monitorare i vari processi cellulari con il massimo grado di dettaglio,
Nell'ambito generale della microscopia di colture cellulari è altresì nota la particolare esigenza di visualizzare, all'interno della cellula, i mitocondri. Questi ultimi svolgono diverse importanti funzioni nelle cellule eucariote in quanto centrale energetica della cellula, oltre che responsabili di vari processi metabolici.
II monitoraggio dei mitocondri è effettuato utilizzando particolari composti fluorescenti (fluorofori), detti marcatori mitocondriali, in grado di localizzarsi selettivamente nei mitocondri e di concentrarsi all'interno degli stessi. Le caratteristiche di fluorescenza di tali composti marcatori vengono quindi utilizzate per la visualizzazione dei mitocondri mediante la microscopia a fluorescenza confocale, in particolare quella del tipo a scansione laser (laser scanning confocal fluorescence microscopy, LSCFM, detta microscopia confocale) che offre migliori prestazioni in termini di risoluzione e di sensibilità oltre che la possibilità di effettuare analisi tridimensionali.
L'importanza di monitorare la morfologia, la funzionalità, l'attività, l'abbondanza dei mitocondri è legata alla possibilità di evidenziare effetti nocivi di varie sostanze e di rivelare mutazioni del DNA mitocondriale. Nel primo caso, ad es. alcuni anestetici si sono rivelati modificatori dell'attività mitocondriale [Biochem. J. 1990, 271, 269] mentre nel secondo caso si è evidenziato che mutazioni del DNA mitocondriale sono spesso implicate in un numero di malattie neurodegenerative quali Parkinson e Alzheimer e comportano morte cellulare per apoptosi o necrosi.
E' oggi possibile anche evidenziare e studiare interazioni fra cellula e farmaco purché quest'ultimo sia opportunamente legato ad una sonda fluorescente. Ad esempio, questo risultato è stato raggiunto incorporando nello stesso coniugato, mediante opportuni legami chimici, un farmaco anticancro (Doxorubicina), un anticorpo avente target specifico per cellule tumorali, e un fluoroforo capace di evidenziare la localizzazione del coniugato [Proc. Nat. Acad. Sci. 1999, 96, 11081; Cancer Res. 2002, 60, 4194].
Sono disponibili diverse metodologie per visualizzare, mediante microscopia confocale, i mitocondri. Alcuni marcatori hanno funzionalità chimiche che si legano direttamente a proteine mitocondriali. Altri hanno alta selettività mitocondriale intrinseca ma il loro assorbimento può variamente dipendere dal potenziale di membrana.
Esempi di composti impiegati nel settore tecnico di riferimento come marcatori mitocondriali comprendono coloranti del tipo della Rodamina 123 e della Tetrametilrosamina [Methods Celi. Biol. 1989, 29, 103] i quali sono rapidamente sequestrati dai mitocondri ma sono anche rapidamente espulsi non appena si perda il potenziale di membrana mitocondriale. Parimenti, coloranti stirilici quali il DASPMI e il DASPEI colorano i mitocondri di cellule vitali [ Int . Rev. Cytol. 1990, 122, 1] in funzione del potenziale di membrana e sono stati usati, fra l'altro, per monitorare la distribuzione e la morfologia di mitocondri nel lievito [J. Celi. Biol. 1994, 126, 1361] e nei suoi mutanti [ J . Celi. Biol. 1990, 111, 967]. Anche le carbocianine sono usate come coloranti di mitocondri nel lievito [ J . Celi. Biol. 1994, 126, 1375; Mol. Biol. Celi. 1998, 9, 912; Meth.Cell. Biol. 1989, 311, 357] e in altre cellule eucariote.
Il colorante Arancio nonil acridina è considerato un marker mitocondriale non potenziometrico cioè indipendente dal potenziale di membrana, anche se dati recenti [J. Neurochem. 2002, 82, 224] indicano che il potenziale di membrana modula l'intensità di fluorescenza. Inoltre, tale colorante risulta tossico a concentrazioni relativamente alte [FEBS Lett. 1990, 260, 236].
Per concentrarsi all'interno dei mitocondri, la maggior parte dei composti marcatori convenzionali, sfrutta l'alto gradiente potenziometrico della membrana mitocondriale. Questa caratteristica, tuttavia, comporta alcuni limitazioni nell'impiego di tali composti.
Infatti è noto che il gradiente potenziometrico della membrana è presente solo quando il mitocondrio è attivo e funzionante. Ciò comporta che in talune situazioni di sofferenza cellulare la membrana mitocondriale risulti parzialmente depotenziata, rendendo scarsamente selettivi i composti marcatori. Le immagini derivanti dalla microscopia confocale risultano in questo caso poco definite, con un alto rumore di fondo dovuto alla concentrazione relativamente elevata di marcatori dispersi più o meno uniformemente nel materiale citoplasmatico extramitocondriale.
Descrizione dell'invenzione
II problema alla base della presente invenzione è quello di mettere a disposizione composti fluorescenti in grado di localizzare selettivamente i mitocondri, in quanto in grado di concentrarsi in modo selettivo e prevalente nei mitocondri senza disperdersi nel citoplasma superando i limiti sopra esposti con riferimento alla tecnica nota citata.
II trovato si propone inoltre di mettere a disposizione composti che possano essere impiegati quali marcatori mitocondriali, ovvero in grado di emettere una qualsiasi radiazione rilevabile strumentalmente, e, in particolare, composti la cui selettività nei confronti dei mitocondri sia sostanzialmente indipendente dal gradiente potenziometrico della membrana mitocondriale. Questo problema è risolto e questi scopi sono raggiunti dal presente trovato mediante l'uso di composti in accordo con le rivendicazioni che seguono. I composti oggetto della presente invenzione hanno la formula generale seguente:
ove
R<1>= alchile, alcossialchile, alchilamminoalchile, dialchilamminoalchile R<3>= alchile
X<">= trifluorometansolfonato, tosilato, alchilsolfonato, cloruro, solfato
R<2>= alchile, alcossialchile, alchilamminoalchile, dialchilamminoalchile
II composto preferito tra i composti di formula (I) è il 2,5-Bis[l-(4-N-metilpiridinio)eten-2-ile)]-N-metilpirrolo ditriflato (di seguito identificato con la sigla PEPEP) la cui formula di struttura (II) è riportata di seguito:
I composti di formula (I), fanno parte di una più ampia famiglia di composti eteroaromatici descritti nella domanda di brevetto italiano n. MI2000A000612 e nella corrispondente domanda di brevetto internazionale n. PCT/EP01/13193, il cui contenuto è da considerarsi interamente incorporato nella presente domanda. In questi documenti è descritta l'attività di tali composti quali cromofori aventi assorbimento a due fotoni e la loro attività quali limitatori ottici e il loro potenziale impiego nella microscopia confocale.
In particolare, in queste domande è riportato in dettaglio il processo di produzione del PEPEP, che viene qui integralmente richiamato e quindi, per brevità di esposizione, omesso.
I composti di formula (I) mostrano una emissione fluorescente anche in ambienti acquosi, prerequisito importante nella microscopia confocale in campo cellulare, e sono stati sottoposti a diversi test per saggiare la possibilità di essere impiegati quali marcatori cellulari. In modo del tutto inatteso, tali composti hanno evidenziato proprietà di localizzazione dei mitocondri che provano non solo la loro generica idoneità all'uso quali marcatori mitocondriali, ma anche, in talune condizioni, la loro superiorità rispetto ai marcatori mitocondriali tradizionali, allargando così il campo delle possibili applicazioni della microscopia confocale.
Breve descrizione delle figure
Le suddette proprietà dei composti di formula (I) meglio risulteranno dalla descrizione dettagliata che segue circa i test cui è stato sottoposto un suo rappresentante esemplificativo, il PEPEP, ed ai quali sono riferite le unite figure in cui:
- la figura 1 è un diagramma rappresentante gli esiti del test di citotossicità di un composto secondo la presente invenzione;
- le figure 2a e 2b rappresentano immagini risultanti da microscopia confocale di cellule trattate con PEPEP in due diverse condizioni operative;
- le figure 2c e 2d rappresentano immagini risultanti da microscopia confocale delle stesse cellule delle figure 2a,b trattate con marcatori mitocondriali noti;
- le figure 3a e 3b rappresentano immagini risultanti da microscopia confocale di un primo tipo di cellule trattate contemporaneamente con PEPEP e con un marcatore noto, ottenute rispettivamente filtrando l'emissione del PEPEP e filtrando l'emissione del marcatore noto, - la figura 3c rappresenta un'immagine ottenuta sovrapponendo le figure 3a e 3b, ai fini della valutazione di colocalizzazione del PEPEP e del marcatore noto;
- le figure da 3d a 3f rappresentano immagini analoghe a quelle delle figure da 3a a 3c, ma riferite ad un secondo tipo di cellule;
- le figure 4a, 4b rappresentano immagini risultanti da microscopia confocale di cellule di Saccharomyces cerevisiae trattate con PEPEP; - le figure 5a e 5b rappresentano immagini risultanti da microscopia confocale di un terzo tipo di cellule trattate con PEPEP, rispettivamente in assenza ed in presenza di un composto disaccoppiatore del potenziale di membrana mitocondriale.
Esempio preferito di applicazione dell'invenzione
L'efficacia dei composti della famiglia di formula 1 per l'uso secondo l'invenzione è stata provata sottoponendo un suo composto rappresentativo, il PEPEP, sopra identificato con la formula di struttura (II), in alcune prove descritte in dettaglio di seguito.
Nelle prove sono stati impiegati i seguenti composti:
- 3,6-diammino-9-(2-(metossicarbonil) fenil cloruro, o rodamina 123 (nel seguito, in breve, R123), fornito da Molecular Probes ;
- dimetilamminostiril-metilpiridinio ioduro (nel seguito, in breve, DASPMI), fornito da Molecular Probes;
- Carbonil cianuro 4-(trifluorometossi) fenilidrazone (di seguito, in breve, FCCP), fornito da Sigma;
- PEPEP preparato direttamente nei laboratori della Richiedente, secondo la procedura riportata in dettaglio nella domanda di brevetto italiano n. MI2000A000612 e nella corrispondente domanda di brevetto internazionale n. PCT/EP01/13193.
Sono state inoltre utilizzate le seguenti colture cellulari:
- cellule endoteliali di cordone ombelicale umano (di seguito HUVEC), provenienti da ATCC e coltivate utilizzando il terreno di coltura M199 addizionato del 10% di siero fetale di vitello, ECGF (150 mg/l) ed eparina (5 U/ml);
- cellule leucemiche umane U937 coltivate utilizzando il terreno di coltura RPMI addizionato del 10% di siero fetale di vitello;
- cellule immortalizzate di rene di scimmia COS7 coltivate utilizzando il terreno di coltura DMEM addizionato del 10% di siero fetale di vitello; cellule del lievito Saccharomyces cerevisiae in fase di crescita stazionaria.
Tutti i reagenti per le colture cellulari provengono da Sigma.
Test di citotossicità
La citossicità del PEPEP è stata valutata misurando spettrofotometricamente la crescita cellulare in funzione dell'attività mitocondriale delle cellule vitali, basata sulla capacità della deidrogenasi mitocondriale, espressa solo dalle cellule vitali, di ridurre il 3-[4,5-dimetiltiazolo-2-ile]-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT).
Cellule HUVEC e U937 sono state coltivate in piastre a 96 pozzetti, trattate con una soluzione 5 μΜ di PEPEP per 24 e 48 ore e quindi incubate per 4 ore a 37°C con MTT. I valori di assorbenza sono stati determinati a 570 nm. I risultati dell'analisi spettrofotometrica a 24 e a 48 ore sono riportati nel diagramma di figura 1 e raffrontati con un campione di controllo.
L'andamento del grafico di figura 1 evidenzia chiaramente come il PEPEP non influenzi in alcun modo la crescita cellulare, e possa essere quindi utilizzato in cellule vitali.
Analisi di localizzazione intracellulare
Il PEPEP è stato sottoposto a vari test per verificare le sue caratteristiche di localizzazione selettiva all'interno di diversi tipi di cellule e confrontato con altri composti marcatori noti.
L'analisi della distribuzione dei composti marcatori all'interno delle cellule è stata effettuata mediante microscopia LSCFM. A questo scopo è stato utilizzato un microscopio a fluorescenza confocale MRC-600 della Bio-Rad Microscience Division (UK) accoppiato ad un microscopio ad epifluorescenza Nikon Optiphot II. È stato utilizzato un obiettivo 60x ad immersione in olio con N.A. = 1.4 o un obiettivo in aria 20x con N.A.=0.4. La fluorescenza dei composti marcatori è stata eccitata tramite l'emissione di un laser ad Argon a 488 nm e rilevata a 515 nm. L'alta sensibilità di questo rilevamento consente di usare una sorgente laser a bassa potenza (0.1 mW), condizione essenziale per lo studio dei mitocondri attivi in cellule vitali.
In un primo test, cellule HUVEC sono state fatte crescere su piastre Petri (37°C, 5% C02). Una soluzione di PEPEP è stata aggiunta a due campioni di queste cellule fino a raggiungere una concentrazione finale in ciascun campione pari a 5 μΜ. Le cellule sono state mantenute in presenza di PEPEP a) per 30 minuti e b) per 24 ore. Al termine del periodo di incubazione entrambi i campioni sono stati analizzati tramite LSCFM, come descritto in precedenza.
In figura 2a e 2b sono riportate le immagini derivanti dalla microscopia a fluorescenza confocale. Da esse si ricava come il PEPEP si localizzi in modo selettivo all'interno dei mitocondri, producendo una intensa fluorescenza con un maggior accumulo dopo 24 ore di incubazione.
La selettività del PEPEP è stata confrontata con quella di altri marcatori mitocondriali noti quali R123 ed il DASPMI.
Cellule HUVEC ottenute nello stesso modo dei campioni precedenti, sono state trattate rispettivamente con una soluzione di R123 fino a raggiungere una concentrazione finale di 1 μΜ e con una soluzione di DASPMI fino a raggiungere una concentrazione finale di 10 μΜ e quindi incubate rispettivamente per 10 e 15 minuti. Questi campioni comparativi sono stati analizzati con LSCFM e le immagini risultanti sono rappresentate nelle figure 2c e 2d.
Test analoghi sono stati condotti anche su campioni di cellule 11937, su campioni di cellule COS7, quali sistemi modello per colture cellulari fisiologiche e patologiche di mammifero, nonché su Saccharomyces cerevisiae per la sua rilevanza nel campo biotecnologico.
Il confronto tra le immagini ottenute da LSCFM rivela come la selettività del PEPEP nei confronti dei mitocondri sia del tutto confrontabile con quella dell'R123 e del DASPMI.
Analisi di colocalizzazione
Cellule HUVEC, preparate come nelle prove precedenti, sono state trattate con una soluzione 5 μΜ di PEPEP e incubate per 20 minuti; dopo di che è stata aggiunta una soluzione ΙμΜ di R123, ed il tutto è stato incubato per altri 10 minuti. Le cellule sono state quindi analizzate con LSCFM, utilizzando prima un filtro passa alto con taglio a 600 nm per rilevare l'emissione del PEPEP (fìg. 3a) e poi un filtro passa banda a 540 nm per rilevare l'emissione dell'R123 (fig. 3b).
Sulla base delle figure 3a e 3b è stato quindi valutato il livello di colocalizzazione dei due marcatori testati tramite sovrapposizione delle immagini usando una specifica applicazione software (Colocalization test plug-in for Image J, Wright Celi Imaging Facility, Canada). L'immagine ottenuta per sovrapposizione è illustrata in figura 3c. Il coefficiente di correlazione di Pearson così valutato è risultato dell'ordine del 95%.
La stessa prova è stata condotta su campioni di cellule U937. Queste cellule sono state trattate con analoghe soluzioni di PEPEP e di R123 ed analizzate con LSCFM, secondo le stesse modalità sopra esposte. Le immagini risultanti sono rappresentate in figura 3d e 3e, mentre in figura 3f illustrata l'immagine ottenuta per sovrapposizione delle immagini delle figure 3d e 3e. Il coefficiente di correlazione di Pearson così valutato è risultato dell'ordine dell'80%.
Analisi di localizzazione nei mitocondri con membrana depotenziata
Un ulteriore prova è stata mirata al tipo di meccanismo che porta il PEPEP a localizzarsi selettivamente all'interno dei mitocondri. In particolare è stato verificato se tale localizzazione era determinata dal gradiente potenziometrico della membrana mitocondriale, come nel caso dei composti marcatori tradizionali, ovvero se il meccanismo fosse di tipo diverso.
Cellule COS7 sono state trattate con una soluzione 5 μΜ di PEPEP e incubate per 30 minuti in assenza ed in presenza di un composto disaccoppiatore del potenziale di membrana, l'FCCP (soluzione 2 μΜ, tempo di incubazione 5-10 minuti). Dopo incubazione, i campioni cellulari sono stati lavati due volte con PBS ed analizzati con LSCFM, utilizzando l'obiettivo ad aria 20x.
L'immagine risultante dal campione cellulare trattato con PEPEP in assenza di FCCP è rappresentato in figura 5a, mentre quello trattato con PEPEP in presenza di FCCP è rappresentato in figura 5b.
Come si può immediatamente constatare, l'intensità della fluorescenza e la localizzazione del PEPEP non è influenzata in modo apprezzabile dalla presenza del FCCP, il che suggerisce che il meccanismo attraverso il quale il PEPEP si concentra all'interno dei mitocondri non è di tipo potenziometrico. Più probabilmente tale meccanismo è legato all'affinità del PEPEP con il DNA mitocondriale.
Peraltro è opportuno precisare che non è stata osservata alcuna localizzazione di PEPEP all'interno del nucleo delle cellule vitali.
I risultati delle prove sopra descritte evidenziano che il PEPEP, non essendo citotossico, possedendo buone proprietà di fluorescenza anche in ambiente acquoso, e, soprattutto, presentando una elevata affinità per i mitocondri, può essere efficacemente impiegato quale marcatore mitocondriale, altamente selettivo, per analisi e visualizzazione di cellule tramite microscopia a fluorescenza confocale.
Gli altri composti della famiglia di formula (I) sono ritenuti avere caratteristiche analoghe a quelle del PEPEP.
Le proprietà di localizzazione selettiva del PEPEP e dei composti della famiglia di composti di formula (I) suggeriscono inoltre il loro impiego quale veicolo per l'introduzione nei mitocondri di altri composti.
Ad esempio, è previsto che il PEPEP possa essere legato, direttamente o tramite un gruppo molecolare intermedio, ad un composto in grado di generare ossigeno di singoletto, così che la sua localizzazione all'interno dei mitocondri possa essere sfruttata per applicazioni di terapia fotodinamica.
Esempi di sostanze note che possono essere legate al PEPEP a questo scopo sono le squaraine.
La presente invenzione risolve quindi il problema sopra lamentato con riferimento alla tecnica nota citata, offrendo nel contempo numerosi altri vantaggi, tra cui quello di mettere a disposizione composti in grado di localizzare selettivamente i mitocondri in modo sostanzialmente indipendente dal loro potenziale di membrana.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di un composto di formula generale (I)oveR<3> R<1>= alchile, alcossialchile, alchilamminoalchile, dialchilamminoalchile, R<3>= alchile, X<'>= trifluorometansolfonato, tosilato, alchilsolfonato, cloruro, solfato,R<2>= alchile, alcossialchile, alchilamminoalchile, dialchilamminoalchile, quale composto per la localizzazione selettiva dei mitocondri.
- 2. Uso in cui il composto ha formula (II) (PEPEP)
- 3. Uso di un composto secondo la rivendicazione 1 o 2 quale marcatore mitocondriale.
- 4. Uso di un composto secondo la rivendicazione 3, per la visualizzazione di mitocondri.
- 5. Uso di un composto secondo la rivendicazione 4 tramite rilevazione di radiazione fluorescente.
- 6. Uso di un composto secondo la rivendicazione 1 o 2 quale veicolo per l'introduzione selettiva nei mitocondri di un composto funzionale.
- 7. Uso secondo la rivendicazione 6 in cui detto composto funzionale è un generatore di ossigeno di singoletto.
- 8. Composto comprendente un composto di formula (I) legato ad un generatore di ossigeno di singoletto per uso in campo terapeutico.
- 9. Metodo per la visualizzazione di mitocondri mediante microscopia confocale comprendente le fasi di: - preparare un campione delle cellule da analizzare, - porre a contatto detto campione con una soluzione comprendente una quantità efficace di un composto marcatore per un tempo sufficiente affinché detto composto marcatore possa localizzarsi selettivamente nei mitocondri, - assoggettare detto campione cellulare ad una radiazione per eccitare detto composto marcatore provocando una emissione di una radiazione fluorescente da detto composto marcatore, - rilevare ed elaborare detta radiazione fluorescente, emessa dal composto marcatore, tramite microscopia confocale, caratterizzato dal fatto che detto composto marcatore ha formula generale (I).
- 10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detto composto marcatore ha formula (II).
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITPD20060128 ITPD20060128A1 (it) | 2006-04-06 | 2006-04-06 | Uso di fluorofori per la localizzazione selettiva di mitocondri |
| PCT/EP2007/053322 WO2007113321A1 (en) | 2006-04-06 | 2007-04-04 | Use of fluorophores for the selective localisation of mitochondria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITPD20060128 ITPD20060128A1 (it) | 2006-04-06 | 2006-04-06 | Uso di fluorofori per la localizzazione selettiva di mitocondri |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITPD20060128A1 true ITPD20060128A1 (it) | 2007-10-07 |
Family
ID=38229266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ITPD20060128 ITPD20060128A1 (it) | 2006-04-06 | 2006-04-06 | Uso di fluorofori per la localizzazione selettiva di mitocondri |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITPD20060128A1 (it) |
| WO (1) | WO2007113321A1 (it) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6638876B2 (ja) * | 2015-03-10 | 2020-01-29 | 国立大学法人山口大学 | ミトコンドリア膜電位応答性蛍光性化合物 |
| JP6620466B2 (ja) * | 2015-08-31 | 2019-12-18 | 国立大学法人山口大学 | ミトコンドリアに局在する性質を有する蛍光性化合物 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6291203B1 (en) * | 1995-11-13 | 2001-09-18 | Molecular Probes, Inc. | Cyanine dyes that stain cells and mitochondria |
| IT1302625B1 (it) * | 1998-10-08 | 2000-09-29 | Silvia Maria Doglia | Metodo per la determinazione della resistenza multidroga e dellealterazioni mitocondriali |
| IT1318421B1 (it) * | 2000-03-23 | 2003-08-25 | Univ Milano Bicocca | Composti eteroaromatici ad elevata prestazione come limitatori otticiin soluzione tramite assorbimento e due fotoni. |
| WO2003094767A1 (en) * | 2002-03-25 | 2003-11-20 | The General Hospital Corporation | Methods of adjuvant photodynamic therapy to enhance radiation sensitization |
| US7338428B2 (en) * | 2002-09-09 | 2008-03-04 | New York University | Combinatorial fluorescent library based on the styryl scaffold |
-
2006
- 2006-04-06 IT ITPD20060128 patent/ITPD20060128A1/it unknown
-
2007
- 2007-04-04 WO PCT/EP2007/053322 patent/WO2007113321A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007113321A1 (en) | 2007-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Quantum dots: a promising fluorescent label for probing virus trafficking | |
| Geng et al. | Fluorescent carbon dots for in situ monitoring of lysosomal ATP levels | |
| Huang et al. | Coherent brightfield microscopy provides the spatiotemporal resolution to study early stage viral infection in live cells | |
| Liow et al. | Highly efficient supramolecular aggregation-induced emission-active pseudorotaxane luminogen for functional bioimaging | |
| Sarder et al. | Molecular probes for fluorescence lifetime imaging | |
| Clède et al. | Metal–carbonyl units for vibrational and luminescence imaging: towards multimodality | |
| Sun et al. | Two-photon semiconducting polymer dots with dual-emission for ratiometric fluorescent sensing and bioimaging of tyrosinase activity | |
| Luo et al. | Highly sensitive hill-type small-molecule pH probe that recognizes the reversed pH gradient of cancer cells | |
| Gunsolus et al. | Analytical aspects of nanotoxicology | |
| Lacerda et al. | Intracellular trafficking of carbon nanotubes by confocal laser scanning microscopy | |
| Liang et al. | In situ surface-enhanced Raman scattering spectroscopy exploring molecular changes of drug-treated cancer cell nucleus | |
| Samanta et al. | Organic fluorescent probes for stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): Recent highlights and future possibilities | |
| KASTEN | Probes: Properties, History and Applications | |
| Walter et al. | Incorporation studies of clickable ceramides in Jurkat cell plasma membranes | |
| Fleischer et al. | Optically activated delayed fluorescence | |
| Tian et al. | Photoswitching-Induced Frequency-Locked Donor–Acceptor Fluorescence Double Modulations Identify the Target Analyte in Complex Environments | |
| Sekiyama et al. | Delayed increase in near-infrared fluorescence in cultured murine cancer cells labeled with oxygen-doped single-walled carbon nanotubes | |
| Wu et al. | Fluorescent polymer dot-based multicolor stimulated emission depletion nanoscopy with a single laser beam pair for cellular tracking | |
| Rimpelová et al. | Rational design of chemical ligands for selective mitochondrial targeting | |
| Rich et al. | Elimination of autofluorescence in fluorescence correlation spectroscopy using the AzaDiOxaTriAngulenium (ADOTA) fluorophore in combination with time-correlated single-photon counting (TCSPC) | |
| Song et al. | Improving brightness and stability of Si-rhodamine for super-resolution imaging of mitochondria in living cells | |
| Gkika et al. | Os (II)-bridged polyarginine conjugates: the additive effects of peptides in promoting or preventing permeation in cells and multicellular tumor spheroids | |
| Neto et al. | Seeing is believing: noninvasive microscopic imaging modalities for tissue engineering and regenerative medicine | |
| Nagai et al. | Synthesis of single-walled carbon nanotubes coated with thiol-reactive gel via emulsion polymerization | |
| Rahim et al. | Phasor analysis of fluorescence lifetime enables quantitative multiplexed molecular imaging of three probes |