JP2004224746A - ２光子蛍光標識方法及び２光子吸収化合物 - Google Patents
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Abstract
【課題】大きな２光子吸収断面積を持ち、しかも蛍光強度が高く、被標識化合物と共有結合を形成し得る化合物を用いて被標識物質を標識する方法を提供する。
【解決手段】物質を標識するに際して、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物と前記被標識物質とを共有結合を介して連結するように反応させる２光子蛍光標識方法。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。
【選択図】 選択図なし
【解決手段】物質を標識するに際して、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物と前記被標識物質とを共有結合を介して連結するように反応させる２光子蛍光標識方法。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。
【選択図】 選択図なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本発明は、天然もしくは人工の化学物質あるいは生体組織の検出や状態の分析を容易にするために、これらの物質に２光子励起により蛍光を発する化合物を結合せしめて標識するための方法およびこの方法に有効に用いられる２光子励起により蛍光を発する化合物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
化学物質に蛍光を発する化合物を共有結合させて標識し、その物質の存在を検出することは広く行われている。標識される化合物の例としては、抗体、蛋白、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、核酸誘導体、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然ないし合成樹脂、合成薬物、毒物、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、硝子粒子、プラスチック粒子、重合体膜等が挙げられる。これらに結合される蛍光を発する物質としては、種々の蛍光物質が用いられ、有機色素が特に頻繁に用いられる。有機色素の中でも、蛍光が強く、蛍光の波長も容易に選べるシアニン色素が特に有用である。シアニン色素は水中で会合体を形成し易く、蛍光強度が弱くなるという欠点がある。この点を克服するために、例えば特許文献１及び２に記載されているような、アリールスルホン酸基を有するシアニン色素が開発されている。すなわちシアニン色素の末端基を構成する塩基性核と呼ばれるヘテロ環に縮合した芳香族環に直接結合したスルホン酸基の存在が、陰イオン間の静電的反発により色素同士が重なる配置を妨げるため、会合が阻害されると主張されている。
【０００４】
しかしながら、不均一溶液状の試料中の物質特に生体組織など三次元的分布を持つ試料中の物質を三次元座標を区別して標識する場合には、上述の標識色素を用いる方法は都合が悪い。なぜなら励起光を特定の位置に焦点を合わせて照射しても、光路の途中にある標識色素からも蛍光が発生してしまうので、特定の位置の情報だけを分別して得ることが出来ないからである。従って、三次元空間中の任意の位置にある標識物質だけを選択的に励起する方法およびこれに適した化合物が求められていた。
【０００５】
また、上述の標識色素を用いる方法は、励起光の波長と発生する蛍光の波長が近接しているため、蛍光の検出時に励起光を遮蔽するフイルターを必要とするため、発する蛍光の一部が失われるので、感度が低くなるという問題があった。従って励起光と蛍光の波長差が大きい標識化合物が求められていた。
【０００６】
通常、物質は励起エネルギーに相当するエネルギーの１光子を吸収して励起され、このエネルギーに満たないエネルギーの光子は吸収されない。しかし光の強度が非常に強い場合には、光子エネルギーの和が励起エネルギーに相当する２光子が同時に吸収されることがある。この性質を利用すると光をレンズで絞り込んだ焦点付近のみで光反応を起こすことができ、空間の任意の位置を選択して励起状態を作って利用することができる。しかしフルオレッセインやローダミンＢのような汎用蛍光色素の２光子吸収の効率は通常非常に低いので、非常に強力かつ大型のレーザー光源を必要とし、普及の障害となっていた。従って、２光子励起効率が高い物質が求められていた。２光子吸収の起こり易さを示す２光子吸収断面積は通常非常に小さく１ＧＭ（ただし１ＧＭ＝１×１０−５０ｃｍ４ ｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｐｈｏｔｏｎ −１）程度であるが、近年数百ないし数千ＧＭ程度の比較的大きな２光子吸収断面積を示すと主張されている物質も報告されている。しかしながらこの値は測定条件により大きく異なり、特に測定に用いるレーザーのパルス幅が比較的長いナノ秒オーダーの場合には、フェムト秒レーザーを用いる実際の態様とかけ離れた、見かけ上非常に大きな値が得られるので、文献値を吟味する際に注意が必要である。
２光子吸収断面積が比較的大きいと主張されている化合物の例は、例えば以下の非特許文献（１）ないし（１０）に記載されている。しかし実用的には更に大きな２光子吸収断面積を持つ化合物が求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｒｅｉｎｈａｒｄｔほか、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ誌，１９９８年発行，１０巻，１８６３．
【非特許文献２】
Ｍ． Ａｌｂｏｔａほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、１９９８年発行、２８１巻、１６５３頁．
【非特許文献３】
Ｍ． Ｒｕｍｉほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ誌、２０００年発行、１２２巻、９５００頁．
【非特許文献４】
Ｊ． Ｄ． Ｂｈａｗａｌｋａｒほかの著した、Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ誌、１９９６年発行、１２４巻、３３頁．
【非特許文献５】
Ｓ．Ｇ．Ｈｅほか、Ａｐｐｌｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、１９９５年発行、６７巻、２４３３頁．
【非特許文献６】
Ｐ． Ｎ． Ｐｒａｓａｄほか、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ誌、１９９９年発行、２１巻、３９頁．
【非特許文献７】
Ｇ． Ｓ． Ｈｅほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ誌、１９９７年発行、８１巻、２５２９頁．
【非特許文献８】
Ｓ． −Ｊ． Ｃｈｕｎｇほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ 誌、１９９９年発行、１０３巻、１０７４１頁．
【非特許文献９】
Ｓ． Ｇ． Ｈｅほか、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、１９９５年発行、２０巻、４３５頁．
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｗ． Ｐｅｒｒｙほか、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ誌、１９９９年、２１巻、２２５頁．
【特許文献１】
特開平２−１９１６７４号公報．
【特許文献２】
特許第２７５７９６５号明細書．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明が解決しようとする課題は、大きな２光子吸収断面積を持ち、しかも蛍光強度が高く、被標識化合物と共有結合を形成し得る化合物、およびこの化合物を用いて種々の条件下において被標識物質を標識する方法を提供することである。これにより、被標識試料の三次元空間中の任意の位置にある被標識物質だけを選択的に励起し、検出することができる。
本発明が解決しようとする他の課題は、励起光と蛍光の波長差が大きい標識化合物の提供、およびこの化合物を用いて物質を標識する方法を提供することである。これにより発生する蛍光を無駄なく利用できるので検出感度を高めることができる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は下記の手段により解決された。
（１）物質を標識するに際して、下記一般式（Ｉ）で表される化合物と前記被標識物質とを共有結合を介して連結するように反応させることを特徴とする２光子蛍光標識方法。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。
（２）上記一般式（Ｉ）で表される化合物においてＡで表される基が少なくとも１個の酸基で置換されている２光子蛍光標識方法。
（３）上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基の部分構造である芳香族環が脂肪族基を介さずに、少なくとも１個のスルホン酸基で直接置換されている２光子蛍光標識方法。
（４）下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする２光子吸収化合物。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。
（５）上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基が少なくとも１個の酸基で置換されていることを特徴とする２光子吸収化合物。
（６）上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基の部分構造である芳香族環が脂肪族基を介さずに、少なくとも１個のスルホン酸基で直接置換されていることを特徴とする２光子吸収化合物。
【００１０】
（作用効果の説明）
本発明の２光子吸収化合物の態様を以下に詳しく述べる。物質に光が当たると通常１光子分に相当するエネルギーが吸収される。この１光子吸収が起こらない波長の光であっても、強度が非常に強い場合には光子エネルギーの和が励起エネルギーに相当する２光子が同時に吸収されることがある。２光子吸収の起こり易さを示す２光子吸収断面積は通常非常に小さく１ＧＭ（ただし１ＧＭ＝１×１０−５０ｃｍ４ ｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｐｈｏｔｏｎ−１）程度であるが、近年数百ないし数千ＧＭ程度の比較的大きな２光子吸収断面積を示す物質も見出されている。このような物質を用いると、光吸収帯が無い波長域の光でも、高パワーレーザーのように非常に強度が強い光源を用いれば２光子分のエネルギーを吸収する。例えば４００ｎｍに１光子の吸収極大波長を示し、８００ｎｍには吸収帯が無い化合物に８００ｎｍの波長の高パワーレーザーを照射することにより、４００ｎｍの光を照射した場合に生じる励起状態に近い励起状態を作ることができる。もしこの化合物を４００ｎｍの光で励起した場合に例えば４３０ｎｍの蛍光を発するなら、８００ｎｍの光を吸収した場合にも４３０ｎｍの蛍光を発する。さらに４３０ｎｍの光を吸収して４６０ｎｍの蛍光を発する化合物が共存すれば、８００ｎｍの高パワーレーザーの照射により４６０ｎｍの蛍光を発する。レーザービームをレンズで絞って照射すれば、光路全体が発光するのではなく、光子密度の高い焦点付近でのみ蛍光を発するという、三次元的な位置選択制を付与できるという特徴がある。また絞ったレーザービームの強度はビームの中心から離れるにしたがって低下するので、２光子励起を起こすに足る光強度を有する部分はビーム径よりも小さく、およそ１／√２倍、すなわち約０．７倍になる。したがって光の波長で決まるビーム径の最小値よりも微細な領域のみを励起することができるという利点を有する。
【００１１】
非共鳴２光子同時吸収により蛍光を発する化合物は、たとえば本来４００ｎｍの光で励起されて蛍光を発する場合、その約２倍の波長である８００ｎｍの光でも光子密度が非常に高い場合には光子２個を同時に吸収して、４００ｎｍで励起された場合と同様の蛍光を発することが可能である。しかしこの２光子吸収効率は一般に極めて低いので高感度の検出系が要求されるが、本発明の化合物を用いることにより感度が改善される。この際発する蛍光の波長は、たとえば４００−５００ｎｍなど、励起光波長８００ｎｍのはるか短波側にあるため、励起光と蛍光の波長は重なることが無く容易に分離できる点でも好ましい。このように本発明の方法では、光子エネルギーの小さい長波長の近赤外光を励起光として、可視光を発光させることができるので、試料の光化学的損傷が少なくて好ましい。また近赤外光はレイリー散乱によるボケが少なく、生体透過性が高く深奥部まで到達し得る点でも好ましいので、組織の深奥部の位置選択的な観察が可能であるなどの利点がある。
【００１２】
しかし本発明の目的に適合し得るほどに、しかも共存物の２光子吸収よりも効率よく２光子吸収が起きるためには２光子吸収断面積は、便宜上ＧＭ単位（Ｇｏｐｐｅｒｔ−Ｍａｙｅｒｓ単位すなわち、１×１０−５０ ｃｍ４ ｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｐｈｏｔｏｎ−１）で表すと、１００ＧＭ以上あることが望ましく、さらに好ましくは１，０００ＧＭ以上、特に好ましくは１００，０００ＧＭないし１，０００，０００，０００ＧＭである。
【００１３】
特に水性媒質中では、均一な標識が可能となるよう、一般式（Ｉ）で表される化合物にカルボキシルやスルホン酸基などの親水性基を導入することが好ましく、特に２光子吸収をつかさどるＡで表される部分にスルホン酸基を導入することが好ましい。Ｈ−Ａで表される化合物は、２光子吸収効率が高いだけでなく蛍光の量子収率も高い化合物であることが望ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明に使用する一般式（Ｉ） の化合物について詳細に説明する。
一般式（Ｉ）において、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、アミノ基、ヒドロキシル基、もしくはメルカプト基と反応して共有結合を形成しうる基などが挙げられる。これらの基としては、カルボキシル基、そのヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、イソシアネート、イソチオシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−ないしジ−ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハライド、酸ハライド、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド、グリオキサルおよびアルデヒドを含有する基などが挙げられる。Ｇの反応性基としては、カルボキシル基（その塩も含む）が好ましい。
ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、アルキレン基、アリーレン基、アルケニレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２ −、−Ｃ（＝Ｏ）−、ヘテロ環基、またはこれらの基の組み合わせからなる基を表す。Ｌとして、アルキレン基、またはアルキレン基と−Ｏ−の組み合わせからなる基が好ましく、アルキレン基（メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン等）がより好ましい。
Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。その化合物例としては上記従来の技術に引用した文献に記載されたものの他、好ましくは特開２００２−１７２８６４の一般式（１）で表される化合物、および下記一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化１】
【００１６】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し、Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。
【００１７】
Ａは少なくとも１個の酸基で置換されていることが好ましく、酸基の例としてはスルホン酸基、カルボキシル基、ホスホン酸基が挙げられる。これらの酸基は、Ａの部分構造としての芳香族環に脂肪族基（アルキレン基等）を介さず直接結合していることが好ましい。スルホン酸基が、Ａの部分構造としての芳香族環に脂肪族基（アルキレン基等）を介さず直接結合している構造が特に好ましい。
【００１８】
一般式（ＩＩ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子または置換基を表し、置換基として好ましくは、アルキル基（好ましくは炭素原子数（以下Ｃ数という）１〜２０、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ベンジル、３−スルホプロピル、４−スルホブチル、カルボキシメチル、５−カルボキシペンチル）、アルケニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、ビニル、アリル）、シクロアルキル基（好ましくはＣ数３〜２０、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル）、アリール基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニル、２−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−メチルフェニル、１−ナフチル）、ヘテロ環基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ）である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６としてより好ましくは水素原子またはアルキル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。特に、Ｒ１とＲ３が結合して環を形成することが好ましく、その際カルボニル炭素原子と共に形成する環が６員環、５員環または４員環であることが好ましく、５員環または４員環であることがより好ましく、５員環であることが最も好ましい。
Ｒ１とＲ３が結合して６員環、５員環または４員環を形成し、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６ がいずれも水素原子である場合が好ましい。Ｒ１とＲ３が結合して環を形成しない場合はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６ がいずれも水素原子であることが好ましい。
【００１９】
一般式（ＩＩ）において、ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、好ましくは１〜３の整数を表す。なお、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。
【００２０】
Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し（これら各基の好ましい例はＲ１〜Ｒ６と同じ）、好ましくはアルキル基を表し、より好ましくは無置換アルキル基、またはスルホ基もしくはカルボキシル基が置換したアルキル基を表し、さらに好ましくはＣ数１〜６の無置換アルキル基またはＣ数１〜４のスルホアルキル基を表す。
【００２１】
Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。形成されるヘテロ環として好ましくは、インドレニン環、アザインドレニン環、ピラゾリン環、ベンゾチアゾール環、チアゾール環、チアゾリン環、ベンゾオキサゾール環、オキサゾール環、オキサゾリン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾール環、チアジアゾール環、キノリン環、またはピリジン環であり、より好ましくはインドレニン環、アザインドレニン環、ピラゾリン環、ベンゾチアゾール環、チアゾール環、チアゾリン環、チアジアゾール環、またはキノリン環であり、さらに好ましくは、インドレニン環、またはアザインドレニン環であり、特に好ましくはインドレニン環である。
【００２２】
Ｚ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環は置換基を有しても良く、置換基として好ましくは、アルキル基（好ましくは炭素原子数（以下Ｃ数という）１〜２０、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ベンジル、３−スルホプロピル、４−スルホブチル、カルボキシメチル、５−カルボキシペンチル）、アルケニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、ビニル、アリル）、シクロアルキル基（好ましくはＣ数３〜２０、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル）、アリール基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニル、２−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−メチルフェニル、１−ナフチル）、ヘテロ環基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ）、アルキニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、エチニル、２−メチルエチニル、２−フェニルエチニル）、ハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アミノ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジブチルアミノ）、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、アシル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、アセチル、ベンゾイル、サリチロイル、ピバロイル）、アルコキシ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メトキシ、ブトキシ、シクロヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（好ましくはＣ数６〜２６、例えば、フェノキシ、１−ナフトキシ）、アルキルチオ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メチルチオ、エチルチオ）、アリールチオ基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニルチオ、４−クロロフェニルチオ）、アルキルスルホニル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メタンスルホニル、ブタンスルホニル）、アリールスルホニル基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、ベンゼンスルホニル、パラトルエンンスルホニル）、カルバモイル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ−フェニルカルバモイル）、アシルアミノ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えばアセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、イミノ基（好ましくはＣ数２〜２０、例えばフタルイミノ）、アシルオキシ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えばアセチルオキシ、ベンゾイルオキシ）、またはアルコキシカルボニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、メトキシカルボニル、フェノキシカルボニル）であり、より好ましくは、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、カルボキシル基（その塩も含む）、スルホ基（その塩も含む）、アルコキシ基、カルバモイル基、またはアルコキシカルボニル基である。
【００２３】
一般式（ＩＩ）で表される化合物は、より好ましくは一般式（ＩＩＡ）で表される。
一般式（ＩＩＡ）
【００２４】
【化２】
【００２５】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、ｍは一般式（１）と同義である。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４はそれぞれ独立にアルキル基またはアリール基を表す。Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立に＝Ｎ−または＝ＣＲ１７−を表し、Ｒ１７は水素原子または置換基を表す。Ｒ１５、Ｒ１６はそれぞれ独立に置換基を表し、ａ１、ａ２はそれぞれ独立に０〜３の整数を表す。なお、ａ１、ａ２が２以上の時Ｒ１５、Ｒ１６は同じでも異なっても良く、互いに連結して環を形成しても良い。
【００２６】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４はそれぞれ独立にアルキル基またはアリール基を表し（好ましい例はＲ１〜Ｒ６と同じ）、好ましくはアルキル基を表し、より好ましくは無置換アルキル基（好ましくはエチル基、またはメチル基）を表し、さらに好ましくはメチル基を表す。
【００２７】
Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立に＝Ｎ−または＝ＣＲ１７−を表し、Ｒ１７は水素原子または置換基（好ましい例はＺ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環上の置換基の例と同じ）を表し、より好ましくはＲ１７は水素原子である。
【００２８】
Ｒ１５、Ｒ１６はそれぞれ独立に置換基（好ましい例はＺ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環上の置換基の例と同じ）を表す。
ａ１、ａ２はそれぞれ独立に０〜３の整数を表し、より好ましくは０または１を表す。
なお、ａ１、ａ２が２以上の時、Ｒ１５、Ｒ１６は同じでも異なっても良く、互いに連結して環を形成しても良く、形成する環としてはベンゼン環が好ましい。
ａ１、ａ２が共に１であり、Ｒ１５、Ｒ１６が共に水素原子、カルボキシル基（その塩も含む）、またはスルホ基（その塩も含む）である場合が好ましい。
【００２９】
以下に本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例を挙げるが、本発明の範囲はこれらのみにて限定されるものではない。
【００３０】
【化３】
【００３１】
【化４】
【００３２】
【化５】
【００３３】
標識する物質（成分）と一般式（Ｉ）で表される化合物とを共有結合で連結して標識するに際し、一般式（Ｉ）で表される化合物が、アミノ基、ヒドロキシ基またはメルカプト基と反応しうる基を有する場合は、両者を溶液中で混合すればよい。この際、酸あるいは塩基が発生する場合にはこれらを中和すべく、それぞれ塩基または酸を添加したり、ｐＨ緩衝液等の緩衝効果を発揮する媒体中で反応させることが好ましい。これらの反応性基の代わりにカルボキシル基を有する場合には、カルボキシル基を対応する混合酸無水物活性エステルに変換した後上記の反応性基の場合と同様に反応させることにより、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミド誘導体のような縮合促進剤の存在下に目的成分と反応させることにより、目的成分を標識することができる。反応条件の例は、例えば特許第２７５７９６５号明細書の例１ないし例５に記載されている。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明の標識化合物およびこれを用いる標識方法の利点を、実施例によって示すが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
本発明の化合物および比較化合物の水溶液の２光子励起発光の強度を表１に示した。なお、発光が最も強くなる波長で励起した場合の発光強度を比較した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
比較化合物Ａ
【００３８】
【化６】
【００３９】
比較化合物Ｂ
【００４０】
【化７】
【００４１】
表１から、本発明の化合物は、比較化合物に比べて２光子励起発光が強いことがわかる。
実施例２
０．５ ％ゼラチン水溶液２０ｍＬに化合物３を２ｍｇ加えてゼラチンを標識した。この溶液を光路長１ｃｍの石英セルに注入した後、１ｃｍ角の石英セルに入れ、波長７８０ｎｍ、平均パワー４０ｍＷ尖頭パワー７ｋｗ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数４８ＭＨｚのレーザーをレンズで集光して暗所で照射したところ、焦点付近のみで青緑色の発光が観測された。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の２光子吸収化合物を用いる標識方法は従来の方法より、励起光と蛍光の波長差が大きく、励起光より短波長の蛍光を発生させることができるので、標識部位の検出が容易である。３次元空間分解能が高く、励起光路中の焦点付近においてのみ蛍光を発生させることが出来る。従来の蛍光標識色素より２光子励起効率が高いので、検出感度が高いという好ましい効果を示す。
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本発明は、天然もしくは人工の化学物質あるいは生体組織の検出や状態の分析を容易にするために、これらの物質に２光子励起により蛍光を発する化合物を結合せしめて標識するための方法およびこの方法に有効に用いられる２光子励起により蛍光を発する化合物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
化学物質に蛍光を発する化合物を共有結合させて標識し、その物質の存在を検出することは広く行われている。標識される化合物の例としては、抗体、蛋白、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、核酸誘導体、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然ないし合成樹脂、合成薬物、毒物、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、硝子粒子、プラスチック粒子、重合体膜等が挙げられる。これらに結合される蛍光を発する物質としては、種々の蛍光物質が用いられ、有機色素が特に頻繁に用いられる。有機色素の中でも、蛍光が強く、蛍光の波長も容易に選べるシアニン色素が特に有用である。シアニン色素は水中で会合体を形成し易く、蛍光強度が弱くなるという欠点がある。この点を克服するために、例えば特許文献１及び２に記載されているような、アリールスルホン酸基を有するシアニン色素が開発されている。すなわちシアニン色素の末端基を構成する塩基性核と呼ばれるヘテロ環に縮合した芳香族環に直接結合したスルホン酸基の存在が、陰イオン間の静電的反発により色素同士が重なる配置を妨げるため、会合が阻害されると主張されている。
【０００４】
しかしながら、不均一溶液状の試料中の物質特に生体組織など三次元的分布を持つ試料中の物質を三次元座標を区別して標識する場合には、上述の標識色素を用いる方法は都合が悪い。なぜなら励起光を特定の位置に焦点を合わせて照射しても、光路の途中にある標識色素からも蛍光が発生してしまうので、特定の位置の情報だけを分別して得ることが出来ないからである。従って、三次元空間中の任意の位置にある標識物質だけを選択的に励起する方法およびこれに適した化合物が求められていた。
【０００５】
また、上述の標識色素を用いる方法は、励起光の波長と発生する蛍光の波長が近接しているため、蛍光の検出時に励起光を遮蔽するフイルターを必要とするため、発する蛍光の一部が失われるので、感度が低くなるという問題があった。従って励起光と蛍光の波長差が大きい標識化合物が求められていた。
【０００６】
通常、物質は励起エネルギーに相当するエネルギーの１光子を吸収して励起され、このエネルギーに満たないエネルギーの光子は吸収されない。しかし光の強度が非常に強い場合には、光子エネルギーの和が励起エネルギーに相当する２光子が同時に吸収されることがある。この性質を利用すると光をレンズで絞り込んだ焦点付近のみで光反応を起こすことができ、空間の任意の位置を選択して励起状態を作って利用することができる。しかしフルオレッセインやローダミンＢのような汎用蛍光色素の２光子吸収の効率は通常非常に低いので、非常に強力かつ大型のレーザー光源を必要とし、普及の障害となっていた。従って、２光子励起効率が高い物質が求められていた。２光子吸収の起こり易さを示す２光子吸収断面積は通常非常に小さく１ＧＭ（ただし１ＧＭ＝１×１０−５０ｃｍ４ ｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｐｈｏｔｏｎ −１）程度であるが、近年数百ないし数千ＧＭ程度の比較的大きな２光子吸収断面積を示すと主張されている物質も報告されている。しかしながらこの値は測定条件により大きく異なり、特に測定に用いるレーザーのパルス幅が比較的長いナノ秒オーダーの場合には、フェムト秒レーザーを用いる実際の態様とかけ離れた、見かけ上非常に大きな値が得られるので、文献値を吟味する際に注意が必要である。
２光子吸収断面積が比較的大きいと主張されている化合物の例は、例えば以下の非特許文献（１）ないし（１０）に記載されている。しかし実用的には更に大きな２光子吸収断面積を持つ化合物が求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｒｅｉｎｈａｒｄｔほか、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ誌，１９９８年発行，１０巻，１８６３．
【非特許文献２】
Ｍ． Ａｌｂｏｔａほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、１９９８年発行、２８１巻、１６５３頁．
【非特許文献３】
Ｍ． Ｒｕｍｉほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ誌、２０００年発行、１２２巻、９５００頁．
【非特許文献４】
Ｊ． Ｄ． Ｂｈａｗａｌｋａｒほかの著した、Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ誌、１９９６年発行、１２４巻、３３頁．
【非特許文献５】
Ｓ．Ｇ．Ｈｅほか、Ａｐｐｌｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、１９９５年発行、６７巻、２４３３頁．
【非特許文献６】
Ｐ． Ｎ． Ｐｒａｓａｄほか、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ誌、１９９９年発行、２１巻、３９頁．
【非特許文献７】
Ｇ． Ｓ． Ｈｅほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ誌、１９９７年発行、８１巻、２５２９頁．
【非特許文献８】
Ｓ． −Ｊ． Ｃｈｕｎｇほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ 誌、１９９９年発行、１０３巻、１０７４１頁．
【非特許文献９】
Ｓ． Ｇ． Ｈｅほか、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、１９９５年発行、２０巻、４３５頁．
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｗ． Ｐｅｒｒｙほか、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ誌、１９９９年、２１巻、２２５頁．
【特許文献１】
特開平２−１９１６７４号公報．
【特許文献２】
特許第２７５７９６５号明細書．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明が解決しようとする課題は、大きな２光子吸収断面積を持ち、しかも蛍光強度が高く、被標識化合物と共有結合を形成し得る化合物、およびこの化合物を用いて種々の条件下において被標識物質を標識する方法を提供することである。これにより、被標識試料の三次元空間中の任意の位置にある被標識物質だけを選択的に励起し、検出することができる。
本発明が解決しようとする他の課題は、励起光と蛍光の波長差が大きい標識化合物の提供、およびこの化合物を用いて物質を標識する方法を提供することである。これにより発生する蛍光を無駄なく利用できるので検出感度を高めることができる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は下記の手段により解決された。
（１）物質を標識するに際して、下記一般式（Ｉ）で表される化合物と前記被標識物質とを共有結合を介して連結するように反応させることを特徴とする２光子蛍光標識方法。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。
（２）上記一般式（Ｉ）で表される化合物においてＡで表される基が少なくとも１個の酸基で置換されている２光子蛍光標識方法。
（３）上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基の部分構造である芳香族環が脂肪族基を介さずに、少なくとも１個のスルホン酸基で直接置換されている２光子蛍光標識方法。
（４）下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする２光子吸収化合物。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。
（５）上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基が少なくとも１個の酸基で置換されていることを特徴とする２光子吸収化合物。
（６）上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基の部分構造である芳香族環が脂肪族基を介さずに、少なくとも１個のスルホン酸基で直接置換されていることを特徴とする２光子吸収化合物。
【００１０】
（作用効果の説明）
本発明の２光子吸収化合物の態様を以下に詳しく述べる。物質に光が当たると通常１光子分に相当するエネルギーが吸収される。この１光子吸収が起こらない波長の光であっても、強度が非常に強い場合には光子エネルギーの和が励起エネルギーに相当する２光子が同時に吸収されることがある。２光子吸収の起こり易さを示す２光子吸収断面積は通常非常に小さく１ＧＭ（ただし１ＧＭ＝１×１０−５０ｃｍ４ ｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｐｈｏｔｏｎ−１）程度であるが、近年数百ないし数千ＧＭ程度の比較的大きな２光子吸収断面積を示す物質も見出されている。このような物質を用いると、光吸収帯が無い波長域の光でも、高パワーレーザーのように非常に強度が強い光源を用いれば２光子分のエネルギーを吸収する。例えば４００ｎｍに１光子の吸収極大波長を示し、８００ｎｍには吸収帯が無い化合物に８００ｎｍの波長の高パワーレーザーを照射することにより、４００ｎｍの光を照射した場合に生じる励起状態に近い励起状態を作ることができる。もしこの化合物を４００ｎｍの光で励起した場合に例えば４３０ｎｍの蛍光を発するなら、８００ｎｍの光を吸収した場合にも４３０ｎｍの蛍光を発する。さらに４３０ｎｍの光を吸収して４６０ｎｍの蛍光を発する化合物が共存すれば、８００ｎｍの高パワーレーザーの照射により４６０ｎｍの蛍光を発する。レーザービームをレンズで絞って照射すれば、光路全体が発光するのではなく、光子密度の高い焦点付近でのみ蛍光を発するという、三次元的な位置選択制を付与できるという特徴がある。また絞ったレーザービームの強度はビームの中心から離れるにしたがって低下するので、２光子励起を起こすに足る光強度を有する部分はビーム径よりも小さく、およそ１／√２倍、すなわち約０．７倍になる。したがって光の波長で決まるビーム径の最小値よりも微細な領域のみを励起することができるという利点を有する。
【００１１】
非共鳴２光子同時吸収により蛍光を発する化合物は、たとえば本来４００ｎｍの光で励起されて蛍光を発する場合、その約２倍の波長である８００ｎｍの光でも光子密度が非常に高い場合には光子２個を同時に吸収して、４００ｎｍで励起された場合と同様の蛍光を発することが可能である。しかしこの２光子吸収効率は一般に極めて低いので高感度の検出系が要求されるが、本発明の化合物を用いることにより感度が改善される。この際発する蛍光の波長は、たとえば４００−５００ｎｍなど、励起光波長８００ｎｍのはるか短波側にあるため、励起光と蛍光の波長は重なることが無く容易に分離できる点でも好ましい。このように本発明の方法では、光子エネルギーの小さい長波長の近赤外光を励起光として、可視光を発光させることができるので、試料の光化学的損傷が少なくて好ましい。また近赤外光はレイリー散乱によるボケが少なく、生体透過性が高く深奥部まで到達し得る点でも好ましいので、組織の深奥部の位置選択的な観察が可能であるなどの利点がある。
【００１２】
しかし本発明の目的に適合し得るほどに、しかも共存物の２光子吸収よりも効率よく２光子吸収が起きるためには２光子吸収断面積は、便宜上ＧＭ単位（Ｇｏｐｐｅｒｔ−Ｍａｙｅｒｓ単位すなわち、１×１０−５０ ｃｍ４ ｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｐｈｏｔｏｎ−１）で表すと、１００ＧＭ以上あることが望ましく、さらに好ましくは１，０００ＧＭ以上、特に好ましくは１００，０００ＧＭないし１，０００，０００，０００ＧＭである。
【００１３】
特に水性媒質中では、均一な標識が可能となるよう、一般式（Ｉ）で表される化合物にカルボキシルやスルホン酸基などの親水性基を導入することが好ましく、特に２光子吸収をつかさどるＡで表される部分にスルホン酸基を導入することが好ましい。Ｈ−Ａで表される化合物は、２光子吸収効率が高いだけでなく蛍光の量子収率も高い化合物であることが望ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明に使用する一般式（Ｉ） の化合物について詳細に説明する。
一般式（Ｉ）において、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、アミノ基、ヒドロキシル基、もしくはメルカプト基と反応して共有結合を形成しうる基などが挙げられる。これらの基としては、カルボキシル基、そのヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、イソシアネート、イソチオシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−ないしジ−ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハライド、酸ハライド、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド、グリオキサルおよびアルデヒドを含有する基などが挙げられる。Ｇの反応性基としては、カルボキシル基（その塩も含む）が好ましい。
ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、アルキレン基、アリーレン基、アルケニレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２ −、−Ｃ（＝Ｏ）−、ヘテロ環基、またはこれらの基の組み合わせからなる基を表す。Ｌとして、アルキレン基、またはアルキレン基と−Ｏ−の組み合わせからなる基が好ましく、アルキレン基（メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン等）がより好ましい。
Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。その化合物例としては上記従来の技術に引用した文献に記載されたものの他、好ましくは特開２００２−１７２８６４の一般式（１）で表される化合物、および下記一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化１】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し、Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。
【００１７】
Ａは少なくとも１個の酸基で置換されていることが好ましく、酸基の例としてはスルホン酸基、カルボキシル基、ホスホン酸基が挙げられる。これらの酸基は、Ａの部分構造としての芳香族環に脂肪族基（アルキレン基等）を介さず直接結合していることが好ましい。スルホン酸基が、Ａの部分構造としての芳香族環に脂肪族基（アルキレン基等）を介さず直接結合している構造が特に好ましい。
【００１８】
一般式（ＩＩ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子または置換基を表し、置換基として好ましくは、アルキル基（好ましくは炭素原子数（以下Ｃ数という）１〜２０、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ベンジル、３−スルホプロピル、４−スルホブチル、カルボキシメチル、５−カルボキシペンチル）、アルケニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、ビニル、アリル）、シクロアルキル基（好ましくはＣ数３〜２０、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル）、アリール基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニル、２−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−メチルフェニル、１−ナフチル）、ヘテロ環基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ）である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６としてより好ましくは水素原子またはアルキル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。特に、Ｒ１とＲ３が結合して環を形成することが好ましく、その際カルボニル炭素原子と共に形成する環が６員環、５員環または４員環であることが好ましく、５員環または４員環であることがより好ましく、５員環であることが最も好ましい。
Ｒ１とＲ３が結合して６員環、５員環または４員環を形成し、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６ がいずれも水素原子である場合が好ましい。Ｒ１とＲ３が結合して環を形成しない場合はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６ がいずれも水素原子であることが好ましい。
【００１９】
一般式（ＩＩ）において、ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、好ましくは１〜３の整数を表す。なお、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。
【００２０】
Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し（これら各基の好ましい例はＲ１〜Ｒ６と同じ）、好ましくはアルキル基を表し、より好ましくは無置換アルキル基、またはスルホ基もしくはカルボキシル基が置換したアルキル基を表し、さらに好ましくはＣ数１〜６の無置換アルキル基またはＣ数１〜４のスルホアルキル基を表す。
【００２１】
Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。形成されるヘテロ環として好ましくは、インドレニン環、アザインドレニン環、ピラゾリン環、ベンゾチアゾール環、チアゾール環、チアゾリン環、ベンゾオキサゾール環、オキサゾール環、オキサゾリン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾール環、チアジアゾール環、キノリン環、またはピリジン環であり、より好ましくはインドレニン環、アザインドレニン環、ピラゾリン環、ベンゾチアゾール環、チアゾール環、チアゾリン環、チアジアゾール環、またはキノリン環であり、さらに好ましくは、インドレニン環、またはアザインドレニン環であり、特に好ましくはインドレニン環である。
【００２２】
Ｚ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環は置換基を有しても良く、置換基として好ましくは、アルキル基（好ましくは炭素原子数（以下Ｃ数という）１〜２０、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ベンジル、３−スルホプロピル、４−スルホブチル、カルボキシメチル、５−カルボキシペンチル）、アルケニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、ビニル、アリル）、シクロアルキル基（好ましくはＣ数３〜２０、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル）、アリール基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニル、２−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−メチルフェニル、１−ナフチル）、ヘテロ環基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ）、アルキニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、エチニル、２−メチルエチニル、２−フェニルエチニル）、ハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アミノ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジブチルアミノ）、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、アシル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、アセチル、ベンゾイル、サリチロイル、ピバロイル）、アルコキシ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メトキシ、ブトキシ、シクロヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（好ましくはＣ数６〜２６、例えば、フェノキシ、１−ナフトキシ）、アルキルチオ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メチルチオ、エチルチオ）、アリールチオ基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニルチオ、４−クロロフェニルチオ）、アルキルスルホニル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メタンスルホニル、ブタンスルホニル）、アリールスルホニル基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、ベンゼンスルホニル、パラトルエンンスルホニル）、カルバモイル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ−フェニルカルバモイル）、アシルアミノ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えばアセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、イミノ基（好ましくはＣ数２〜２０、例えばフタルイミノ）、アシルオキシ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えばアセチルオキシ、ベンゾイルオキシ）、またはアルコキシカルボニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、メトキシカルボニル、フェノキシカルボニル）であり、より好ましくは、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、カルボキシル基（その塩も含む）、スルホ基（その塩も含む）、アルコキシ基、カルバモイル基、またはアルコキシカルボニル基である。
【００２３】
一般式（ＩＩ）で表される化合物は、より好ましくは一般式（ＩＩＡ）で表される。
一般式（ＩＩＡ）
【００２４】
【化２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、ｍは一般式（１）と同義である。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４はそれぞれ独立にアルキル基またはアリール基を表す。Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立に＝Ｎ−または＝ＣＲ１７−を表し、Ｒ１７は水素原子または置換基を表す。Ｒ１５、Ｒ１６はそれぞれ独立に置換基を表し、ａ１、ａ２はそれぞれ独立に０〜３の整数を表す。なお、ａ１、ａ２が２以上の時Ｒ１５、Ｒ１６は同じでも異なっても良く、互いに連結して環を形成しても良い。
【００２６】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４はそれぞれ独立にアルキル基またはアリール基を表し（好ましい例はＲ１〜Ｒ６と同じ）、好ましくはアルキル基を表し、より好ましくは無置換アルキル基（好ましくはエチル基、またはメチル基）を表し、さらに好ましくはメチル基を表す。
【００２７】
Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立に＝Ｎ−または＝ＣＲ１７−を表し、Ｒ１７は水素原子または置換基（好ましい例はＺ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環上の置換基の例と同じ）を表し、より好ましくはＲ１７は水素原子である。
【００２８】
Ｒ１５、Ｒ１６はそれぞれ独立に置換基（好ましい例はＺ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環上の置換基の例と同じ）を表す。
ａ１、ａ２はそれぞれ独立に０〜３の整数を表し、より好ましくは０または１を表す。
なお、ａ１、ａ２が２以上の時、Ｒ１５、Ｒ１６は同じでも異なっても良く、互いに連結して環を形成しても良く、形成する環としてはベンゼン環が好ましい。
ａ１、ａ２が共に１であり、Ｒ１５、Ｒ１６が共に水素原子、カルボキシル基（その塩も含む）、またはスルホ基（その塩も含む）である場合が好ましい。
【００２９】
以下に本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例を挙げるが、本発明の範囲はこれらのみにて限定されるものではない。
【００３０】
【化３】
【化４】
【化５】
標識する物質（成分）と一般式（Ｉ）で表される化合物とを共有結合で連結して標識するに際し、一般式（Ｉ）で表される化合物が、アミノ基、ヒドロキシ基またはメルカプト基と反応しうる基を有する場合は、両者を溶液中で混合すればよい。この際、酸あるいは塩基が発生する場合にはこれらを中和すべく、それぞれ塩基または酸を添加したり、ｐＨ緩衝液等の緩衝効果を発揮する媒体中で反応させることが好ましい。これらの反応性基の代わりにカルボキシル基を有する場合には、カルボキシル基を対応する混合酸無水物活性エステルに変換した後上記の反応性基の場合と同様に反応させることにより、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミド誘導体のような縮合促進剤の存在下に目的成分と反応させることにより、目的成分を標識することができる。反応条件の例は、例えば特許第２７５７９６５号明細書の例１ないし例５に記載されている。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明の標識化合物およびこれを用いる標識方法の利点を、実施例によって示すが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
本発明の化合物および比較化合物の水溶液の２光子励起発光の強度を表１に示した。なお、発光が最も強くなる波長で励起した場合の発光強度を比較した。
【００３６】
【表１】
比較化合物Ａ
【００３８】
【化６】
比較化合物Ｂ
【００４０】
【化７】
表１から、本発明の化合物は、比較化合物に比べて２光子励起発光が強いことがわかる。
実施例２
０．５ ％ゼラチン水溶液２０ｍＬに化合物３を２ｍｇ加えてゼラチンを標識した。この溶液を光路長１ｃｍの石英セルに注入した後、１ｃｍ角の石英セルに入れ、波長７８０ｎｍ、平均パワー４０ｍＷ尖頭パワー７ｋｗ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数４８ＭＨｚのレーザーをレンズで集光して暗所で照射したところ、焦点付近のみで青緑色の発光が観測された。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の２光子吸収化合物を用いる標識方法は従来の方法より、励起光と蛍光の波長差が大きく、励起光より短波長の蛍光を発生させることができるので、標識部位の検出が容易である。３次元空間分解能が高く、励起光路中の焦点付近においてのみ蛍光を発生させることが出来る。従来の蛍光標識色素より２光子励起効率が高いので、検出感度が高いという好ましい効果を示す。
Claims (6)
- 物質を標識するに際して、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物と前記被標識物質とを共有結合を介して連結するように反応させることを特徴とする２光子蛍光標識方法。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。 - 上記一般式（Ｉ）で表される化合物においてＡで表される基が少なくとも１個の酸基で置換されている請求項１に記載の２光子蛍光標識方法。
- 上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基の部分構造である芳香族環が脂肪族基を介さずに、少なくとも１個のスルホン酸基で直接置換されている請求項１に記載の２光子蛍光標識方法。
- 下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする２光子吸収化合物。
一般式（Ｉ）
Ｇ−（Ｌ）ｎ１−Ａ
式中、Ｇは被標識体と反応して共有結合を形成し得る反応性基を表し、ＬはＧとＡとを共有結合で連結するための連結基を表し、Ａは、Ｈ−Ａであらわされる化合物の２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上であるような有機基を表す。ｎ１は０または１を表す。 - 上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基が少なくとも１個の酸基で置換されていることを特徴とする２光子吸収化合物。
- 上記一般式（Ｉ）においてＡで表される基の部分構造である芳香族環が脂肪族基を介さずに、少なくとも１個のスルホン酸基で直接置換されていることを特徴とする２光子吸収化合物。
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