CN104059378B - 一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法 - Google Patents

一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法 Download PDF

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本发明公开了一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料，其结构通式为：其中R为CH3O-或(CH3)2N-。本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构，具有有效的双光子吸收截面，可以被双光子激发产生荧光，具有低的细胞毒性，可以进入细胞，用于细胞生物成像。

Description

一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法
一、技术领域
本发明涉及一种荧光染料及其制备方法，具体地说是一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法，属于双光子荧光生物成像领域。
二、背景技术
荧光成像技术相对其他成像技术如核磁共振成像，正电子发射断层成像，超声成像等具有极大的优越性，能够无损实时动态监测活体体内的活动及反应，在基因表达，肿瘤监测药物筛选等方面具有很大应用潜力。
双光子荧光显微成像具有红外激发，成像深度深，降低组织自发荧光干扰，避免荧光漂白和光致毒等特点而显著的优于单光子荧光显微成像。
香豆素衍生物具有水溶性好，低细胞毒性，生物兼容性好，斯托克位移大等优点，经常被于生物荧光成像信号系统。但是在双光子荧光领域还很少被报道。因此设计并合成香豆素衍生物的双光子荧光染料具有很好的应用前景。
三、发明内容
本发明旨在提供一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法，本发明香豆素衍生物双光子荧光染料具有低的细胞毒性，可以用于双光子荧光生物成像。
本发明六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的结构通式如下：
其中R为CH3O-或(CH3)2N-。
本发明六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的制备方法如下：
(1)将ICl溶于冰乙酸中配制得到1M的ICl冰乙酸溶液，将96ml配制的ICl冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入9.76g(0.08mol)水杨醛，40℃反应48h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体1；
(2)将5g(20mmol)中间体1、3.9g(24mmol)丙二酸二乙酯、0.2ml哌啶以及5滴冰乙酸加入50ml乙醇中，回流反应5h，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体2；
(3)将2g(6mmol)中间体2、7.2mmol化合物A、42mg(0.06mmol)PdCl2(PPh3)2以及23mg(0.12mmol)CuI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ml三乙胺和30ml四氢呋喃，室温搅拌反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(洗脱液按体积比为乙酸乙酯：石油醚＝1:3)得到目标产物；
所述化合物A为对甲氧基苯乙炔或4-二甲基氨基苯乙炔。
合成路线如下：
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构，具有有效的双光子吸收截面，可以被双光子激发产生荧光，低的细胞毒性，可以进入细胞，进行细胞成像。
四、附图说明
图1(a)是实施例1制备的荧光染料1的单晶结构图。图1(b)是实施例2制备的荧光染料2的单晶结构图。
图2是本发明荧光染料1(图a)和荧光染料2(图b)在细胞培养24小时后的细胞存活率。从图2中可以看出，浓度为10μM时，细胞存活率还有90％左右，说明了本发明荧光探针分子对细胞无毒性作用，因此可以用来做细胞成像。
图3是本发明荧光染料的双光子荧光共聚焦成像照片，其中图a为荧光染料1(10μM)在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗3次，在双光子荧光共聚焦显微成像，在700nm激发下，荧光发射收集范围450-490nm；图b为CHO细胞明场；图c为荧光染料2(10μM)在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗3次，在双光子荧光共聚焦显微成像，在740nm激发下，荧光发射收集范围500-540nm。图d为CHO细胞明场。
五、具体实施方式
实施例1：
1、中间体1的合成
将ICl溶于冰乙酸中配制得到1M的ICl冰乙酸溶液，将96ml配制的ICl冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入9.76g(0.08mol)水杨醛，40℃反应48h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体117.8g(0.072mol)，产率90％。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.95(s,1H),9.83(s,1H),7.84(d,J＝2.0Hz,1H),7.76(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),6.80(d,J＝8.8Hz,1H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.40,161.20,145.28,141.85,122.56,120.19,80.38.
2、中间体2的合成
将5g(20mmol)中间体1、3.9g(24mmol)丙二酸二乙酯、0.2ml哌啶以及5滴冰乙酸加入50ml乙醇中，回流反应5h，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体26.4g(18.8mmol)，产率94％。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),7.94(d,J＝1.8Hz,1H),7.89(dd,J＝8.7,1.9Hz,1H),7.13(d,J＝8.7Hz,1H),4.42(q,J＝7.1Hz,2H),1.41(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ162.65,155.95,154.67,146.95,142.65,137.66,119.89,119.30,118.75,87.43,62.22,14.21.
3、目标产物的合成
将2g(6mmol)中间体2、0.92g(7.2mmol)对甲氧基苯乙炔、42mg(0.06mmol)PdCl2(PPh3)2以及23mg(0.12mmol)CuI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ml三乙胺和30ml四氢呋喃，室温搅拌反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析100-200目硅胶，洗脱液按体积比为乙酸乙酯：石油醚＝1:3，得到目标产物1.94g，产率96％，记为荧光染料1，结构式如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(s,1H),7.74(d,J＝1.8Hz,1H),7.72(s,1H)7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.33(d,J＝9.1Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,2H),4.43(q,J＝7.1Hz,2H),3.84(s,3H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ162.92,160.04,156.31,154.34,147.92,137.04,133.17,131.94,120.80,119.00,117.92,117.04,114.49,114.15,90.74,85.83,62.14,55.36,14.23.
实施例2：
1、中间体1的合成
将ICl溶于冰乙酸中配制得到1M的ICl冰乙酸溶液，将96ml配制的ICl冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入9.76g(0.08mol)水杨醛，40℃反应48h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体117.8g(0.072mol)，产率90％。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.95(s,1H),9.83(s,1H),7.84(d,J＝2.0Hz,1H),7.76(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),6.80(d,J＝8.8Hz,1H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.40,161.20,145.28,141.85,122.56,120.19,80.38.
2、中间体2的合成
将5g(20mmol)中间体1、3.9g(24mmol)丙二酸二乙酯、0.2ml哌啶以及5滴冰乙酸加入50ml乙醇中，回流反应5h，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体26.4g(18.8mmol)，产率94％。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),7.94(d,J＝1.8Hz,1H),7.89(dd,J＝8.7,1.9Hz,1H),7.13(d,J＝8.7Hz,1H),4.42(q,J＝7.1Hz,2H),1.41(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ162.65,155.95,154.67,146.95,142.65,137.66,119.89,119.30,118.75,87.43,62.22,14.21.
3、目标产物的合成
将2g(6mmol)中间体2、1.05g(7.2mmol)4-二甲基氨基苯乙炔、42mg(0.06mmol)PdCl2(PPh3)2以及23mg(0.12mmol)CuI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ml三乙胺和30ml四氢呋喃，室温搅拌反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析100-200目硅胶，洗脱液按体积比为乙酸乙酯：石油醚＝1:3，得到目标产物2.06g，产率95％，记为荧光染料2，结构式如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(s,1H),7.73(d,J＝7.9Hz,1H),7.72(s,1H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),7.31(d,J＝8.6Hz,1H),6.67(d,J＝8.3Hz,2H),4.43(q,J＝7.1Hz,2H),3.01(s,6H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ162.99,156.44，154.05,150.40，148.07,136.97,132.83,131.61,121.43,118.85,117.89,116.93,111.78,108.93,92.13，85.20，62.10,40.18,14.24.
实施例3：单晶培养
将实施例1、2制备的荧光染料1和荧光染料2分别溶于二氯甲烷中，浓度接近饱和0.3mol/L，缓慢加入甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为1:4，室温培养48h。
实施例4：细胞毒性测试
MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)实验是根据已报道的文章，做细胞毒性测试。分别在两批细胞中加入10，30，50μM的荧光染料1和荧光染料2，在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育24小时，根据细胞存活度的公式：细胞存活率％＝OD570(样品)/OD570(对照组)×100，可算得细胞存活率(图2)。从图2中我们可以看出，浓度为10μM时，加入荧光染料1和荧光染料2的细胞存活率还有90％左右，说明了荧光染料1和荧光染料2对细胞无毒性作用，因此可以用于双光子荧光成像。
实施例5：双光子荧光共聚焦成像
CHO细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，CHO细胞种于荧光成像平底表面皿中，贴壁之后向两皿CHO细胞分别加入10μM的荧光染料1和荧光染料2的DMSO溶液，于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液或无血清培养基充分洗涤后，用荧光共聚焦成像，得图3a，3c。说明荧光染料1和荧光染料2可以进入细胞，被双光子激发，成像细胞。

Claims (2)

1.一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料，其特征在于其结构通式为：
其中R为CH3O-或(CH3)2N-。
2.一种权利要求1所述的六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的制备方法，其特征在于按以下步骤操作：
(1)将96mL浓度为1M的ICl冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入0.08mol水杨醛，40℃反应48h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体1；
(2)将20mmol中间体1、24mmol丙二酸二乙酯、0.2mL哌啶以及5滴冰乙酸加入50mL乙醇中，回流反应5h，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体2；
(3)将6mmol中间体2、7.2mmol化合物A、0.06mmolPdCl2(PPh3)2以及0.12mmolCuI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10mL三乙胺和30mL四氢呋喃，室温搅拌反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离得到目标产物；
所述化合物A为对甲氧基苯乙炔或4-二甲基氨基苯乙炔。
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